Paola GrammaticoIrene Bottillo18-04-2015

Tecniche di nuovagenerazione nella diagnostica

molecolare di patologie cardiache

Sequence revolutions

Thro

ugh

put

Kb

Gb

Mb

Lenght of Read (bp)

70030050

NGS

whole genome

whole transcriptome

whole exome

target seq

Sequence revolutions

Genome sequencing: intero genoma -> mutazioni puntiformi + riarrangiamenti cromosomici

Exome sequencing: solo le regioni codificanti di un genoma

Trascriptome sequencing: sequenziamento e quantificazione degli RNA, sia codificanti che non-codificanti -> fusioni intrageniche + mutazioni puntiformi + isoforme + profili di espressione

Target sequencing: diverse regioni/geni contemporaneamente

NGS, applicazioni

RNA RNA-Seq

studi di espressione

Small-RNA

Regolazione

metilazione

analisi interazioni DNA-proteine

DNA

resequencing geni/genomi noti

sequenziamento de novo

sequenziamento di regioni target

identificazione SNP/mutazioni

identificazione riarrangiamenti strutturali e CNV

transcriptome sequencing

whole genome sequencing

- target sequencing- exome sequencing

ChIP-Seq

Molecular analysis of sarcomeric and non-sarcomeric genes in patients with hypertrophic cardiomyopathy

Bottillo Irene1, D’Angelantonio Daniela, Caputo Viviana2, Paiardini Alessandro3 , Lipari Martina1, De Bernardo Carmelilia1, Giannarelli Diana4, Pizzuti Antonio2, Majore Silvia1, Castori Marco1, ZacharaElisabetta5, Re Federica5, Grammatico Paola1

1Medical Genetics, Department of Molecular Medicine, Sapienza University, San Camillo-Forlanini Hospital, Rome, Italy; 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, Rome, Italy; 3Department of Biochemical Sciences, Sapienza University of Rome, Rome, Italy; 4Biostatistic Unit, Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italy; 5Cardiomyopathies Unit, Division of Cardiology and Cardiac Arrhythmias, San Camillo-Forlanini Hospital, Rome, Italy

Scopo del lavoro

Il test genetico permette di confermare o escludere la HCM in casi atipici, e di identificare portatori in fase pre-clinica attraverso

screening familiare

Analisi genetiche medianteSanger si limitano a 4-5 geni e richiedono tempi/costiimpegnativi

Assenza di chiare correlazionigenotipo-fenotipo

NGS di 62 geni cardiomiopatia-associati per un test molecolare altamente sensibile e per determinare il contributo di ogni gene

nell’insorgenza ed espressione della HCM

Principali proteine coinvolte nelle cardiomiopatie

HCMDCM

ARVD

Materiali e Metodi

44 pazienti HCM adulti, 23 ♂ e 21 ♀

NGS (Ion Torrent PGM) di 62 geni (CDS, ss, 5’UTR, 3’UTR)

ABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CALR3, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, CTF1, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, EYA4, FHL2, FXN, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP, TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTR, TXNRD2 e VCL

Esperimento Ampliseq su Ion Torrent PGMABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CALR3, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, CTF1, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, EYA4, FHL2, FXN, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP,

TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTR, TXNRD2 e VCL

Analisi dei dati (Torrent Suite 4.0) Alignment on hg19 Coverage/Read depth analyses varianti’ calling

Annotazione delle varianti (wAnnovar2 WEB SERVER)

Filtraggio delle varianti MAF < 0,01

Prioritizzazione delle varianti Exonic ±10bp from splicing junction

Validazione delle varianti (Sanger)

Materiali e Metodi

Predizioni funzionali in silico Molecular Modelling

Correlazioni genotipo-fenotipo

Risultati

18.810 varianti/44 pazienti~ 427 varianti/pazente

Validazione del test NGS: confermate tutte le varianti identificate precedentemente mediante Sanger di MYBPC3, MYH7, TNNT2, TNNI3 in 23/40 pazienti

155 varianti

SANGER VALIDATION

FILTERING

(MAF<0,01) +

PRIORITIZATION

(Ex ± 10bp)

18.810 varianti

Risultati

106 non-sinonime(nsSNV) 81 missense 15 intronic (±10 bp) 4 nonsense 4 frameshift 1 stop-loss 1 in frame deletion

49 sinonime in Htz

Risultati

35/44 (82%) dei pazienti portatori di una o più variantinon-sinonime

4 pazienti: solo varianti sinonime

4 pazienti negativi

24/62 geni negativiACTC1, ANKRD1, CASQ2, CRYAB, CTF1, DES, EMD, EYA4, FXN, LDB3, MYL3, MYLK2, MYOZ2, NEXN, PLN, PRKAG2, PTPN11, SGCD, TAZ, TCAP, TMEM43, TNNC1, TNNI3 and TTR

Numero varianti non-sinonime identificate per ciascun gene

Risultati

Risultati

Numero varianti non-sinonime identificate per ciascunacategoria genica funzionale

“Other” includes the loci coding for lysosomal, thioredoxin reductase, anti-apoptotic and membrane proteins

Risultati

Numero e zigosità dei cambi non-sinonimi identificati nei 44 pazienti HCM

Risultati

Numero dei pazienti mutate VS categoria genica

Sarcomeric

Other

Desmosomal5 31

812 3

4

Molecular Modelling

Risultati

Structural comparison of wild-type and mutant forms for (a) FLH2 A37S; (b) LAMA4 E1646G; (c) MYH6 R23H; (d) MYH7 A226T; (e) MYH7 R143Q; (f) MYOM1 R711H; (g) PKP2 R767S; (h) RYR2 E1127G; (i) RYR2 R485Q. The mutation is indicated in white. The predicted structural effects of mutations are: (a, d) steric hindrance (red circles); (b) local misfolding of linker domain (orange); (c, e, f, g) loss of important inter-residues contacts; (h) loss of a π-anion interaction; (i) loss of a π-cation interaction.

Effects of nsSNVs for (a) the cadherin domain of DSC2; (b) the melibiase domain of GLA; (c) the FGF13 interaction domain of SCN5; (d) the Na Channel of SCN5 (the approximate position of the negatively charged Asp872 residue is shown in red, in each of the four protein subunits forming the channel).

Pt Gene Mutation NM Status TypedbSNP138

clin ass

Referenc

echr start end

Re

fVar UNIPROT Domain

PolyPh

en-2 SIFT

Conservation-

GERP scoreComment

1

MYBPC3 c.T1664C,

p.M555T000256 Htz missense -

Girolami

et al.

2006

chr11 47363668 47363668 A G Q14896Ig-like C2-

type 4B (0) T (1) 4.22

Mol Mod: No

predicted

deleterious

effect

RyR2 c.A3380G,

p.E1127G001035 Htz missense rs200525962 - chr1 237730032 237730032 A G Q92736

B30.2/SPR

Y 2

D

(0.979)DLT (0) 5.29

Mol Mod:

Probably

destructuring

the tertiary

structure (loss of

π-anion

interaction with

Trp1145)

3 TMPO c.A1037G,

p.H346R003276 Htz missense - - chr12 98927072 98927072 A G P42166

disordered

region

B

(0.001)T (0.32) -1.03

Mol Mod: No

possible

prediction

5 MYH6 c.643-5C>T 002471 Htz intronic rs199859986 - chr14 23873602 23873602 G A - - - - -1.15Branch-point

site broken

8

RBM20c.G3373A,

p.E1125K

001134

363Htz missense rs116908219 - chr10 112583294 112583294 G A Q5T481 -

PD

(0.911)T (0.34) 6.16

Probably not

pathogenic

MYH6c.2928+5G

>A002471 Htz intronic rs28730772 - chr14 23862870 23862870 C T - - 4.37

Donor splice site

broken

CSRP3c.T10C,

p.W4R003476 Htz missense rs45550635

Knoll et

al. 2002;

Geier et

al. 2008

chr11 19213986 19213986 A G P50461LIM zinc-

binding 1

PD

(0.888)DLT (0.01) 6.02

Previously

reported alone

in CMD1M

pazienti and in

conjunction with

a sarcomeric

mutation in

HCM pazienti

Risultati

… … …Dall’analisi della tipologia delle varianti, revisione della letteratura, analisi in silico e

molecular modeling, tutti i pazienti sono risultati portatori di almeno una nsSNV patogenetica, o già descritta come un modificatrice del fenotipo

Risultati Correlazioni genotipo-fenotipo Age at diagnosis

Family History

Heart Transplantation

NYHA

Maximal Wall Thickness

Left Ventricular Mass

Cardiac magnetic resonance areas of contrast

Left Ventricular Ejection Fraction

VS total number of nsSNVs

number of sarcomeric nsSNVs

number desmosomal nsSNVs

number of nsSNVs in genes for K+ and Na+ channels and interacting proteins

number of nsSNVs in mRNA splicing, cellular enzymes and nuclear genes

number of cytoskeletal nsSNVs

number of Z-disk nsSNVs

number of intracellular calcium homeostasis nsSNVs

↑ num. nsSNVs: ↓ età di esordio

nsSNVS in geni per Ca++ homeostasis, per canali K+ e Na+, e per proteine del citoscheletro possono modulare l’espressione di HCM

Sudden Cardiac Death

Obstructive Cardiomyopathy

Supraventricular Arrhythmias

Non-Sustained Ventricular Tachycardia

Syncope/Presyncope

VO2

Maximal oxygen uptake

Diastolic Dysfunction

Thoracic pains

ECG Hypertrophy criteria

Conduction abnormalities

Hypertension

Intracardiac Defibrillator

Pacemaker

Myectomy

Coronary-Ventriculography

AMI/NSTEMI

Coronary Bypass

Discussione

Ruolo di 62 geni nell’HCM

Percorso sperimentale/bioinformatico applicabile

in un contesto clinico

82% dei casi: almeno una nsSNV rara

Discussione

3/44 pazienti sindromici

Paz 24: ♀, 7 anni, sindrome di Cantù (AD, ipertricosi congenita,osteocondrodisplasia, cardiomegalia, HCM e dismorfismi)

ABCC9 c.C3460T,p.R1154W (Htz): descritta in 3 pazienti con S. di Cantù (vanBon et al 2012)

Paz 27: ♀, 23 anni, malattia di Danon o glicogenosi da deficit di LAMP2 (Lysosomal-Associated Membrane Protein 2), X-linkedrecessiva (cardiomiopatia , debolezza muscolare, ritardo mentale)

LAMP2 c.453delT,p.F151fs mai descritta prima

Paz 10: ♀, 65 anniGLA c.A644G,p.N215S (alfa-galattosidasi A, malattia di Fabry, X-linkedrecessiva, segni neurologici, angiocheratoma, insufficienza renale, cardiomiopatia)

p.N215S già associata a forma con coinvolgimento solo cardiaco (Davies et, al, Eng et al 1993)

Prospettive future …

Toward a prenatal non-invasive diagnosis of Congenital HeartDiseases (CHDs): identification of early plasmatic markers (miRNAs)

Non-Invasive Prenatal Diagnosis (NIPD) targets cell-free DNA andRNA (fetal + maternal) circulating in maternal plasma

miRNA vengono rilasciati dallaplacenta e poi esportati nellacircolazione materna, qualificandosicome BIOMARKER PRENATALI DI PATOLOGIA

miR-19b, miR-22, miR-29c, miR-375 sono up-regolati in gravidanze di fetiCHD

Identificare miRNA come biomarcatori di CHD fetale in uno stadio precoce di gravidanza

Scopo del progetto

Pazienti e Metodi

Gravidanze di feti non-cromosomici

Gravidanze di feti cromosomici (trisomia 13, 18, 21 e monosomia X)

Gravidanze di controllo (non crososomici, no CHD)

Studio del miRNoma sia da plasma materno che da liquid amniotico

... GrazieProf. Paola Grammatico

Dr. Lilia De Bernardo

Dr. Daniela D’Angelantonio

Dr. Martina Lipari

Dr. Marco Castori

Dr. Silvia Majore

Dr. Elisabetta Zachara

Dr. Federica Re

Dr. Flavia Ventriglia

Dr. Antonella Giancotti

Dr. Angela Caiaro

Dr. Viviana Caputo

Dr. Alessandro Paiardini