上海岛津分析中心姚劲挺 Tel: 021-64711813 64728442*321 Fax: 021-64711499

HPLC Business DeptShimadzu Corporation

上海岛津分析中心上海岛津分析中心姚劲挺姚劲挺 Tel: 021-64711813Tel: 021-64711813 64728442*32164728442*321 Fax: 021-64711499Fax: 021-64711499


上海代表处：上海代表处： 021-64728442021-64728442免费电话：免费电话： 800-810-0439800-810-0439维修部：维修部： 021-64451437021-64451437零配件：零配件： 021-64677635021-64677635http://www.shimadzu.com.cnhttp://www.shimadzu.com.cn


液相色谱液相色谱


HPLC 的环境设置：HPLC 的环境设置：

HPLCHPLC 的日常操作条件：温度：的日常操作条件：温度： 1010 ～～ 30℃30℃ ；相对湿度；相对湿度<80<80 ％；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振％；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。动设备，有良好的通风设施。


一、色谱起源石油醚

碳酸钙颗粒

色素

色谱

组分


液相色谱流程图液相色谱流程图

输液泵进样器

色谱柱柱温箱

检测器

溶剂数据处理


HPLC 的分离类型HPLC 的分离类型

正相色谱正相色谱 (NP-HPLC)(NP-HPLC)反相色谱反相色谱 (RP-HPLC)(RP-HPLC)反相离子对色谱反相离子对色谱 (RPIC)(RPIC)离子交换色谱离子交换色谱 (IEC)(IEC)空间排阻色谱空间排阻色谱 (SEC)(SEC)手性化合物分离模式手性化合物分离模式 (Chiral separat(Chiral separation mode)ion mode)


液相色谱按两相极性不同分为液相色谱按两相极性不同分为 ::正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱化合物保留时间随流动相配比的变化化合物保留时间随流动相配比的变化不同极性的化合物出峰顺序不同极性的化合物出峰顺序


正相 HPLC 色谱柱

硅胶型硅胶型氰基型氰基型氨基型氨基型糖类分析糖类分析二醇基型蛋白质分析二醇基型蛋白质分析

Silica gel

SiSi

-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

Modified Si


反相 HPLC 色谱柱

C18 (ODS) type C18 (ODS) type C8 (octyl) typeC8 (octyl) typeC4 (butyl) typeC4 (butyl) typePhenyl type Phenyl type TMS typeTMS typeCyano typeCyano type

-Si-C18H37

Si

Non-polar propertyNon-polar property


流动相流动相

流动相选择注意事项：纯度：采用“ HPLC ”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂

对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相配制时的顺序


溶剂等级

水的等级纯化水蒸馏水去离子水

波长 (nm)

纯化水

去离子水

因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高

纯化水中去除了无机和有机的污染物

吸光吸光

率率


HPLC 用水可以通过以下几个方面来得到：HPLC 用水可以通过以下几个方面来得到：

1 1 专门的纯水机或超纯水机；专门的纯水机或超纯水机； 2 2 去离子水重蒸；去离子水重蒸； 3 3 二次或三次重蒸水；二次或三次重蒸水； 4 4 采用类似家用的纯水机；采用类似家用的纯水机； 5 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； 6 6 其它途径；其它途径；


不管采用何种途径，配制流动相应用新不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。鲜水，水质越高放置时间越短。

理想的理想的 HPLCHPLC 用水应为用水应为 18.2Ω18.2Ω 的超纯的超纯水，并通过水，并通过 0.22um0.22um 的滤膜，除去热源、的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。有机物、无机离子及空气等。


溶剂前处理溶剂前处理

过滤： 0.45um 或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。


30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由 0.22µm 和 0.45µm 两种规格 , 材料有纤维素 , 醋酸纤维 , 聚四氟乙烯。处理样品体积少于 50µl。13mm 内径：适用于范围广的过滤，由 0.22µm 和 0.45µm 两种规格 , 材料为纤维素。3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由 0.22µm 和 0.45µm 两种规格。处理样品体积为 7µl 。

样品过滤头的类型：


滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙 66 滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸 ,70% 乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。


溶剂前处理溶剂前处理

脱气

目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小

气泡对测定的影响： 1 ）柱压波动，流量偏小 2 ）基线波动返回


柱塞往复泵柱塞往复泵

单向阀

马达和凸轮

柱塞杆柱塞杆密封圈

泵头

10 -100uL


岛津 VP 系列输液泵岛津 VP 系列输液泵

目的单元流速范围特性和应用

分析 LC-10ADVP 0.001-9.999 无脉动，适于半微量 LC 和 LC-MS

LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性，适于常量分析

*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度


等度洗脱等度洗脱

输液泵进样器

色谱柱

柱温箱检测器

单一或混合溶剂单一或混合溶剂


梯度洗脱梯度洗脱

A 泵进样器

色谱柱柱温箱

检测器

B 泵

A

B

时间

B 浓度


分析时间长分析时间长

分离度差分离度差

MeOH / H2O = 6 / 4

MeOH / H2O = 8 / 2

( column : ODS type )

等度洗脱等度洗脱


95%

30% MeO

H

浓

度

梯度洗脱梯度洗脱


混合器

低压梯度比例阀

高压梯度低压梯度

脱气机

高压 /低压梯度系统高压 /低压梯度系统


返回

高压梯度系统梯度准确度好系统复杂 (需两台或三台泵 )

低压梯度系统系统简单需在线脱气机存在时间滞后效应

高压 /低压梯度系统高压 /低压梯度系统


进样器进样器

自动进样器手动进样器原理：（六通阀）注入方式： 1 ）全量注入 2 ）部分注入

返回


HPLC六通阀进样器的使用及保养HPLC六通阀进样器的使用及保养

六通阀进样器是高效液相色谱系统中最六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫理想的进样器，它是由圆形密封垫 (( 转转子子 )) 和固定底座和固定底座 (( 定子定子 )) 组成。美国组成。美国 RheRheodyneodyne 公司的六通阀进样器最为通用，各公司的六通阀进样器最为通用，各大大 HPLCHPLC 仪器制造商均以此产品作为仪器仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。的进样器。


工作原理工作原理

手柄位进样手柄位进样 (Load)(Load) 位置时，样品经微量位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；充满后，多余样品从放空孔排出；

将手柄转动至进样将手柄转动至进样 (Inject)(Inject) 位置时位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。柱进行分析。


手动进样器的原理图

装填状态进样状态返回


虽然六通阀进样器具有结构简单、使用虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样可连续进样 33 万次而无需维修。万次而无需维修。


手柄处于手柄处于 LoadLoad 和和 InjectInject 之间时，由于暂时堵之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在动阀，不能停留在中途。在 HPLCHPLC 系统中使用系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。，也防止了针头刺坏密封组件及定子。


六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的最多为定量环体积的 7575 ％，如％，如 20μl20μl 的定量环的定量环最多进样最多进样 15μl15μl 的样品，并且要求每次进样体的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的量最少为定量环体积的 33 至至 55 倍，即倍，即 20μl20μl 的的定量环最少进样定量环最少进样 6060 至至 100μl100μl 的样品，这样才的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用要求的精密度及重现性。推荐采用 100ul100ul 的平的平头进样针配合头进样针配合 20ul20ul 满环进样。满环进样。


可根据进样体积的需要自已制作定量环可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上譬如，一根名义上 10μl10μl 的定量环，实际的定量环，实际是是 9μl9μl 还是还是 1lμl1lμl 并不重要，因为被测样并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。计算结果时误差都被抵消了。


进样样品要求无微粒和能阻死针头及进进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用样阀的物质，样品溶液均要用 00 ．． 45μm45μm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的阀的 LoadLoad 和和 InjectInject 位置反复冲洗，再位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。


进样体积

检测器响应值

定量管体积的一半 3 倍定量管体积

全量注入

部分注入

进样体积与响应值关系

返回


泵的保养泵的保养

使用流动相尽量要清洁；使用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时要防止沉淀；

避免泵内堵塞或有气泡；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样

品的交叉污染；品的交叉污染；


色谱柱色谱柱

1 ）柱压低于 150kgf/cm2（ 15cm 色谱柱）2）柱温在 40℃左右，最高使用温度为 50℃3 ）流动相 PH 使用范围为 2～ 7.5

返回

ODS 柱的使用注意点：


柱的保养：柱的保养：

柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净

；；要注意流动相的脱气；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；进样样品要提纯；严格控制进样量；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭

；；


流动相注意点流动相注意点

离子对试剂的使用离子对试剂的使用具有缓冲盐流动相的使用分析结束及具有缓冲盐流动相的使用分析结束及开始开始

流动相平衡加快平衡时间流动相平衡加快平衡时间异丙醇的使用异丙醇的使用


LC 检测器LC 检测器

紫外可见检测器（UV/VIS ）二极管阵列检测器（ PDA ）示差检测器（RID ）电导检测器（CDD ）荧光检测器（RF ）电化学检测器（ L-ECD ）质谱检测器（MS ）蒸发光散射检测器（ ELSD ）


反相色谱分析时

添加 10-30 mM 三乙胺 (triethylamine) 可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾

添加 1% 醋酸 acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾

三乙胺 (triethylamine) 也用于正相色谱中 , 使硅胶部分去活性 , 以获得化合物合适的保留时间


维护流程图维护流程图

吸滤头

单向阀

柱塞密封圈

线路过滤器

检测器


管线选择

材料不锈钢 Teflon

PEEK (聚醚醚酮 ) 尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.


管线材料

不锈钢 ( 可用于所有连接 ) 能承受几千 kg/cm2 压力酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 ( 尤其在 pH 小于 2 时 )

PEEK ( 可用于所有连接 ) 能承受高达 250 kg/cm2压力可在整个 PH范围 (pH 1-14) 内使用不适用于高溶解性溶剂如氯仿等

Teflon ( 用于柱后阻尼管、反应管和排液管 ) 化学惰性大能承受 5 kgf/cm2 压力


接头

不锈钢接头 / 垫圈主要用于输液泵、进样器的连接

能承受 400 kgf/cm2压力一旦固定，垫圈不可再动

PEEK接头主要用于色谱柱、检测器的连接

易于安装能承受 250 kgf/cm2 压力容易产生死体积

不锈钢接头

垫圈

PEEK接头


吸滤头吸滤头

材料：不锈钢烧结，孔径 10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或 5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗


单向阀单向阀

T 泵：串联式往复泵 D 泵：并联式往复泵


单向阀单向阀

单向阀结构

球座

吸液冲程排液冲程出口单向阀

进口单向阀

泵头

抛光面

宝石球

流动相

单向阀原理


单向阀清洗单向阀清洗

故障：宝石球或球座受污导致密封不好表现：系统压力波动大措施：

打开排液阀，以异丙醇为流动相输液

拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗


故障 1 ：宝石球粘附于垫片

表现：泵无法吸液或排液，流路不通

措施： 1）用针筒抽出口单向阀以产生负压

，使宝石球与垫片分开

2 ）拆下单向阀，放入异丙醇或水中

，用超声波清洗

单向阀粘结单向阀粘结


柱塞密封圈的更换柱塞密封圈的更换

故障：密封圈磨损导致密封不良现象：系统压力波动大或漏液措施：更换密封圈注意点：1）更换前，新密封圈用异丙醇浸泡 15 min

2 ）拆卸泵头前，柱塞杆复位（ P－ SET ）流动相

泵头清洗管路

柱塞杆

密封圈


线路过滤器线路过滤器

故障：堵塞现象：系统压力波动大或压力偏高措施：异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速 1mL/min ，如压力 >5kgf/cm2，则堵塞。

排液阀

压力传感器

线路过滤器

流动相


手动进样器手动进样器

操作注意点：1）进样时，进样针应插到底2 ）不使用时将针头留在进样器内3 ）进样应使用液相色谱专用平头进样针4 ）样品溶液 pH 小于 10, 常用密封垫的材质适用 pH<10, 否则换特氟隆材质的密封垫 pH10-13

5 ）清洗应使用专用针口清洗器

定子转子

针头密封垫

弹簧不锈钢套


清洗针口清洗针口


色谱柱柱效降低原因

滤片或填料堵塞

样品或流动相中杂质吸附

机械振动产生空隙

填料变性


滤片或填料堵塞

使用预柱缓冲液和溶剂使用 0.45um 滤膜过滤样品溶液使用 0.45um 滤膜过滤

反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液打开柱头，清洗或更换滤片

Back


样品或流动相中杂质吸附

杂质会产生拖尾峰使用高溶解性溶剂清洗色谱柱

仅 1 cm深度会被污染

色谱

柱

取出污染填料，装填新的填料


机械振动产生空隙机械振动产生空隙

不要撞击色谱柱如不要撞击色谱柱如色谱柱掉落或柱压急剧变化色谱柱掉落或柱压急剧变化。。

8 9

4 5 6

1 2 3

7

0

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx xxxx

000 0 000 0

LC-10AD :::::::

输液时不要打开排液阀


填料变性填料变性

硅胶型聚合物型pH 范围 2 - 7.5 广泛使用有机溶剂所有溶剂有限制

压力低于 250 kgf/cm2 压力低温度最好低于60℃ 可在高温下使用


产生峰变形（如拖尾等）的原因

柱进口污染柱内存在空隙样品过载溶解样品的溶剂选择不当二次保留效应

担体表面存在硅醇基担体表面残留重金属


溶解样品的溶剂选择不当

最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂

甲醇作为溶剂

20 20 uLuL Caffeine

乙醇作为溶剂

20 20 uLuL Caffeine

乙醇作为溶剂

10 10 uLuL Caffeine

最好注入少量样品


溶解性效应

低溶解性溶剂高溶解性溶剂

Back


机械振动产生空隙

不要撞击色谱柱如不要撞击色谱柱如色谱柱掉落或柱压急剧变化色谱柱掉落或柱压急剧变化。。

8 9

4 5 6

1 2 3

7

0

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx xxxx

000 0 000 0

LC-10AD :::::::

输液时不要打开排液阀

Back


紫外检测器紫外检测器

参比池

样品池

光线

硅光电池板


紫外灯的保养：紫外灯的保养：

在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。在分析完成后，马上关闭检测器。

样品池要保养样品池要保养


检测池清洗检测池清洗

故障：样品池受污表现：样品池和参比池能量相差较大检查方法：设定 250 nm 波长，通甲醇或水，查看 SMPL

EN 和 REF EN ，如两者相差较大，则样品池受污措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中清洗。


检测池 - 气泡 -检测池 - 气泡 -

使用 0.3 mmID x 2 m 塑料管作为阻尼管连接于检测器出口

连接阻尼管之前，必须先确认检测池能够承受的压力


更换氘灯更换氘灯

• 判断氘灯能量：

设定 220nm 波长，检查参比池能量，如能量低于 800 ，需考虑更换氘灯。

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