זמינות ביולוגית ויציבות ויטמין D בננו-אנקפסולציה במיצלות

קזאיןדר' יואב ליבני

הפקולטה להנדסת ,ביוטכנולוגיה ומזון

הטכניון, מכון טכנולוגי לישראל

livney@technion.ac.il

פרופ' צופיה איש-שלום

מרכז רפואי רמב"ם, היחידה למטבוליזם

העצם והמינרלים

הפקולטה לרפואה, הטכניון מכון טכנולוגי

לישראל

Dרקע: ויטמין נוצר בעור בחשיפה לקרינתUVB . בעל חשיבות רבה לתפקוד רב מערכתי: למטבוליזם

העצם והסידן, תגובתיות לאינסולין, מערכת החיסון ועוד. לפי מחקרים אפידמיולוגים, סטטוס תקין של ויטמיןD

קשור בהפחתת סיכון לשברים, ליתר לחץ דם, לסוכרת, ולסרטן.

מקורותיו התזונתיים מעטים ואינם יכולים לספק אתהתצרוכת הנדרשת בהעדר חשיפה מספקת לשמש.

יש חסר ויטמיןD בכל רובדי האוכלוסייה, עקב הימנעות מחשיפה לשמש מחשש למלנומה, ושימוש בקרם הגנה.

לכן קיימת חשיבות רבה להעשרת מזונותומשקאות הנצרכים ע"י אוכלוסיות רחבות בויטמין זה לשם העלאת אספקת הויטמין

ומניעת חסר קיצוני. הויטמין מסיס שומן ורגיש לחום, חמצן וUV התוסף חייב להיות בעל כושר פיזור

הומוגני במוצר כדי למנוע הרעלה.

Dרקע: ויטמין

פיתוח מערכות הובלה ננוסקופיותלחומרים נוטרסאוטיים הידרופוביים,

המבוססות על חלבוני חלב,בהשראת מערכות טבעיות

הגישה:

מיצלות הקזאין )מ"ק(

nm 50-500 בגודל קולואידים כדוריים•nm 150))בממוצע-

מיצלות במיליליטר חלב 1014-1016יש כ-• גר' מים לגרם חלבון2מכילות כ- • 6% קזאין, 94%הרכב על בסיס יבש: •

מולקולות קטנות )סידן, פוספאט, ציטראט(

תפקידן הביולוגי: ריכוז, ייצוב, והובלה של נוטריאנטים • בעיקר חלבון וסידן, מהאם לתינוק.,חיוניים

Dalgleish et al. (2004)

!!הן למעשה ננוקפסולות טבעיות Semo, E.; Kesselman, E.; Danino, D.; Livney, Y. D., Food

Hydrocolloids, 2006.

יתרונות האנקפסולציה בתוך מיצלות הקזאין

הוספה וייצוב חומרים הידרופוביים נוטרסאוטיים •במזונות חסרי או דלי-שומן.

העשרת מזונות בסיסיים בחומרים בריאותיים אלה תוך •צמצום הפגיעה במרקם ובטעם המוצר, ובתכונות

הפונקציונאליות של הקזאין.הגנה על החומרים הרגישים מפני קלקול בייצור •

ובמהלך חיי המדף.צמצום תחושת טעמים לא רצויים של החומרים •

המוספים..הביולוגית שלהםשיפור פוטנציאלי של הזמינות •השגת כל הנ"ל תוך שימוש בחומרים טבעיים המוכרים•

GRASכ-

תוצאות מחקר מוקדם

לקזאיןDחקר קישור ויטמין

0.E+001.E+062.E+063.E+064.E+065.E+066.E+067.E+068.E+069.E+061.E+07

0 50 100 150Vitamin Concentration )miliMolar(

Fluo

resc

ence

Inte

nsity mM 1 ריכוז הקזאין:

The Parameter Estimated Valuen (moles vitamin D

per mole casein) 4.04 ± 0.27

Ka (the association constant) (x106 M-

1)9.38 ± 3.13

ע"י מדידת פלואורסנציה של טריפטופן בקזאין

תהליך לאנקפסולציה במ"ק:Two-Flow Mode

UHP-Homogenization

+Ca2תמיסת

תמיסת קזאינאט עם

D ויטמין ועם פוספאט

תוצר חלבי הומוגני

בהמגון תוצאות האנקפסולציה :מורפולוגיה

דומה לזו של מיצלות קזאין טבעיות A:r-CM (UHPH) B: natural CM

ABB

100 nm

התפלגות גודל המיצלות לאחר יצירתן בהמגון

יעילות קישור הויטמין לחלבון

הפרדה בצנטריפוגציה  )שיקוע המיצלות הגדולות(

הפרדה בשיקוע איזואלקטרי

( pH=4.6 ))שיקוע כל החלבון(

30% כ-DLS)גם עפ"י 31.8מהחלבון במיצלות הגדולות(

98.8% אחוז החלבון ששקע

46.2 98.8% אחוז מהויטמין שנמצא במשקע

µg/mg 16.3mol/mol 0.99

µg/mg 16.0mol/mol 0.97

יחס ויטמין\חלבון בסרום

(µg-ויטמין ל mg חלבון(

µg/mg 32.7mol/mol 2.0

µg/mg 18.2mol/mol 1.1

יחס ויטמין\חלבון במשקע

(µg-ויטמין ל mg חלבון(

(43mM משקלי )Mw~24kDa 1%)ריכוז החלבון )

עם החלבון1:1 כלומר ביחס מולרי Mw=396Da 43mM)) ריכוז הויטמין

בפני טיפול חוםD הגנה על ויטמין

Vitamin D Stability During Heating)740C for 20sec(

0

20

40

60

80

100

120

vit D in r-CM vit D in water

Rel

ativ

e vi

tam

in c

once

ntra

tion

)%(

before heatingafter heating

הגנה על הויטמין במשך חיי מדף בקירור

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20

Time at 40C )days(

Resi

dual

Vita

min

D

)% R

elat

ive

to T

ime

0(

vit D in r-CM

vit D in Tween 80emulssion

vit D in water

Linear )vit D in r-CM(

Linear )vit D inTween 80emulssion(Linear )vit D inwater(

ויטמין D.נקשר היטב לקזאין בתמיסה מימית פותח תהליך תעשייתי חדשני לאנקפסולציה של חומרים

נוטרסאוטיים במיצלות קזאין – ע"י המגון בלחץ אולטרא גבוה.

הושגה הגנה לחומר הפעיל כנגד UV חימום ובאחסון ,בקירור.

חלב שיועשר במיצלות קזאין מועשרות כאלה בכמות של מהקצובה היומית 1/3 מהקזאין כולו, יספק 0.002%

המומלצת של הויטמין בכוס חלב אחת!

מסקנות משלבי המחקר הקודמים

:מטרת המחקר הנוכחי

במיצלות קזאין, לזמינות Dלהשוות זמינות של ויטמין בתכשיר רפואי סטנדרטי.Dויטמין

השערת העבודה

אנקפסולציה במ"ק עשויה לשפר את זמינות D :ויטמין

הגודל הננוסקופי ושטח הפנים העצום )לגרם( של מ"ק המבנה הפרוש של הקזאינים, שהתפתח אבולוציונית

להיות נגיש וקל לפרוטאוליזה במערכת העיכול

שעבר D צפויים לסייע לזמינות ויטמין . ננואנקפסולציה בתוך מ"ק

תוכנית המחקר 3 אנקפסולציה של ויטמיןD.במ"ק תבוצע בשיטה שפותחה :שעברו בדיקה 18-65 מבוגרים בריאים בגילאי 105 ניסוי קליני

קבוצות: 3רפואית לאישור התאמתם לניסוי יחולקו אקראית ל- מ"ל( עם 250 שומן )0% קבוצה א': כל נבדק יקבל כוס חלב

במיצלות קזאין.D3 יחב"ל ויטמין 50,000 3 יחב"ל ויטמין 50,000 קבוצה ב': כל נבדק יקבלD בתרחיף

מימי סטנדרטי שומן ללא העשרה 0% קבוצה ג': כל נבדק יקבל כוס חלב

.)אינבו( 28 ו- 14, 7, 1 ילקחו דגימות דם לפני נטילת התכשיר, וכן לאחר

ימים. 25 רמת(OH)D-בסרום תיבדק ב ELISA .

ממצאים צפויים באופן אופטימאלי, אנו מקוים שהזמינות של הויטמין

במיצלות הקזאין תהיה גבוהה מזו של הויטמין בתכשיר בהשוואה 60%הרפואי, אם כי גם זמינות של מעל

לתכשיר הרפואי תחשב לתוצאה טובה, שכן כאמור לננוקפסולות ייתרונות רבים, כגון ייצוב, פיזור אחיד, והגנה בפני חום וקרינה, והן עשויות חומרים טבעיים בלבד. )ניתן יהיה לפצות על זמינות מופחתת מעט ע"י הגברת המינון.(

בכוונתנו לערוך מחקר המשך )אולי בשת"פ עם התעשייה( בו תושווה הזמינות של הויטמין במיצלות

הקזאין לזמינותו בשיטות העשרה קיימות במוצרים עם (.1%שומן )למשל חלב

חשיבות המחקרוהשלכות אפשריות לרפואה

שיטת אנקפסולציה חדשנית זו מאפשרת לייצב חומרים נוטרסאוטיים הידרופוביים בסביבה מימית,

בפרט במוצרים חסרי שומן, להגן עליהם במהלך ייצור המוצר וחיי המדף שלו ולשפר את אחידות פיזורם על

פני מנות גדולות של מוצרים נוזליים לצורך מניעת 3Dהרעלות שנגרמו בעבר עקב פיזור לקוי של ויטמין

ננואנקפסולציה של נוטרסאוטיים ותרופות במ"ק עשויה להוות כלי טבעי ואפקטיבי לייצוב, הגנה, ושיפור

עשויה Dהזמינות. העשרת מזונות בדרך זו בויטמין לסייע במלחמה בתופעות החסר באוכלוסיה המודרנית

שאינה נחשפת כמעט לשמש מחשש למלנומה.

תודות:לסטודנטים שלי שעשו את העבודה המוקדמת

אפרת סמודינה קנוךפטריסיה סימט

שמימנהGIFלקרן את המחקר המוקדם

למועצת החלב ולמשרד הבריאותוכמובן- על מענק עבור המחקר הנוכחי!

דר' יואב ליבניהמעבדה לביופולימרים וננוטכנולוגיה

של מזוןהפקולטה להנדסת ביוטכנולוגיה ומזון

04-829-4225טל: livney@technion.ac.ilאימייל:

פרופ' צופיה איש-שלוםמרכז רפואי רמב"ם, היחידה

למטבוליזם העצם והמינרלים

והפקולטה לרפואה, הטכניון מכון טכנולוגי לישראל

References DeKruif, C.G., and Holt, C., Casein micelle structure,

functions and interactions. In: P.F. Fox and P.L.H. McSweeney, Editors, Advanced dairy chemistry-1 proteins part A, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2003), pp. 233–276.

Fox, P.F., Milk proteins: General and historical aspects. In: P.F. Fox and P.L.H. McSweeney, Editors, Advanced dairy chemistry-1 proteins part A, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2003), pp. 1–48.

Eitenmiller, R.R., and Landen, W.O. Jr., Vitamin D, Vitamin analysis for the health and food science, CRC Press, Boca Raton, FL (1999), pp. 77–82.

Semo, E., Kesselman, E., Danino, D., Livney, Y.D., Casein micelle as a natural nano-capsular vehicle for nutraceuticals, Food Hydrocolloids (2006)

Cogan, U., Kopelman, M., Mokady, S., Shinitzky, M., Binding affinities of retinol and related compounds to retinol binding proteins, European Journal of Biochemistry. 65, 71-78 (1976)

Vitamin D

• Over 40 known metabolites of vitamin D.

• D2 originates from plants, and can be found in nature in limited amounts.

• D3 originate form animal sources )e.g. cod fish liver oil(