目的基因的原核诱导表达及SDS-PAGE 凝胶电泳

现代分子生物学大实验

实验目的• 重点掌握表达载体构建的原理及方法

• 掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法

• 了解目的蛋白质 “标签”纯化的基本原理和方法

• 掌握 PAGE 变性凝胶电泳的原理及方法

• 掌握考马斯亮蓝染色的方法

• 目的蛋白质的诱导表达

• 目的蛋白质的纯化

• 目的蛋白质的检测

实验原理

• 蛋白质的表达：将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。

• 体内很难分析单个蛋白质的作用• 进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究

• 应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面

实验原理

图 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋白在 Hela 细胞中的荧光显微镜检测（ ×400 ）

例

• 酵母表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统

• 表达的蛋白具有正常的活性、构象

• 技术难度较大、耗时、耗资

• 大肠杆菌表达系统

• 实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备

• 不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体

原核细胞表达系统 真核细胞表达系统

实验原理

• 原核细胞表达系统菌株– 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达

产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。

– 堪称经典的 BL21 系列就是 lon和 ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。

– 大名鼎鼎的 BL21(DE3) 融源菌则是添加 T7 聚合酶基因，为 T7 表达系统而设计。

实验原理

• 原核表达质粒的构建

– 目的基因

– 表达载体

Plasmid

Tag

lacIq

Promoter

Ampr

多克隆位点

实验原理

• 目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer

• 例：• p38 中抑制多肽 16 肽序列

– GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC

• F 5’-ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT-3’ • R 5’-ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG

G-3’

• 5’端引物中 AC 是随机保护碱基， G GAT CC 是 BamH I 酶切位点， TA 是为防止移码而引入的两个碱基，随后是编码 16 肽前 7 个氨基酸的碱基序列。

• 3’端引物中 AC 是随机保护碱基， G GAT CC 是 BamH I 酶切位点， TAA 是终止密码子的反向互补序列，随后是从编码 16 肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。

实验原理

• 表达载体– 能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中 ; 在基本骨架的基

础上增加表达元件，就构成了表达载体。

• 元件– 启动子、终止子、核糖体识别序列– 诱导性表达所需要的元件

• 操纵子序列• 调控基因

– 多克隆位点– 融合 Tag– 复制起始序列– 筛选标记 / 报告基因

• 各种表达载体的不同之处 在于其表达元件的差异。

实验原理

• 启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。 lac 和Tac ， PL 和 PR ， T7 是最常用的启动子，

• 转录终止子• 核糖体结合位点

启动子、终止子、核糖体识别序列

操纵子序列及配套的调控基因• 诱导性表达所需要的元件

多克隆位点复制起始序列

实验原理

• 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （ Tag ）。• 标签位于表达载体的多克隆位点的 N 端或者 C 端，能够与目

的基因融合表达（ N 端或者 C 端融合表达）。

• 目前常用的标签有– 组氨酸标签（ His-Tag ）– 谷胱甘肽 S 转移酶（ glutathione S transferase ）标签

（ GST-Tag ）– 硫氧还蛋白（ thioredoxin, Trx ）标签– 麦芽糖结合蛋白（ Maltose Binding Protein, MBP ）– 蛋白质 A （ protein A ）– 纤维素结合位点（ cellulose binding domain ）标签等。

• 一般对于小分子用较大的 Tag （如 GST ）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小 Tag （如 His ）减少对目的蛋白的影响。

实验原理

• 筛选标记 / 报告基因表达

• 抗药性基因， Amp 是最常见的筛选标记， kana ，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。

• 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。

• GFP （绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因了，半乳糖苷酶，荧光素酶。

• 一些融合表达 Tag 也有报告基因的功能。

实验原理

• 常用表达载体– pGEX 系列载体是谷胱甘肽 S- 转移酶（ GST ）

融合蛋白表达系统的载体。• Ptac Promoter• Amp• pGEX - KG

– pET 系列的载体是 His6 融合蛋白的表达载体。• T7• Kana• pET - 14b

实验原理

• 目的蛋白质的诱导表达

– lacI q （ Lactose ）

– lacI 是大肠杆菌中 lac 操纵子（ Operon ）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是 lac 操纵基因（ Operator ）的抑制因子，抑制转录启动。

– 当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使 lac 操纵子上的结构基因 lacZ （ β-半乳糖苷酶 ) 、 lacY （透性酶 ) 、 lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。

– IPTG （异丙基 -β-D-1- 硫代半乳糖苷 ) 作为乳糖的类似物与 lacI 阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此 IPTG 经常作为 lac 操纵子的诱导剂而使用。

实验原理

AmpRPlasmid

pGEX-KG

GST

lacIq

Ptac Promoter

Ampr

IPTG

多克隆位点

实验原理

BamH I

Nde I BamH I

cDNA

酶切

Nde I基因片段

酶切后的目的基因

酶切

连接

转化 筛选（蓝白斑）

鉴定（ PCR 、酶切、测序）

原核表达质粒的构建成功

• 原核表达的诱导条件

– IPTG 浓度： 0.01-5mmol/L

– 诱导时间：～ 3h

– 诱导温度： 15-42℃

实验原理

• 目的蛋白质的纯化– 破碎细胞

• 超声破碎• 溶菌酶裂解

– 从细胞蛋白中纯化出 GST 和 His 融合蛋白• GST 可以通过谷胱甘肽 -琼脂糖亲和层析进行纯化。由

于 GST 对谷胱甘肽的亲和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对 GST 及其融合蛋白进行纯化，最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液 ,洗脱结合的 GST 融合蛋白。

• Poly His 多聚组氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和物结合，因此带 HIS-6 的蛋白能结合与固化的 Ni2+树脂，用适当的缓冲液（ PBS ）洗冲洗去除其他杂蛋白后，再用可溶的竞争性鳌合剂（咪唑）洗脱可以回收靶蛋白。

实验原理

• 目的蛋白质的检测

– 蛋白质分子量的检测

– SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳

– 目的蛋白质的分析

实验原理

• 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。

• SDS 是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入 SDS 和还原剂后，强还原剂例如 β巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与 SDS 结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS 复合物。

实验原理

蛋白质中加入 SDS 并加热， SDS 分子上的非极性区 ( 黄色尾巴 ) 会与蛋白质上的非极性区结合，使蛋白质变性，成为一线状长条分子，上面布满 SDS 分子。 SDS 分子的极性区 ( 洋红色圆点 ) ，则露在外面，以增加亲水性。SDS 是一种阴离子表面活性剂，能打断氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白质分子间的天然的电荷差异。 SDS 最终使蛋白质变成具有高负电荷的线状分子。

97.0 kDa

实验准备

• 诱导、培养– 37℃恒温摇床

• 电泳检测– Hoefer miniVE

Vertical Electrophoresis System

仪器与设备

• LB培养基、 Amp 、 IPTG

• 30%丙烯酰胺贮液• 1.0M Tris(PH6.8)(浓缩胶 ),1.5M Tris(PH8.8)( 分

离胶 )• 10%SDS ， 10% 过硫酸铵（ AP ），四甲基乙二铵

（ TEMED ）• 1XTris- 甘氨酸电泳缓冲液： 25mM Tris, 250mM

甘氨酸， 0.1% SDS• 1xSDS 上样缓冲液： 50mM Tris-

HCl （ 6.8 ）， 100mM DTT ， 2% SDS ， 10% 甘油， 0.1% 溴酚蓝

• 染色液： 90甲醇： 90冰乙酸： 20水＋ 0.5g R-250

• 脱色液： 90甲醇： 90冰乙酸： 20水

实验试剂

实验步骤

• 培养• 诱导• 样品制备• SDS-PAGE• 凝胶检测

实验步骤

1 ）挑取单菌落，接入 3ml含氨苄青霉素（ 50ug/ml ）的 LB培养液， 37℃培养过夜。

2 ）取 50ul 过夜培养物接入 3ml含氨苄青霉素（ 50ug/ml ）的LB培养液， 37℃振荡培养 2h 以上，至对数中期（ A600=0.5~0.6 ）。

3 ）吸出 500ul未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速离心 1min ，沉淀悬浮于 100ul 1 x SDS 凝胶加样缓冲液，100度加热 3min ，室温高速离心 1min ，冰上放置。

4 ）在剩余培养物中加入 IPTG至终浓度 1mmol/L ， 37 ℃继续培养 3h ，取 500ul样品放于微量离心管中，室温高速离心1min 。

5 ）沉淀悬浮于 100ul 1 x SDS 凝胶加样缓冲液， 100度加热3min ，室温高速离心 1min ，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

目的蛋白质的诱导表达及检测

6 ）将电泳槽玻璃板洗净，吹干，并用凡士林封边 ,安装好7 ）配 12% 分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶

槽 高三分之二处，加蒸馏水密封。待胶凝固后（约需 30min倒掉 水，用吸水纸吸干8 ）配 5%浓缩胶将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内（以插入梳子

不 溢出为宜），插入梳子9 ）待胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中10 ）制备好的样品加入上样孔11 ）连接电泳仪12 ）打开电源，调整电压至 80V ，待样品跑过浓缩胶（大约需 30min ）后将电压调至 120V ，待指示剂（溴酚兰）到达

凝胶 的底部距离下缘 1cm 时停止电泳，大约需 2h ，电泳结束。

SDS-PAGE

聚丙烯酰胺凝胶配制（ mini VE ）

12％分离胶 5%浓缩胶H2O 2.45 ml 2.05ml

30%丙稀酰胺

3.0 ml 0.5ml

Tris 缓冲液 1.9 ml （ 1.5M pH8.8 ） 375ul （ 1.0M pH6.8 ）

10%SDS 75 ul 30ul

10% 过硫酸铵

75 ul 30ul

TEMED 3 ul 3ul

注： 1 . 丙稀酰胺为神经毒剂，使用时要小心，操作请务必戴手套。 2. 过硫酸铵需新鲜配制，并注意浓度，否则影响胶凝固。 3. 1块胶可以用 10 ml 离心管， 2块胶要使用小三角瓶便于混匀，配制 后余液可暂时留存，便于参考胶凝固时间，一般 30min即可。

目的蛋白质的检测 -考马斯亮蓝染色

• 考马斯亮蓝 R250 （ coomassie brilliant blue ）是一种三苯甲烷纺织染料，又称酸蓝 83 ，分子上含有两个 S03H基团，偏酸性，能结合在蛋白质的碱性基团上。

• 能够检测出大于 0.1ug 蛋白条带。

• 将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色 4小时（或过夜）。

• 脱染：将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次，浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或 37℃ 加热使其脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带为止。

• 脱色后，将凝胶保存在水中或是 20% 甘油的水中。

凝胶染色

作业

• 按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤、实验结果。

• 阐述目的基因表达载体的构建。

• 分析实验结果。

• 包涵体的出现是目的基因的原核表达中常见问题，其发生原因是什么，如何解决？

实验结果与分析

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