Применение технологий секвенирования Illumina для исследований человека

А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin

проф. Ханс Лерах – руководитель лаборатории

Татьяна Бородина, кбн – «мокрая» биология

Алексей Давыдов, аспирант – «мокрая» биология

Дмитрий Пархомчук, кбн – биоинформатика

Области интересов: анализ экспрессии генов и гаплотипирование.

Группа была вовлечена в NGS-сиквенирование с первых моделей

машин. Принимала участие в нескольких интернациональных

проектах.

Применение технологий секвенирования

ILLUMINA для исследований человека

революция в

биомедицине

•

биология

•

медицина

•

человеческая

история

•

текущий момент

•

перспективы

Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin

Общеинтересный слой

• в настоящее время в биомедицине происходит компьютерная

революция

• эта революция сильно изменит биологию, медицину и ощутимо

поменяет повседневную жизнь

В двух словах о всѐм выступлении



•

биология

•

медицина

•


история

•


•



Профессиональный слой

• двигателем революции является внедрение

высокопроизводительных методов сиквенса ДНК в исследовательскую

и медицинскую практику

• NGS-методы очень востребованы. Многие области биомедицины

выиграли/выиграют от их внедрения

• необычно и странно, что уже несколько лет общий прогресс

определяется главным образом аномально высокой скоростью

улучшения сиквенса. Из-за этого тот, кто хочет преуспеть в ближней

перспективе, должен (кроме всего прочего) ответственно отнестись к

выбору сиквенсовой платформы

• в дальней перспективе важно сознавать, что мы участвуем в

компьютерной революции, а не в конкурсе на лучший сиквенсовый

прибор.

В двух словах о всѐм выступлении



•

биология

•

медицина

•


история

•


•



• сложные задачи можно решать сложным способом,

совершенствуя подходы и алгоритмы коллективными усилиями

• можно быстро обработать большие объѐмы данных

• алгоритмы легко адаптируются к подобным задачам

Компьютерная революция



•

биология

•

медицина

•


история

•


•



• цифровые данные: однажды полученный результат не меняется

• ожидаемое будущее: все уже давно ждут, когда «понятный

геном» и «понятный транскриптом» изменят нашу жизнь к лучшему

• разнообразные области применения - этому будет посвящена

существенная часть слайдов

• высокая чувствительность: возможность работать с биопсиями,

парафиновыми срезами, на уровне отдельных клеток

• быстрое развитие технологии: опережение закона Мура

Двигатель революции: сиквенс ДНК



•

биология

•

медицина

•


история

•


•



Карта распределения по планете сиквенаторов следующих поколений

http://pathogenomics.bham.ac.uk/hts/

Масштабные сиквенсовые проекты




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Масштабные сиквенсовые проекты




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


• 1000 Genomes Project: поиск геномных вариаций в ~20 популяциях

• PGP: personal genome project: изучение вклада наследственности и среды в

проявление различных признаков; секвенирование геномов добровольцев,

согласных предоставить личную информацию

• GEUVADIS Genetic European Variation in Disease: медицинскя интерпретация

сиквенсовых данных для разных моно- и полигенных заболеваний; на основе

RNA-Seq и ExonSeq

• ESGI: European Sequencing and Genotyping Infrastructure: организация NGS

инфраструктуры для европейского научного сообщества

• IHEC: International Human Epigenome Consortium: характеристика эпигенома

человека, ~1000 образцов

Раковые программывыявление диагностичеких маркеров, анализ и выбор лечения

• ICGC: International Cancer Genome Consortium: подпрограммы по разным

видам рака (напрмер, рак простаты, детские опухоли мозга)

• Treat 1000: разные виды рака

• OncoTrack: рак прямой кишки

• CAGEKID: рак почки

• Treat 20: меланома

Анализ генома


Сиквенс и ресиквенс• микроорганизмы / малые геномы: самый эффективный подход

• большие геномы: ресиквенс с анализом небольших перестроек был хорош

всегда, сиквенс de novo и анализ больших перестроек совершенствуются на

глазах

• классификация организмов по молекулярным признакам

• сиквенс определенных областей генома: обогащение

Геномная архитектура• позиция нуклеосом

• трѐхмерная структура генома: 3C (hypothesis-free) и 5C

(высокопроизводительный анализ)

Эпигенетика• метилирование: сиквенс после бисульфидной обработки или ChIP-Seq

• возможно, машины третьего поколения смогут определять модификации

напрямую

Взаимодействие нуклеиновых кислот с белками• ChIP-Seq

• полногеномный неселективный анализ мест посадки белков

• гиперчувствительность к нуклеазам, FAIRE-Seq

• анализ специфичности взаимодействия, поиск консенсусных

последовательностей



•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Полнота анализа

• все типы РНК: кодирующие последовательности, малые некодирующие РНК,

антисенс-транскрипция и т.д.

• чувствительность: при адекватной организации эксперимента можно быть

уверенным, что замечены все действующие РНК

• структура транскриптов: очень хорошо с аллельной экспрессией и РНК-

редактированием, есть прогресс по анализу сплайс-вариантов

RNA-Seq позволяет• определять как отностительный, так и абсолютный уровни экспрессии

• аннотировать новые и уточнять аннотацию известных генов

•смотреть отдельно ядерную, цитоплазматическую, ассоциированную с

рибосомами (в цитоплазме и на мембранах) и т.п. РНК

• выявлять присутствие в образце микроорганизмов и вирусов

Чувствительностьпропорциональна цене, можно грубо оценить как ~$150 за уровень 1 копия на

клетку

Транскрипция: RNA-Seq




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Сравнительный функциональный анализ


Сравнение геномов разных видов позволяет• выявить функциональные элементы генома

• связать эволюционные нововведения с появлением в геноме

новых функциональных участков, типа проект «Origins of

Multicellularity»

• выявить механизмы и движущие факторы эволюции для

разных эпох

• разобраться, что отличает нас от ближайших и дальних

родичей

Внутривидовое сравнение геномов

• причина тонких различий в реакции на факторы окружающей

среды (болезни) и поведении

• факторы, определяющие сложные полигенные признаки (рост,

вес, предрасположенность к распространенным болезням)

• факторы отбора в «историческое» время

• механизмы рекомбинации



•

биология

•

медицина

•


история

•


•


• анализ всех видов вариаций: замены, малые делеции/инсерции,

CNV (психические расстройства), большие хромосомные

перестройки

• гаплотип: пока довольно сложно, но по-любому сиквенсом

• GWAS – сейчас на чипах. Снижение цены приведѐт к

переключению на сиквенс. При этом качество и охват повысятся.

Будет окончательный результат, а не QTL. Преодоление кризиса

«потерянной наследственности»

Вариации




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Предрасположенность к болезни → генотип

• GWAS, вовлеченные гены

• редкие болезни, семейный анализ: «быстрый» тест сиквенсом

кодирующих последовательностей

• молекулярные причины болезни, выбор мишени

• выявление патогена: холера на Гаваях, токсичная E.coli в Германии

• неинвазивная и пренатальная диагностика по ДНК в крови

Болезнь → профиль экспрессии

• классификация опухолей, тонкий и/или ранний диагноз

Медицинская биология




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Проекты по сиквенсу разных типов опухолей

• спектр мутагенеза, «завершить» список онкогенов

• тестирование лекарств на клеточных линиях и ксенографах

• тонкая диагностика и «стандартные» способы лечения

• неинвазивная диагностика (посттреатмент): ДНК и опухолевые

клетки в крови

Онкология




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Превентивная медицина неизбежна

• 4 миллиона американцев страдают болезнью Альцгеймера. Это

обходится национальной системе здравоохранения в $500

миллионов в год. В связи с увеличением продолжительности жизни

ожидается, что сумма возрастѐт до $1-2 миллиардов (5-10% ВВП)

в ближайшие десятилетия.

• ежегодно тратится ~$132 миллиона на лечение диабета второго

типа. Ранний диагноз и умеренное изменение стиля жизни

способны существенно снизить расходы

• 60% страховых выплат приходится на последние два года жизни

Персональная и превентивная медицина




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Персональная медицина

• лекарство для черных (сосуды) BiDil

• Vioxx scandal, популярное лекарство было отозвано из-за

побочных эффектов

• практически все противораковые лекарства очень вредны

– очень востребован персональный подбор

Виртуальный пациент / доктор• инициатива http://www.itfom.eu/ сиквенс, масс-спек и

другие объективные анализы

Персональная и превентивная медицина




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


http://www.itfom.eu/

DTC (direct-to-consumer) тестирование:

компании-участники




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Весной 2010 года более 30 DTC-компаний предлагали более 400 тестов, связанных со

здоровьем.

Пока – либо цирк (практ. польза – выбор супруга для малых замкнутых популяций), зато

дешевый, либо всерьез, но дорого, а толку мало (как резюме – плохое покрытие

страховыми взносами, превентивный сиквенс точно не оплатят, разве что постфактум).

Проблема серьѐзного подхода – отсутствие фазы.

Практически все компании позиционируют свои тесты как "для образовательных и

информационных целях", но не медицинские. Видимо, в первую очередь это связано с

лицензированием медицинской деятельности. Реальная польза очень ограничена и

сложно получить лицензию на такую работу в области здравоохранения.

Большие корпорации. Погнозы усредняются и становятся надежнее. Выигрыш за счет

экономии на лечении.

• происхождение человека (Европа, Азия, Африка, Южная и Северная Америка и т.п.),

колличественно (в процентах). Актуально для Американцев

материнская линия -- по митохлндриальной ДНК

отцовская -- по Y-хромосоме

• SNP связанные с разными забавными признаками, совершенно не не влияющими на

жизнеспособность, типа чувствительность к запаху мочи после спаржи, умение сворачивать

язык в трубочку, цвет глаз, консистенция ушной серы, склонность к облысению, способность

вкус горечи брюссельской капусты, способность потреблять молоко, чихание на ярком

солнце

• SNP, связанные с признаками, которые могут быть полезны сейчас, но не могли

подвергаться отбору ранее:

-- скорость метаболизма кофеина

-- генетическая предрасположенность к героиновой зависимости

-- воспреимчивость к лекарствам может быть сильно сцеплена с SNP

• не рекламируется, но очевидно может использоваться для установления родственных

связей (в том числе -- отцовства и материнства)

• редкие наследственные заболевания -- высокий риск заболеть, но заболевания

действительно редкие -- подавляющее большинство пациентов ничего подобного не

обнаружат

• "сильный прогноз" на распространенные заболевания -- единственный пример

apolipoprotein E (APOE): 2% населения гомозиготы, 15-кратно выше риск заболеть

-- забавно, что о нем Уотсон и не хотел узнавать.

* "слабые прогнозы" на распространенные заболевания -- довольно много, но с очень

слабой предсказательной ценностью

DTC тестирование: типичный пакет




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


https://www.23andme.com/

Silicon Valley; California, ноябрь 2007

основатели Anne Wojcicki (еѐ муж --

Sergey Brin -- один из владельцев

Google) и Linda Avey

Вначале -- $999 -- 600,000 SNP на ките от

Illumina

С сентября 2008 -- $399,

На сегодня – лидер области. Собственно анализ

проводит посторонняя лаборатория. Фирма

проводит web-представление результатов,

прогнозы, хранение, предоставление новой

информации по мере исследований.

Sergey Brin обнаружил, что он носитель G2109S

мутации, приводящей к 60% риску болезни Паркинсона.

Написал в блоге, что это дало ему возможность

готивится к возможной проблеме много лет:

поддерживать и проводить исследования в этой

области, выполнять профилактические упражнения.

https://www.23andme.com/

http://www.decode.com/

CEO Kari StefanssonИсландская биотехнологическая компания, предложила в ноябре

2007 web-сервис deCODEme для непосредственной работы с

потребителями. Сами являются первооткрывателями многих

ассоциаций сами проводили генотипирование.

Пожалуй, наиболее академически-сильная компания.

600,000 SNP на ките от Illumina

Исландия -- население: ~300,000, ~95% - местные. deCODE

Genetics имеет материал на ~140,000, из них 40,000 полностью

генотипированы

Компания обанкротились. В 2010 повысила цену на deCODEme

до нереальных $2000 и, фактически, вышла из игры

http://www.navigenics.com/

New York, весна 2008основатель - онколог David Agus "Doc Hollywood"

-- родословная в фоне только для уточнения вероятности прогноза

-- не интересуются "развлекательными" количественными признаками; то же

для неизлечимых (без профилактических упражнений) болезней

«I just hope in my heart we didn't do this too early»

абстрактная оценка от Navigenics: среди знакомых и родственников, прошедших тест, примерно половина

предприняла какие-то позитивные действия: сходили к врачу или записались в тренажорный зал.

DTC-тестирование: регуляция деятельности

Сиквенс перс. Геномов

Например: Медицинская инициатива

http://www.itfom.eu/

Сравнение с шахматными программами

Сравнение с участковым и др. Хаусом

предросположенности к раку д.б. явными

• индивидуальный подбор лекарств (

• -- РАКОВЫЕ – все очень вредные – перс. Подбор очень важен

• лек

Виртуальный пациент / доктор




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


• история расселения, связь с жизнедеятельностью

(сельское хозяйство)

• факторы отбора в разное историческое время:

экспрессия лактазы во взрослом состоянии, цвет кожи

• (история с обр. стороны) персональная история –

откуда предки (компании кот анализ. Перс. геном)

История человечества: прошлое




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


несмотря на мрачные картины GATTACA серьѐзных

этических проблем не ожидается

• выбор эмбриона перед имплантацией (разрешено в Европе) – б.м.

очевидно распространяется на рисковые ситуации

• выбор супруга (опять же, без Шекспировских альтернатив)

• внебрачн детей типа «папа не знал» – не будет вообще

• спортсмены – уже проводятся генетические тесты. Но не как в

Гаттаке, а выбор среди равных

• страховки – если шансы на заболеть разные, то справедливо, если

разная оплата

• не только диагнозы, но и текущее состояние проблемы

История человечества: будущее




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Выбор платформы: третье поколение




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


http://www.my454.com/

454 Life Sciences организована в 2000

Roche приобрела 454 за $150 million

В августе 2005 Rothberg опубликовал статью

описывающую 454-технологию в Nature. 26

25 million bases за четыре часа.

Май 2010 - геном Неандертальца

http://www.illumina.com/

Solexa,

Professor Shankar Balasubramanian

Illumina приобрела Solexa за $600 million

Летом 2006 Solexa отправила первые

инструменты в геномные центры

GA II – весна 2008

HiSeq2000 – начало 2010

MiSeq – конец 2011

http://www.appliedbiosystems.com/

$120 million Agencourt Personal

Genomics

Ion Torrent for $375 million

Выбор

платформы

параметр HiSeq2000 SOLiD 5500xl

oбласти применения,

приготовление библиотек,

типы ранов (SR, PE, barcoding),

параллелизация

≈

каналов во flowcell: HiSeq - 8, SOLiD - 6

качество

• одинаковое если проводится выравнивание

относительно референсного генома

• для de novo сборки качество выше у Illumina

цена машины SOLiD можно купить примерно в два раза дешевле

независимость каналов-Illumina: 2 независимых flowcell

-SOLiD: 12 независимых каналов

производительность ~49Gb/день ~11Gb/день

цена (реактивы) ~€36/Gb ~€50/Gb

цена сиквенса генома человека ~€3330, три недели ~€4765, четыре недели

длина сиквенсаSR: до 100nt

PE: до 100 и 100nt

SR: до 75nt

PE: до 75 и 35nt

размер вставки <600bp <300bp

время приготовления flowcell 5 hours

1,5 days

максимум 4 библиотеки

в день (на одной EZ

Bead System)

удобство и стабильность

Illumina лучше SOLiDa:

-гораздо реже требует ремонта

-производительность соответствует или больше

заявленной

-немного удобнее и заметно безопаснее в смысле

загрязнения старой библиотекой

оптимизация сиквенса и

использование нестандартных

библиотек

Illumina существенно удобнее: легкое

перепрограммирование машины, простой переход на

новые сиквенсовые праймеры



•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Выбор платформы: малые машины


• существенно слабее и «дороже», чем большие братья. Цена за

нуклеотид Выход MiSeq: ~1/50 одной дорожки HiSeq2000, а цена -

~1/2 одной дорожки.

• «быстрые» сиквенсы (часы вместо дней) – важно для разработки

новых методов и клинической диагностики

• IonTorrent, MiSeq – выбор в пользу MiSeq. Основные причины:

-- полная совместимость с большим братом

-- большая гибкость за счѐт возможности читать обе цепи



•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Выбор платформы: малые машины




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Ion Torrent MiSeq

цена машины~€96k (incl sequencer, server, Ion

OneTouch system and MwSt)€125k (incl MwSt)

дополнительное

оборудованиеnone server (~15k)

тип сиквенса single read single read, PE

длина ридаmax 100nt, in Oct. - 200nt; expected up

to 400nt in 2012max 2x150nt

размер вставки ~600bp

цена сиквенса ~€ 400 (314) - €750 (316 or 318) €330 (1x50bp) - €630 (2x150bp)

число ридов 0.1-10 M (depending on the chip) ~3.4 M (~6.8 M for PE)

выход с одного

прогона

chip

typewells bases

0.2 Gb (1x50bp) - >1 Gb (2x150bp)314 1,2 M >10 Mb

316 6,2 M >0,1 Gb

318 11,1 M >1 Gb

приготовление

библиотек

~10 hours

~3 hours with OneTouch system

as for Illumina

~1,5 hours (Nextera)

время одного

сиквенса~3 hours

4 hours for 1 x 35bp

27 hours for 2x150bp reads

Быстрое развитие области


• не стоит терять время на оптимизацию или

примитивно экономить: улучшаются параметры ридов

(длина, качество), цена падает

• важно учитывать быстрое развитие, чтобы не целится

в то, что уже минуло

• цена смещается в сторону вычислений

• делать то, что можно проанализировать сейчас –

иначе переплата

• неправильно брать параметры с запасом

• был слишком резкий скачек, не стоит строить иллюзии

о простоте анализа – все устаканется и без бутылки не

разберешься



•

биология

•

медицина

•


история

•


•


NB! один и тот же термин «сиквенирование» для классической и

новой технологии

• соотношение затрат на «мокрую» биологию и биоинформатику

падает... и будет только хуже

• вырабатываются стандарты

• cloud computing и возможность делать на стороне

Медикобиологические базы знаний

• модельные организмы, модельные ткани: dbSNP и геномных

перестроек, экспрессия: анотация экспрессирующихся участков,

базы сплайс-вариантов, уровень и вариабельность экспрессии

• каталог внутриклеточных процессов

• клинические диагностические базы знаний

Биоинформатика




•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Найти своѐ место


• случится резкое изменение «востребованности» NGS, по

видимому, скачек вызовет клиника. Но двигателем будет академия.

аналогия с телефонией

• всех коснется через медицину, которой понадобятся объективные

данные

Аналогия с другими технологическими

революциями: повсеместное внедрение персональных

компьютеров, интернет, мобильная телефония, спутниковая связь и

навигация

• если биолог - надо разбираться в биоинформатике

• если медик – в прогностической медицине



•

биология

•

медицина

•


история

•


•


Documents

Применение технологий секвенирования Illumina для исследований человека