РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБАПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,

ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(51) МПКC07D 489/02 (2006.01)B01D 11/00 (2006.01)

(19) RU (11) 2 429 238(13) C1

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2010112141/04, 29.03.2010

(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 29.03.2010

Приоритет(ы):(22) Дата подачи заявки: 29.03.2010

(45) Опубликовано: 20.09.2011 Бюл. № 26

(56) Список документов, цитированных в отчете опоиске: КОЛЫЧЕВ И.А. Криминалистическое

исследование наркотических средств,получаемых из растений мак, Судебнаяэкспертиза, 2007, №1, С.102-109. WO2005123743 A, 29.12.2005.

Адрес для переписки:350040, г.Краснодар, ул. Ставропольская,149, ГОУ ВПО "Кубанский государственныйуниверситет", отдел интеллектуальнойсобственности

(72) Автор(ы):Колычев Игорь Алексеевич (RU),Киселева Наталья Владимировна (RU),Кальницкий Александр Григорьевич (RU),Темердашев Азамат Зауалевич (RU)

(73) Патентообладатель(и):ГОСУДАРСТВЕННОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГООБРАЗОВАНИЯ "КУБАНСКИЙГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"(ГОУ ВПО КубГУ) (RU)

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПИЙНЫХ АЛКАЛОИДОВ(57) Реферат:

Изобретение относится к способуопределения опийных алкалоидов, которыйможет найти применение, в частности, приоценке соответствия мака пищевоготребованиям ГОСТ Р 52533-2006 «Макпищевой» и в судебной экспертизе дляопределения количественного содержаниянаркотических компонентов. Предлагаемыйспособ определения опийных алкалоидоввключает в себя экстракционнуюпробоподготовку, осуществляемую водно-ацетонитрильной смесью с соотношениемкомпонентов вода:ацетонитрил от 38:12 до 42:

8, а также анализ полученного экстрактаметодом высокоэффективной жидкостнойхроматографии, осуществляемый при длинахволн 210, 220 нм. Также можно повыситьскорость извлечения алкалоидов путемдобавления в экстрагирующую водно-ацетонитрильную смесь минеральной кислоты,например ортофосфорной кислоты. Данныйспособ определения опийных алкалоидовотличается от известных аналоговуменьшенным временем анализа и сниженнымчислом проводимых операций при сохранениистепени экстракции алкалоидов на уровне 93-95%. 2 з.п. ф-лы, 9 ил.

Ñòð.: 1

ru

RU

2429238

C1

1C

83

29

24

2U

R

Ñòð.: 2

RU

2429238

C1

1C

83

29

24

2U

R

RUSSIAN FEDERATION

FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY,PATENTS AND TRADEMARKS

(51) Int. Cl.C07D 489/02 (2006.01)B01D 11/00 (2006.01)

(19) RU (11) 2 429 238(13) C1

(12) ABSTRACT OF INVENTION

(21)(22) Application: 2010112141/04, 29.03.2010

(24) Effective date for property rights: 29.03.2010

Priority:(22) Date of filing: 29.03.2010

(45) Date of publication: 20.09.2011 Bull. 26

Mail address:350040, g.Krasnodar, ul. Stavropol'skaja, 149,GOU VPO "Kubanskij gosudarstvennyjuniversitet", otdel intellektual'noj sobstvennosti

(72) Inventor(s): Kolychev Igor' Alekseevich (RU),Kiseleva Natal'ja Vladimirovna (RU),Kal'nitskij Aleksandr Grigor'evich (RU),Temerdashev Azamat Zaualevich (RU)

(73) Proprietor(s): GOSUDARSTVENNOE OBRAZOVATEL'NOEUChREZhDENIE VYSShEGOPROFESSIONAL'NOGO OBRAZOVANIJa"KUBANSKIJ GOSUDARSTVENNYJUNIVERSITET" (GOU VPO KubGU) (RU)

(54) METHOD OF DETERMINING OPIUM ALKALOIDS(57) Abstract:

FIELD: chemistry.SUBSTANCE: disclosed method of determining

opium alkaloids involves extraction samplepreparation carried out using a water-acetonitrilemixture with ratio of water to acetonitrile rangingfrom 38:12 to 42:8, as well as analysis of theobtained extract through high-performance liquidchromatography, carried out at wavelength 210 and220 nm. The rate of extraction of alkaloids can beincreased by adding mineral acid, for exampleorthophosphoric acid, to the extracting water-acetonitrile mixture.

EFFECT: shorter analysis time and fewer

operations while preserving the degree of extractionof alkaloids.

3 cl, 9 dwg, 1 ex

Ñòð.: 3

en

RU

2429238

C1

1C

83

29

24

2U

R

RU 2 429 238 C1

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к методам определенияопийных алкалоидов, которые могут найти применение при оценке соответствия макапищевого требованиям ГОСТ Р 52533-2006 «Мак пищевой» и в судебной экспертизедля определения количественного содержания наркотических компонентов.

Известен способ определения тебаина и орипавина в семенах мака, включающийпробоподготовку и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии(ВЭЖХ). Пробоподготовка при проведении анализа заключалась в том, чтоэкстракция алкалоидов проводилась буферным раствором с pH 4.5, содержащим 0.2 Мфосфат аммония, 20%-ный этанол, после чего проводилось отделение маточногораствора от твердого остатка центрифугированием. Анализ проводился методомВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором при аналитической длине волны 254нм. Подвижная фаза при этом включает в себя 30% метанол и буфер с pH 4.5. Данныйспособ не позволяет определять содержание морфина и кодеина, являющихсяосновными компонентами опия.

Вышеописанная методика ВЭЖХ пригодна только для определения тебаина иорипавина и не обеспечивает полноту извлечения других опийных алкалоидов.Следует также отметить, что данная методика не позволяет определятьмикроколичества анализируемых веществ, поскольку их наиболее интенсивныемаксимумы поглощения лежат в коротковолновой области спектра (патент №6723894US, A01B 79/00. Production of thebaine and oripavine. April 20, 2004, Appl. №047206, January15, 2002, Tasmanian Alkaloids PTY. Ltd. (Westbury, AU), Fist; Anthony John (Norwood, AU);Byrne; Christopher James (Westbury, AU); Gerlach; Wayne Lyie (Killara, AU)).

Известен способ экстракции опийных алкалоидов из опия, включающийпробоподготовку, включающую их экстракцию различными кислотами приразличных температурных режимах, и анализ полученного экстракта методом ВЭЖХ.В процессе анализа образующегося экстракта возможно определение практически всехопийных алкалоидов. Данный способ при всех его достоинствах трудоемкий иматериалоемкий, требует жесткого контроля условий и не является экспрессным.Кроме того, данный способ не позволяет извлекать опийные алкалоиды из семянмака (WO 2005/123743, October 16, 2006, C07D 489/02 (2006.01.01), PCT/US 2005/016512,December 29, 2005, Tomazi; Keith G. (Florissant, МО), Mallinckrodt Inc (Hazelwood, МО)).

Известен экстракционный способ определения опийных алкалоидов внаркотических средствах, получаемых из мака (Сорокин В.И., Савенко ВТ., СемкинЕ.П. Определение вида наркотических средств, получаемых из конопли и мака:Методические рекомендации / Ред. д-ра мед. наук, проф. Э.А.Бабаяна. - М.: ЭКЦ МВДРоссии, РФЦСЭ МЮ России, 1995). В качестве экстрагентов рекомендуетсяиспользовать хлороформ или смесь хлороформ-этанол-25% водный раствор аммиакав соотношении 1:2:0,1 соответственно либо слабоподкисленную воду. При этомнеобходимо строго соблюдать соотношение образец (г) - экстрагент (мл) - 1:10.Определение проводится методами тонкослойной и газовой хроматографии.

При анализе методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) нахроматографическую пластину наносят стандартные образцы, представляющие собойрастворы наркотически активных алкалоидов опия, и 3-4 мкл экстракта исследуемогообъекта. Полученные хроматограммы рассматривают в ультрафиолетовом свете,отмечая при этом зоны поглощения флуоресценции. Выявленные зоны проявляютреактивом Марки. При этом зоны морфина и кодеина окрашиваются в фиолетовыйцвет, а зона тебаина - желтый. Хроматограммы могут быть проявлены реактивомДрагендорфа, который окрашивает все выявленные зоны в коричневый цвет.

Ñòð.: 4

DE

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 429 238 C1

Разделение проводят в следующих системах растворителей: толуол (бензол)-этанол-триэтиламин - 9:1:1; толуол-ацетон-этанол-25% водный раствор аммиака - 45:45:7:3;этанол-диэтиловый эфир-25% водный раствор аммиака - 3:6:1.

В данном способе для идентификации опия и водных экстрактов используетсякачественная цветная реакция на содержание меконовой кислоты - природногоспутника опия. Готовят 3%-ный раствор хлорида железа, который вносят в экстрактисследуемого объекта. Эта реакция позволяет отличать экстракт маковой соломы отопия и его водных экстрактов. При этом навеску опия растворяют в воде всоотношении 1:100 и к 10 мл водного извлечения прибавляют одну каплю водногораствора хлорида железа (III). При наличии меконовой кислоты появляется красноеокрашивание.

Для количественного определения морфина и кодеина используется метод газовойхроматографии. Исследуемый объект, высушенный при 110-115°С до постоянноговеса, измельчают; затем навеску 0,5 г помещают в коническую колбу с притертойпробкой, смачивают 1,25 мл 5% водного раствора карбоната калия, тщательноперемешивают до равномерного увлажнения и оставляют на 15 мин для набухания.Затем приливают 25 мл хлороформа, колбу закрывают пробкой и перемешивают втечение 30-40 мин. Прилипшие к стенкам колбы частицы периодически погружают враствор стеклянной палочкой. Раствор фильтруют через ватный фильтр, отбирают 20мл фильтрата, переносят его в круглодонную колбу, добавляют 1 мл стандартногораствора метилстеарата в метаноле, этаноле или хлороформе (концентрацияметилстеарата - 1 мг/мл) и отгоняют растворитель досуха. После окончания отгонкирастворителя экстракт обрабатывают силилирующей смесью, для этого в колбу сэкстрактом добавляют 1 мл пиридина и осторожно смывают пленку экстракта состенок колбы. Затем к пиридиновому раствору последовательно добавляют 0,6 млгексаметилдисилазана и 0,2 мл триметил-хлорсилана, перемешивая смесь последобавления каждого реагента. Смесь выдерживают 20 мин при температуре 40-50°С.Определение проводят на набивной колонке длиной 2-3 м с нанесенной фазой OV-101или SE-30 (3 или 5%) или капиллярной кварцевой колонке длиной 10-25 м идиаметром 0,2 мм с нанесенной фазой OV-101. Газ-носитель - гелий или азот. Условияхроматографирования следующие: детектор - пламенно-ионизационный; температураиспарителя 275°С, детектора - 290°С; режим изотермический (оптимальнаятемпература выбирается в диапазоне 230-250°С) либо с программированиемтемпературы колонки от 200 до 280°С со скоростью 10°С/мин; деление потока газа-носителя для капиллярной колонки - 1:55.

Для количественной оценки содержания морфина и кодеина можно использоватьотносительный массовый коэффициент. Относительный массовый коэффициентсилилпроизводных морфина и кодеина к метилстеарату равны 0,94 и 0,96соответственно.

Несмотря на то что в ГОСТ Р 52533-2006 «Мак пищевой» имеется ссылка наданную методику, но как способ определения наркотических алкалоидов опия всеменах мака пищевого вышеописанный способ не рассматривает семена макапищевого как источник наркотически активных алкалоидов опия и не содержитуказаний по извлечению и анализу алкалоидов опия из семян мака. Более того, вметодике указано, что семена мака наркотических алкалоидов опия не содержат и кнаркотическим средствам не относятся.

Наиболее близким аналогом является способ определения опийных алкалоидов насеменах мака (Колычев И.А. Криминалистическое исследование наркотических

Ñòð.: 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 429 238 C1

средств, получаемых из растений мака /И.А.Колычев, B.C.Федорович / Судебнаяэкспертиза. - 2007. - №1. - С.102-109).

В процессе пробоподготовки берут среднюю навеску семян мака массой по 25,00 ги помещают в колбу, в которую добавляют 50 мл смеси толуол: ацетон: этанол:раствор аммиака в соотношении 25:25:2:1 и проводят экстракцию при встряхивании втечение одного часа. Полученные экстракты сливаются в отдельную колбу, аоставшуюся в колбе навеску вновь заливают 50 мл такой же экстракционной смесью,процедуру повторяют еще дважды. Объединенные экстракты упаривают доисчезновения запаха органического растворителя. К образовавшимся вязкиммаслянистым веществам темно-коричневого цвета добавляют 25 мл 0,3%-ногораствора соляной кислоты и кипятят в течение 15-20 минут, охлаждают и аккуратноотбирают водную фракцию, например, шприцем с иглой. Данную процедуруповторяют дважды. К оставшемуся после второго добавления соляной кислотымаслянистому остатку добавляют 15-20 мл ацетона, а к полученному раствору - 0,3%-ный раствор соляной кислоты объемом 20-25 мл. При этом образовываетсяустойчивая эмульсия, которую сначала выдерживают в течение 10-15 минут вобычных условиях, а затем кипятят до исчезновения запаха ацетона, периодическидобавляя воду. Полученные экстракты отфильтровывают и упаривают притемпературе 110°С до образования сухих остатков. Сухие остатки растворяют в 10 млэлюента (ацетонитрил - фосфатный буфер (3:7), фосфатный буфер: 0,04 М K2HPO4, pH3,5 с добавлением ион-парного реагента (додецил-сульфат натрия)). Полученныерастворы отстаивают и фильтруют, затем анализируют методом ВЭЖХ.

Экстракты наркотических средств, получаемых из мака, имеют темно-коричневуюокраску, поэтому проведение известных капельных химических реакций при ихисследовании нецелесообразно. Для проведения химического исследования опия сиспользованием качественной цветной реакции на содержание в нем меконовойкислоты необходимо навеску вещества растворить в воде в соотношении 1:100, а к 10мл водного извлечения прибавить одну каплю 0,3%-ного водного раствора хлоридажелеза (III). При наличии меконовой кислоты появляется красное окрашивание.Данная реакция позволяет отличать экстракционный опий от опия, в которомсодержится меконовая кислота. Стоит отметить, что меконовая кислота - природныйспутник опия.

Данный способ пробоподготовки очень трудоемкий и длительный, однако онобеспечивает высокую степень экстракции алкалоидов опия. При анализе проб свнесением морфина было установлено, что его потери при экстракции составляют неболее 5%. При таком способе удается проанализировать шесть образцов в течениедвух рабочих дней.

Технической задачей заявленного изобретения является упрощение способаопределения опийных алкалоидов из семян мака пищевого, снижение трудоемкости иуменьшение времени определения опийных алкалоидов.

Для решения технической задачи предлагается экстракционную пробоподготовкудля определения опийных алкалоидов осуществлять экстрагентом, представляющимводно-ацетонитрильную смесь. При этом исходные компоненты взяты в диапазонесоотношений вода: ацетонитрил от 38:12 до 42:8 соответственно. Полученныйэкстракт анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией при длинахволн 210, 220 нм. При переводе алкалоидов в солевую форму повышается скорость ихизвлечения путем добавления минеральной кислоты. Следует также отметить, чтоопределение опийных алкалоидов можно осуществлять и без добавки минеральной

Ñòð.: 6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 429 238 C1

кислоты. Добавка в смесь минеральной кислоты обусловлена тем, что она не вноситмешающего влияния при их определении и легко удаляется при термическойобработке.

Наиболее эффективно пробоподготовку осуществлять водно-ацетонитрильнойсмесью, в которой исходные компоненты взяты в соотношении 40:10.

На фиг.1 представлен график исследования зависимости степени извлеченияалкалоидов от соотношения вода: ацетонитрил; на фиг.2 - график зависимости степениизвлечения алкалоидов от объема добавленной минеральной кислоты; на фиг.3а -хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода:ацетонитрил 35:15 соответственно; на 3б - хроматограмма экстракта из семян макамасличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно; на 3в -хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода:ацетонитрил 45:5 соответственно; на 3г - хроматограмма экстракта из семян макамасличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно с добавлениемортофосфорной кислоты в объеме 0,01 мл; на 3д - хроматограмма экстракта из семянмака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно сдобавлением ортофосфорной кислоты в объеме 0,03 мл; на 3е - хроматограммаэкстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10соответственно с добавлением ортофосфорной кислоты в объеме 0,05 мл; на 3ж -хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода:ацетонитрил 40:10 соответственно с добавлением ортофосфорной кислоты вобъеме 0,07 мл.

Выбор оптимальных условий для решения технической задачи проводили, взявнавеску семян мака, помещенную в колбу, заливая водным раствором ацетонитрила вкачестве экстрагента. Исследования по установлению оптимальных соотношенийвода: ацетонитрил, при которых извлечение опийных алкалоидов максимально,представлено на фиг.1.

Как видно из графика на фиг.1, оптимальным является соотношение вода:ацетонитрил, равное 38:12-42:8 соответственно, наилучшим - 40:10. Эффективностьэкстракции алкалоидов повышается путем добавления минеральной кислоты за счетобразования их солевых форм. С учетом уровня определяемых концентрацийалкалоидов концентрация минеральной кислоты, например, 85% о-фосфорнойкислоты минимально от 0,045 мл (фиг.2). Как видно из хроматограмм, приведенныхна фиг.3а - фиг.3в извлечения алкалоидов целесообразно проводить при соотношениивода: ацетонитрил 38:12-42:8 соответственно. Из хроматограмм на фиг.3г - 3ж мывидим, что добавка минеральной кислоты повышает степень экстракции алкалоидов.Наилучшими аналитическими условиями для определения алкалоидов являются длиныволн 210, 220 нм.

Степень извлечения алкалоидов в процессе экстракции повышается привстряхивании за счет интенсификации контакта семян мака с экстрагентом.

Пример: 20 мл экстрагента, состоящего из воды, ацетонитрила и о-фосфорнойкислоты, взятых в соотношении 40:10:0.05 соответственно (соотношение можетварьироваться в зависимости от используемых реактивов и условий экстракции).Колбы устанавливают на встряхиватель, проводят экстракцию 10-15 минут, послечего полученный экстракт из каждой колбы сливают в отдельную колбу, оставшуюсянавеску повторно заливают такой же смесью и повторяют экстракцию. В третий разнавеску достаточно промыть 10 мл экстрагента. Объединенные экстракты фильтруюти доводят водой до метки в колбе на 50 мл. Полученный экстракт из семян мака

Ñòð.: 7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 429 238 C1

анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии приследующих условиях:

1. Жидкостный хроматограф с фотометрическим детектором в УФ-области спектра.2. Колонка с обращенно-фазным сорбентом.3. Возможно как изократическое, так и градиентное элюирование, при этом состав

элюента подбирается в зависимости от используемой колонки. При градиентномэлюировании достигается наибольшая эффективность разделения компонентов. Приэтом наиболее универсальным составом элюента при работе с обращенно-фазнымихроматографическими колонками может служить следующий вариант: перваяступень: ацетонитрил - фосфатный буфер (3:7), вторая ступень - ацетонитрил -фосфатный буфер (6:4).

4. Фосфатный буфер: 0,04 М K2HPO4, pH 3,5 с добавлением ион-парного реагента(додецилсульфат натрия).

5. Аналитическая длина волны - 210, 220 нм.Полученные результаты представлены на фиг.3б.Содержание морфина в семенах, мг/г семян 4,1±0,5.Содержание кодеина в семенах, мг/г семян 0,61±0,08.На полученной хроматограмме (фиг.3б) имеются пики, соответствующие

меконовой кислоте, морфину, кодеину, тебаину. Возможность определения меконовойкислоты позволяет исключить дополнительный этап ее анализа методом капельныхреакций. Анализ алкалоидов опия на семенах мака пищевого в этом случае занимаетвремя менее одного часа. Степень экстракции алкалоидов при этом составляет 93-95%.

В отличие от прототипа в заявленном способе используют экстрагент другогосостава. Кроме того, данный метод является более дешевым и экспрессным посравнению с прототипом.

Формула изобретения1. Способ определения опийных алкалоидов, включающий экстракционную

пробоподготовку и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии,отличающийся тем, что в качестве экстрагента используют водно-ацетонитрильнуюсмесь, при этом исходные компоненты взяты в соотношении 38:12-42:8соответственно, а анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографииосуществляют при длинах волн 210, 220 нм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в водно-ацетонитрильной смеси исходныекомпоненты взяты в соотношении 40:10 соответственно.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что определение осуществляют сдобавлением минеральной кислоты, например ортофосфорной кислоты.

Ñòð.: 8

CL

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 429 238 C1

Ñòð.: 9

DR

RU 2 429 238 C1

Ñòð.: 10

RU 2 429 238 C1

Ñòð.: 11

RU 2 429 238 C1

Ñòð.: 12

RU 2 429 238 C1

Ñòð.: 13