Технологии секвенирования нового поколения

в диагностике и прогнозировании лечения рака

ПОСЛЕ завершения секвенирования генома человека исследователи и клиницисты ощутили потреб-

ность в прочтении все большего ко-личества индивидуальных геномов, чтобы найти ответы на фундамен-тальные и клинически значимые вопросы. Геномная информация, как ожидалось, даст ключ к пониманию природы болезней и позволит создать специфические диагностические и терапевтические стратегии, в част-ности, для лечения рака. Тем самым будет реализована идея таргетной и персонализированной медицины. Растущие потребности дали толчок технологическому развитию, и по-мимо традиционного метода секвени-рования по Сенгеру стали появляться новые высокопроизводительные геномные технологии. В 2005 году возникли первые платформы для параллельного ДНК-секвенирования, открыв эру секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS). Эти технологии радикально уве-личили скорость получения данных о нуклеотидной последовательно-сти – до сотен гигабаз за один запуск прибора, в то время как стоимость секвенирования снизилась на не-сколько порядков.

Что такое NGSК технологиям секвенирования

нового поколения относятся:– секвенирование путем синтеза с

обратимой терминацией (Illumina),

– пиросеквенирование (Roche),

– секвенирование путем лигирова-ния (SOLiD),

– полупроводниковое секвенирова-ние (Ion Torrent),

а также недавно появившиеся технологии:

– секвенирования одной молекулы (Helicos Genetic Analysis System),

– наносеквенирование (DNA-nanoboll) (Complete Genomic).

Они высокотехнологичны, то есть позволяют определять последова-тельность нуклеотидов быстрее и дешевле. В настоящее время на рынке лидирует компания Illumina, которая за два-три года собирается довести стоимость секвенирования

одного генома с 30х покрытием (кратность прочтения) до суммы меньше $1000. Помимо полногеном-ного секвенирования, которое для многих клинических лабораторий остается слишком затратным, раз-вивается таргетное секвенирова-ние – ограниченное интересующими исследователей участками генома, которые можно прочитать с более высоким покрытием. Наиболее часто используются методы, основанные на обогащении образцов последо-вательностями исследуемых генов путем ПЦР (PCR-based enrichment methods). Другой вариант – методы обогащения, основанные на гибриди-зации (hybridization-based enrichment methods) с олигонуклеотидными ДНК-чипами либо в растворе на магнитных частицах-носителях. Пре-имущество методов гибридизации заключается в возможности охвата большого участка генома.

Сложный геномный ландшафт опухоли

Обстоятельство, осложняющее диагностику и лечение, состоит

HiSeq2000, Illumina

в том, что злокачественная опухоль генетически неоднородна. Тради-ционно опухоль рассматривали как массу трансформированных клеток, которые несут сходные генетические отличия, и, хотя меняются по мере прогрессии заболевания и в ответ на лечение, но меняются в одном направлении. Использование ме-тодов NGS показало, что все гораздо сложнее – опухоль представляет собой совокупность клеточных по-пуляций с различными профилями генетических нарушений. Гетероген-ность можно считать отличительной чертой злокачественных новооб-разований, и именно она может стать причиной неточного диагноза и терапевтической устойчивости опухоли.

Команда Чарльза Свантона (Charles Swanton) из Института иссле-дований рака Университета Лондона (Cancer Research UK London Research Institute) провела полногеномное исследование клеток из биопсий пер-вичных опухолей и их метастазов, полученных от четырех пациентов с почечно-клеточной карциномой. Убедившись в геномном разнообра-зии раковых клеток, ученые нашли подтверждение модели «ветвящейся эволюции» (branched evolution) кле-точных популяций. В соответствии с этой моделью, опухоль инициирова-на клетками, несущими первичную мутацию, которые через какое-то время дают начало целому букету клональных клеточных популяций. Эти популяции несут первичную мутацию, но, поскольку в клетках ломается система защиты ДНК, в них быстро накапливают и другие мутации. «Опухолевые клетки гете-рогенны на всех уровнях, – говорит Свантон. – От числа копий ДНК и мутаций до изменения уровней экс-прессии генов и функциональных нарушений. Гетерогенность раковых клеток, по-видимому, перевешивает их общность». Его группа обнаружи-ла, что анализ биомаркеров даже в

двух образцах одной и той же опу-холи может дать противоречивые прогностические результаты. Это ставит под сомнение то, насколько точно геномный анализ материала, полученного при биопсии из одного или даже нескольких мест опухоли, позволит правильно определить стратегию лечения. Еще больше осложняет ситуацию свойство рако-вых клеток изменяться в ответ на терапию – так, метастазы, появивши-еся после химиотерапии, могут быть генетически не очень похожи на первичную опухоль, из которой они возникли. Но, даже выявив это раз-нообразие, очень трудно отличить мутации-драйверы, определяющие развитие опухолевого процесса от «случайных пассажиров», по вы-ражению Свантона. Он же говорит о том, что при всей гетерогенности в раковых клетках наблюдаются и при-знаки конвергентной эволюции, ког-да ветви с разными мутациями могут приобретать одни и тем же наруше-ния, например, инактивацию гена PTEN (ген фосфатазы, считающейся опухолевым супрессором). Свантон считает, что это свидетельствует о

сильном отборе, способствующем возникновению таких мутаций.

Более полную информацию о ге-терогенности опухоли дают техно-логии секвенирования единичных клеток, которые позволяют выявлять и разнообразие их геномных на-рушений, и изменения транскрип-томов. Однако для использования в клинической практике эти техно-логии пока слишком дороги, и, что еще более важно – результаты этих исследований трудно интерпрети-ровать. Как бы то ни было, методы NGS оказались очень полезны для исследования клональной структуры и генетической эволюции опухоли. А поскольку гетерогенность значитель-но осложняет поиск биомаркеров и прогнозирование чувствительности опухоли к терапии, внедрение этих знаний в клиническую практику связано с большими ожиданиями по повышению точности постановки диагноза, подбора таргетной и персо-нализированной терапии.

Мутации, ассоциированные с раком

За последние годы в ходе исследо-ваний полногеномных ассоциаций (GWAS) выявлены сотни генетиче-ских вариаций, ассоциированных с болезнями. В большинстве случаев это однонуклеотидный полимор-физм (SNP), выражающийся в замене одного нуклеотида на другой. Но GWAS имеют дело только с обычны-ми вариациями (частота встречаемо-сти которых в популяции > 5%). На сегодня более 7000 сильных SNP-ассоциаций (p < 1.0 х 105) включено в каталог Catalog of Published Genome-Wide Association Studies, собранный в Национальном институте иссле-дований генома человека (National Human Genome Research Institute). Однако большинство этих SNP ока-зывает незначительный эффект и очень редко они являются причиной

Чарльз Свантон

Модель «ветвящейся эволюции»

Гены Тип аберрации Тип опухоли Мишень Эффект Метод секвенирования Тип образца

EBF1-PDGFRB, BCR-JAK2, NUP214-ABL1

слияние любая киназный сигнальный путь активация полногеномное острая лимфобластическая лейкемия

IL7R, SH2B3 мутация любая цитокиновый сигнальный путь

активация полногеномное острая лимфобластическая лейкемия

TP53 мутация клет. карцинома регуляция клет.цикла инактивация полногеномное перифер.кровь

VTI1A-TCF7L2 слияние прямая кишка транскрипц. факторы активация полногеномное колоректальные аденокарциномы

ARID1A, ARID1B, ARID2, MLL, MLL3

мутация печень регуляция хроматина инактивация полногеномное гепатоклеточные карциномы

PREX2 мутация меланома Rac exchange factor инактивация полногеномное меланомыATRX мутация нейробластома надстройка теломер инактивация полногеномное нейробластомыBRIP1 мутация яичники репарация ДНК инактивация полногеномное перифер. кровьDNMT3A мутация AML метилирование ДНК инактивация экзом острые моноцитические

лейкемииCBFB мутация молочная железа транскрипц. факторы инактивация экзом опухоли молочной железыMAGI3-AKT3 слияние молочная железа клет. сигнальный путь активация экзом опухоли молочной железыN0TCH1 мутация клет. карцинома клет. сигнальный путь инактивация экзом клет. карциномы головы и шеиSF3B1 мутация CML сплайсинг мРНК инактивация экзом хронич. лимфоцитические

лейкемииMXRA5 мутация легкое ремоделирование матрикса активация экзом немелкоклеточные

карциномы легкогоCSMD3 мутация легкое неизвестно инактивация экзом немелкоклеточные

карциномы легкогоRAC1 мутация меланома клет. сигнальный путь активация экзом меланомыGRIN2A мутация меланома глутаматные рецепторы неизвестно экзом меланомыSPOP, FOXA1, MED 12 мутация простата регуляция транскрипции неизвестно экзом опухоли простатыFAT4 мутация желудок клеточная адгезия инактивация экзом аденокарциномы желудкаARID1A мутация желудок ремоделирование хроматина инактивация экзом аденокарциномы желудка

патологии. Гипотеза, связывающая обычные вариации с обычными болезнями, оказалась несостоятель-ной. Методы NGS дали возможность изучить редкие вариации (с часто-той встречаемости <5%), связанные с предрасположенностью к болезням, в том числе, к раку. Для поиска ред-ких вариаций необходимо полноге-номное секвенирование относитель-но большой выборки людей. Этой цели должны послужить результаты проекта «1000 геномов», в котором будет составлен каталог генетиче-ских вариантов с частотой < 1% в по-пуляции. Более амбициозный проект UK10K ставит своей целью секве-нировать 10 тысяч геномов из двух хорошо фенотипически описанных популяций в Великобритании, чтобы описать редкие вариации, ассоции-рованные с несколькими болезнями.

NGS технологии уже помогли вы-явить некоторые мутации, которые способствуют опухолевой трансфор-мации (см. таблицу ниже). (Jiekun Xuan, Ying Yu a, Tao Qing a at all, 2013)

Гены, входящие в диагностические панели, выявляемые методами NGS, представляют собой потенциальные мишени для таргетных препаратов или потенциальные маркеры устой-чивости к ним. Большая часть этих лекарств создана для лечения часто диагностируемых раков, таких как

рак молочной железы или прямой кишки. Для менее изученных форм опухолей методы NGS могут вы-явить неизвестные ранее ключевые мутации, что может стать основой для разработки новых биомаркеров. Хотя сегодня существуют база данных генетических вариантов, напри-мер Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), собранный Инсти-тутом Сенгера (Wellcome Trust Sanger Institute), коллекция “золотого стан-

дарта” прогностических индикаторов пока не создана, и лишь небольшая часть биомаркеров испытана и кли-нически проверена (менее 100 из не-скольких тысяч). Большую проблему представляет интерпретация данных секвенирования. Некоторые компа-нии специализируются на биоинфор-матических и системно-биологиче-ских подходах к этой проблеме, в том числе, разрабатывают компью-терные модели, воспроизводящие

Гистограмма, показывающая диапазон мутации для гена CDKN2A (из базы COSMIC)

сигнальные и транскрипционные пути в организме человека.

Анализ РНКМетоды секвенирования нового

поколения позволяют исследовать не только ДНК, но и РНК злокачествен-ных опухолей. Совокупность РНК, которые в настоящий момент син-тезируются с ДНК, – транскриптом, представляет собой моментальный снимок спектров экспрессии генов и регуляторных элементов в клетке, ткани или организме при опреде-ленном физиологическом состоянии. Транскриптом включает матричные РНК (mRNA), а также микроРНК (miRNA) и другие некодирующие РНК.

Разнообразие транскриптов (РНК, синтезируемых с одного гена) увеличивается за счет альтернатив-ного сплайсинга, слияния генов, и редактирования РНК. Образование слитных генов считается одним из общих свойств злокачественной трансформации. Наиболее часто такие перестройки выявляются при гематологических новообразованиях и саркомах костей и мягких тканей, реже в эпителиальных карциномах. Обнаружить слияния генов в обыч-ной солидной опухоли цитогенети-ческими методами сложно. Анализ РНК методами RNA-Seq значительно облегчает задачу поиска новых слитных генов в различных опухо-лях, в том числе при раке простаты, раке молочной железы, лимфоме, саркоме, меланоме. Специалисты считают, что появление слитных ге-нов связано с механизмами канцеро-генеза в некоторых органах и тканях, и на основе этого можно разработать специфические маркеры. Напри-мер, в В-клеточных лимфомах было обнаружено несколько вариантов слитных генов с участием транс-активатора MHC II классаCIITA. Мож-но предположить, что перестройка CIITA – это новый онкогенный механизм в лимфоидных опухолях. Определен также новый подтип кост-

ной саркомы, вызванной слиянием генов BCOR-CCNB3. Другие вариан-ты слияния генов представлены в различных типах рака. Например, слияние, включающее гены RAF сиг-нального пути, выявлено при раке простаты, раке желудка и меланоме, что указывает на терапевтическую мишень для всех трех типов рака.

Некодирующие РНК участвуют в различных биологических процессах, включая пролиферацию, дифферен-цировку и апоптоз. Показано, что нарушения их экспрессии сопрово-ждают патогенез многих болезней человека, в том числе рака. К ним относятся длинные некодирующие РНК (lncRNA), состоящие более чем из 200 нуклеотидов, которые задей-ствованы в эпигенетических модифи-кациях, регуляции транскрипции и пост-транскрипционном процессинге мРНК. Участие в возникновении рака доказано для десятков lncRNA, но их функциональный каталог еще далек от завершения. Последнее ис-следование выявило участие новой lncRNA – PCAT-1 в развитии рака простаты. Другой вид некодирующих

РНК – микроРНК (miRNA), состоящие из ~22 нуклеотидов. Это важнейший регуляторный элемент экспрессии генов, свое влияние они оказывают, соединяясь с комплементарными последовательностями в таргетных областях. МикроРНК могут рабо-тать как онкогены или супрессоры опухоли, нарушение их экспрессии было описано при многих формах злокачественных новообразований. Специалисты считают, что профиль микроРНК, который выявляется методами NGS, может быть индикато-ром типа опухоли и степени злокаче-ственности опухолевого процесса. Вы-явление микроРНК в биологических жидкостях открывает возможность для разработки методов неинвазив-ной диагностики и прогноза терапии злокачественных опухолей.

Наконец, эпигенетические моди-фикации ДНК (химические измене-ния, не затрагивающие последова-тельности нуклеотидов) вовлечены во многие процессы, происходящие в опухолях. Исследователи считают, что мониторинг статуса метили-рования ДНК, проведенный NGS

Панель SuraSeq компании Asuragen (Austin, Texas) – таргетное секвенирование от 5 до 52 опухоль-ассоциированных генов.

методами, будет информативен для диагностики, прогноза опухолевого процесса и ответа на терапию.

Что уже делаетсяСегодня существует несколько

пилотных проектов, развивающих применение методов секвенирова-ния нового поколения в клинике. Так, ученые из Translational Genomics Research Institute (Phoenix, Arizona), в партнерстве с US Oncology Research (Woodlands, Texas) и Life Technologies (Carlsbad, California) используют полногеномное секвенирование, что-бы создать направленную стратегию лечения для 14 пациенток с трой-ным негативным раком молочной железы. В Мичиганском университете (University of Michigan, Ann Arbor) ис-следователи, работающие по програм-ме ‘MI-ONCOSEQ’ (Michigan Oncology Sequencing Project), объединили результаты геномного и транскрип-томного секвенирования опухолей у пациентов с поздними стадиями рака и нашли мутации, которые помогут разработать для них оптимальное медикаментозное лечение.

Команда Foundation Medicine (Cambridge, Massachusetts) проверила свою панель из 182 генетических локусов, ассоциированных с раком, на приблизительно 400 пациентах и представила первичные данные на симпозиуме American Society for Clinical Oncology (ASCO). «Более 70% исследованных нами случаев связаны с клинически корректируемыми на-рушениями», – сказал Майкл Пел-лини (Michael Pellini), руководитель исследования.

Команда специалистов в Genomics and Pathology Services (University of Washington, St. Louis) выполнила таргетное секвенирование 27 отобран-ных генов у сотен раковых пациентов. «Мы очень осторожны, потому что должны быть абсолютно уверены, что имеем доказательную систему, кото-рую можно использовать в клинике», – говорит руководитель исследования. Компания Asuragen (Austin, Texas) недавно выпустила на рынок панель SuraSeq – три продукта, которые

делают возможным таргетное секве-нирование от 5 до 52 опухоль-ассо-циированных генов. По словам Гэри Лэтмана (Gary Latham), директора по диагностическим исследованиям и развитию технологий, этот решение основано на клинических реалиях – ограниченном количестве исходного материала: «Обычно бывает, что если

вы просите 50 нанограммов ДНК, то получаете 10, а если просите 10, то получаете 2». Компания Ion Torrent пришла к такому же решению, раз-вивая AmpliSeq – панель для секве-нирования мутаций в 46 различных опухоль-ассоциированных генах всего из 10 нанограммов ДНК.

Другие компании делают ставку на полногеномное секвенирование, на-пример, Complete Genomics (Mountain View, California). Джилл Хэйгенкорд (Jill Hagenkord), медицинский дирек-тор компании, замечает, что полно-геномное секвенирование открывает возможность идентифицировать типы структурных перестроек, кото-рые в изобилии встречаются в гено-мах опухолевых клеток, с разрешени-ем, невозможным при традиционных методах исследования кариотипа. Он считает, что полногеномное секвени-рование гораздо информативнее, чем таргетное.

Многие специалисты обратились к анализу транскриптома. Например, компания Genomic Health (Redwood City, California) продвигает на рынок продукты линии Oncotype DX, ис-пользующие ПЦР с обратной транс-

крипцией (RT-PCR), чтобы проследить изменение профиля экспрессии клю-чевых генов, связанных с прогрессией и рецидивами рака молочной железы и прямой кишки. Специалисты, рабо-тающие по программе MI-ONCOSEQ, сделали трансриптомику ключевым компонентом своих исследований. «В биологии опухоли анализ транскрип-тома очень информативен», – говорит директор программы Ханс Лерах (Hans Lehrach). Он подчеркивает, что основная задача опухоли – устранить ограничение роста, и добиться этого она может любым способом – деле-цией участка хромосомы, приобре-тением точечной мутации в экзоне или аномальным метилированием промотора.

Грандиозный проект в настоящее время планируется в Норвегии, его организатор Norwegian Cancer Genomics Consortium, участвуют в нем исследовательские группы в клини-ках, биотехнологические и фармако-логические компании. Цель проек-та – секвенирование опухолевых и

нормальных тканей каждого онко-логического пациента в стране. Это первая национальная инициатива такого рода, она получила поддержку норвежского правительства. «Мы на-чали с того, что планируем секвени-ровать экзомы образцов опухолей и крови двух тысяч пациентов, охватив при этом восемь типов рака», – сказал Ола Майклбост (Ola Myklebost), лидер проекта (Oslo University Hospital).

Еще более амбициозен IT-Future of Medicine (ITFOM) – обширный между-народный проект, входящий в про-грамму Европейского Союза Future and Emerging Technologies (FET). Он ставит целью объединение разных источников данных – геномики, метагеномики, эпигеномики, транс-криптомики, протеомики и метаболо-мики, для создания общих предсказа-тельных моделей, пригодных для всех онкологических пациентов в Европе.

Материал предоставлен компанией «Персональная биомедицина»

Майкл Пеллини Джилл Хэйгенкорд

Ханс Лерах Ола Майклбост