| Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het

Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie |

Erasmushogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur

Laarbeeklaan 121 | B-1090 Jette | t +32 (0)2 472 52 00 | [email protected] | www.erasmushogeschool.be

Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen

Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.

| Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie (MLT)|

Wilke Vandensande

Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx

Labo Hematologie Militair Hospitaal Koningin Astrid (MHKA) Neder-Over-Heembeek

Departement Gezondheidszorg

Academiejaar 2013-2014

Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie |

Erasmushogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur

Laarbeeklaan 121 | B-1090 Jette | t +32 (0)2 472 52 00 | [email protected] | www.erasmushogeschool.be

Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen

Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.

| Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie (MLT)|

Wilke Vandensande

Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx

Labo Hematologie Militair Hospitaal Koningin Astrid (MHKA) Neder-Over-Heembeek

Departement Gezondheidszorg

Academiejaar 2013-2014

Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.

WILKE VANDENSANDE 2013-2014 I | P a g i n a

VOORWOORD

Ik zou graag mijn dankwoord willen uiten aan geneesheer Kolonel Neirinckx, directeur

van het Militair Hospitaal Koningin Astrid voor de mogelijkheid en de toestemming om in

het bioklinisch laboratorium een eindwerkstage te mogen uitvoeren.

Mijn promotor Klinisch Bioloog Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx zou ik willen bedanken

voor de mogelijkheid om een eindwerkstage te mogen uitvoeren in het bioklinisch

laboratorium onder zijn begeleiding en steun, maar ook omwille van het vertrouwen in mij.

Vervolgens wil ik Klinisch Biologe Apr. Van Haute bedanken voor de begeleiding, maar ook

voor de kennis en expertise die ze met mij wou delen. Tevens wil ik ook Christa Van de Ven

bedanken voor de goede opvang, de technische uitleg en de begeleiding bij het uitvoeren

van dit eindwerk, maar ook alle laboranten van het laboratorium voor het goed ontvangst,

uitleg, aangename sfeer en het vertrouwen om mij gedurende deze periode zelfstandig te

laten werken.

Graag had ik ook mijn dankwoord geuit aan Marjan Van Esbroeck en Anne-Marie Feyens van

het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor het uitwisselen van

malariapositieve monsters, de hulp en informatie gedurende deze stage. Ik apprecieer ook

de hulp van Anne Demulder van het UVC Brugmann om bereid te zijn malariapositieve

monsters uit te wisselen.

Ook mijn dank aan An Vermoesen en Lobke Tremmerie van de firma ANALIS voor de

opleiding, hulp en informatie van het toestel UniCel DxH800.

Mijn dankwoord gaat ook uit naar Apr. Dorien Van den Bossche voor het contact met het ITG

en de hulp gedurende deze periode.

Mevrouw Brisaert, Mevrouw Crabbe en Mevrouw Roelandt zou ik tevens ook willen

bedanken voor hun tussentijdse opvolging en hulp tijdens dit eindwerk.


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 II | P a g i n a

ORGANIGRAM

Klinisch laboratorium Militair Hospitaal Koninging Astrid (MHKA)

(Klinisch Bioloog Apotheker Luitenant-kolonel Heuninckx)

Pre- en postanalytische diensten Analytische diensten

Labo Hematologie

Labo Biochemie

Labo Bacteriologie

Labo Serologie

Labo Toxicologie

Labo Urine

Wachtpersoneel

Quality Manager Klinisch Bioloog

(Apotheker Luitenant-kolonel Heuninckx)

Adjunct Klinisch Biologen (Apotheker Luitenant-kolonel (res) Van Haute

Apotheker Kapitein (res) Hing)


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 III | P a g i n a

INHOUDSTAFEL

VOORWOORD ...................................................................................................................... I

ORGANIGRAM ..................................................................................................................... II

INHOUDSTAFEL .................................................................................................................. III

FIGURENLIJST ................................................................................................................... VI

TABELLENIJST ................................................................................................................... IX

LIJST AFKORTINGEN ........................................................................................................... XI

SAMENVATTING ................................................................................................................ XII

ABSTRACT ....................................................................................................................... XIII

I. INLEIDING ................................................................................................................ 1

II. PROBLEEMSTELLING ............................................................................................... 2

III. PROEFOPSTELLING ................................................................................................. 3

IV. THEORIE ................................................................................................................ 4

1. ACHTERGROND ................................................................................................... 4

1.1. MALARIA .................................................................................................... 4

1.2. MALARIA IN BELGIË ..................................................................................... 4

1.1. PARASIET ................................................................................................... 5

1.1.1. ASEKSUELE CYCLUS IN DE MENS ............................................................... 5

1.1.2. SEKSUELE CYCLUS IN DE ANOPHELES MUG ................................................ 6

1.2. IMMUNITEIT ............................................................................................... 6

1.3. THERAPIE ................................................................................................... 7

1.3.1. PROFYLAXIE ............................................................................................ 7

1.3.2. BEHANDELING ......................................................................................... 8

1.4. RESISTENTIE .............................................................................................. 8

1.5. RECIDIVITEIT ............................................................................................. 9

1.6. SYMPTOMEN ............................................................................................... 9

1.7. KLINISCHE VERSCHIJNSELEN ....................................................................... 9

1.7.1. HEMATOLOGIE ......................................................................................... 9

1.7.2. BIOCHEMIE ............................................................................................. 9

1.8. DIAGNOSE ................................................................................................. 10

1.8.1. MICROSCOPIE ........................................................................................ 10

1.8.2. IMMUNOCHROMATOGRAFIE (SNELTEST) .................................................... 10

1.8.2.1. HRP-2 ................................................................................................ 10

1.8.2.2. PLDH ................................................................................................. 10

1.8.3. SEROLOGIE ............................................................................................ 11

1.8.4. MOLECULAIRE TECHNIEKEN ..................................................................... 11

1.8.5. HEMATOLOGISCHE ANALYSERS ................................................................ 11

2. LITERATUUR ...................................................................................................... 12

V. EXPERIMENTEN ..................................................................................................... 20

1. BECKMAN COULTER UNICEL DXH 800 .................................................................. 20

1.1. MATERIAAL EN METHODEN .......................................................................... 20

1.1.1. APPARATUUR .......................................................................................... 20

1.1.2. MONSTER ............................................................................................... 20


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 IV | P a g i n a

1.1.3. MEETPRINCIPES ...................................................................................... 20

1.1.3.1. COMPLETE CLOOD COUNT (COULTER PRINCIPE) ..................................... 21

1.1.3.2. HEMOGLOBINE (SPECTROFOTOMETRISCH PRINCIPE) ............................. 23

1.1.3.3. DIFFERENTIATIE (VCS PRINCIPE) ......................................................... 23

1.1.3.3.1. VOLUME ....................................................................................... 24

1.1.3.3.2. CONDUCTIVITEIT .......................................................................... 24

1.1.3.3.3. LICHTVERSTROOIING .................................................................... 25

1.1.3.3.4. MTM ............................................................................................ 25

1.1.3.4. NRBC (VCS METHODE) ........................................................................ 26

1.1.4. REAGENTIA ............................................................................................ 26

1.1.4.1. DXH DILUENT ..................................................................................... 26

1.1.4.2. DXH CELL LYSE ................................................................................... 26

1.1.4.3. DXH DIFF PACK .................................................................................. 26

1.1.4.4. DXH CLEANER .................................................................................... 26

1.1.5. RAPPORTERING ...................................................................................... 27

1.1.5.1. CBC EN DIFFERENTIATIE ..................................................................... 27

1.1.5.2. FLAGS ............................................................................................... 27

1.1.5.3. SUPPLEMENTAIRE DATA ....................................................................... 28

1.1.5.4. HISTOGRAM ....................................................................................... 29

1.1.5.5. 2D-DATAPLOTS ................................................................................... 29

1.1.5.6. 3D-DATAPLOTS ................................................................................... 31

1.1.5.7. SURFACE-PLOTS ................................................................................. 31

1.1.5.8. CODES ............................................................................................... 32

1.1.5.9. SUSPECT/SYSTEM/DEFINITIVE MESSAGES ............................................. 32

1.1.6. PROEFOPSTELLING .................................................................................. 32

1.1.7. METHODE ............................................................................................... 33

1.1.7.1. MONSTERAFNAME ............................................................................... 33

1.1.7.2. CONTROLES ....................................................................................... 33

1.1.7.3. ANALYSE OP UNICEL DXH 800 .............................................................. 33

1.1.7.4. STATISTIEK ........................................................................................ 34

1.2. RESULTATEN .............................................................................................. 34

1.2.1. PARAMETERS PER GROEP ......................................................................... 35

1.2.1.1. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP (NORMAAL) ............................... 35

1.2.1.2. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP (MALARIA) ................................. 35

1.2.1.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE ................... 36

1.2.1.4. GROEP TERUGKERENDE MILITAIREN VAN BUITENLANDSE MISSIE ............ 36

1.2.2. MALARIA DISCRIMINANT FACTOR ............................................................. 37

1.2.3. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME LYMFOCYTEN .......................... 38

1.2.4. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME MONOCYTEN ........................... 39

1.2.5. BLOEDPLAATJES ..................................................................................... 40

1.2.6. HISTOGRAM ........................................................................................... 41

1.2.7. DATAPLOTS ............................................................................................ 42

1.2.7.1. 5PD1 ................................................................................................. 42

1.2.7.2. NRBC1 ............................................................................................... 44


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 V | P a g i n a

1.2.8. SENSITIVITEIT / SPECIFICITEIT / CUTT-OFF WAARDE ................................. 46

1.3. DISCUSSIE ................................................................................................ 47

2. SNELTEST (SD P.F./PAN) ..................................................................................... 49


2.1.1. APPARATUUR .......................................................................................... 49

2.1.2. MONSTER ............................................................................................... 49

2.1.3. MEETPRINCIPE ........................................................................................ 49

2.1.4. PROCEDURE ........................................................................................... 51

2.2. RESULTATEN .............................................................................................. 52

2.2.1. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP ...................................................... 52

2.2.2. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP ..................................................... 53

2.2.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE ....................... 53

2.2.4. GROEP MILITAIREN TERUGKEREND VAN BUITENLANDSE MISSIE .................. 53

2.3. CONCLUSIE ............................................................................................... 54

3. MICROSCOPIE .................................................................................................... 55


3.1.1. APPARATUUR .......................................................................................... 55

3.1.2. REAGENTIA ............................................................................................ 55

3.1.3. PRINCIPE ............................................................................................... 55

3.1.3.1. BLOEDUITSTRIJKJE ............................................................................. 55

3.1.3.1. DIKDRUPPEL ...................................................................................... 56

3.1.3.2. MAY GRÜNWALD GIEMSA ..................................................................... 56

3.1.3.3. GIEMSA ............................................................................................. 57

3.1.4. PROCEDURE ........................................................................................... 57

3.1.4.1. BLOEDUITSTRIJKJE MET MAY GRÜNWALD GIEMSA KLEURING .................. 57

3.1.4.2. DIKDRUPPEL ...................................................................................... 57

3.1.4.3. MICROSCOPIE .................................................................................... 58

3.2. RESULTATEN .............................................................................................. 60

3.3. CONCLUSIE ............................................................................................... 61

VI. CONCLUSIE ........................................................................................................... 62

VII. DISCUSSIE ........................................................................................................... 64

VIII. REFERENTIES ..................................................................................................... 65

IX. APPENDIX ............................................................................................................. 69

X. BIJLAGE ................................................................................................................ 87


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 VI | P a g i n a

FIGURENLIJST

Figuur 1: Proefopstelling studie .............................................................................................................. 3

Figuur 2: Plasmodium species verdeling van 210 malariagevallen in België in 2005 (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007).................................................. 4

Figuur 3: VCS-data (V: volume, C: conductiviteit, S: scattering) met het gemiddelde (Mean) en de standaarddeviatie (SD) van de populatie witte bloedcellen (NE: neutrofielen, LY: lymfocyten, MO: monocyten en EO: eosinofielen) na telling en differentiatie op de UniCel DxH 800. Links de VCS-data van een persoon in goede gezondheid. Rechts de VCS-data van een persoon met een malaria-infectie die een duidelijk hoger gemiddeld volume en een grotere standaarddeviatie van de monocyten en lymfocyten weergeeft. (Briggs et al., 2006) ................................................................................................................................................. 12

Figuur 4: Histogram van de witte bloedcellen met op de x-as de grootte of volume (fL) en op de y-as de celfrequentie. Links een histogram van een persoon in goede gezondheid en rechts van een persoon met een malaria-infectie met een extra piek voor de drempelwaarde van 35 fL. (Briggs et al., 2006) ......................... 13

Figuur 5: 2D-dataplot van de bloedcepopulaties met op de x-as de lichtverstrooiing en op de y-as het volume. Links een persoon in goede gezondheid met een goede scheiding in de celpopulaties en een geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. Rechts een persoon met een malaria-infectie met geen goede scheiding tussen de celpopulaties en een heterogene minder geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. (Briggs et al., 2006) ............................................................................................................................ 13

Figuur 6: ROC-analyse voor de malariafactor. Een cut-off waarde of grenswaarde van 3,7 vertoont een sensitiveit van 98% en een specificiteit van 94%. Een lagere cut-off waarde resulteert in een lagere specificiteit, een hogere factor in een lagere sensitiviteit. (Briggs et al., 2006) ............................................ 14

Figuur 7: NRBC 2D-plot (y-as RLALS, x-as AL2) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn groen, NRBC-signalen rood en de WBC signalen blauw. (Lee at al, 2012) ................................................... 15

Figuur 9: NRBC 2D-plots van een patiënt met P.vivax-infectie. Links de dataplot op dag 0 van de behandeling, in het midden de dataplot na 2 dagen behandeling en rechts de dataplot na 12 dagen behandeling. Naarmate de parasitemie afneemt, neemt ook het aantal malariasignalen af. (Lee at al, 2012) .................................... 16

Figuur 8: Differentiatie 2D-plot (y-as volume, x-as RLS) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn rood (inclusief rode bloedcellen, neutrofielen zijn roze, de blauwe signalen zijn lymfocyten , de groene signalen zijn monocyten , de gele signalen zijn eosinofielen en de witte signalen zijn basofielen. (Lee at al, 2012) ........................................................................................................................................ 16

Figuur 10: De 2D-dataplots en WBC-histogrammen van een normaal bloedmonster (links) en een bloedmonster met een malaria-infectie (rechts). De dataplot van malaria toont een extra populatie aan onder de populatie lymfocyten en een extra populatie (piek voor 35 fL grenswaarde) voor de lymfocyten op het histogram. (Simon-Lopez, 2013) ........................................................................................................... 17

Figuur 11: ROC-analyse van de malariafactor toont een cutt-off waarde van 5,06 met een sensitiviteit van 69,9% en een specificiteit van 82,5%. (Simon-Lopez, 2013) ..................................................................... 18

Figuur 12: Herhaalbaarheid. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters na elke run. Voor de lymfocyten is de gemiddelde variatiecoëfficiënt 4,4% en voor de monocyten 5,5%.(Simon-Lopez, 2013) ................................................................................................................... 19

Figuur 13: De invloed van de leeftijd van het monster op de SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters gedurende een tijdspanne van 77u. Het monster is stabiel voor deze parameter gedurende 11 uur na de bloedafname. (Simon-Lopez, 2013) ........................................................................................................................... 19

Figuur 14: Coulter-methode in de Beckman Coulter DxH voor de celtelling van bloedcellen in een bloedmonster (Beckman Coulter Ireland, 2013) ........................................................................................................... 22

Figuur 15: Meting van het volume in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) ......................................... 24

Figuur 16: Meting van de conductiviteit in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) .................................. 24

Figuur 17: Lichtverstrooiing meting in de MTM, simultaan met de meting van volume en conductiviteit (Beckman Coulter Ireland, 2013) ........................................................................................................... 24

Figuur 18: Meting van het volume door gelijkstroom (DC) impedantie in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) ................................................................................................................................................. 24

Figuur 19: Meting van de intracellulaire inhoud van de cel door radiofrequentie (RF) impedantie in de MTM. . 24

Figuur 20: Multitransducermodule (MTM) in de UniCel DxH 800 die gebruikt wordt voor de meting van volume, conductiviteit en lichverstrooiing of scattering (VCS technologie). De onderdelen van deze module worden uitgelegd in tabel 7 en 8. (Beckman Coulter Ireland, 2013)....................................................................... 25

Figuur 21: ‘Patient Results’ scherm die de rapportering van de resultaten (grijze kaders) weergeeft van een bloedmonster na een ‘complete blood count’ (CBC) en een differentiatie. ................................................... 27


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 VII | P a g i n a

Figuur 22: Supplementaire data van de differentiatie (DIFF) geeft voor elke meting (volume, conductiviteit en lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD) weergegeven. ....... 28

Figuur 23: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie. ...................................................................................................................................... 29

Figuur 24: Histogram van de rode bloedcellen (RBC) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie. ...................................................................................................................................... 29

Figuur 25: Histogram van de bloedplaatjes (PLT) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie. ...................................................................................................................................... 29

Figuur 26: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie en de situering van de populaties witte bloedcellen op de x-as. (Beckman Coulter Ireland, 2013) ......................................................................................................................................................... 29

Figuur 27: Celpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weergegeven op de 2D-dataplots na differentiatie. Links de 5PD1-dataplot met op de x-as de ‘rotated light scattering’ (RLS) en op de y-as het volume (V). Rechts de 5PD2 dataplot met op de x-as het de ondoorzichtigheid (OP) en op de y-as het volume (V). ................................. 30

Figuur 28: Celpopulaties nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) weergegeven op de 2D-dataplot na differentiatie. Links de NRBC1-dataplot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de ‘rotated light angle scatter’ (RLALS). Rechts de NRBC2-dataplot met op de x-as het volume (RUMALS) en op de y-as het doorgelaten licht (ALS2). ............................................. 30

Figuur 29: 3D-dataplot met de assen volume, lichtverstrooiing en het doorgelaten licht geeft de elpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weer. ............................................................................................................... 31

Figuur 30: Surface-plot van de 5PD1-plot met op de x-as de ‘rotated light scattering’ (RLS) en op de y-as het volume (V). Lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) ..................................................................................................... 31

Figuur 31: Surface-plot van de NRBC1-plot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de ‘rotated light angle scatter’ (RLALS). Nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) ............................................................................................................................... 31

Figuur 32: Boxplot voor de evaluatie van de malaria discriminant factor met n= het aantal monsters. .......... 37

Figuur 33: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters. ................................................................................................................ 38

Figuur 34: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters. ................................................................................................................ 39

Figuur 35: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van de bloedplaatjes met n= het aantal monsters. ..... 40

Figuur 36: WBC-histogrammen van de malaria positieve monsters. Histogrammen A, B, D en E vertonen geen mooie afgescheiden piek op de 35 fL genswaarde. Het begin van een extra piek of populatie is zichtbaar ter hoogte van de 35 fL grenswaarde. ......................................................................................................... 41

Figuur 37: WBC-histogrammen van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Histogrammen A t.e.m.H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en histogrammen I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. Deze histogrammen vertonen geen extra piek voor de 35 fL grenswaarde .......................................................... 41

Figuur 38: Differentiatie 5PD1-dataplot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden en persoon in goede gezondheid). .............................................................................................................. 42

Figuur 39: Differentiatie 5PD1-dataplots van malaria positieve monsters. ................................................. 43

Figuur 40: Differentiatie 5PD1-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. .................... 43

Figuur 41: NRBC1 data-plot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden). .................. 44

Figuur 42: NRBC-dataplots van malaria positieve monsters. .................................................................... 45

Figuur 43: NRBC-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. ................................ 45

Figuur 44: ROC-analyse van de malaria disciminant factor geeft een ideale cut-off waarde van 5,0 op basis van de data in deze studie. ......................................................................................................................... 46

Figuur 45: Immunochromatografisch principe voor de malariadetectie van de SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan sneltest (World Health Organization, 1999) .................................................................................. 50

Figuur 46: Werkwijze voor de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) .................................. 51


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 VIII | P a g i n a

Figuur 47: Een P.ovale trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ........................................................................................................... 61

Figuur 48: Een P.ovale geparasiteerde rode bloedcel met meerdere trofozoïeten (polyparasitisme, zeldzaam) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop . 61

Figuur 49: Een P.ovale schizont die op uitbarsten staat in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ..................................................................... 61

Figuur 50: Een P.falciparum trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ........................................................................................... 61

Figuur 51: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ..................................................................... 61

Figuur 52: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ..................................................................... 61

Figuur 53: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) op de dag van diagnose ........................................................................................... 78

Figuur 54: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) vier dagen na de dag van diagnose en na behandeling met chloroquine. ........................ 78

Figuur 55: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een abnormale verdeling en een extra populatie op de 35 fL volume grenswaarde (hoge celfrequentie). .......................................................................................... 79

Figuur 56: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een goede verdeling en geen extra populatie op de 35 fL volume grenswaarde. ........................................................................................................................... 79

Figuur 57: NRBC dataplot van een militair met een P.ovale infectie vertoont een groene extra populatie links onderaan. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw. ................................... 80

Figuur 58: NRBC dataplot van de militair met een P.ovale infectie na 4 dagen behandeling met chloroquine. De groene extra populatie is verdwenen. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw. ......................................................................................................................................................... 80

Figuur 59: NRBC surface plot van een militair met een P.ovale infectie vertoont een groene extra populatie links onderaan. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw. ............................ 80

Figuur 60: NRBC dataplot van de militair met een P.ovale infectie na 4 dagen behandeling met chloroquine. De groene extra populatie is verdwenen. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw ......................................................................................................................................................... 80

Figuur 61: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de malaria discriminant factor. ...................................... 83

Figuur 62: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V monocyten ..................................................... 83

Figuur 63: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V lymfocyten...................................................... 83

Figuur 64: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ....................................................................... 84

Figuur 65: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ...................................................................................... 84

Figuur 66: De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname)................................................................. 84

Figuur 67 : De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ....................................................................... 84

Figuur 68: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ............................................... 85

Figuur 69: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ....................................................................... 85

Figuur 70: Correlatie malaria discriminant factor met de standaarddeviatie van de lymfocyten. ................... 86

Figuur 71: Correlatie malaria discriminant factor met de standaarddeviatie van de monocyten . .................. 86

Figuur 72: Correlatie SD V lymfocyten met SD V monocyten3 .................................................................. 86

Figuur 73: Correlatie bloedplaatjes met de malaria discriminant factor ..................................................... 86

Figuur 74: Stadia van de P.falciparum parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-18: Trofozoïeten (2-10 ringstadia); 19-26: Schizonten; 27-28: Vrouwelijke gametocyten (macrogametocyten); 29-30 Mannelijke gametocyten (microgametocyten). ........................................................................................................ 88

Figuur 75: Stadia van de P.ovale parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-5: Jonge trofozoïeten (ringstadia); 6-15: Trofozoïeten; 16-13: Schizonten; 24: Vrouwelijke gametocyt ; 25: Mannelijke gametocyt. ..................... 90


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 IX | P a g i n a

TABELLENIJST

Tabel 1: Parameters op de UniCel DxH 800 die gebruikt werden in deze studie. ........................................... 3

Tabel 2: Malariaprofylaxe (www.itg.be, 2010) .......................................................................................... 8

Tabel 3: Behandeling malaria aanval (www.itg.be, 2010) .......................................................................... 8

Tabel 4: Significante verschillen tussen de malaria positieve en malaria negatieve groep na een Wilcoxon rank test. (Simon-Lopez, 2013) .................................................................................................................... 18

Tabel 5: Beschrijving, eenheid en meetprincipe per parameter bij analyse op de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) .......................................................................................................................... 20

Tabel 6: Baden voor het mengen van reagens met monster in de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) ................................................................................................................................................. 22

Tabel 7: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die het volume en de conductiviteit meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) .......................................................................................................................... 25

Tabel 8: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die de lichtverstrooiing meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) ..................................................................................................................................... 26

Tabel 9: Flags bij de rapportering van de resultaten (UniCel DxH 800) (Beckman Coulter Ireland, 2013) ....... 28

Tabel 10: Codes op de UniCel DxH800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) ................................................... 32

Tabel 11: Parameters op de Beckman Coulter DxH80 die in deze studie worden geëvalueerd. ...................... 32

Tabel 12: Het aantal monsters met een malariafactor hoger dan 4,5 en lager dan 4,5 per groep na analyse op de UniCel DxH 800............................................................................................................................... 34

Tabel 13: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria negatieve controlegroep. ............................................................... 35

Tabel 14: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria positieve controlegroep.................................................................. 35

Tabel 15: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie. ...................................... 36

Tabel 16: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. ................................ 36

Tabel 17: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de malaria discriminant factor .... 37

Tabel 18: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten). ......................................................................................................... 38

Tabel 19: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten). ......................................................................................................... 39

Tabel 20: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de bloedplaatjes....................... 40

Tabel 21: Sensitiviteit/specificiteit malaria discriminant factor berekend op de resultaten van de monsters uit de vier groepen (positieve controlegroep, negatieve controlegroep, groep terugkerende militairen van buitenlandse missie en de groep patiënten met een infectie). .................................................................... 46

Tabel 22: Significante verschillen malaria discriminant factor (Malaria D factor). ........................................ 47

Tabel 23: Interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) ................................. 51

Tabel 24: Resultaten van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep. . 52

Tabel 25: Resultaten, foto’s en interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep. ....................................................................................................................... 52

Tabel 26: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria). ............................................................................................... 53

Tabel 27: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. ...................................................................................................................... 53

Tabel 28: Som van de resultaten SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. ............................................................................................................................ 54

Tabel 29: Resultaten, specificiteit en sensitiviteit van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. ...................................................................................... 54

Tabel 30: Resultaten van de microscopie (dikdruppel en bloeduitstrijkje). ................................................. 60


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 X | P a g i n a

Tabel 31: Het aantal geparasiteerde rode bloedcellen per µl (AP/µl), de Plasmodium species en de verschillende stadia dat werd vastgesteld bij elk monster in de malaria positieve controlegroep. ................... 60

Tabel 32: Vergelijking van de sneltest SD Biolone Malaria p.f./pan met de malaria discriminant factor op de UniCel DxH 800 en de ‘gouden standaard’ microscopie. ............................................................................ 63

Tabel 33: Beschrijvende statistiek van de malaria discriminant factor voor de vier groepen. ........................ 70

Tabel 34: T-test voor de vergelijking van de malaria discriminant factor tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). .......... 70

Tabel 35: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten) voor de vier groepen. .................................................................................................................................. 72

Tabel 36: T-test voor de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten)tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). ....................................................................................... 72

Tabel 37: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) voor de vier groepen. .................................................................................................................................. 74

Tabel 38: T-test voor de vergelijking van de van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). ............................................................................................................... 74

Tabel 39: Beschrijvende statistiek van de spreiding van de bloedplaatjes voor de vier groepen. ................... 76

Tabel 40: T-test voor de vergelijking van de van de bloedplaatjes tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). .............. 76

Tabel 41: De invloed van kamertemperatuur en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten) ......................................................................................................................................................... 81

Tabel 42: De invloed van koelkasttemperatuur (4°C) en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten) ........................................................................................................................................ 82

Tabel 43: Kenmerken P.falciparum (ITG) ............................................................................................... 87

Tabel 44: Kenmerken P.ovale (ITG) ...................................................................................................... 89


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 XI | P a g i n a

LIJST AFKORTINGEN

Afkorting Beschrijving Afkorting Beschrijving

# Absoluut aantal MCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration

µl microliter MCV Mean corpuscular volume

2D 2 dimensionaal Mean Gemiddelde

3SD 3 keer de standaarddeviatie MHKA Militair Hospitaal Koningin Astrid

5PD 5 scatterkanalen MLT Medische laboratoriumtechnologie

AL2 Axial light loss MO Monocyten

AP Aantal parasieten MPV Mean platelet volume

Apr. Apotheker MTM Multitransducermodule

AUC Area under the curve n Aantal

BA Basofielen NE Neutrofielen

CBC Complete blood count NRBC Genucleërde rode bloedcellen

CRP C-reactief proteïne p p-waarde

d.w.z. dit wil zeggen P. Plasmodium

DC Gelijkstroom P.f. Plasmodium falciparum

DIFF Differentiatie PCR Polymerase chain reaction

EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur pLDH parasiet- Lactaat dehydrogenase

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay PLT Platelet

EO Eosinofielen RBC Rode bloedcellen

fL Femtoliter RDT Rapid Diagnostic Test

HCT Hematocriet RDW Red cell distribution width

HGB Hemoglobine RDW-SD Red cell distribution width- standaarddeviatie

HIV HIV- infectie RF Radiofrequentie

HRP Histidine-rich-proteïne RLALS Rotated low angle light scatter

ID Identificatie RLS Rotate light scatter

ITG Instituut voor Tropische Geneeskunde SAM Sample aspiration module

LDH Lactaat dehydrogenase SD V Standaarddeviatie van het volume

LMALS Lower M axial light scatter SMS Slidemaker stainer

LY Lymfocyten t.o.v. ten opzichte van

m.b.v. met behulp van UMALS Upper M axial light scatter

MALS LMALS +UMALS V Volume

MCH Mean corpuscular hemoglobin VCS Volume Conductiviteit Scattering

Vsd Standaarddeviatie van het volume

WBC Witte bloedcellen

http://nl.wikipedia.org/wiki/Ethyleendiaminetetra-azijnzuur


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 XII | P a g i n a

SAMENVATTING

Malaria is een tropische ziekte die uitgezonden militairen in risicogebieden kan treffen. Er

is noodzaak naar een snelle diagnose wanneer er een vermoeden is van een malaria-

infectie om de juiste behandeling toe te passen. Een gecalculeerde malaria discriminant

factor ((standaarddeviatie volume lymfocyten * standaarddeviatie volume

monocyten)/100) op een automatische hematologische celteller (UniCel DxH 800) zou

een additionele test kunnen zijn om de aanwezigheid van een malaria-infectie aan te

tonen. De malaria dicriminant factor op de automatische celteller werd vergeleken met

de malaria antigen P.f./pan sneltest en de lichtmicroscopie als referentiemethode. Deze

studie heeft als doel vast te stellen of de factor kan worden toegepast in de routine van

het Militair Hospitaal Koningin Astrid. In deze studie werd gebruik gemaakt van een

negatieve controlegroep (296 monsters negatief voor malaria afkomstig van 296 gezonde

personen) en een positieve controlegroep (6 monsters van 6 patiënten die

gediagnosticeerd werden met malaria). Daarnaast werd gebruik gemaakt van 2 andere

groepen; 178 monsters afkomstig van 52 gehospitaliseerde patiënten met een infectie en

136 monsters afkomstig van 136 personen die terugkeerden van buitenlandse missie.

Er is een groot significant verschil tussen malaria negatieve monsters en malaria

positieve monster wanneer de malaria discriminant factor, SD V monocyten, SD V

lymfocyten en de bloedplaatjes werden vergeleken (**p<0.01). Echter kunnen andere

infecties ook een verhoogde malaria discriminant factor vertonen door de aanwezigheid

van grotere monocyten en lymfocyten als reactie op de infectie. De waarden van de

malaria discriminant factor, de SD V monocyten en de SD V lymfocyten bij enkele

monsters met een ‘valspositieve’ indicatie voor malaria kunnen de resultaten van deze

waarden bij de monsters met een ‘echt positieve’ malaria discriminant factor overlappen.

De overlapping is vooral op te merken bij de SD V monocyten en in mindere mate bij de

SD V monocyten. In deze studie is een cut-off waarde van 5,0 beter geschikt voor

malaria indicatie dan de gebruikte 4,5 cut-off waarde, omdat het aantal monsters met

een valspositieve indicatie voor malaria werd gereduceerd met ongeveer 48% en de

specificiteit steeg zonder een daling van de sensitiviteit.

Het witte bloedcellen- (WBC) histogram en de nucleated red blood cells (NRBC) dataplots

kunnen geraadpleegd worden wanneer een hoge malaria dicriminant factor wordt

aangegeven om eventuele malariasignalen op te merken. Echter is de NRBC dataplot

enkel nuttig om een indicatie te geven van een eventuele P.ovale-infectie.

De sneltest kan een tweede indicatie geven voor een malaria-infectie wanneer een hoge

malariafactor wordt aangegeven, maar de microscopie blijft de gouden standaard omwille

van de hoogste sensitiviteit en specificiteit in de routine laboratoria.


WILKE VANDENSANDE 2013-2014 XIII | P a g i n a

ABSTRACT

Malaria is a tropical disease that can affect military people on mission in high-risk areas.

There is need for a rapid diagnosis when there is a suspicion of malaria infection to apply

the appropriate treatment. A malaria calculated discriminant factor ((standard deviation

volume lymphocytes * standard deviation volume monocytes)/100) to an automatic

hematology cell counter (UniCel DxH 800) may be an additional test in order to detect

the presence of a malaria infection, but the specificity of this parameter is uncertain. The

factor in the automatic cell counter was compared with the malaria antigen P.f./pan

sneltest test (RDT) and light microscopy as the reference method. This study aims to

determine whether the factor can be used in the routine of the Military Hospital Royal

Astrid. In this study, a negative control group consisted 296 samples negative for malaria

from 296 healthy individuals and a positive control group consisted 6 samples from 6

patients who were diagnosed with malaria. In addition two groups were examined in the

same way as the positive and the nagative control group; the first group consisted 178

samples from 52 hospitalized patients with an infection and the second group consisted

136 samples form military people who were returning from a mission abroad.

There is a significant difference between the malaria negative samples and malaria

positive samples when the malaria discriminant factor, SD V monocytes, SD V

lymphocytes, and platelets were compared (** p < 0.01). However, other infections may

also have an increased malaria discriminant factor due to the effects of the presence of

larger monocytes and lymphocytes in response to the infection. The values of the malaria

discriminant factor, SD V monocytes and SD V lymphocytes in some samples with a

"false positive" indication for malaria had an overlap with these values in the samples

with a “real positive” indication for malaria. This overlap is particularly noticeable in the

SD V monocytes and to a lesser extent in the SD V monocytes. In this study, a cut-off

value of 5,0 for malaria indicaton was better than the 4.5 cut-off value wich was used in

this study, because the number of samples with a false positive indication for malaria

was reduced by approximately 48 % and specificity was increased without a decrease in

sensitivity.

The white blood cell (WBC) histogram and the nucleated red blood cells (NRBC) data plot

can be evaluated when a high malaria discriminant factor is been detected to notice

malaria signals. However, the NRBC dataplot is only useful to give an indication of a

possible P.ovale infection.

The rapid diagnostic test can provide a second indication of a malaria infection when a

high malaria discriminant factor is been detected but the microscopy remains the ‘gold

standard’ of its high sensitivity and specificity in routine laboratories.


WILKE VANDENSANDE 1 | P a g i n a

I. INLEIDING

Het Militair Hospitaal Koningin Astrid is een hospitaal dat de medische bijstand voorziet

van de Belgische militairen. Een aantal van deze militairen wordt onderzocht alvorens ze

op missie vertrekken en bij terugkeer van missie. De overige monsters zijn afkomstig

van militairen die een medische keuring ondergaan. Deze monsters kunnen zowel

afkomstig zijn van kandidaten als van huidig militair personeel. Daarnaast beschikt het

hospitaal over een brandwondencentrum en een hospitalisatieafdeling voor patiënten met

een infectie. Deze patiënten zijn gehospitaliseerd of komen op geregelde basis langs voor

hun nodige verzorging.

Het labo Hematologie onderzoekt interne bloedmonsters en externe bloedmonsters. De

interne bloedmonsters zijn afkomstig van militair personeel, patiënten die een onderzoek

ondergaan of van gehospitaliseerde patiënten. Externe monsters zijn afkomstig van

militair personeel op de verschillende legerbasissen in België. Onlangs werd een nieuw

hematologische automatische celteller (UniCel DxH 800) aangekocht om de celtelling en

de differentiatie van bloedmonsters te kunnen bepalen. Dit toestel biedt de mogelijkheid

om een malaria discriminant factor te laten bepalen op de monsters die door het toestel

onderzocht worden voor een differentiatie en een celtelling. Dit is een gecalculeerde

factor die afhankelijk is van de spreiding van het volume van de monocyten en de

spreiding van het volume van de lymfocyten in een bloedmonster. Hoe groter de

spreiding (SD: standaarddeviatie) van het volume tussen de monocyten en de spreiding

van het volume tussen de lymfocyten, hoe groter de waarde van de factor. Een hoge

factor zou wijzen op een vermoeden van een malariainfectie.

Deze bachelorproef begint met een korte samenvatting van de uitgevoerde studie.

Vervolgens wordt de algemene achtergrond van malaria geschetst gevolgd door een

literatuurstudie van de Beckman Coulter UniCel DxH800. In het experimenteel gedeelte

wordt het materiaal, de procedure, de resultaten en de discussie voor elke experiment in

deze studie weergegeven, gevolgd door de vergelijking met de bevindingen in de

literatuur. In de conlusie wordt de studie besproken aan de hand van de doelstellingen.



II. PROBLEEMSTELLING

Deze factor is interessant voor het Militair Hospitaal Koningin Astrid omdat dit de

mogelijkheid biedt om een malariaroutinescreening uit te voeren op bloedstalen

afkomstig van militair personeel die terugkeerden van malariarisicogebieden.

Er moet echter nagegaan worden of de gehospitaliseerde patiënten met een infectie ook

een verhoogde malaria discriminantfactor hebben. Wanneer dit het geval is, zullen een

groot aantal monsters een valspositieve indicatie voor malaria vertonen. Bovendien moet

worden nagegaan of de cut-off waarde van 4,5 voldoende sensitiviteit en specificiteit

biedt om malaria te detecteren.

Deze studie heeft als doel deze factor te bestuderen aan de hand van een groep

negatieve malaria monsters afkomstig van gezonde personen, een groep stalen

afkomstig van gehospitaliseerde patiënten met een infectie, een groep stalen afkomstig

van militairen die terugkeerden van buitenlandse missie en een groep stalen van malaria

positieve patiënten om vast te stellen of deze factor gebruikt kan worden in het

Hospitaal.



Malaria discriminant factor

>4,5

SD Bioline Malaria p.f./pan sneltest

Microscopie

Bloeduitstrijkje

Dikdruppel

III. PROEFOPSTELLING

Gedurende 12 dagen werden EDTA-volbloed

stalen van de malaria negatieve

controlegroep, de groep patiënten met een

infectie en de groep terugkerende militairen

van buitenlandse missie geanalyseerd op de

UniCel DxH 800. Van elk staal binnen de groep werden de resultaten van enkele

parameters bijgehouden (tabel 1). Wanneer een malaria factor hoger dan 4,5 door het

toestel werd berekend, werd een Malaria antigen P.f./pan sneltest uitgevoerd om een

eventuele malaria-infectie te kunnen bevestigen.

Tabel 1: Parameters op de UniCel DxH 800 die gebruikt werden in deze studie.

Complete blood count (CBC) Differentiatie Additionele gegevens

Rode bloedcellen count Neutrofielen SD V lymfocyten

Bloedplaatjes count Lymfocyten SD V monocyten

Witte bloedcellen count Monocyten Malaria discriminant factor

Eosinofielen

Basofielen

Van deze bloedmonsters werd ook een geautomatiseerd of manueel bloeduitstrijkje

gemaakt en gekleurd met May-Grünwald Giemsa door de Beckman Coulter SMS. Een

dikdruppel preparaat werd bereid en gekleurd met Giemsa. Beide werden onder de

lichtmicroscoop bekeken om na te gaan of er effectief sprake was van malaria. Indien er

Plasmodium-parasieten op te merken waren in het bloeduitstrijkje of in de dikdruppel,

werd een telling uitgevoerd om het aantal parasieten of het aantal geïnfecteerde RBC per

µl volbloed te bepalen. Vanaf er één parasiet in het bloeduitstrijkje of dikdruppel

aanwezig is, werd het monster als positief voor malaria bevonden, maar wel ter

confirmatie opgestuurd naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde. Stalen met een

malariafactor hoger of gelijk 4,5 met een negatieve sneltest, een negatieve dikdruppel en

een negatief bloeduitstrijkje werden als vals positief aangenomen. Stalen met een

malariafactor lager dan 4,5 met een negatieve sneltest, een negatieve dikdruppel en een

negatief bloeduitstrijkje werden als negatief aangenomen.

Vervolgens werd aangetoond of er een significant verschil is tussen de 4 groepen op vlak

van de malaria discriminant factor, de SD V lymfocyten, de SD V monocyten en de

bloedplaatjes door deze resultaten statistisch te verwerken in een boxplot en de

significante verschillen aan te tonen met een t-test. Een ROC-analyse werd uitgevoerd

om de ideale cut-off waarde in deze studie te bepalen.

Figuur 1: Proefopstelling studie



Malariagevallen gediagnosticeerd in België (2005) (n=210)

P.malariae

P.ovale

P.vivax

P.falciparum

IV. THEORIE

1. ACHTERGROND

1.1. MALARIA

Malaria is een parasitaire infectieziekte die overgedragen wordt door de Anopheles mug

die de vector is voor de protozoa van het geslacht Plasmodium. Er zijn een 146 tal

verschillende soorten Plasmodium die verschillende gastheren kunnen infecteren,

bijvoorbeeld mensen, apen, vogels, knaagdieren, enzovoort. Er zijn vier Plasmodium

species die de mens infecteren en malaria kunnen veroorzaken. P.falciparum kan

potentiëel dodelijk zijn omdat het zich kan ophopen in de bloedvaten van de hersenen.

(Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)

(Guillaume, 2009)

1.2. MALARIA IN BELGIË

Malaria treedt in België vooral op bij

patiënten die verbleven hebben in een

malaria risicogebied en daar een malaria-

infectie hebben opgelopen, hiervoor

gebruikt men de term importmalaria.

Vroeger kwam malaria wereldwijd voor,

maar de infectieziekte werd in Europa

uitgeroeid waardoor de infectiehaarden

verdwenen. Tot 2000 steegde de

‘importmalaria’ door de groei van migratie,

missies en reizen naar tropische streken.

Na 2000 was er een daling door het nemen

van van nieuwe profylaxe.

Malaria kan buiten de risicogebieden ook optreden in de omgeving van luchthavens, men

spreekt in deze gevallen over airportmalaria. De geïnfecteerde Anopheles mug kan

bijvoorbeeld meereizen in de bagageruimte van een vliegtuig of in containers vanuit de

malaria risicogebieden. Wanneer de mug de reis overleeft kan deze nog in staat zijn om

een mens te infecteren. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische

Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)

Figuur 2: Plasmodium species verdeling van 210

malariagevallen in België in 2005 (Instituut voor

Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van

LaboratoriumTechnologen, 2007)



In Europa werden 64 gevallen van airportmalaria vastgesteld tussen 1969 en 1996. In de zomer van 1995

werden zelfs 6 malariagevallen gedetecteerd in de luchthaven van Brussel bij personen die nooit in het

buitenland geweest waren, waarvan zelfs één met dodelijke afloop. Drie van deze patiënten waren personeel

van de luchthaven en de overige 3 patiënten waren bezoekers van de luchthaven. (Instituut voor Tropische

Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)

Malaria kan ook overgedragen worden via transplantatatie van organen (hart, nieren,

lever), via bloedtransfusie of per ongeluk door het personeel in de laboratoria en

zorginstellingen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van


1.1. PARASIET

Er zijn vier Plasmodium species die de mens infecteren en malaria kunnen veroorzaken;

P.falciparum, P.vivax, P.ovale en P.malariae. Meer info en afbeeldingen over deze

parasieten in ‘Bijlage 1: Plasmodium Falciparum’ en ‘bijlage 2: Plasmodium Ovale’

De cyclus bevat een seksuele cyclus (sporogenie) met vermenigvuldiging in bepaalde

Anopheles soorten en een aseksuele cyclus (schizogenie) met vermenigvuldiging in de

gewervelde gastheer. De levenscyclus is voor de vier species van Plasmodium

gelijkaardig met slechts enkele verschillen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische

Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009)

1.1.1. ASEKSUELE CYCLUS IN DE MENS

De besmette Anopheles mug steekt de mens en zuigt bloed op. Tijdens het steken

worden de sporozoïeten geïnjecteerd in de bloedstroom van de mens met een beetje

speeksel van de mug dat een anticoagulans bevat. De sporozoïeten in de bloedstroom

migreren naar de lever waar ze de levercellen (hepatocyten) binnen dringen waarin de

parasiet zich aseksueel zal vermenigvuldigen (schizogenie in de lever, pre-erytrocytaire

fase) tot een schizont ontstaat. Deze schizont leidt uiteindelijk tot duizenden merozoïten.

De fase in de lever is de incubatieperiode van de parasiet en verloopt asymptomatisch.

Uiteindelijk barst de levercel die de schizont bevat open waardoor al de merozoïeten

vrijkomen in de bloedbaan. Elke merozoït infecteert een rode bloedcel. Wanneer de

parasiet in de rode bloedcel zit, spreekt men van een trofozoïet. In de rode bloedcel zal

de parasiet zich opnieuw vermenigvuldigen tot een schizont (schizogenie in de rode

bloedcel, erytrocytaire fase). Deze schizont voedt zich met het hemoglobine in de rode

bloedcel wat leidt tot het metabolisatieproduct hemozoïne. Dit hemozoïne bestaat

voornamelijk uit ijzercomponenten en toont zich onder de vorm van een pigment. Op het

einde van de vermenigvuldiging barst ook hier de schizont open en komen de

merozoïeten vrij die opnieuw nieuwe rode bloedcellen kunnen infecteren, wat gepaard

gaat met symptomen (koortsige aanvallen).



Sommige leverschizonten kunnen blijven voortbestaan in de levercellen tot jaren na de

infectie, namelijk hypnozoïeten. Hypnozoïeten worden alleen teruggevonden bij P.ovale

en P.vivax. Hypnozoïeten kunnen de oorzaak zijn van een nieuwe malaria aanval tot zelfs

jaren nadat de persoon teruggekeerd is uit de streek waar hij besmet raakte. Na de

verschillende cycli in de rode bloedcellen zullen sommige parasieten zich differentiëren in

seksuele vormen, namelijk gametocyten. Wanneer een Anopheles mug deze persoon

terug steekt zal de mug deze gametocyten opnemen. Deze mug is de vector waarin de

seksuele cyclus van de parasiet plaats vindt. Gametocyten geven geen symptomen bij de

geïnfecteerde personen. Deze kunnen zelfs tot meerdere dagen of weken na de

behandeling teruggevonden worden in het perifere bloed omdat deze niet gevoelig zijn

aan de behandeling. Door de opeenvolging van de erytrocytaire cycli zal de parasitemie

zich steeds verhogen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van

LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009) (World Health Organization, 1999)

1.1.2. SEKSUELE CYCLUS IN DE ANOPHELES MUG

Er zijn 60 soorten Anopheles muggen die een belangrijke vector zijn voor malaria.

Aangezien enkel de vrouwelijke muggen een bloedmaaltijd nemen, komen ook enkel

deze muggen in aanmerking voor de overdracht van malaria. Wanneer de vrouwelijke

Anopheles mug een bloedmaaltijd neemt bij een mens met malaria, zuigt deze zowel de

aseksuele vormen op als de gametocyten. Enkel de gametocyten overleven de vertering

in de mug en kunnen zich verder ontwikkelen. Mannelijke gameten delen zich in

gameten die de vrouwelijke gameten kunnen bevruchten wat tot het voortbrengen van

zygoten leidt. Deze zygoten vormen zich om tot mobiele oökineten. Oökineten migreren

door de maagwand van de mug en nestelen zich in de buitenwand van de maag. Deze

genestelde oökineten worden oöcysten genoemd. Een oöcyst kan duizenden sporozoïten

produceren en loslaten rond de maag van de mug. De losgelaten sporozoïten migreren

naar de speekselklieren van de mug. De ontwikkeling in de mug is afhankelijk van het

Plasmodium species, maar ook van de buitentemperatuur. Hoe lager de

buitentemperatuur, hoe trager de cyclus en zelfs bij een temperatuur onder de 18°C is

de ontwikkeling zo traag dat de levensduur van de mug overschreden wordt. (Instituut voor

Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009)

(Simon-Lopez, 2013)

1.2. IMMUNITEIT

Malaria komt in bepaalde streken vaak voor, deze streken worden ‘endemische’ streken

genoemd. Omdat de lokale bevolking in deze streken frequent geïnfecteerd werd hebben

sommige personen na enkele jaren een natuurlijke immunisatie verwoven voor de

parasiet. Echter komt deze immuniteit langzaam op gang en verschijnt dit pas 2 tot 5



jaar na blootstelling. Door deze ‘verworven’ immuniteit kunnen deze personen de

parasiet asymptomatisch dragen. Dit betekent echter niet dat deze personen een totale

bescherming hebben voor malaria, ze kunnen nog steeds geïnfecteerd worden maar

vertonen echter geen symptomen. Deze immuniteit is labiel en verdwijnt tussen de 12

en 24 maanden in afwezigheid van herinfectie. Het biedt dus zeker geen garantie tot een

totale en levenslage immuniteit. In deze streken worden vooral jonge kinderen en

zwangere vrouwen getroffen door malaria. Jonge kinderen hebben nog geen voldoende

immuniteit opgebouwd en. Bij zwangere vrouwen is de immuniteit verzwakt en kan de

parasiet zich manifesteren in de placenta. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische

Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (Lee et al, 2012) (World Health

Organization, 1999) (World Health, Organization, 2012)

Niet-endemische gebieden zijn gebieden waar malaria helemaal niet frequent voorkomt.

Bijgevolg is deze bevolking ook niet geïmmuniseerd. Personen uit deze bevolking hebben

een grotere kans op malaria omdat ze geen verwoven immuniteit hebben. (Instituut voor

Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (World Healt Organiztion,

2012)

1.3. THERAPIE

1.3.1. PROFYLAXIE

De muggen in de risicogebieden zijn vooral ’s avonds en ’s nachts actief, door

beschermende kledij te dragen en te slapen onder een muskietennet kan een beet van

een Anopheles mug al vermeden worden

Malaria-infectie bij reizigers in de risicogebieden wordt voorkomen door het innemen van

malariaprofylaxe (chemoprofylaxe) middelen. Profylaxe middelen voorkomen geen

besmetting maar wel een uitbraak van een malaria aanval, maar kunnen wel de aanval

uitstellen. Afhankelijk van het gebied, het seizoen, de verblijfsduur en eerder ingenomen

profylaxe wordt voor een bepaalde profylaxe gekozen. (www.itg.be, 2010) (World Health

Organization, 2012)

Er wordt volop onderzoek verricht naar de ontwikkeling van een vaccin tegen malaria

door het opsporen en onderzoeken van de verschillende antigenen. Maar tot nu toe is er

nog steeds geen efficiënt vaccin werkzwaam. Het doel van vaccinatie is om in het

lichaam antistoffen te vormen die specifiek binden aan de antigenen van de parasiet.

(Strien, 2002)



Tabel 2: Malariaprofylaxe (www.itg.be, 2010)

Actieve stof Beschrijving

Chloroquine P.vivax, P.ovale en P.malariae, P.falciparum is vaak resistent

Voor reizigers: één week voor vertrek innemen tot weken na terugkomst ( 3

tabletten per week)

Atovaquon + proguanil P.vivax, P.ovale en P.malariae en P.falciparum

Voor reizigers: één dag voor vertrek innemen tot 1 week na terugkomst

(1 tablet/dag)

Mefloquine P.vivax, P.ovale, P.malariae en P.falciparum

Voor reizigers: twee weken voor vertek innemen tot 4 weken na terugkomst

(1 tablet/week)

Doxycycline P.vivax, P.ovale, P.malariae en P.falciparum

Voor reizigers: één dag voor vertek innemen tot 4 weken na terugkomst

(1 tablet/dag)

1.3.2. BEHANDELING

Om een acute malaria-aanval te behandelen komen verschillende actieve stoffen in

aanmerking.

Tabel 3: Behandeling malaria aanval (www.itg.be, 2010)

Actieve stof(fen) Beschrijving

Atovaquon + Proguanil 4 tabletten éénmaal per dag

Artemether + Lumefantrine

24 tabletten (6x 4 tabletten) in een periode van 60 uur

Kinine + Doxycyxline Minimum 3 dagen inname van kininesulfaat (500mg) om de 8 uur en op

dag 3 of 2 wordt doxycycline gestart (200mg) en de dag erna wordt de

dosis gehalveerd (100mg) gedurende de komende 6 dagen.

Artemsinine combinaties Artesunaat (dag 1 200mg, dag 2 100 mg) altijd in combinatie met

doxycycline of mefloquine.

Chloroquine 25 mg per kg lichaamsgewicht op drie dagen (enkel bij verlaten van een

gebied waar P.falciparum of choroquine resistentie zeer laag is of

onbestaand).

1.4. RESISTENTIE

Bij de Plasmodium-parasiet kunnen ook toevallige mutaties van het parasitaire genoom

optreden. Wanneer deze mutaties optreden wanneer antimalariatherapie wordt

toegepast, zullen parasieten zonder mutatie vernietigd worden, maar parasieten met een

mutatie kunnen de parasiet resistent maken tegen de behandeling waardoor deze de

therapie overleven. Zo zullen deze ‘resistente’ parasieten zich verder vermenigvuldigen

waardoor de reeds toegepaste therapie niet meer effectief zal zijn. Op deze manier is er

voor vele antimalariamedicatie langzaam een resistentie ontstaan. Vandaar is het

belangrijk om steeds op zoek te gaan naar nieuwe therapieën. De keuze voor een

http://www.itg.be/

http://www.itg.be/



therapie waar twee actieve stoffen gecombineerd worden, vermindert de kans op

resistentie. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen,

2007) (World Health Organization, 1999)

1.5. RECIDIVITEIT

Naast resistentie kan ook recidiviteit optreden. Wanneer een therapie niet de

interhepatische parasieten (hypnozoïeten) bij P.vivax, P.ovale en P.malariae infecties

treft, kunnen deze ook lang in de lever verblijven en de oorzaak zijn van een herval.

(Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)

1.6. SYMPTOMEN

De symptomen van een malaria-infectie zijn moeilijk te definiëren en heel aspecifiek. Een

hoge parasitemie gaat niet steeds gepaard met sterkere symptomen. De meest

voorkomende symptomen zijn koorts, rillingen, gewrichtspijn, soms overgeven en

diarree. Deze symptomen lijken erg op een griep waardoor malaria soms hiermee

verward. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen,

2007) (Castrynck, 2013) (World Health Organization, 2003)

1.7. KLINISCHE VERSCHIJNSELEN

1.7.1. HEMATOLOGIE

In sommige gevallen van een malaria-infectie wordt een verlaagd aantal bloedplaatjes of

trombocyten teruggevonden (trombopenie). Zowel leukopenie als leukocytose kunnen

optreden bij een infectie met de Plasmodium parasiet. Bij een malaria-infectie kunnen

ook grote lymfocyten en monocyten waargenomen worden omdat deze cellen de infectie

willen bestrijden door fagocytose. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van

LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization, 2003)

1.7.2. BIOCHEMIE

Bij malaria kan ook het C-reactief proteïne (CRP) verhoogd zijn omwille van de infectie.

Ook kan het gehalte billirubine verhoogd zijn door de lyse van de levercellen. Een

verhoogd gehalte lacaat dehydrogenase (LDH) en hypoglycemie worden ook soms

teruggevonden bij een malaria-infectie. (Paugam & Yera, 2005) (Nicolas et al., 1998)



1.8. DIAGNOSE

De diagnose van malaria kan vastgesteld worden door microscopie (onderzoek

bloeduitstrijkje en dikdruppelpreparaat), immunochromatografische sneltesten, serologie,

moleculaire technieken (PCR) en automatische celtellers.

1.8.1. MICROSCOPIE

Microscopisch onderzoek kan uitgevoerd worden op een bloeduitstrijkje of een

dikdruppelpreparaat. Als monster wordt volbloed gebruikt dat wordt afgenomen via een

vingerprik of via een veneuze punctie. Het bloeduitstrijkje wordt gekleurd met May-

Grünwald Giemsa en het dikdruppelpreparaat met Giemsa. Het bloeduitstrijkje wordt

vooral gebruikt om de Plasmodium species te differentiëren. (Instituut voor Tropische

Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World

Health Organization 1999) (World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999)

1.8.2. IMMUNOCHROMATOGRAFIE (SNELTEST)

Commerciële malariasneltesten zijn gebaseerd op het immunochromatografisch principe.

Deze testen detecteren de parasitaire antigenen in een bloedhemolysaat. Deze testen

bevatten monoklonale antilichamen gericht tegen één of meerdere Plasmodium

antigenen. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van


1.8.2.1. HRP-2

HRP-2 is een wateroplosbaar proteïne, namelijk een glycoproteïne dat geproduceerd

wordt door de aseksuele vormen en de jonge gametocyten van P.falciparum. Dit proteïne

wordt in grote hoeveelheid teruggevonden op de oppervlakte van de geparasiteerde rode

bloedcellen omdat het uitgescheiden wordt doorheen de celwand van de geïnfecteerde

rode bloedcel. Momenteel wordt steeds HRP-2 gedetecteerd samen met een panmalaria

antigen, dit is een antigen dat geproduceerd wordt door alle vier species van

Plasmodium. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van

LaboratoriumTechnologen, 2007) (Hopkins et al., 2007) (Hänscheid, 199)

1.8.2.2. PLDH

Het panmalaria antigen pLDH, parasietspecifiek lactaat dehydrogenase is een enzyme dat

betrokken is bij de glycolyse en wordt geproduceerd door de aseksuele vormen en de

gametocyten van de levende parasieten en in mindere mate door de sexuele vormen.

(Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van

LaboratoriumTechnologen, 2007) (Hopkins et al., 2007) (Hänscheid, 199)



1.8.3. SEROLOGIE

De antilichamen in het bloed kunnen ook aangetoond worden en een hulp zijn bij de

diagnose. Maar deze zijn pas aantoonbaar minstens één week na het begin van de

symptomen. Onderzoek voor deze fase zou tot vals negatieve vastellingen leiden en

bovendien kunnen reeds genezen patiënten tot enkele maanden vals positief reageren.

Deze opsporing kan wel van belang zijn om aan te tonen of een persoon in het verleden

een malaria-infectie heeft doorgemaakt. Deze antilichamen geven geen bescherming

tegen en volgende besmetting. De meest gebruikte technieken zijn de indirecte

immunofluorescentie en de ELISA-test. Deze methode gebruikt de antigenen voor de

detectie van antilichamen tegen Plasmodium. De parasitemie die nog te laag is om in een

dikdruppel zichtbaar te zijn, is de subpatente parasitemie. Deze parasitemie kan echter

wel al gedetecteerd worden door de serologische technieken. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut

voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) Deze techniek

wordt toegepast voor de screening van bloeddonoren en voor de bevestiging van een

vroegere vermoedde malaria-aanval. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging

van LaboratoriumTechnologen, 2007)

1.8.4. MOLECULAIRE TECHNIEKEN

Deze technieken worden toegepast in de referentielaboratoria voor malaria. Deze

techniek heeft de grootste gevoeligheid en de grootste specificiteit en wordt niet

toegepast in de routine omdat dit een tijdrovende en dure techniek is. De techniek is het

beste voor de identificatie van twijfelachtige species en ook voor de vaststelling van een

menginfectie. De test wordt toegepast als confirmatie van de microscopie. De subpatente

parasitemie kan echter wel al gedetecteerd worden met de PCR-techniek. (Instituut voor

Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005)

(Hänscheid, 199)

1.8.5. HEMATOLOGISCHE ANALYSERS

Hematologische analysers kunnen ook bijdragen in de detectie van malaria. De Abott

Cell-Dyn 3000 en 4000 kunnen het hemozoïne in de monocyten en neutrofielen

detecteren door depolarisatie van licht. De Abott Cell-Dyn 4000 kan ook het aanwezige

DNA van de parasiet in de geïnfecteerde rode bloedcellen detecteren door de

fluorescentiekleuring die normaal wordt gebruikt voor de telling van reticulocyten. De

UniCel DxH 800 meet de standaarddeviatie van het volume van de lymfocyten en

monocyten en berekent hieruit een discriminant factor voor de indicatie van malaria. Dit

laatste toestel wordt gedetailleerd besproken in het experiment ‘1. Beckman Coulter

UniCel DxH 800’. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van

LaboratoriumTechnologen, 2007) (Campuzona-Zulunga, 2010) (Briggs et al., 2006)



2. LITERATUUR

Het menselijk lichaam reageert op een malaria-infectie door een stijging van het aantal

monocyten en de activering van monocyten wat resulteert in grotere monocyten.

Mononuclaire fagocyterende cellen zullen bij een malaria-infectie trachten de

geïnfecteerde rode bloedcellen te fagocyteren. Hemozoïne is een bruin pigment dat

geproduceerd wordt wanneer de parasieten het hemoglobine in de rode bloedcellen

verteren. Hemozoïne wordt gefagocyteerd door neutrofielen en monocyten. Het is ook

bewezen dat de lymfocyten een belangrijke rol spelen in de afweerreactie op malaria.

Door de activatie van de lymfocyten zijn deze cellen ook groter dan de gewone

lymfocyten. (Pierce & Miller, 2009) (Chua et al., 2013) (Fourcade et al., 2004) (Briggs et al., 2006) (Lee at

al, 2012) (Simon-Lopez, 2013)

Studies hebben aangetoond dat de spreiding (standaarddeviatie: SD) van het volume

(grootte) van de populatie monocyten en de populatie lymfocyten significant verschillend

is bij een malaria-infectie t.o.v. normaal. Beckman Coulter UniCel DxH 800 is een

automatische hematologische celteller die deze grootte of volume van de cellen in deze

populaties meet en een standaarddeviatie op deze populatie berekent met behulp van de

VCS technologie. De VCS technologie laat toe om het volume, conductiviteit en de

scattering van een cel simultaan te meten. Meer informatie over deze technologie wordt

vermeld in ‘1.1.3. Meetprincipe’. Het volume van een cel wordt volgens het impedantie

principe gemeten. Uit de standaarddeviatie van het volume van de monocyten (SD V

monocyten) en de standaarddeviatie van het volume van de lymfocyten (SD V

lymfocyten) wordt een malaria discriminant factor berekend. Wanneer deze factor hoger

is dan een bepaalde cut-off waarde, wijst dit op een indicatie van een malaria-infectie.

(Fourcade et al., 2004) (Briggs et al., 2006) (Lee at al, 2012) (Simon-Lopez, 2013)

Figuur 3: VCS-data (V: volume, C: conductiviteit, S: scattering) met het gemiddelde (Mean) en de

standaarddeviatie (SD) van de populatie witte bloedcellen (NE: neutrofielen, LY: lymfocyten, MO: monocyten

en EO: eosinofielen) na telling en differentiatie op de UniCel DxH 800. Links de VCS-data van een persoon in

goede gezondheid. Rechts de VCS-data van een persoon met een malaria-infectie die een duidelijk hoger

gemiddeld volume en een grotere standaarddeviatie van de monocyten en lymfocyten weergeeft. (Briggs et al.,

2006)

Een witte bloedcelhistogram (WBC histogram) onderscheidt na analyse de witte

bloedcellen van de gekernde rode bloedcellen (erytroblasten) en puin (apoptotische

cellen, celmembranen, infectieuze organismen,…) op basis van hun grootte uitgedrukt in

fL. Vanaf de drempelwaarde van 35 fL worden cellen als witte bloedcellen geïdentificeerd.



Een WBC histogram geeft een grootteverdeling weer van de witte bloedcellen. Een WBC

histogram van een monster met een malaria-infectie vertoont een kleine extra piek voor

de drempel van 35 fL die afwezig is bij personen in goede gezondheid. (Briggs et al., 2006)

(Simon-Lopez, 2013)

Figuur 4: Histogram van de witte bloedcellen met op de x-as de grootte of volume (fL) en op de y-as de

celfrequentie. Links een histogram van een persoon in goede gezondheid en rechts van een persoon met een

malaria-infectie met een extra piek voor de drempelwaarde van 35 fL. (Briggs et al., 2006)

Voor de differentiatie van de verschillende celpopulataties wordt een 2D-dataplot

weergegeven die het volume (y-as) uitzet t.o.v. geroteerde lichtverstrooiing (x-as). Door

de aanwezigheid van geactiveerde monocyten en geactiveerde monocyten in monsters

met Plasmodium parasieten, is de populatie monocyten en lymfocyten op de dataplot

minder geconcentreerd dan bij monsters van gezonde personen. Door de heterogeniteit

in volume (grootte) van cellen binnen de populatie, liggen de dots ook meer verspreid en

minder geconcentreerd. (Briggs et al., 2006) (Simon-Lopez, 2013)

Figuur 5: 2D-dataplot van de bloedcepopulaties met op de x-as de lichtverstrooiing en op de y-as het volume.

Links een persoon in goede gezondheid met een goede scheiding in de celpopulaties en een geconcentreerde

lymfocyten en monocyten populatie. Rechts een persoon met een malaria-infectie met geen goede scheiding

tussen de celpopulaties en een heterogene minder geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie.

(Briggs et al., 2006)

Studie Briggs et al.

Een studie in Zuid-Afrika en Londen onderzocht een groep monsters afkomstig van

gezonde personen met bloedwaarden binnen de referentiewaarden (n=1079), een groep

monsters waar een malaria onderzoek door de dokters is aangevraagd (n=275) en een

groep monsters afkomstig van personen met een HIV-infectie (n=51). Deze groepen

werden geanalyseerd met de VCS technologie en werden vergeleken met de microscopie



en immunologische diagnostische technieken. De monsters bestonden uit perifeer bloed

in K3EDTA tubes. Uit de groep waarop een malaria onderzoek werd aangevraagd bleken

147 monsters echt positief voor een malaria-infectie, de overige stalen waren afkomstig

van personen met koorts, virale of besmettelijke ziektes. De monsters werden

geanalyseerd op de Beckman Coulter analyser en microscopisch onderzocht ter

referentie. De resultaten van de SD volume van de lymfocyten en monocyten, het

gemiddelde volume van monocyten, de malaria discriminant factor, het aantal

bloedplaatjes en het aantal eosinofielen werden met behulp van de Mann-Whitney U test

onderzocht om statistische verschillen vast te stellen tussen de malaria positieve

monsters verdacht op malaria-infectie, malaria negatieve monsters verdacht op malaria-

infectie, HIV positieve monsters en de monsters uit de controlegroep (gezond). De HIV

positieve groep, de malaria negatieve groep en de malaria positieve groep hadden

significant hogere waarden dan de controlegroep bij de variabelen malaria discriminant

factor, SD V monocyten, SD V lymfocyten en gemiddeld volume van de monocyten

(p<0.0001). De malaria negatieve monsters en de HIV positieve monsters waren ook

significant verschillend van de malaria positieve monsters bij deze variabelen

(p<0.0001). De malaria positieve monsters en de malaria negatieve monsters hadden

een lager aantal bloedplaatjes dan de controlegroep (p<0.05). De malaria positieve

monsters hadden een significant lager aantal bloedplaatjes dan de malaria negatieve

groep (p<0.001). De malaria positieve monsters hadden ook een lager aantal

bloedplaatjes dan HIV positieve monsters (p<0.001). (Briggs et al., 2006)

Een ROC-analyse werd ook uitgevoerd op de

malariafactor om een grenswaarde of cutt-off value in te

stellen voor de detectie van malaria. De ROC-curve

toonde aan dat de grenswaarde van 3,7 voor de malaria

factor een sensitiviteit had van 98% en een specificiteit

van 94%. Een lagere cut-off waarde resulteert in een

lagere specificiteit (hoger aantal vals waarden), een

hogere factor in een lagere sensitiviteit (hoger aantal vals

negatieve waarden). De UAC (area under the curve)

bedraagde 0,983. (Briggs et al., 2006)

In deze studie werd echter geen relatie gevonden tussen

het percentage parasitemie en de waarde van de

malariafactor. Een hoge parasitemie gaat dus niet

gepaard met een hoge malariafactor. Het type

Plasmodium species beïnvloedde ook niet de

malariafactor. (Briggs et al., 2006)

Figuur 6: ROC-analyse voor de

malariafactor. Een cut-off waarde of

grenswaarde van 3,7 vertoont een

sensitiveit van 98% en een

specificiteit van 94%. Een lagere

cut-off waarde resulteert in een

lagere specificiteit, een hogere

factor in een lagere sensitiviteit.

(Briggs et al., 2006)



De valspositieve monsters waren vooral afkomstig van personen met andere infecties.

Een virale infectie zoals bijvoorbeeld HIV kan de SD V lymfocyten verhogen wat kan

resulteren in vals positieve waarden van de malariafactor. Deze studie moet herhaald

worden op monsters afkomstig van kinderen omdat kinderen verschillend van

volwassenen reageren op infecties wat kan resulteren in verschillende veranderingen in

de VCS-data. (Briggs et al., 2006)

Studie H.K. Lee et al.

De volledige bloedbeeld- (CBC) telling werd uitgevoerd op de UniCel DxH 800 tussen juli

2009 en april 2011 in Seoul in St. Mary's Hospital, Korea. Deze analyse werd uitgevoerd

op een groep personen met P.vivax infectie (84 tot 67980 AP/μL en gemiddeld 6532

AP/μL) (AP= aantal parasieten), een malaria negatieve groep (inclusief personen met

sepsis, hematologische aandoeningen en gezonde personen) en een groep monsters met

leukopenie (<2000 WBC/µl). Microscopie was de referentiemethode om malaria te

diagnosticeren en werd uitgevoerd door experts. De patiënten met een malaria-infectie

werden behandeld met hydroxychloroquine en primaquine. Enkele patiënten werden ook

opgevolgd. De dataplots van de genucleëerde rode bloedcellen (NRBC) werden

gescreend. (Lee at al, 2012)

De monsters positief voor P.vivax vertoonde karakteristieke, geaggregeerde ronde

signalen die laag gelegen waren op de RLALS-as (y-as, lichtverstrooiing) en op de AL2-as

(x-as, doorgelaten licht). De malariasignalen waren groen, de NRBC-signalen rood en de

WBC-signalen blauw op de 2D-plot. Op de differentiatie-dataplots waar het volume werd

uitgezet t.o.v. de geroteerde lichtverstrooiing (x-as, RLS) lagen de malariasignalen

horizontaal gelegen op de bodem onder de witte bloedcelpopulaties en waren rood. Deze

rode plots waren echter inclusief de rode bloedcellen die ook rode signalen geven. (Lee at

al, 2012)

Figuur 7: NRBC 2D-plot (y-as RLALS, x-as AL2) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen

zijn groen, NRBC-signalen rood en de WBC signalen blauw. (Lee at al, 2012)



De NRBC 2D-plots van patiënten met P.vivax infectie werden verzameld in het begin van

de behandeling en gedurende enkele dagen na de behandeling. Naarmate de behandeling

vorderde, daalde het aantal malariasignalen op de dataplots. Vier tot twaalf dagen na de

behandeling verdwenen de parasieten uit het bloed en waren geen malariasignalen

zichtbaar op de plots. De grootte van de malariasignalen was ruw gecorreleerd met de

parasitemie. (Lee at al, 2012)

Figuur 9: NRBC 2D-plots van een patiënt met P.vivax-infectie. Links de dataplot op dag 0 van de behandeling,

in het midden de dataplot na 2 dagen behandeling en rechts de dataplot na 12 dagen behandeling. Naarmate

de parasitemie afneemt, neemt ook het aantal malariasignalen af. (Lee at al, 2012)

Alle monsters uit de malaria (P.vivax) positieve groep vertoonden de karakteristieke

malariasignalen op de NRBC-dataplots en waren makkelijk te identificeren, de

sensitiviteit was 100%. Slechts één monster vertoonde licht gelijkaardige signalen maar

deze signalen konden makkelijk onderscheden worden van die van de P.vivax monsters,

de specificiteit werd hierdoor 100%. Men is echter onzeker welke cellen verantwoordelijk

zijn voor deze malariasignalen. Men beweert dat de gametocyten verantwoordelijk zijn

voor deze signalen. De gametocyten zijn groter dan andere stadia en werden in alle

monsters van de malaria positieve groep teruggevonden. De rode bloedcellen worden

Figuur 8: Differentiatie 2D-plot (y-as volume, x-as RLS) van een patiënt met een P.vivax infectie.

Malariasignalen zijn rood (inclusief rode bloedcellen, neutrofielen zijn roze, de blauwe signalen zijn

lymfocyten , de groene signalen zijn monocyten , de gele signalen zijn eosinofielen en de witte signalen zijn

basofielen. (Lee at al, 2012)



gelyseerd om de differentiatie uit te voeren waardoor shizonten tijdens de lyse zullen

barsten in kleine merozoiëten en bovendien zijn de trofozoëten veel te klein. Hierdoor

zijn enkel de gametocyten potentiëel verantwoordelijk voor deze signalen op de plots van

de UniCel DxH 800. (Lee at al, 2012)

Studie R. Simon-Lopez

Ook deze studie toonde aan dat in malaria positieve monsters de SD V lymfocyten

verhoogd is door de aanwezigheid van grote lymfocyten, namelijk reactieve en

geactiveerde lymfocyten en dat de SD V monocyten verhoogd is door de aanwezigheid

van geactiveerde monocyten, macrofagen en pigment-dragende monocyten. Er werden

in deze studie klinische bloedmonsters onderzocht, namelijk monsters waarvan de arts

een onverklaarde koorts vaststelde of monsters van personen afkomstig uit malaria

endemische gebieden of van personen die gereisd hebben in deze gebieden (n=89). Er

waren 32 monsters positief voor P.falciparum (n=28) en P.vivax (n=4) en 57 monsters

negatief op basis van microscopisch onderzoek van het bloeduitstrijkje. Het aantal

geïnfecteerde rode bloedcellen werd geteld en er werd een range van 0,1% tot 4,65%

geïnfecteerde rode bloedcellen bij de positieve monsters waargenomen. De monsters

waren afkomstig van zowel kinderen als volwassenen (8 maand tot 72 jaar). Alle

monsters werden geanalyseerd op de hematologische analyser Coulter GEN*STM van

Beckman Coulter. De dataplots bij malaria positieve monsters gaven een grotere

heterogeniteit in de populatie lymfocyten en monoyten en een extra populatie onder de

populatie lymfocyten weer. In het WBC histogram was een extra populatie aanwezig aan

de linkerzijde van de lymfocyten wat zichtbaar is als een extra piek voor de grenswaarde

van 35 fL. (Simon-Lopez, 2013)

Figuur 10: De 2D-dataplots en WBC-histogrammen van een normaal bloedmonster (links) en een

bloedmonster met een malaria-infectie (rechts). De dataplot van malaria toont een extra populatie aan onder

de populatie lymfocyten en een extra populatie (piek voor 35 fL grenswaarde) voor de lymfocyten op het

histogram. (Simon-Lopez, 2013)



De onderzochte parameters werden onderworpen aan een statistische analyse m.b.v. de

Wilcoxon rank test. De parameters die verantwoordelijk waren voor een significant

verschil tussen de positieve en de negatieve malariagroep werden onderworpen aan een

ROC-analyse om een cut-off waarde te bepalen voor de detectie van malaria. Deze studie

toonde aan dat er een significant verschil verschil was tussen de twee groepen wanneer

het gemiddeld volume van de neutrofielen, de SD V lymfocyten, het gemiddeld volume

van de monocyten en de SD V monocyten. De ROC analyse van de malaria factor toonde

aan dat een cut-off waarde van 5,06 een sensitiviteit gaf van 96,9% en een specificiteit

van 82,5%. Een sensitiviteit van 100% gaf echter een specificiteit van 77,2%.

Omdat de SD V volumes van de monocyten en de lymfocyten significant verschillend zijn

tussen de malaria positieve bloedmonsters en de malaria negatieve bloedmonsters ,

werden op deze paramers additionele testen uitgevoerd. (Simon-Lopez, 2013)

De herhaalbaarheid, de stabiliteit en de invloed van de leeftijd van de monsters op de

parameters werden onderzocht. Enkele monsters werden meerdere malen op de analyser

geplaatst en de variatiecoëfficiënt van de twee parameters werden berekend voor elk

monster. De gemiddelde variatiecoëfficiënt van de monsters werd berekend om de

herhaalbaarheid uit te drukken, dit bedroeg voor de SD V lymfocyten 4,4% en voor de

SD V monocyten 5,5%. De invloed van de leeftijd van het monster werd geevalueerd

door 15 monsters op geregelde tijdstippen op hetzelfde toestel te analyseren (5, 8, 11,

17, 29, 53 en 77 uur na de bloedafname). De gemiddelden van het volume en de SD V

van de monocyten en lymfocyten werden berekend. Deze test toonde aan dat de SD V

lymfocyten en SD V monocyten stabiel blijven gedurende een tijdsperiode van 11u,

nadien is er een stijging. (Simon-Lopez, 2013)

Positieve Negatieve Significantie

Gemiddeld V

neutrofielen 151,8 ± 11,9 145,7 ± 12,4 p = 0.0059

Gemiddeld V

monocyten 186,6 ± 12,1 170,4 ± 11,9 p = 0.0000

SD V

monocyten 24,7 ± 3,6 20,1 ± 4,1 p = 0.0000

SD V

lymfocyten 27,6 ± 4,2 20,3 ± 4,4 p =0.0000

Tabel 4: Significante verschillen tussen de malaria positieve

en malaria negatieve groep na een Wilcoxon rank test.

(Simon-Lopez, 2013)

Figuur 11: ROC-analyse van de malariafactor

toont een cutt-off waarde van 5,06 met een

sensitiviteit van 69,9% en een specificiteit van

82,5%. (Simon-Lopez, 2013)



De stabiliteit werd onderzocht door regelmatig een groep monsters van 10 testpersonen

op de Coulter Gen*STM te analyseren en ook op een ander toestel met hetzelfde VCS

detectiesysteem (LH750) gedurende een maand. Het gemiddelde van de volumes en de

SD V van de monocyten en lymfocyten werd berekend voor elke groep. Gedurende een

maand werd een range van 18,6-20,6 waargenomen voor de SD V lymfocyten en een

range van 15,3-16,9 voor de SD V monocyten met een variatiecoëfficiënt gelijk aan 4%

voor beide parameters. (Simon-Lopez, 2013)

Conclusie

Microscopie blijft de gouden standaard voor de malariadiagnose. De PCR-techniek is

bewezen gevoeliger om de 4 species te identificeren maar is vooral duur en niet praktisch

in de routinelabo’s. De malariafactor mag niet dienen als vervanging van de microscopie

maar dient om het laboratoriumpersoneel te waarschuwen om aandachtig te zijn voor

malaria in bepaalde monsters en bloeduitstrijkjes.

Figuur 13: De invloed van de leeftijd van het

monster op de SD V volume (Vsd) van de

monocyten en lymfocyten. Het gemiddelde SD V

volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten

van 10 monsters gedurende een tijdspanne van

77u. Het monster is stabiel voor deze parameter

gedurende 11 uur na de bloedafname. (Simon-

Lopez, 2013)

Figuur 12: Herhaalbaarheid. Het gemiddelde SD V

volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van

10 monsters na elke run. Voor de lymfocyten is de

gemiddelde variatiecoëfficiënt 4,4% en voor de

monocyten 5,5%.(Simon-Lopez, 2013)



V. EXPERIMENTEN

1. BECKMAN COULTER UniCel DxH 800

1.1. MATERIAAL EN METHODEN

1.1.1. APPARATUUR

De automatische celteller UniCel DxH 800 van Beckman Coulter werd gebruikt om de

celtelling en de differentiatie van de bloedmonsters uit te voeren.

1.1.2. MONSTER

Als monster werd gebruik gemaakt van een volbloed K3EDTA-tube. Een minimumvolume

van 200µl monster is vereist. Het monster mag maximaal 48u na afname op het toestel

geanalyseerd worden (zie Appendix 7) (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.3. MEETPRINCIPES

Beckman Coulter heeft een patent op de ‘Coulter methode’. Deze methode wordt

toegepast om de de ‘Complete Blood Count’ op een monster uit te voeren. De VCS

technologie wordt gebruikt voor de differentiatie van de witte bloedcellen. Deze

technologie steunt op 3 meetprincipes; volume, conductiviteit en laserlichtverstrooiing

(scattering). Tabel 5 geeft per parameter de beschrijving, de eenheid en het

meetprincipe weer. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Tabel 5: Beschrijving, eenheid en meetprincipe per parameter bij analyse op de UniCel DxH 800 (Beckman

Coulter Ireland, 2013)

Parameter Meetprincipe Eenheid

WBC White Blood Cell Count Coulter principe 10³ cells/μL

RBC Red Blood Cell Count Coulter principe 106 cells/μL

HGB Hemoglobine Spectrofotometrie g/dL

MCV Mean Corpuscular Volume

Gemiddeld volume van de rode bloedcellen Afgeleid uit RBC histogram fL

PLT Platelet Count Coulter principe 10³ cells/μL

MPV Mean Platelet Volume

Gemiddeld volume van de bloedplaatjes Afgeleid uit PLT histogram Fl

NE Neutrofielen percentage

[NE /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %

LY Lymfocyten percentage

[LY /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %

MO Monocyten percentage

[MO /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %



EO Eosinofielen percentage

[EO /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %

BA Basofielen percentage

[BA /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %

NRBC Nucleated Red Blood Cell percentage

Erytroblasten VCSn technologie /100 WBC

HCT

Hematocriet

The relative volume of packed erythrocytes

to whole blood

Berekening

Hct (%) = (RBC X MCV)/10 %

MCH

Mean Corpuscular Hemoglobin

Gemiddelde hoeveelheid hemoglobine in de

RBC

Berekening

MCH (pg) = (Hgb/RBC) x 10 Pg

MCHC

Mean Corpuscular Hemoglobin

Concentration

Gemiddelde concentratie hemoglobine in de

RBC

Berekening

MCHC (g/dL) = (Hgb/Hct) x 100 g/dL

RDW

Red Cell Distribution Width

De grootteverdeling spreiding van de RBC

(Variatiecoefficiënt)

Afgeleid uit RBC histogram %

RDW-

SD

Red Cell Distribution Width – SD

De grootteverdeling spreiding van de RBC

(Standaarddeviatie)

Afgeleid uit RBC histogram fL

NE# Neutrofielen (absoluut aantal) Berekening

NE# (10³/μL) = (NE/100) x WBC 10³ cells/μL

LY# Lymfocyten (absoluut aantal) Berekening

LY# (10³/μL) = (LY/100) x WBC 10³ cells/μL

MO# Monocyten (absoluut aantal) Berekening

MO# (10³/μL) =(MO/100) x WBC 10³ cells/μL

EO# Eosinofielen (absoluut aantal) Berekening

EO# (10³/μL) = (EO/100) x WBC 10³ cells/μL

BA # Basofielen (absoluut aantal) Berekening

BA# (10³/μL) = (BA/100) x WBC 10³ cells/μL

NRBC

#

Nucleated red blood cells

(absoluut aantal)

Berekening

NRBC (10³/μL) = (NRBC/100) x WBC 10³ cells/μL

1.1.3.1. COMPLETE CLOOD COUNT (COULTER PRINCIPE)

De ‘complete blood count’ (CBC) bevat de telling van de witte bloedcellen, de rode

bloedcellen en de bloedplaatjes. De naald aspireert 165 µl monster uit de tube en een

pomp zorgt ervoor dat het monster naar het WBC- en het RBC-bad getransporteerd

wordt. Hierin wordt diulent onderaan het bad via aan opening onder een spiraalstroom in

het bad aangevoerd. In het WBC-bad wordt WBC-diluent en lyse toegevoegd, aan het



RBC-bad enkel RBC-diluent. Door deze spiraalstroom worden luchtbellen voorkomen en

ontstaat een goed mengsel. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Tabel 6: Baden voor het mengen van reagens met monster in de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland,

2013)

WBC bad RBC bad

Monster 28 µl 1,6 µl

DxH Diluent 6 ml 10 ml

DxH Cell Lyse 1,08 ml /

Finale dilutie 1:251 1:6250

De suspensie (reagens en de cellen) wordt doorheen een meetopening geleid. Alle cellen

passeren één voor één door de meetopening. Achter de opening stroomt een extra

hoeveelheid diluent in één richting (sweep flow) die de cel meeneemt in de stroom

waardoor voorkomen wordt dat de cellen opnieuw door de opening passeren

(recirculatie) en worden geteld als bloedplaatjes. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

De coulter methode telt en meet de cellen door het meten en detecteren van

veranderingen in elektrische weerstand wanneer een partikel in een conductieve diluent

passeert doorheen een smalle opening. Aan beide kanten van de opening bevindt zich

een elektrode, deze elektroden

zorgen voor een bepaalde spanning

in de opening. Wanneer een cel of

partikel doorheen deze opening

passeert, zal dit een hogere

weerstand genereren. Dit resulteert

in een meetbare elektrische puls. De

grootte van de elektrische puls is

proportioneel aan het celvolume en

de het aantal pulsen is een waarde

voor de celtelling. (Beckman Coulter

Ireland, 2013)

Om foute waarden te voorkomen (bijvoorbeeld als gevolg van een geblokkeerde

opening), wordt voor elke staalverdunning drie metingen in 3 verschillende

meetopeningen geanalyseerd. Het gemiddelde van deze metingen wordt weergegeven

als het resultaat. Er moeten minstens twee metingen zijn die binnen elkaars bereik liggen

om een resultaat te kunnen rapporteren. Een meting die volledig afwijkt van de twee

andere metingen wordt automatisch geëxcludeerd. Wanneer er voor een parameter

geen twee metingen binnen elkaars bereik liggen, geeft het systeem geen waarde voor

Figuur 14: Coulter-methode in de Beckman Coulter DxH

voor de celtelling van bloedcellen in een bloedmonster

(Beckman Coulter Ireland, 2013)



deze parameter en voor de parameters die hiervan afhankelijk zijn (bijvoorbeeld de

berekende parameters). Een resultaat is dus minstens het gemiddelde van twee

metingen. Wanneer na de celtelling te weinig elektrische pulsen werden waargenomen,

zal het toestel automatisch de telling verlengen. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.3.2. HEMOGLOBINE (SPECTROFOTOMETRISCH PRINCIPE)

Vanuit de verdunning voor de WBC-telling wordt het hemoglobine in een aparte

meetkamer (cuvet) bepaald. Het lysereagens lyseert de rode bloedcellen waardoor het

hemoglobine vrij komt en met het reagens een gekleurd complex vormt

(hemochromogeen) dat gemeten kan worden. De absorptie van het gekleurd complex is

recht evenredig met het hemoglobinegehalte van het monster. Hemoglobine wordt

fotometrisch gemeten bij een golflengte van 525 nm. Een optische lichtbundel schijnt

door de cuvet en een fotodetector meet de absorptie van de lichtbundel. Hoe meer licht

geabsorbeerd wordt, hoe meer gekleurd complex aanwezig in de verdunning en hoe

hoger het hemoglobinegehalte. Bij elke analyse wordt eerst een blancometing uitgevoerd

op diluent waarmee het monstersignaal wordt vergeleken. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.3.3. DIFFERENTIATIE (VCS PRINCIPE)

Deze technologie steunt op 3 meetprincipes; volume, conductiviteit en

laserlichtverstrooiing (scattering). Beckman Coulter ontwierp een module waarin deze 3

metingen simultaan uitgevoerd kunnen worden, namelijk de multitransducermodule

(MTM). De differentiatie, de NRBC en de reticulocyten worden bepaald in de VCS-module

van het toestel. Deze module zorgt voor de dilutie van het monster in de mengkamers.

De module en reagentia staan onder gecontroleerde temperatuur zodat de lyse steeds

een correcte werking heeft. Het lyse reagens wordt eerst toegevoegd en zal de rode

bloedcellen lyseren. Nadien wordt de stabilisator toegevoegd die de activiteit van het lyse

reagens stopt door neutralisatie waardoor de vorm van de witte bloedcellen behouden

wordt. Monster en reagentia worden gemengd door een gereguleerde gerichte

luchtstroom van 4 psi. Vervolgens worden de mengsels via een valve tot in de multi-

transducing module (MTM) gebracht. Deze MTM laat één cel tegelijk passeren doorheen

de flowcel door hydrodynamische focussering. Wanneer een cel door de flowcel passeert

worden tegelijkertijd verschillende metingen uitgevoerd. Een diodelaser zal de cellen

belichten. In deze flowcel wordt het volume, de conductiviteit en de lichtverstrooiing

(onder 5 bepaalde hoeken) gemeten. Er worden steeds 8192 cellen geanalyseerd. Bij

stalen met veel interferenties, bijvoorbeeld door de aanwezigheid van lyse-resistente

rode bloedcellen, worden de 8192 evenementen uitgebreid tot 50.000 evenementen. Zo

bekomt men steeds, zelfs in aanwezigheid van interferenties, een accurate formule.




Figuur 18: Meting van het

volume door gelijkstroom (DC)

impedantie in de MTM

(Beckman Coulter Ireland,

2013)

1.1.3.3.1. VOLUME

Het volume wordt in de MTM gemeten door gebruik te maken

van gelijkstroom (DC) impedantie. De DC impedantie is een

maat voor het celvolume van de cel. Wanneer de cel

doorheen de flowcel in het geleidend medium van de MTM

passeert zal er een verandering zijn in elektrische weerstand.

Aan beide kanten van de flowcel opening bevinden zich

elektrodes die een spanning genereren in de flowcel. De

passage van een cel zal een hogere weerstand geven wat

resulteert in een meetbare elektrische puls en de grootte van

de puls is proportioneel aan het celvolume. (Beckman Coulter

Ireland, 2013) (Simon-Lopez, 2013)

1.1.3.3.2. CONDUCTIVITEIT

Conductiviteit is de eigenschap die een component heeft om

elektrische stroom te geleiden. De conductiviteit in de MTM

wordt gemeten door gebruik te maken van radiofrequentie

(RF) impedantie. De RF-impedantie is een maat voor de

intracellulaire inhoud. Celwanden kunnen een geleidende

functie hebben voor hoogfrequente stroom. De stroom kan

doorheen de celwand en detecteert het verschil in de

isolerende eigenschappen van de celcomponenten.

De stroom karakteriseert de nucleaire, chemische en

granulaire bestanddelen van de cel. (Beckman Coulter Ireland,

2013)

Figuur 17: Lichtverstrooiing

meting in de MTM, simultaan met

de meting van volume en

conductiviteit (Beckman Coulter

Ireland, 2013)

Figuur 16: Meting van de

conductiviteit in de MTM

(Beckman Coulter Ireland,

2013)

Figuur 15: Meting van het

volume in de MTM (Beckman


Figuur 19: Meting van de

intracellulaire inhoud van de cel

door radiofrequentie (RF)

impedantie in de MTM.



1.1.3.3.3. LICHTVERSTROOIING

Een laser zal de cel in de flowcel belichten waardoor de cel een deel van de lichtbundel

zal absorberen en een deel zal verstrooiien. Sensoren zijn onder bepaalde hoeken

geplaatst die dit licht kunnen detecteren. Een sensor die in dezelfde richting als de laser

gesitueerd is, meet het licht dat door de cel gaat. Zo kan waargenomen worden hoeveel

licht verstrooid wordt. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.3.3.4. MTM

Figuur 20: Multitransducermodule (MTM) in de UniCel DxH 800 die gebruikt wordt voor de meting van volume,

conductiviteit en lichverstrooiing of scattering (VCS technologie). De onderdelen van deze module worden

uitgelegd in tabel 7 en 8. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Tabel 7: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die het volume en de conductiviteit meten. (Beckman


Kanaal Electrode

1 Lower electrode (RF en DC)

2 Higher electrode(RF en DC)



Tabel 8: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die de lichtverstrooiing meten. (Beckman Coulter

Ireland, 2013)

Kanaal Sensor Hoek Meting

3 AL2 0° Axial Light Loss Schaduw/absorptie

4 LALS 5°-1° Low Angle Light Scatter Grootte en structuur van de cel

5 LMALS 10°-20° Granulariteit

6 UMALS 20°-42°

7 MALS LMALS + UMALS

1.1.3.4. NRBC (VCS METHODE)

De metingen van de ‘Rotaded angle light scatter’ (RLALS) versus het licht dat door de cel

wordt doorgelaten (AL2) in de flowcel in de MTM bieden het beste onderscheid tussen

NRBC en WBC en de beste detectie van reuzeplaatjes en plaatjesaggregaten. (Beckman


1.1.4. REAGENTIA

1.1.4.1. DXH DILUENT

Deze isotonische bufferoplossing verdunt de monsters, spoelt de modules tussen de

verschillende analyses en zorgt voor een ‘sheat’ vloeistofstroom wanneer de

monsteroplossing door de flowcel passeert. Het wordt gebruikt voor de telling van de

WBC, RBC, bloedplaatjes en NRBC. (Beckman Coulter Ireland, 2013) (Simon-Lopez, 2013)

1.1.4.2. DXH CELL LYSE

Dit is een reagens die de rode bloedcellen lyseert om de witte bloedcellen te kunnen

tellen en om het hemoglobine gehalte te kunnen meten. Het zet het hemoglobine om in

een hemochromogeen dat fotometrisch gemeten kan worden. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

(Simon-Lopez, 2013)

1.1.4.3. DXH DIFF PACK

Dit pack bevat een erytrocytaire lysereagens die de rode bloedcellen lyseert en een

stabilisatiereagens die ervoor zorgt dat de witte bloedcellen hun vorm behouden wordt.

Deze twee reagentia verdunnen samen het monster dat nadien door de flowcel zal

passeren. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.4.4. DXH CLEANER

Deze oplossing reinigt het toestel door de residuele componenten te degraderen zodat ze

kunnen worden weggespoeld met de DxH Diluent. (Beckman Coulter Ireland, 2013)



1.1.5. RAPPORTERING

De rapportering ven de resultaten na de analyse van een bloedmonster kan gebeuren op

verschillende manieren. Deze resultaten en rapporteringen kunnen geraadpleegd worden

op de software van het toestel (UniCel DxH 800).

1.1.5.1. CBC EN DIFFERENTIATIE

Na een complete blood count en differentiatie van een bloedmonster op de UniCel DxH

800 worden de parameters met hun eenheden gerapporteerd in het ‘Patient Results’

scherm.

Figuur 21: ‘Patient Results’ scherm die de rapportering van de resultaten (grijze kaders) weergeeft van een

bloedmonster na een ‘complete blood count’ (CBC) en een differentiatie.

1.1.5.2. FLAGS

Naast het resultaat van een parameter kunnen flags weergegeven worden. Deze flags

maken diegene die de resultaten interpreteert alert op enkele overschreden limieten of

problemen. Indien de waarde van de parameter buiten de referentiewaarden valt wordt



deze aangeduid rechts van het resultaat met een flag (H: high of L: low). (Beckman Coulter

Ireland, 2013)

Tabel 9: Flags bij de rapportering van de resultaten (UniCel DxH 800) (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Flag Beschrijving

+ Resultaat boven de meetrange

- Resultaat onder de meetrange

R ‘Review’ van een resultaat vereist. Verschijnt ook bij een ‘System message’

C L Lage kritische limiet overschreden

C H Hoge kritische limiet overschreden

a L Lage actie limiet overschreden

a H Hoge actie limiet overschreden

H Hoge referentierange overschreden

L Lage referentierange overschreden

P Partiele of gedeeltelijke opzuiging gedetecteerd gedurende de monsteranalyse

N Non-bloedmonster gedetecteerd

1.1.5.3. SUPPLEMENTAIRE DATA

Door in het ‘Patient results’ scherm onderaan het tabblad ‘Additional data’ te selecteren,

verschijnt een pop-up venster waarin supplementaire data van de analyse geraadpleegd

kunnen worden. In het tabblad ‘DIFF’ wordt voor elke meting (volume, conductiviteit en

lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD)

weergegeven. Door de veranderingen in deze waarden kunnen abnormale popultaties of

heterogeniteiten van populaties opgespoord worden. De malariafactor is een

automatische regel die berekend wordt op basis van de waarde van de spreiding van het

volume van de lymfocyten (LY SD op het V kanaal) en die van de monocyten (MO SD op

het V kanaal). (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Figuur 22: Supplementaire data van de differentiatie (DIFF) geeft voor elke meting (volume, conductiviteit en

lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD) weergegeven.



1.1.5.4. HISTOGRAM

In het ‘Patient results’ scherm worden ook 3 histogrammen weergegeven. De x-as van

het histogram geeft de relatieve celfrequentie weer t.o.v. de grootte van de cel (fL). Voor

de witte bloedcellen, de rode bloedcellen en de bloedplaatjes wordt een histogram

uitgezet en weergegeven in dit scherm. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.5.5. 2D-DATAPLOTS

Er worden 2 dataplots weergegeven om de celpopulaties na differentiatie weer te geven.

5PD1/5PD2

Een eerste dataplot 5PD1 zet volume (y-as) uit t.o.v. geroteerde lichtverstrooiing of

‘rotated light scattering’ (RLS, x-as). De tweede dataplot 5PD2 zet volume uit (y-as)

t.o.v. de ondoorzichtigheid (OP, x-as). (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Figuur 26: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-

as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie en de situering

van de populaties witte bloedcellen op de x-as. (Beckman Coulter

Ireland, 2013)

Figuur 25: Histogram van de

bloedplaatjes (PLT) met op de x-

as het celvolume (fL) en op de y-

as de celfrequentie.


rode bloedcellen (RBC) met op de

x-as het celvolume (fL) en op de

y-as de celfrequentie.


witte bloedcellen (WBC) met op

de x-as het celvolume (fL) en

op de y-as de celfrequentie.



NRBC1/NRBC2

Voor de NRBC worden ook 2 dataplots weergegeven. Deze dataplot geeft twee populaties

weer , de WBC en de NRBC. De eerste dataplot NRBC1 ze het licht dat doorgelaten wordt

door de cel (AL2, x-as) uit t.o.v. van de ‘rotaded angle light scatter’ (RLALS, y-as). De

tweede dataplot NRBC2 geeft het volume (RUMALS, y-as) weer t.o.v. van het licht dat

door de cel wordt doorgelaten (AL2, x-as). (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Figuur 28: Celpopulaties nucleated red blood cells (rood), witte

bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) weergegeven op de

2D-dataplot na differentiatie. Links de NRBC1-dataplot met op de x-as

het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de ‘rotated light angle

scatter’ (RLALS). Rechts de NRBC2-dataplot met op de x-as het

volume (RUMALS) en op de y-as het doorgelaten licht (ALS2).

Figuur 27: Celpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen),

neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-

witte bloedcellen (rood) weergegeven op de 2D-dataplots na

differentiatie. Links de 5PD1-dataplot met op de x-as de ‘rotated

light scattering’ (RLS) en op de y-as het volume (V). Rechts de 5PD2

dataplot met op de x-as het de ondoorzichtigheid (OP) en op de y-as

het volume (V).



1.1.5.6. 3D-DATAPLOTS

Deze dataplot plaats 3 assen ten opzichte van elkaar waardoor een 3D structuur in de

vorm van een kubus gecreërd wordt. Deze dataplots geven de populaties weer op basis

van densiteit volume, lichtverstrooiing (RLS) en het doorgelaten licht (OP) waardoor een

3D-structuur onstaat. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.5.7. SURFACE-PLOTS

Deze hebben dezelfde assen zoals de 2D plots maar bevatten nog de densiteit op een z-

as. Deze z-as wordt weergegeven als een piekhoogte. Hoe meer cellen van een bepaalde

populatie aanwezig, hoe hoger de piek op de oppervlakte. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Figuur 31: Surface-plot van de

NRBC1-plot met op de x-as het

doorgelaten licht (AL2) en op de y-as

de ‘rotated light angle scatter’

(RLALS). Nucleated red blood cells

(rood), witte bloedcellen (blauw), en

andere populaties (groen)

Figuur 30: Surface-plot van de

5PD1-plot met op de x-as de ‘rotated

light scattering’ (RLS) en op de y-as

het volume (V). Lymfocyten (blauw),

monocyten (groen), neutrofielen

(paars), eosinofielen (oranje),

basofielen (wit) en non-witte

bloedcellen (rood)

Figuur 29: 3D-dataplot met de assen volume, lichtverstrooiing en het doorgelaten licht geeft de

elpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje),

basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weer.



1.1.5.8. CODES

Wanneer het toestel geen resultaten kan genereren door bijvoorbeeld problemen tijdens

de analyse, wordt een code weergegeven in plaats van het resultaat. (Beckman Coulter

Ireland, 2013)

Tabel 10: Codes op de UniCel DxH800 (Beckman Coulter Ireland, 2013)

Code Beschrijving

===== De analyse werd stopgezet door het systeem

::::: In de flow cel is een klonter gedetecteerd

….. De berekende parameter kan niet worden berekend omdat een van de primaire

parameters buiten de meetrange ligt. Of verschijnt wanneer de klep van het toestel

werd geopend tijdens de analyse.

+++++ Resultaat overschrijdt de operatierange

????? Resultaat ligt buiten de range van waarden die op het scherm kunnen worden

weergegeven

##### Resultaat werd verworpen

1.1.5.9. SUSPECT/SYSTEM/DEFINITIVE MESSAGES

De ‘suspect’, ‘system’ en ‘definitive’ berichten worden weergegeven in het vak

Susp/Sys/Def net onder de patiëntgegevens aan de bovenkant van het scherm. ‘Suspect’

berichten zijn rood; ‘System’ berichten zijn groen, en ‘definitive’ berichten zijn blauw.

Berichten zijn alfabetisch gerangschikt in hun soort. (Beckman Coulter Ireland, 2013)

1.1.6. PROEFOPSTELLING

Gedurende 12 dagen werden 296 EDTA-volbloed monster van de malaria negatieve

controlegroep, 178 monsters van de groep patiënten met een infectie, 136 monsters van

de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie en 6 monsters van de malaria

positieve controlegroep geanalyseerd op de UniCel DxH 800. Van elk staal in deze

groepen werden de resultaten van enkele parameters geëvalueerd (tabel 8).

Tabel 11: Parameters op de Beckman Coulter DxH80 die in deze studie worden geëvalueerd.

Complete blood count (CBC) Differentiatie Additionele gegevens

Rode bloedcellen count Neutrofielen SD V lymfocyten

Bloedplaatjes count Lymfocyten SD V monocyten

Witte bloedcellen count Monocyten Malaria discriminant factor

Eosinofielen

Basofielen



1.1.7. METHODE

1.1.7.1. MONSTERAFNAME

Volbloed werd veneus afgenomen in paarse K3EDTA tubes. Deze tubes werden in het

trieercentrum gelabeld a.d.h.v. de aangevraagd analyses. Het was uitermate belangrijk

dat in deze monsters geen bloedstolsels aanwezig waren omdat dit resulteert in vals lage

waarden van de bloedplaatjes. De bloedmonsters in deze studie waren maximaal 48

dagen oud.

1.1.7.2. CONTROLES

Elke ochtend werden 2 controlereeksen met het toestel geanalyseerd alvorens er werd

gestart met de routinetubes. De Coulter 6C Cell controlereeks geeft de mogelijkheid om

na te gaan of het toestel nog een correcte werking heeft voor alle gemeten en

gecalculeerde parameters (CBC, differentiatie en NRBC parameters). De Coulter Retic-X

Cell controlereeks wordt toegepast om de reticulocyten parameters te controleren. Elke

controlereeks bevat 3 controletubes; een monster met hoge, normale en lage waarden

voor de parameters. Wanneer deze controles geen afwijkende waarden vertoonden (niet

boven 3SD) konden de resultaten binnen de tijdspanne van twee opeenvolgende

controles vrijgegeven worden, d.w.z. deze monsters waren correct geanalyseerd.


1.1.7.3. ANALYSE OP UNICEL DXH 800

De routine EDTA-tubes werden na triage met hun dop in de casettes (rekjes) geplaatst

die compatibel zijn met de DxH 800 en de SMS en met de tubes. Dit rek heeft een

capaciteit voor 5 tubes. Elke plaats in de cassette heeft een eigen ID-barcode, de tubes

werden zodanig geplaatst dat de 2D-barcode leesbaar is langs de opening van de

cassette.

De cassette werd vervolgens op het toestel geplaatst. De transportband detecteerde het

rekje en plaatste via een transportband het rekje tot voor de barcodereader. De laser

scande de barcodes van de tubes en van de plaatsen op het rek. Op deze manier kon het

toestel weten welke tube zich waar bevindt. Het rekje werd doorgeschoven naar een

mengonderdeel, waar het hele rekje 11 keer gekanteld werd waardoor alle tubes samen

gemengd werden. Vervolgens daalde de naald en detecteerde automatisch de hoogte van

de tube om op deze manier te weten hoe diep de naald moet aspireren. Vervolgens werd

een volume van 165µl bloed geaspireerd en via tubings en valven naar de analysekamers

van het toestel geleid. Tussen de aspiratie van 2 tubes werd het rekje nogmaals 4 maal



gekanteld. Na analyse van alle tubes in het rekje, werd het rekje doorgeschoven naar de

output bufferruimte.

De aspiratienaald (SAM : Sample aspiration module) transporteerde het monster naar

een valve waar het monster werd gesegmenteerd voor een CBC analyser (Complete

blood count). Wanneer ook een differentiatie, een NRBC analyse of een reticulocyten

analyse werd aangevraagd, werd via dezelfde naald ook monster verdeeld over

verschillende dilutie of mengkamers.

1.1.7.4. STATISTIEK

De onderzochte parameters en de factor van de vier groepen werden grafisch

weergegeven als een boxplot die de verdeling van de data voorstelde. Vervolgens werd

ook met behulp van een t-test de parameter tussen alle groepen vergeleken om

significante verschillen waar te kunnen nemen. Er werd gebruik gemaakt van een t-test

op het gemiddelde van 2 reeksen ongepaarde metingen (twee verschillende groepen)

met ongelijke varianties. De outliers werden opgespoord door gebruik te maken van de

Grubb’s outlier test.

1.2. RESULTATEN

Tabel 12: Het aantal monsters met een malariafactor hoger dan 4,5 en lager dan 4,5 per groep na analyse op

de UniCel DxH 800.


< 4,5


> 4,5

NORMAAL (296 monsters)

Malaria negatieve

controlegroep

296 monsters 0 monsters

MALARIA (6 monsters)

Malaria positieve controlegroep 0 monsters 6 monsters

INFECTIE (178 monsters)

Groep patiënten met een

infectie


TRAVEL (136 monsters)

Groep militairen terugkerend

van buitenlandse missie




1.2.1. PARAMETERS PER GROEP

1.2.1.1. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP (NORMAAL)

Tabel 13: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse

op de UniCel DxH 800 voor de malaria negatieve controlegroep.

Complete blood count

(CBC) / differentiatie Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde

Standaard-

deviatie (SD)

Rode bloedcellen 3,78 106/mm³ 6,05 106/mm³ 5,00 106/mm³ 0,36 106/mm³

Bloedplaatjes 130 103/mm³ 391 103/mm³ 227,46 103/mm³ 45,39 103/mm³

Witte bloedcellen 3,0 103/mm³ 14,8 103/mm³ 6,80 103/mm³ 2,09 103/mm³

Neutrofielen 32 % 81% 56,77 % 8,97 %

Lymfocyten 12,3 % 57 % 30,94 % 7,96 %

Monocyten 2 % 19 % 8,95 % 2,11 %

Eosinofielen 0 % 9,4 % 2,66 % 1,78 %

Basofielen 0 % 2,1 % 0,69 % 0,36 %

SD V lymfocyten 11,27 20,46 13,90 1,21

SD V monocyten 13,62 23,55 16,86 1,58

Malaria discriminant

factor 1,6720 4,4235 2,3498 0,3646

1.2.1.2. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP (MALARIA)


op de UniCel DxH 800 voor de malaria positieve controlegroep.


(CBC) / differentiatie Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde

Standaarddeviatie

(SD)




Neutrofielen 16,9 % 87 % 63,6 % 24,23 %

Lymfocyten 9,4 % 61,5 % 23,55 % 19,80 %

Monocyten 2,3 % 20,5 % 11,25 % 7,46 %

Eosinofielen 0,4 % 1,6 % 0,93% 0,45 %

Basofielen 0,1 % 1 % 0,67 % 0,36 %

SD V lymfocyten 19,29 42,94 29,51 9,32

SD V monocyten 12,8 33,97 26,13 7,82


factor 5,2835 9,0469 7,2485 1,7555



1.2.1.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE (INFECTIE)


op de UniCel DxH 800 voor de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie.


(CBC) Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde

Standaarddeviatie

(SD)




Neutrofielen 24,90 % 94,00 % 67,4551 % 13,63 %

Lymfocyten 24,0 % 68,70 % 20,9557 % 12,18 %

Monocyten 1,00 % 16,40 % 8,5749 % 3,11 %

Eosinofielen 0,00 % 8,00 % 2,1204 % 1,73 %

Basofielen 0,00 % 1,80 % 0,391% 0,36 %

SD V lymfocyten 12,1 29,54 17,1766 2,92

SD V monocyten 14,33 29,2 20,3218 2,81


factor 2,0180 7,0364 3,5251 0,9225

1.2.1.4. GROEP TERUGKERENDE MILITAIREN VAN BUITENLANDSE MISSIE (TRAVEL)


op de UniCel DxH 800 voor de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie.

Complete blood

count (CBC)

Minimum

waarde

Maximum

waarde Gemiddelde

Standaarddevia

tie (SD)




Neutrofielen 37,60 % 83,80 % 57,17 % 9,40 %

Lymfocyten 10,00 % 53,00 % 31,58 % 8,41%

Monocyten 3,00 % 14,50 % 8,22 % 2,09 %

Eosinofielen 0,00 % 12,00 % 2,37 % 1,86 %

Basofielen 0,00 % 1,40 % 0,66 % 0,30 %

SD V lymfocyten 11,8 21,90 14,0404 1,43

SD V monocyten 14,17 29,11 17,0016 1,94


factor 1,8948 5,8307 2,4024 0,5230



1.2.2. MALARIA DISCRIMINANT FACTOR

Figuur 32: Boxplot voor de evaluatie van de malaria discriminant factor met n= het aantal monsters.

Tabel 17: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de malaria discriminant factor

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL

& TRAVEL

NORMAAL &

MALARIA

INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

TRAVEL &

MALARIA

Significant

verschil

**p < 0.01 p > 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 **p < 0.01 **p < 0.01

4,4235**

7,0364*

5,8307**

4,3367**

5,1859**

3,8980*

4,6494**

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

3,5000

4,0000

4,5000

5,0000

5,5000

6,0000

6,5000

7,0000

7,5000

8,0000

8,5000

9,0000

9,5000

10,0000

Monsters van personen in goede

gezondheid (n=296)

Monsters van 52 personen met een

infectie (n=178)

Monsters van personen

terugkerend van missie (n=136)

Monsters van personen met een

malaria infectie (n=6)

Mal

aria

fact

or

(SD

vo

lum

e ly

mfo

cyte

n x

SD

vo

lum

e m

on

ocy

ten

) / 1

00

)

Groep

Studie malaria discriminant factor (Beckman Coulter DxH800)



1.2.3. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME LYMFOCYTEN (SD V LYMFOCYTEN)

Figuur 33: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten)

met n= het aantal monsters.

Tabel 18: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor

de lymfocyten (SD V lymfocyten).

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL

& TRAVEL

NORMAAL &

MALARIA

INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

TRAVEL &

MALARIA

Significant

verschil

**p < 0.01 p> 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 *p < 0.05 **p < 0.01

20,4600**

29,5400**

21,9000**

20,0400**

28,5800**

20,0300**

19,0000** 19,4700*

10,0000

12,0000

14,0000

16,0000

18,0000

20,0000

22,0000

24,0000

26,0000

28,0000

30,0000

32,0000

34,0000

36,0000

38,0000

40,0000

42,0000

44,0000

46,0000


gezondheid (n=296)


infectie (n=179)

Monsters van personen

terugkerend van missie (n=136)



SD V

Lym

focy

ten

Groep

Studie SD V Lymfocyten (Beckman Coulter DxH800)

(n=6)



1.2.4. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME MONOCYTEN (SD V MONOCYTEN)

Figuur 34: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten)

met n= het aantal monsters.

Tabel 19: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor

de monocyten (SD V monocyten).

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL

& TRAVEL

NORMAAL &

MALARIA

INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

TRAVEL &

MALARIA

Significant

verschil

**p < 0.01 p > 0.05 *p < 0.05 **p < 0.01 p > 0.05 *p < 0.05

23,5500**

29,1100**

23,1200* 23,8800* 23,6800*

10,0000

12,0000

14,0000

16,0000

18,0000

20,0000

22,0000

24,0000

26,0000

28,0000

30,0000

32,0000

34,0000

36,0000


gezondheid (n=296)


infectie (n=179)

Monsters van personen terugkerend

van missie (n=136)



SD V

Mo

no

cyte

n

Groep

Studie SD V monocyten (Beckman Coulter DxH800)

(n=6)



1.2.5. BLOEDPLAATJES

Figuur 35: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van de bloedplaatjes met n= het aantal monsters.

Tabel 20: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de bloedplaatjes.

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL

& TRAVEL

NORMAAL &

MALARIA

INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE

& MALARIA

TRAVEL &

MALARIA

Significant

verschil

**p< 0.01 p > 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 *p < 0.05 **p < 0.01

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

Monsters van personen in goede gezondheid

(n=295)

Monsters van 52 personen met een

infectie (n=178)

Monsters van personen terugkerend van missie

(n=136)

Monsters van personen met een malaria

infectie (n=6)

Blo

ed

pla

atje

s (

.10

³/m

m³)

Groep

Studie Bloedplaatjes (Beckman Coulter DxH800)



1.2.6. HISTOGRAM

Vier van de zes malaria positieve monsters vertoonden vermoedelijk een extra

celpopulatie kleiner dan de lymfocyten. Het histogram op dit toestel toonde de piek voor

de 35 fL grenswaarde niet, maar een hoge celfrequentie op de 35 fL grens en geen goede

afgescheiden piek voor deze grens wees op de aanwezigheid van de extra piek of

celpopulatie kleiner dan 35 fL. De celfrequentie bij de malaria positieve monsters op deze

grenswaarde is veel hoger dan die bij normale (niet malaria) monsters. Alle

histogrammen van de monsters met een vals positieve malariafactor (hoger dan >4,5)

vertoonden een lagere celfrequentie op de 35 fL grenswaarde, waardoor geconcludeerd

werd dat er geen extra celpopulatie of piek aanwezig was voor de 35 fL grenswaarde.

Figuur 36: WBC-histogrammen van de malaria positieve monsters. Histogrammen A, B, D en E vertonen geen

mooie afgescheiden piek op de 35 fL genswaarde. Het begin van een extra piek of populatie is zichtbaar ter

hoogte van de 35 fL grenswaarde.

Figuur 37: WBC-histogrammen van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5).

Histogrammen A t.e.m.H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en histogrammen I

t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. Deze

histogrammen vertonen geen extra piek voor de 35 fL grenswaarde



1.2.7. DATAPLOTS

1.2.7.1. 5PD1

De 5PD1-dataplots van de malaria positieve monsters en de monsters met een vals

positieve malaria factor werden geëvalueerd. Deze dataplot onderscheidt de populaties

lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje),

basofielen (wit) van elkaar.

Op de dataplots van de malaria positieve monsters was een meer verspreidde populatie

monocyten en lymfocyten aanwezig op de dataplots en was er geen optimale scheiding

tussen de populaties t.o.v. een normaal monster (figuur 38 met parameters binnen de

referentiewaarden en een goede scheiding tussen de populaties). Links onderaan lagen

bij alle malaria positieve monsters een opmerkelijk grotere rode populatie t.o.v. van een

normaal monster. Deze rode populatie bevat het ‘puin’ dat niet als een witte bloedcel

werd gedefiniëerd. Volgens de literatuur zijn deze rode dots de malariasignalen.

Echter toonden enkele monsters (figuur 40: monsters A, G, I, J en K ) met een vals

positieve malaria discriminant factor (>4,5) ook een rode populatie en een meer

verspreidde populatie monocyten en lymfocyten op de 5DP1 dataplot. Bij deze monsters

was de populatie met rode dots minder dens dan bij de malaria positieve monsters.

Figuur 38: Differentiatie 5PD1-dataplot van een

normaal monster (parameters binnen

referentiewaarden en persoon in goede

gezondheid).



Figuur 39: Differentiatie 5PD1-dataplots van malaria positieve monsters.

Figuur 40: Differentiatie 5PD1-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor

(>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I

t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie.



1.2.7.2. NRBC1

De NRBC1 dataplots van de malaria positieve monsters en de monsters met een vals

positieve malaria factor (>4,5) werden geëvalueerd. Deze dataplot onderscheidt de

populatie witte bloedcellen (blauw) van de gekernde rode bloedcellen of erytroblasten

(NRBC, rood) en de non-witte bloedcellen (groen).

Op de dataplots van twee monsters met een P.ovale infectie (figuur 46, monsters A en F)

was linksonder op de dataplots een duidelijke groene populatie zichtbaar t.o.v. een

normaal monster (figuur 41 met parameters binnen de referentiewaarden). Volgens de

literatuur zouden deze groene dots de malariasignalen voorstellen. De groene dots

linksboven op de dataplot waren mogelijk bloedplaatjesaggregaten. De overige malaria

positieve monsters met een P.falciparum infectie (figuur 42, monsters B, C, D en E)

vertonen echter geen groene populatie links onderaan de dataplot.

De monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5) (figuur 43)

vertoonden geen groene populatie links onderaan de dataplot.

Figuur 41: NRBC1 data-plot van een normaal

monster (parameters binnen referentiewaarden).



Figuur 42: NRBC-dataplots van malaria positieve monsters.

Figuur 43: NRBC-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5).

Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K

zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie.



1.2.8. SENSITIVITEIT / SPECIFICITEIT / CUTT-OFF WAARDE

Van de negatieve controlegroep en de groep patiënten met een infectie (andere infectie

dan malaria) is gekend dat deze groep negatief is voor een malaria-infectie, en bij de

positieve controlegroep dat ze positief is voor een malaria-infectie.

Wanneer de cut-off waarde voor malaria werd ingesteld op 4,5 is een sensitiviteit van

100% en een specificiteit van 94,30% waar te nemen. Op basis van deze data zou de

cut-off waarde voor de malariafactor verhoogd kunnen worden naar 5,0 wat het aantal

vals positieve monsters in deze studie met ongeveer 48% reduceert zonder het aantal

vals negatieve te induceren, dit resulteert in een sensitiviteit van 100% en een

specificiteit van 97,26%.

Tabel 21: Sensitiviteit/specificiteit malaria discriminant factor berekend op de resultaten van de monsters uit

de vier groepen (positieve controlegroep, negatieve controlegroep, groep terugkerende militairen van

buitenlandse missie en de groep patiënten met een infectie).

4,0 4,5 5,0

5,5 6,0

6,5

9,0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0 2 4 6 8 10 12

Sen

siti

vite

it (

%)

100-Specificiteit(%)

ROC analyse Malariafactor Beckman Coulter UniCell DxH800

Plasmodium in bloed

(Microscopie postief)

Geen Plasmodium in het bloed

(Microscopie negatief)

Malariafactor > 4,5 6

(TP: True Positive)

27

(FP: False Positive)(11 patiënten)

Malariafactor < 4,5

0

(FN : False Negative)

480

(TN: True Negative)

Totaal 6 507

Sensitiviteit ( in deze studie) 100 %

Specificiteit (in deze studie) 94,30 %

Figuur 44: ROC-analyse van de malaria disciminant factor geeft een ideale cut-off waarde van 5,0 op basis

van de data in deze studie.



1.3. DISCUSSIE

Er is een significant verschil waar te nemen in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van

het volume van de lymfocyten (p<0.01) en in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van

het volume van de monocyten (p<0.05) tussen de malaria negatieve en de malaria

positieve controlegroep.

Er is een significant verschil waar te nemen in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van

het volume van de lymfocyten (p<0.05), maar geen significant verschil in de

standaarddeviatie (SD of spreiding) van het volume van de monocyten (p>0.05) tussen

de malaria negatieve en de malaria positieve controlegroep. De spreiding van het

celvolume van de monocyten bij de malaria positieve monsters en de monsters met een

andere infectie dan malaria zijn beide verhoogd en overlappen elkaar.

De malaria discriminant factor is berekend op basis van de standaarddeviatie van het

volume van lymfocyten en van de monocyten ((SD V lymfocyten*SD V monocyten)/100).

Deze factor is significant verschillend (p<0.01) tussen de vergelijkingen van deze drie

groepen (malaria positieve controlegroep, malaria negatieve controlegroep en de groep

patiënten met een infectie). Wanneer de cut-off waarde van de malariafactor op 4,5 werd

ingesteld, worden in de groep patiënten met een infectie 27 vals positieve monsters

vastgesteld door gebruik te maken van microscopie als referentiemethode (zie later). Er

een overlapping waar te nemen van de laagste waarden van de malaria positieve

controlegroep met de hoogste waarden van de onderzoeksgroep gehospitaliseerde

patiënten met een infectie. De malariafactor is onderhevig aan de veranderingen in de

celpopulaties van andere infecties wat resulteert in vals positieve malaria indicaties.

Tabel 22: Significante verschillen malaria discriminant factor (Malaria D factor).

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL &

TRAVEL

NORMAAL &

MALARIA

INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

TRAVEL &

MALARIA

Malaria D factor p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01

SD V lymfocyten p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.05 p < 0.01

SD V monocyten p < 0.01 p > 0.05 p < 0.05 p < 0.01 p > 0.05 p < 0.05

Bloedplaatjes p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01

Op basis van deze data zou de cut-off waarde voor de malariafactor verhoogd kunnen

worden naar 5,0 wat het aantal vals positieve monsters met ongeveer 48% reduceert

zonder het aantal vals negatieve te induceren, dit resulteert in een sensitiviteit van 100%

en een specificiteit van 97,25%. De omvang van de monsters in de malaria positieve

controlegroep is echter klein (6 monsters) waardoor de studie best herhaald wordt met

een groter aantal monsters om deze conclusie te bekrachtigen



Het aantal bloedplaatjes kan een indicatie zijn voor een malaria-infectie, maar er kunnen

even goed monsters afkomstig van malaria geïnfecteerde patiënten een normaal aantal

bloedplaatjes bevatten. Het enkel focussen op deze parameter zou het aantal

valsnegatieve monsters verhogen. Deze parameter is niet specifiek genoeg om een

malaria-infectie vast te stellen.

De extra celpopulatie voor de 35 fL grenswaarde die zichtbaar was als een hogere

celfrequentie op de 35 fL grens t.o.v. van een normaal staal kan een indicatie zijn voor

een malaria-infectie. Deze extra celpopulatie was bij de patiënten met een andere

infectie dan malaria en een malaria dicriminant factor > 4,5 afwezig, wat het onderscheid

kan maken tussen deze twee groepen. Maar het is ook bekend dat

bloedplaatjesaggregaten deze extra piek ook kunnen genereren.

De rode populatie links onderaan de differentiatie 2D-dataplots van de lichtverstrooiiing

(5PD1) was zowel bij de malaria positieve monsters als bij sommige monsters met een

andere infectie dan malaria en een malaria discriminant factor > 4,5 aanwezig. Hierdoor

is deze dataplot het niet ideaal om een indicatie voor malaria aan te geven.

De groene populatie links onderaan, de ‘malariasignalen’ op de NRBC 2D-dataplots waren

enkel aanwezig bij de positieve malaria monsters met een P.ovale infectie. Deze signalen

waren bij de patiënten met een andere infectie dan malaria en een malaria dicriminant

factor > 4,5 afwezig

Deze dataplot kan een bevestiging zijn van een P.ovale-infectie maar niet voor alle

Plasmodium species.



2. SNELTEST (SD p.f./pan)


2.1.1. APPARATUUR

Er wordt gebruik gemaakt van de SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan sneltest-kit. Deze kit

bevat capillairen, een bufferoplossing en sneltestcassettes.

2.1.2. MONSTER

Als monster kan zowel vers veneus bloed als veneus bloed in een EDTA-, citraat- of

heparinetube gebruikt worden. Stalen ouder dan 3 dagen kunnen resulteren in een

aspecifieke reactie. Wanneer de stalen bewaard worden in de koelkast, moeten ze binnen

de 3 dagen gebruikt worden voor de sneltest. (Alere, 2013)

2.1.3. MEETPRINCIPE

Deze sneltest maakt de detectie van het antigen HRP-2 specifiek voor Plasmodium

falciparum en het antigen pLDH pan specifiek voor Plasmodium species in een humaan

bloedmonster mogelijk. Pan specifiek betekent dat de vier species van Plasmodium

gedetecteerd kunnen worden. (Alere, 2013)

De sneltestcassette bevat een membraanstrip met 3 regio’s. Op de P.f.-regio werden

monoklonale muisantilichamen geïmmobiliseerd die specifiek zijn voor HRP-2

(P.falciparum). Dit antigen is een glycoproteïne dat massaal wordt geproduceerd door te

trofozoïeten en de jonge gametocyten van het species P.falciparum. Het antigen kan tot

28 dagen na het verdwijnen van de parasieten in het bloed aanwezig blijven. Op de pan

regio werden muis monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd die specifiek zijn voor LDH

van de vier Plasmodium species. Dit antigen is een lactaat dehydrogenase dat

geproduceerd wordt door de aseksuele vormen van alle Plasmodium species. Op de

controleregio werden geit-anti-muis monoklonale antilichamen gebonden die binden met

de vije niet-gebonden muisantilichamen. In deze regio moet steeds een zichtbare lijn

verschijnen om te concluderen dat de migratie van de componenten correct gebeurde en

om de sneltest als geldig aan te nemen. (Alere, 2013) (World Health Organization, 1999)

Daarnaast zijn er ook niet gebonden muisantilichamen (HRP-2 en pLDH) aanwezig op het

membraan en deze zijn met colloïd goud geconjugeerd en kunnen een reactie aangaan

met de malaria antigenen in het bloedstaal. Volgens het chromatografisch principe zullen

deze migreren over het membraan tot de verschillende regio’s. Op de regio’s zal het

antigen-antilichaam complex specifiek voor het geïmmobiliseerde antilichaam op het

membraan binden en een zichtbare lijn induceren. De colloïd goud geconjugeerde vrije



antilichamen op het membraan migreren verder tot de controlelijn waar ze binden met

de geïmmobiliseerde antilichamen en ook een zichtbare lijn induceren. (Alere, 2013) (World

Health Organization, 1999)

Tijdens het aanbrengen van het monster wordt ook een buffer toegevoegd. Deze buffer

bevat runderalbumine die dient als blokkeerstof om aspecifieke bindingen te voorkomen,

maar bevat ook Triton X-100 die de rode bloedcellen lyseert. (Alere, 2013) (World Health

Organization, 1999)

Echter is er een kans op valsnegatieve RDT’s door het prozone-effect. Het prozone-effect

of het hoge-dosis ‘Hook’ effect treedt op wanneer er een overmaat te detecteren

antilichamen of antigenen aanwezig zijn in het te onderzoeken monster. Een studie van

het Instituut Tropische Geneeskunde te Antwerpen en de faculteit ‘Health, medicine and

Life Sciences’ van de Universiteit te Maastricht toonde aan dat het prozone-effect een

oorzaak is van valsnegatieve P.falciparum bij RDT’s die HRP-2 antigenen detecteren.

Terwijl het pLDH, en pan specifiek-LDH geen prozone-effect vertoonden.

Hyperparasitemie van P.falciparum kan resulteren in valsnegatieve resultaten bij een

HRP-2 sneltest. (World Health Organization, 1999) (Gillet et al., 2009)

SD Bioline beweert dat deze sneltest een sensitiviteit heeft van 99,7% bij P.falciparum

monsters, 95,5% bij non-P.falciparum monsters en een specificiteit van 99,5%. (Alere,

2013)

Figuur 45: Immunochromatografisch principe voor de malariadetectie van de SD SD BIOLINE

Malaria Ag P.f/Pan sneltest (World Health Organization, 1999)



2.1.4. PROCEDURE

Elk bloedmonster met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 na analyse op de

UniCel DxH 800 en elk bloedmonster uit de malaria positieve controlegroep, werd

aangebracht op een sneltestcasette en geinterpreteerd.

Na analyse op de UniCel DxH 800 werd bij 28 bloedmonsters van de 178 bloedmonsters

uit de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie, een malaria discriminant factor

hoger dan 4,5 waargenomen. Dit waren 28 bloedmonsters afkomstig van 8

gehospitaliseerde patiënten op de infectie-afdeling. Wegens de hoge kostprijs van de

sneltest werd geopteerd om slechts één positief bloedmonster per patiënt te

onderzoeken. De 6 bloedmonsters uit de malaria positieve controlegroep, die ook een

malaria discriminant factor hadden hoger dan 4,5 na analyse op de UniCel DxH 800

werden onderzocht met de sneltest. Tenslotte werden de 3 bloedmonsters met een

malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de groep militairen terugkerend van

buitenlandse missie ook onderzocht met de sneltest.

Er werd een volume van 5 µl bloed op de cassette aangebracht in de ‘sample’ opening en

5 druppels buffer in de bufferopening. Na 15 minuten werd de testregio van de

sneltestcassette geïnterpreteerd.

Figuur 46: Werkwijze voor de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013)

Tabel 23: Interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013)

Sneltestcassette Interpretatie

Positief: Plasmodium falciparum-infectie

Positief: Plasmodium falciparum-infectie positief of menginfectie

van Plasmodium falciparum met een andere Plasmodium species

Positief: Andere Plasmodium species (niet P.falciparum) infectie

Negatief

Ongeldig: Controlelijn is niet zichtbaar

Ongeldig: Controlelijn is niet zichtbaar



2.2. RESULTATEN

2.2.1. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP

Vijf onderzochte bloedmonsters met een discriminant factor hoger dan 4,5 gaven een

postivieve sneltest. Slechts één bloedmonster van een patiënt gediagnosticeerd met

malaria (P.ovale) gaf een negatieve sneltest, dit is dus een vals-negatief resultaat van de

sneltest.

Vier van de 6 bloedmonsters gaven na de interpretatie van de sneltest een positief

resultaat voor een Plasmodium falciparum-infectie of een menginfectie van Plasmodium

falciparum met de andere Plasmodium species. Eén van de 6 bloedmonsters gaf na de

interpretatie van de sneltest het resultaat van een infectie met Plasmodium ovale,

Plasmodium vivax of Plasmodium malariae. Echter werd ook na de sneltest vastgesteld

dat één bloedmonster een negatief resultaat gaf voor Plasmodium, terwijl dit monster

afkomstig is van een patiënt gediagnosticeerd met malaria.

Tabel 24: Resultaten van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep.

Aantal personen met een

positieve malaria sneltest


negatieve malaria sneltest

Aantal patiënten met een malaria discriminant

factor hoger dan 4,5 na analyse op UniCel DxH

800 (6 monsters)

5 1

Tabel 25: Resultaten, foto’s en interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria

positieve controlegroep.

Bloedmonster Regio’s Interpretatie Confirmatie

ITG

Gekleurd bandje:

- Controleregio Negatief = Vals-negatief P.ovale

Gekleurd bandje:

- Controleregio

- Pan regio

- P.f. regio

Positief: P.falciparum-infectie

positief of menginfectie van P.

falciparum met een andere

Plasmodium species

P.falciparum

Gekleurd bandje:

- Controleregio

- Pan regio

- P.f. regio




Plasmodium species

P.falciparum

Gekleurd bandje:

- Controleregio

- Pan regio

- P.f. regio

Positief: P. falciparum-infectie



Plasmodium species

P.falciparum



Gekleurd bandje:

- Controleregio

- Pan regio

- P.f. regio


positief of menginfectie van

P.falciparum met een andere

Plasmodium species

P.falciparum

Gekleurd bandje:

- Controleregio

- Pan regio

Positief: Plasmodium species

infectie positief P.ovale

2.2.2. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP

Er werden geen bloedmonsters uit deze groep onderzocht omdat geen enkel monster een

malaria discriminant factor hoger dan 4,5 had na analyse op de Beckman Coulter DxH.

2.2.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE (NIET-MALARIA)

De 8 onderzochte bloedmonsters van de 8 patiënten waarvan de 27 bloedmonsters met

een discriminant factor hoger dan 4,5 afkomstig waren gaven een negatieve sneltest.

Tabel 26: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria).

Aantal patiënten met een


Aantal patiënten met een


Aantal patiënten met een malaria

discriminant factor hoger dan 4,5 na

analyse op UniCel DxH 800 (8 patiënten)

0 8

2.2.4. GROEP MILITAIREN TERUGKEREND VAN BUITENLANDSE MISSIE

Uit de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie bleken na de sneltest de 3

bloedmonsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 een negatieve sneltest

te vertonen.

Tabel 27: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep militairen terugkerend

van buitenlandse missie.





Aantal personen met een malaria

discriminant factor hoger dan 4,5 na

analyse op UniCel DxH 800 (3 monsters)

0 3



2.3. CONCLUSIE

Er werd de som gemaakt van de bloedmonsters uit de 3 onderzoeksgroepen die een

malaria discriminant factor hoger dan 4,5 gaven, namelijk 36 bloedmonsters. Van de 36

bloedmonsters bleken uit de sneltest slechts 5 bloedmonsters een echt positieve sneltest

te vertonen voor een Plasmodium-infectie (true positive) op basis van de sneltest, de

malaria discriminant factor, de microscopie en de malaria diagnose van het ITG. Op basis

van de sneltest en de malaria discriminant factor én de gekende malariadiagnose bleek

echter één bloedmonster een vals negatieve sneltest te vertonen (false negative). De

overige 30 bloedmonsters bleken op basis van de microscopie vermoedelijk een echte

negatieve sneltest te vertonen voor een Plasmodium-infectie (true negative).

Tabel 28: Som van de resultaten SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de

groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van

buitenlandse missie.

Positieve sneltest Negatieve sneltest

5 bloedmonsters

(True positive)

1 bloedmonster

(False negative)

Diagnose van malaria bekend

(confirmatie ITG)

0 bloedmonsters

(False positive)

11 bloedmonsters

(True negative)

Diagnose van malaria onbekend

(confirmatie ITG)

Tabel 29: Resultaten, specificiteit en sensitiviteit van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria

positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep

militairen terugkerend van buitenlandse missie.

Plasmodium in bloed

(Microscopie positief)

Geen Plasmodium in het bloed

(Microscopie negatief)

Sneltest positief 5 0

Sneltest negatief 1 11

Totaal 6 11

Sensitiviteit 83,3%

Specificiteit 100%

Op basis van deze studie heeft de sneltest SD Bioline Malaria Antigen P.f./Pan een

sensitiviteit van 83,3% en een specificiteit van 100%. De firma beweert dat de sneltest

een sensitiviteit heeft van 99,7% bij P.falciparum-monsters, 95,5% bij non-P.falciparum

monsters en een specificiteit van 99,5%. Op basis van de resultaten in deze studie is de

sensitiviteit van de sneltest 16,7% lager en de specificiteit 0,5% hoger dan wat men

beweert.

Door enkel een sneltest uit te voeren op de bloedmonsters met een factor hoger dan 4,5

kan onvoldoende bevestiging gegeven worden voor een malaria-infectie. Dit is te

concluderen uit één bloedmonster uit de malaria positieve controlegroep (P.ovale) die

een malaria factor hoger dan 4,5 had, maar een negatieve sneltest.



3. MICROSCOPIE

De microscopie blijft de ‘gouden standaard’ op vlak van malaria diagnose. De dikdruppel

en het bloeduitstrijkje worden altijd onderzocht om eerdere screeningstesten te

confirmeren. Voor de groep patiënten met een infectie en de groep militairen

terugkomend van buitenlandse missie werd een bloeduitstrijkje en dikdruppel onderzocht

wanneer de malaria discriminant factor hoger of gelijk was aan 4,5. Voor de malaria

positieve controlegroep werd voor elk monster een bloeduitstrijkje en een dikdruppel

onderzocht.


3.1.1. APPARATUUR

Voor de groep patiënten met een infectie en de groep militairen terugkomend van

buitenlandse missie werd steeds een automatisch bloeduitstijkje gemaakt en gekleurd

door de Beckman Coulter SMS. Wegens het beperkt monstervolume van de monsters uit

de malaria positieve controlegroep werden deze bloeduitstrijkjes manueel bereid maar

gekleurd met de Beckman Coulter SMS. De dikdruppel werd voor alle groepen manueel

bereid en gekleurd.

3.1.2. REAGENTIA

Methanol 96%

May Grünwald

Giemsa

Hemato-buffer pH 6,8

Malaria-buffer pH 7,5

3.1.3. PRINCIPE

3.1.3.1. BLOEDUITSTRIJKJE

Veneus afgenomen volbloed in een tube met anticoagulans K3EDTA of een druppel

volbloed afgenomen via een vingerprik werd uitgestreken op een objectglaasje tot een

dun laagje bloed werd bekomen. Een bloeduitstrijkje bestaat uit een dik gedeelte in het

begin van de vlam en een dun gedeelte in het uitlopend einde van de vlam. Hierdoor is

het bloed minder geconcentreerd in het einde van de vlam waardoor een monolayer van

rode bloedcellen na kleuring microscopisch kan waargenomen worden. Het

bloeduitstrijkje werd gefixeerd om de rode bloedcellen intact te houden en vervolgens

gekleurd met May-Grünwald Giemsa. Aangezien het bloed minder geconcentreerd is, is



de gevoeligheid van een bloeduitstrijkje lager dan die van het geconcentreerde

dikdruppel preparaat. Hierdoor wordt het bloeduitstrijkje voornamelijk gebruikt om de

Plasmodium species te identificeren in de rode bloedcellen. De rode bloedcellen in het

uitstrijkje zijn intact wat de identificatie makkelijker maakt. (Instituut voor Tropische

Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World

Health Organization 1999) (World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999)

(www.parasitologie.nl, 2006) (www.cdc.gov, 2011)

3.1.3.1. DIKDRUPPEL

Een druppel volbloed veneus afgenomen in een tube met anticoagulans K3EDTA of een

druppel volbloed afgenomen via een vingerprik werd aangebracht op een objectglaasje.

Deze druppel bloed werd gedefibrineerd door met een scherp voorwerp in de druppel

bloed te draaien. Dit gebeurde onmiddellijk en lang genoeg om een goed

dikdruppelpreparaat te bekomen. Het preparaat werd niet gefixeerd zodat de rode

bloedcellen lyseerden. Doordat de druppel bloed op een kleine oppervlakte

geconcentreerd werd, heeft dit preparaat een grotere sensitiviteit voor de Plasmodium

opsporing dan het bloeduitstrijkje. De detectielimiet is sterk afhankelijk van de

microscopist die het preparaat onderzoekt. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische

Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization 1999)

(World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999) (www.parasitologie.nl, 2006)

3.1.3.2. MAY GRÜNWALD GIEMSA

De May-Günwald Giemsa kleuring werd toegepast om de componenten van

hematologische uitstrijkjes te kleuren. De zure kleurstof eosine en de basische kleurstof

methyleenblauw in de May-Grünwald kleurstof hebben een affiniteit voor de basische

respectievelijke zure celcomponenten. Eosine bindt aan de positief geladen groepen in

hemoglobine of positief geladen korrels (alkalische derivaten) van de eosinofiele

granulocyten waardoor ze roze kleuren. Methyleenblauw kleurt het RNA en DNA doordat

het bindt aan de negatief geladen fosfaatgroepen, maar het kleurt ook de negatief

geladen korrels (heparine) in het cytoplasma van de basofiele granulocyten en het

primitieve cytoplasma waardoor deze blauw tot paars kleuren. De May-Grunwald

oplossing bevat ook methanol die de bloedcellen zal fixeren. Giemsa bevat naast eosine,

methyleenblauw en methanol ook het oxidatie product van methyleenblauw, namelijk

methyleenazuur. Methyleenazuur bevat polychrome (veelkleurige) kleureigenschappen

waardoor het de details van de kernen van de witte bloedcellen en de granulatie van de

bloedplaatjes beter en duidelijker zal kleuren. Vandaar dat Giemsa toegevoegd wordt aan

de May-Grünwald kleuring om een nog optimalere kleuring te bekomen en een beter

onderscheid te kunnen maken tussen de morfologie van de verschillende bloedcellen.

(Guillaume, 2009) (www.avantormaterials.com) (at.vwr-cmd.com)

http://www.parasitologie.nl/

http://www.cdc.gov/


http://www.avantormaterials.com/



3.1.3.3. GIEMSA

Zoals reeds vermeld bevat Giemsa eosine, methyleenblauw, methanol en

methyleenazuur. Methyleenazuur bevat polychrome (veelkleurige) kleureigenschappen

waardoor het de details van de kernen van de witte bloedcellen en de granulatie van de

bloedplaatjes beter en duidelijker zal kleuren. (Guillaume, 2009)

3.1.4. PROCEDURE

3.1.4.1. BLOEDUITSTRIJKJE MET MAY GRÜNWALD GIEMSA KLEURING

Er werd 5 µl volbloed (van K3EDTA tube of van een vingerprik afgenomen) en

aangebracht op een objectglaasje. Onmiddellijk na het aanbrengen van het bloed werd

een tweede objectglaasje met de smalle rand in een hoek van 45° geplaatst vlak voor de

druppel bloed. Door het objectglaasje naar achter te trekken tot tegen de druppel, vult

de contactoppervlakte tussen de twee objectglaasjes zich voor 2/3 met het bloed.

Vervolgens werd met een vloeiende en snelle beweging het objectglaasje naar voren

getrokken te om het bloed uit te strijken. (www.parasitologie.nl, 2006) (Deluol, 2004)

Het bloeduitstrijkje werd gedroogd aan de lucht maar bloeduitstrijkjes die bereid werden

met volbloed uit K3EDTA tubes moesten extra lang drogen omdat de adhesie aan de

objectglaasjes moeilijker verloopt. Het uitstrijkje werd manueel aangeboden aan de

Beckman Coulter SMS en doorliep een automatisch kleurproces doordat het objectglaasje

verschillende baden doorliep (methanol 96%, May-Grünwald ½ verdund met

hematobuffer pH 6,8, Giemsa ½ verdund met hematobuffer pH 6,8). (Beckman Coulter

Ireland, 2013)

3.1.4.2. DIKDRUPPEL

Er werd 5 µl volbloed (van K2EDTA tube of van een vingerprik afgenomen) en

aangebracht op een objectglaasje. Onmiddellijk na het aanbrengen van het bloed werd

met de niet-afgeronde hoek van een tweede objectglaasje de druppel plaatselijk

uitgesmeerd door continu met de hoek van het glaasje in de druppel te draaien

gedurende 2 minuten. (www.parasitologie.nl, 2006) (Deluol, 2004) (Van Haute, 2013)

Het objectglaasje werd 10 minuten gedroogd in een droogoven bij een temperatuur van

80°C. (Van Haute 2013)

De Giemsa kleuring werd steeds vers bereid door aan 40 ml malaria buffer (pH 7,2) 50

druppels Giemsa kleurstof toe te voegen en te homogeniseren (Van Haute, 2013). Deze

malaria buffer werd bereid door een buffertablet (Kaliumdiwaterstoffosfaat 0,7 g

(KH2PO4), Dinatriumwaterstoffosfaat 1,04 g (Na2HPO4)) op te lossen in 1 L water en de





pH te controleren met een pH meter (Guillaume, 2009). De pH van deze buffer is zeer

belangrijk omdat anders de kleuring van de granulatie niet correct verloopt, wat

resulteert in valse microscopische beelden. (Guillaume, 2009)

Het gedroogde objectglaasje werd met de bloedoppervlakte naar onderen gericht op een

deksel met een holte naar boven gericht geplaatst. Vervolgens werd de kleurstof

voorzichtig in het deksel gegoten tot de kleurstof contact heeft met de volledige

oppervlakte van het objectglaasje. Het objectglaasje werd gedurende 35 minuten op

deze manier gekleurd. Deze methode werd voorgesteld op een congres in Amsterdam en

nu toegepast in de routine van het Militair Hospitaal. Deze methode heeft het voordeel

dat mogelijke vervuiling van de kleurstof niet op het objectglaasje terechtkomt maar

naar de bodem van het deksel zakt. Vervolgens werd het objectglaasje voorzichtig

afgespoeld met water. De dikdruppel werd nogmaals 10 minuten bij 80°C gedroogd en

nadien microscopisch afgelezen. (Van Haute, 2013)

3.1.4.3. MICROSCOPIE

Om de Plasmodium-parasieten microscopisch op te sporen in het bloed werd de

dikdruppelpreparaat onder een vergroting van 50x10 globaal gescreend en nadien op een

vergroting van 100x10 met immersieolie grondig gescreend. Deze screening diende

ongeveer 15 minuten te duren. (Van Haute, 2013)

Indien een preparaat vermoedelijk negatief leek te zijn, werd nog 30 minuten verder

gezocht alvorens ‘negatief’ geantwoord werd. In gevallen waar men malaria vermoedde

(omwille van de symptomen en verblijf patiënt) kon een tweede microscopist

ingeschakeld worden voor een tweede opinie of bij een zeer sterk vermoeden kon op een

later tijdstip een tweede bloedstaal van de verdachte patiënt onderzocht worden. (Van

Haute, 2013)

Wanneer een preparaat positief is voor Plasmodium parasieten, werd nagegaan hoe groot

de densiteit was van de parasitemie. Wanneer het aantal parasieten in het preparaat

veel te groot was om nauwkeurig te tellen, werd geteld op het bloeduitstrijkje. Wanneer

het aantal parasieten niet te hoog was, kon de parasitemie bepaald worden op het

dikdruppel preparaat.

DIKDRUPPEL

In het dikdruppelpreparaat werd op een 100x10 vergroting het aantal parasieten geteld

per 200 witte bloedcellen. Wannneer men minder dan 10 parasieten telde per 200 witte

bloedcellen werd de telling verdergezet tot 500 witte bloedcellen. Wanneer er

gametocyten of schizonten werden waargenomen, werden deze niet meegeteld maar wel



vermeld als commentaar bij de telling. Wanneer het aantal parasieten per 200 witte

bloedcellen en het totaal aantal witte bloedcellen per µl in het bloed (door CBC analyse

op de Beckman Coulter DxH) gekend was kon het aantal parasieten per µl berekend

worden. (Van Haute, 2013) (World Health Organization, 2003)

Bijvoorbeeld:

250 parasieten waargenomen bij het tellen van 200 witte bloedcellen en de concentratie witte

bloedcellen in het staal is 4,5.10³/mm³ (4,5.10³/µl) dan is de parasitemie 5625 AP/µl.

Wanneer een dikdruppel positief was voor de Plasmodium parasieten, werd een

ongekleurd dikdruppelpreparaat van dit monster opgestuurd naar het Instituut voor

Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor de confirmatie van de parasitemie. Het

ITG is het nationaal referentiecentrum voor malaria.

BLOEDUITSTRIJKJE

In het uitstrijkje werd het aantal geparasiteerde rode bloedcellen op 5000 rode

bloedcellen geteld. De beste methode hiervoor is het aantal rode bloedcellen in één veld

te tellen en hier het aantal geparasiteerde rode bloedcellen te tellen, vervolgens werd er

overgegaan tot een naastgelegen veld met dezelfde densiteit rode bloedcellen tot een

totaal van 5000 rode bloedcellen werd geteld. Deze telling kon het best herhaald worden

tot verschillende velden geteld werden en hiervan werd het gemiddelde genomen.

Gametocyten en schizonten werden niet meegeteld maar wel vermeld als commentaar.

Wanneer het aantal geparasiteerde rode bloedcellenparasieten per 5000 rode bloedcellen

en het totaal aantal rode bloedcellen per µl in het bloed ook (door CBC analyse op de

Beckman Coulter UniCel DxH 800) gekend was, kon het aantal parasieten per µl

berekend worden. (Van Haute, 2013) (World Health Organization, 2003)

Bijvoorbeeld:

Op 5000 rode bloedcellen (10 velden) werden 10 geparasiteerde rode bloedcellen getelt en de

concentratie rode bloedcellen in het staal is 4,5.106/mm³ (4,5.106/µl) dan is de parasitemie 9000

AP/µl of 0,2%.

In het bloeduitstrijkje werd ook de Plasmodium species geïdentificeerd, omdat de

trofozoïeten en schizonten van de verschillende species bepaalde specifieke

veranderingen van de rode bloedcellen induceren. Gametocyten zijn het meest specifiek

per species, de aanwezigheid van gametocyten vergemakkelijkt de identificatie. In het

bloeduitstrijkje kon ook een eventuele menginfectie waargenomen worden.

Wanneer een bloeduitstrijkje positief was voor een Plasmodium-infectie, werd een

ongekleurd maar wel gefixeerd bloeduitstrijkje van dit monster opgestuurd naar het



Instituut voor Tropische Geneeskunde te Antwerpen voor de confirmatie van de

parasitemie en de identificatie. In het ITG werd de PCR-techniek toegepast om met

zekerheid een menginfectie of een species te bevestigen. De correcte species identificatie

is belangrijk voor de behandeling en in geval van resistentie.

3.2. RESULTATEN

In alle monsters uit de malaria positieve controlegroep werd na microscopisch onderzoek

(dikdruppel en bloeduitstrijkje) Plasmodium-parasieten, namelijk trofozoiëten

waargenomen. Twee van de zes monsters werden vastgesteld als een P.ovale infectie, en

de overige vier als P.falciparum. Alle monsters met een malaria discriminant factor hoger

dan 4,5 uit de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie hadden geen

parasieten zichtbaar in hun bloed. De drie monsters met een malaria discriminant factor

hoger dan 4,5 uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie hadden geen

Plasmodium parasieten zichtbaar in het bloed bij microscopisch onderzoek, waarvan één

monster afkomstig was van een patiënt die drie dagen eerder gediagnosticeerd was met

malaria (P.ovale) en in die 3 dagen een behandeling onderging.

Tabel 30: Resultaten van de microscopie (dikdruppel en bloeduitstrijkje).

Geen parasieten in bloed

Microscopie negatief

Parasieten in bloed

Microscopie positief

Malaria factor < 4,5 / /

Malaria factor > 4,5 30 (11 patiënten) 6

Sneltest - 30 (11 patiënten) 1

Sneltest + 0 5

Tabel 31: Het aantal geparasiteerde rode bloedcellen per µl (AP/µl), de Plasmodium species en de

verschillende stadia dat werd vastgesteld bij elk monster in de malaria positieve controlegroep.

Monster AP/µl Plasmodium species Stadia

1 4192 P.ovale Trofozoïeten, schizonten en gametocyten

2 6089 P.falciparum Trofozoïeten




6 Parasitemie

niet gekend

P.ovale Trofozoïeten



3.3. CONCLUSIE

Alle 6 monsters uit de malaria positieve controlegroep werden malaria positief bevonden

op basis van microscopisch onderzoek. Er werden dus geen valsnegatieve monsters

vastgesteld. Bovendien werden dankzij de microscopie de overige 30 monsters afkomstig

van 11 patiënten met een malaria factor hoger dan 4,5 negatief bevonden. Microscopie

blijft de gouden standaard voor de malaria diagnose in routine laboratoria.

Figuur 52: Een P.falciparum

trofozoiët (oudere vorm) in

een bloeduitstrijkje gekleurd

met May-Grünwald Giemsa

op een vergroting 100x10

onder de lichtmicroscoop


trofozoiët (oudere vorm) in

een bloeduitstrijkje gekleurd

met May-Grünwald Giemsa

op een vergroting 100x10

onder de lichtmicroscoop


trofozoiët in een

bloeduitstrijkje gekleurd met

May-Grünwald Giemsa op

een vergroting 100x10 onder

de lichtmicroscoop

Figuur 49: Een P.ovale

schizont die op uitbarsten

staat in een bloeduitstrijkje

gekleurd met May-Grünwald

Giemsa op een vergroting

100x10 onder de

lichtmicroscoop


geparasiteerde rode bloedcel

met meerdere trofozoïeten

(polyparasitisme, zeldzaam)

in een bloeduitstrijkje

gekleurd met May-Grünwald

Giemsa op een vergroting

100x10 onder de

lichtmicroscoop


trofozoiët in een

bloeduitstrijkje gekleurd met

May-Grünwald Giemsa op

een vergroting 100x10 onder

de lichtmicroscoop



VI. CONCLUSIE

De malaria discriminant factor kan een hulp zijn in de screening van malaria. Wanneer

een monster op de UniCel DxH 800 een celtelling en differentiatie (CBC+DIFF) ondergaat

wordt automatisch deze malaria factor berekend. Deze methode is snel en vereist geen

extra expertise of extra hoeveelheid monster. Er is een groot significant verschil tussen

malaria negatieve monsters en malaria positieve monster. Echter kunnen andere

infecties ook een verhoogde malaria discriminant factor vertonen door de aanwezigheid

van grotere monocyten en lymfocyten als reactie op de infectie. De waarden van de

malaria discriminant factor, de SD V monocyten en de SD V lymfocyten bij monsters met

een ‘vals positieve’ malaria discriminant factor kunnen de resultaten van deze waarden

bij de monsters met een ‘echt positieve’ malaria discriminant factor overlappen. De

spreiding van het celvolume van de lymfocyten toonde meer significante verschillen aan

tussen de groepen dan de spreiding van het celvolume van de monocyten. In deze studie

is de een cut-off waarde van 5,0 voor malaria indicatie ideaal. Het aantal monsters met

een vals positieve indicatie voor malaria werd gereduceerd met ongeveer 48% en de

specificiteit steeg zonder een daling van de sensitiviteit.

Het witte bloedcelhistogram (WBC-histogram) kan geraadpleegd worden wanneer door

het toestel een hoge malaria discriminant factor wordt aangegeven. Echter vertonen niet

alle malaria positieve monsters een hogere celfrequentie op de 35 fL grens t.o.v. een

normaal monster. Een WBC-histogram met een hogere celfrequentie op de 35 fL grens

kan echter wel het vermoeden van malaria bij een hoge malaria discriminant factor

bevestigen.

De differentiatie 2D-dataplots van de lichtverstrooiing (5PD1) vertoonden een extra

populatie of malariasignalen bij de zes monsters van de malaria positieve controlegroep.

Echter waren deze niet karakteristiek aanwezig en verscheen deze populatie ook bij

enkele monsters van de gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria). De

interpretatie van de dataplots is niet specifiek genoeg om bij een hoge malaria

discriminant factor het vermoeden van een malaria-infectie te bevestigen.

De NRBC-dataplots vertoonden enkel een groene populatie links onderaan bij de

monsters met een P.ovale infectie. De interpretatie van deze dataplots voor het

bevestigen van een vermoeden van malaria-infectie bij een hoge malaria discriminant

factor is niet specifiek en sensitief genoeg aangezien 4/6 van de monsters deze populatie

niet vertoondde.

De sneltest van de gekende malaria positieve monsters was bij 5 van de 6 monsters

positief met de juiste interpretatie van Plasmodium species. De sneltest was negatief bij



alle monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 maar een negatief

microscopisch onderzoek.

De microscopie kon de malaria-infectie bij alle gekende malaria positieve monsters

bevestigen. De monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de

overige 3 groepen waren negatief voor microscopisch onderzoek.

Tabel 32: Vergelijking van de sneltest SD Biolone Malaria p.f./pan met de malaria discriminant factor op de

UniCel DxH 800 en de ‘gouden standaard’ microscopie.

Diagnose malaria bekend Diagnose malaria onbekend

maar negatief bij microscopie

Malaria factor < 4,5 0 / (580)

Malaria factor > 4,5 6 30 (11 patiënten)

Sensitiviteit: 100%

Specificiteit: 94,30%

Sneltest - 1 11

Sneltest + 5 0

Sensitiviteit: 83,33 %

Specificiteit: 100%

Microscopie - 0 11

Microscopie + 6 0

Sensitiveit: 100 %

Maximale specificiteit: 100%

Deze studie toont aan dat de automatische detectie van malaria met behulp van de

malaria discriminant factor op de UniCel DxH 800 interessant kan zijn voor een eerste

screening van malaria wanneer er geen vermoeden is van een malaria-infectie. Een

hogere malaria discriminant factor kan de laborant of onderzoeker alert maken op een

potentiële malaria-infectie. Een sneltest kan additioneel uitgevoerd worden om een

tweede screening uit te voeren, maar het microscopisch onderzoek dient steeds

uitgevoerd te worden voor de confirmatie van de potentiële malaria-infectie.

Wanneer men een monster positief voor malaria heeft ontdekt of een monster heeft

waarvan men een malaria-infectie sterk vermoedt, moet het monster opgestuurd worden

naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor de confirmatie

met de moleculaire technieken zoals PCR die de grootste gevoeligheid hebben voor de

malaria detectie.

Deze screening kan bijdragen tot de detectie of indicatie van malaria-infecties wanneer

de symptomen afwezig zijn en de dokter geen vermoeden heeft van malaria. Hierdoor

zou het aantal ‘niet ontdekte’ malaria-infecties kunnen dalen.



VII. DISCUSSIE

In deze studie was de omvang van de malaria positieve monsters erg klein. Gedurende

de periode februari-april waren er slechts 6 monsters van patiënten met een malaria-

infectie beschikbaar voor de studie. Bovendien waren enkel de species P.falciparum en

P.ovale vertegenwoordigd en niet P.vivax en P.malariae.

De studie zou herhaald moeten worden met een groter aantal malaria positieve monsters

om een betere conclusie te vormen over de geautomatiseerde detectie van malaria. Ook

zouden alle species vertegenwoordigd moeten zijn om te evalueren of de detectie

mogelijk is voor alle Plasmodium species.

De groep monsters van militairen die terugkeerden van buitenlandse missie hoefde niet

in deze studie toegevoegd te worden. Maar deze groep werd toch onderzocht om een

eventuele onvermoedde malaria-infectie te kunnen detecteren.



VIII. REFERENTIES

Alere. (2013). SD Bioline Malaria Antigen P.f/Pan test procedure.

Beckman Coulter Ireland, Inc. (2013a). Unicel DxH800 Coulter Cellular Analysis System

and UniCel DxH 600 Coulter Cellular Analysis System: Instructions for Use. USA.

Beckman Coulter Ireland, Inc. (2013b). UniCel DxH Slidemaker Stainer, Coulter Cellular

Analysis System Slidemaler Stand-Alone for Hematology Specimen Processing:

Instructions for Use. USA.

Briggs, C., Da Costa, A., Freeman, L., Aucamp, I., Ngubeni, B. & Machin S.J. (2006).

Development of an Automated Malaria Discriminant Factor Using VCS Technology.

Journal of clinical pathology, 126, nr.5, pp. 691-698. Geraadpleegd op 18 januari 2014

via http://ajcp.ascpjournals.org/content/126/5/691.long

Campuzano-Zuluanga, G. Grobusch, M.P. & Hänscheid, T. (2010). Automated

haematology analysis to diagnose malaria. Malaria Journal, 9, nr.346. Geraadpleegd op

19 januari 2014 via http://www.malariajournal.com/content/9/1/346

Castrynck, H., Meensel, Van B. & Lontie, M. (2013). Diagnose van malaria. Labo-mailing,

nr.209. Geraadpleegd op 19 januari 2014 via

http://www.mcharts.be/artsen/Documenten/Labomailing/062013lm.pdf

Chua, C.L. Brown, G. Hamilton, J.A. Rogerson, S. & Boeuf, P. (2013). Monocytes and

macrophages in malaria: protection or pathology?. Trends in parasitology, 29, pp 26-34.

Geraadpleegd op 15 februari 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23142189

Coatney, G.R., Collins, W.E., Warren, M. & Contacos, P.G. (1971). The Primate Malarias.

U.S. Department of Health, Education and Welfare. Betesha.

De Jonge, N., Polderman, A.M. & Verhave, J.P. (1999). Diagnose van malaria. Nederlands

tijdschrift Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde, nr.24, pp. 34-37.

Geraadpleegd op 19 januari 2014 via

https://www.nvkc.nl/tijdschrift/content/1999/nr%201/p34/1999-1-p34.pdf

Deluol, A.M. (2004). Colour Atlas of parasitology vol.4: Blood and tissue parasites. Saint-

Maur: Éditions Varia.

http://ajcp.ascpjournals.org/content/126/5/691.long

http://www.malariajournal.com/content/9/1/346

http://www.mcharts.be/artsen/Documenten/Labomailing/062013lm.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23142189

https://www.nvkc.nl/tijdschrift/content/1999/nr%201/p34/1999-1-p34.pdf



Donati, D., Mok, B., Chêne, A., XU, H., Thangarajh, M., Glas, R., Chen, Q., Wahlgren, M.

& Bejarano, M.T. (2006). Increased B Cell Survival and Preferential Activation of the

Memory Compartment by a Malaria Polyclonal B Cell Activator. International Journal of

Immunology, 177, nr.5, pp.3035-3044. Geraadpleegd op 8 februari 2014 via


Everdingen, van J.J.E., Glerum, J.H. & Wiersma T. (2001). Praktische

huisartsgeneeskunde: Diagnose en therapie. Houten: Bohn Stafleu van Loghum.

Fourcade, C., Casbas, M.J., Belaouni, H., Duran Gonzalez, J.J., Sassier, P., Jiminze

Garcia, P.J. & Esteban Pepio, M.A. (2004). Automated detection of malaria by mean of

the haematology analyser Coulter® GEN.S™. International Journal of Laboratory

Hematology, 26, pp. 367-372. Geraadpleegd op 8 februari 2014 via


Gillet, P., Mori, M., Esbroeck, Van E., Ende, Van den J. & Jacobs, J. (2009). Assessment

of the prozone effect in malaria rapid diagnostic tests. Malaria Journal, 8, nr.271.

Geraadpleegd op 10 mei 2014 via http://www.malariajournal.com/content/pdf/1475-

2875-8-271.pdf

Guillaume, V. (2009, april). Parasitologie sanguin. (1e druk). Brussel: De Boeck.

Hänscheid, T. (1999). Diagnosis of malaria: a review of alternatives to conventional

microscopy. Clinical & Laboratory Haematology,21, 4, pp. 235-245. Geraadpleegd op 2

februari 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10583325

Hedley, B.D., Keeney, M., Chin-YEE, I. & Brown, W. (2010). Initial performance

evaluation of the UniCel DxH 800 Coulter cellular analysis system. International Journal

of laboratory hematology, 33, pp.45-56. Geraadpleegd op 1 februari 2014 via

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3044820/

Hoffman, R., Benz, E.J., Shattil, S.J., Furie, B. & Cohen, H.J. (1991). Hematology: Basic

principles and practice. (1e druk). New York: Churchill Livingstone.

Hopkins, H., Kambale, W., Kamya, M.R., Staedke, S.G., Dorsey, G. & Rosenthal, P.J.

(2007). The comparison of HRP2- and pLDH-based rapid diagnostic tests for malaria with

longitudinal follow-up in Kampala, Uganda. The Amarican Society of Tropical Medicine

and Hygiene, 76, nr.6, pp. 1092-1097. Geraadpleegd op 18 januari 2014 via

http://www.ajtmh.org/content/76/6/1092.long


http://www.malariajournal.com/content/pdf/1475-2875-8-271.pdf

http://www.malariajournal.com/content/pdf/1475-2875-8-271.pdf



http://www.ajtmh.org/content/76/6/1092.long



Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van

LaboratoriumTechnologen. (2007, juni). Laboratoriumdiagnose van malaria en andere

bloedparasieten, voortgezette beroepsopleiding in de parasitologie.

Lee, H.K., KIM, S.I., CHAE, H., Kim, M., LIM, J., OH, E.J., KIM, Y., PARK, Y.J., LEE, W., &

HAN, K. (2012). Sensitive detection and accurate monitoring of Plasmodium vivax

parasites on routine complete blood count using automatic blood cell analyzer

(DxH800TM). International Journal of Laboratory Hematology, 34, pp. 201-207.

Nicolas, X., Hugard, L., Desemerie, F., Nicolas, F. & Floch, J.J. (1998). Paludisme: Apport

diagnostique des modifications biologiques chez l’expatrié. Feuillets de biologie, xxix,

nr.223, pp. 45-48.

Paugam, A. & Yera, H. (2005). Diagnostic biologique du paludisme. Biologiste et

practicien, 2, nr.142, pp. 28-53.

Pierce, S.K. & Miller, L.H. (2009). World Malaria Day 2009: What malaria knows about

the immune system that immunologists still don’t. International Journal of Immunology,

182, nr.9, pp.5171-5177. Geraadpleegd op 8 februari 2014 via


Simon-Lopez, R. (2013). U.S Patent No. 7,256,048B2. Fullerton, Beckman Coulter, Inc.

Strien, van W. (2002). Malariakaarten helpen bij speurtocht naar vaccin. Cicero, nr. 16,

pp.12-13. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via

https://www.lumc.nl/rep/1040/att/811071156182556/811110022122556/81112114808

2556/811120003492556.pdf

Tangpukdee, N., Duangdee, C., Wilairatana, P. & Krudsood, S. (2009). Malaria diagnosis:

A Brief Review. Korean Journal of Parasitology, 47, nr.2, pp.93-102. Geraadpleegd op 1

februari 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2688806/pdf/kjp-47-

93.pdf

Van Haute (2013). Procedure: Frottis de sanguin et DDR. [SOP]. Labo Hematologie,

Militair Hospitaal Koninging Astrid.

Warhurst, D.C. & Williams, J.E. (1996). Laboratory diagnosis of malaria. Journal of

clinical pathology, 49, nr.7, pp. 533-538. Geraadpleegd op 18 januari via



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2688806/pdf/kjp-47-93.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2688806/pdf/kjp-47-93.pdf




World Health Organization Geneva. (1999, oktober). New Perspectives: Malaria Diagnosis

, Report of a joint WHO/Usaid informal consultation. (WHO/MAL/2000.1091).

Geraadpleegd op 18 januari 2014 via

http://www.who.int/tdr/publications/documents/malaria-diagnosis.pdf

World Health Organization Geneva. (2003). Manual of basic techniques for a health

laboratory.(2de editie). Geraadpleegd op via 15 maart 2014 via

http://apps.who.int/iris/handle/10665/42295

World Health Organization Geneva. (2009, oktober). Parasitological confirmation of

malaria diagnosis: Report of a WHO technical consultation Geneva. (NLM classification:

WC 765). Geraadpleegd op 1 februari 2014 via

http://www.finddiagnostics.org/export/sites/default/resource-

centre/reports_brochures/docs/9789241599412_eng.pdf

World Health Organization. (2012). International travel and health. Hoofdstuk 7.

Geraadpleegd op 2 februari 2014 via http://www.who.int/ith/en/

Websites:

May Grünwald’s stain for microscopy. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via www.at.vwr-

cmd.com

Product Information May-Grünwald Giemsa. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via

www.avantormaterials.com

Laboratory diagnosis of malaria: Preparation of blood smears (2011). Geraadpleegd op

18 januari 2014 via http://www.cdc.gov/dpdx/

Malariabehandeling in geval van nood (2010). Geraadpleegd op 26 april 2014 via

www.itg.be

Standard Operating Procedure voor het maken van grotere hoeveelheden

malariapreparaten (2006). Geraadpleegd op 20 januari 2014 via

http://www.parasitologie.nl

Clinical manifestations of malaria (2013). Geraadpleegd op 18 januari 2014 via

www.uptodate.com

http://www.who.int/tdr/publications/documents/malaria-diagnosis.pdf

http://apps.who.int/iris/handle/10665/42295

http://www.finddiagnostics.org/export/sites/default/resource-centre/reports_brochures/docs/9789241599412_eng.pdf

http://www.finddiagnostics.org/export/sites/default/resource-centre/reports_brochures/docs/9789241599412_eng.pdf

http://www.avantormaterials.com/

http://www.cdc.gov/dpdx/

http://www.itg.be/

http://www.parasitologie.nl/assets/files/richtlijnen_diagnostiek/sop_edta_prep_skml060206.pdf



IX. APPENDIX

Appendix 1: Schema malaria discriminant factor in de onderzochte groepen ................69

Appendix 2: Beschrijvende statistiek en t-test analyse (malaria discriminant factor) .....70

Appendix 3 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V lymfocyten) ..................72

Appendix 4 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V monocyten) ..................74

Appendix 5 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (bloedplaatjes) .......................76

Appendix 6: ‘Case study’ P.ovale infectie .................................................................78

Appendix 7: Invloed temperatuur en leeftijd van het bloedmonster op de malaria discriminant factor, de dataplots en het WBC histogram. ...........................................81

Appendix 8: Correlatie ..........................................................................................86

Appendix 1: Schema malaria discriminant factor in de onderzochte groepen

STUDIE

296 monsters

Gezonde personen (296)

Geen bezoek aan risicogebied, geen

symptomen

0 monsters

met een malaria discriminant factor > 4,5

178 monsters

Gehospitaliseerde patiënten met een

infectie (52)

Geen bezoek aan risicogebieden, geen

symptomen

27 monsters (8 patiënten)


27 monsters

vals positief (geen malaria) op basis van de lichtmicroscopie

en/of sneltest

6 monsters

Personen met malaria diagnose (6)

6 monsters


6 monsters

echt positief (malaria infectie) op basis van de lichtmicroscopie

en/of sneltest

132 monsters

Militairen terugkerend van buitenlandse missie

(132)

3 monsters


2 monsters

vals positief (geen malaria) op basis van de lichtmicroscopie

en/of sneltest

1 monster

afkomstig van een patiënt met malaria na 4 dagen behandeling



Appendix 2: Beschrijvende statistiek en t-test analyse (malaria discriminant factor)

Tabel 33: Beschrijvende statistiek van de malaria discriminant factor voor de vier groepen.

NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA

Gemiddelde 2,3306 3,5052 2,3388 7,2485

Standaardfout 0,0182 0,0692 0,0260 0,7167

Mediaan 2,2797 3,4026 2,2930 7,4641

Modus 2,1168 3,0400 #N/B #N/B

Standaarddeviatie 0,3122 0,9234 0,2995 1,7554

Steekproefvariantie 0,0975 0,8527 0,0897 3,0816

Kurtosis 0,9666 0,5270 4,8427 -2,9458

Scheefheid 0,9676 0,7612 1,5639 -0,1075

Bereik 1,7442 5,0184 1,9151 3,7633

Minimum 1,6720 2,0180 1,8948 5,2835

Maximum 3,4162 7,0364 3,8099 9,0469

Som 682,8723 623,9190 311,0570 43,4910

Aantal (zonder outliers)

293 178 133 6

CI (95%) 0,0359 0,1366 0,0514 1,8422

CI (99%) 0,0473 0,1802 0,0679 2,8897

Tabel 34: T-test voor de vergelijking van de malaria discriminant factor tussen de groepen. Significant verschil

op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**).

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL &

TRAVEL

NORMAAL & MALARIA

(eenzijdig)

T- statistische gegevens -16,4099 -0,2569 -6,8600

P (T<=t) 5,09973.10-39 0,797471 0,000503

Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9718 1,9690 2,0150

Kritiek gebied van T-toets 98,75%

(Bonferroni correctie van 95%) 2,5203 2,5149 3,1634



(Bonferroni correctie van 99%)

3,0617

3,0525

4,7733

Conclusie

T > Kritische T

Significant

verschil**

(µ1≠µ2)

p(5,09973 10-39)

< α

T < Kritische T

Geen significant

verschil

(µ1=µ2)

p(0,797471) > α

T > Kritische T

Significant verschil**

(µ2>µ1)

p(0,000503) < α



INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

(eenzijdig)

TRAVEL & MALARIA

(eenzijdig)

T- statistische gegevens 15,7783 -5,1991 -6,8464

P (T<=t) 3,25048.10-38 0,001735 0,000508







Conclusie

T > Kritische T

Significant

verschil**

(µ1≠µ2)

p(3,25 10-38) < α

T > Kritische T

Significant

verschil**

(µ2>µ1)

p(0,001735) < α

T > Kritische T

Significant verschil**

(µ2>µ1)

p(0,000508) < α



Appendix 3 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V lymfocyten)

Tabel 35: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten) voor

de vier groepen.


Gemiddelde 13,84 17,04 13,94 29,49

Standaardfout 0,061 0,20 0,10 3,79

Mediaan 13,75 16,82 13,80 25,77

Modus 13,57 16,63 13,43 #N/B



Kurtosis -0,10 -0,58 3,81 -1,28

Scheefheid 0,46 0,40 1,27 0,74

Bereik 5,81 11,49 7,67 23,65

Minimum 11,27 12,16 11,8 19,29

Maximum 17,08 23,65 19,47 42,94

Som 4054,90 2999,33 1867,57 176,91

Aantal 293 176 134 6

CI (95%) 0,1205 0,3930 0,1963 9,7523

CI (99%) 0,1588 0,5186 0,2593 15,2971

Tabel 36: T-test voor de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V

lymfocyten)tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant

verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**).

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL &

TRAVEL

NORMAAL & MALARIA

(eenzijdig)


P (T<=t) 3,5459.10-36 0,402275 0,004571


Kritiek gebied van T-toets

98,75%


2,2577 2,2557

3,1634



99,75%


2,8371 2,8334

4,7733

Conclusie

T > Kritische T

Significant verschil** (µ1≠µ2) p(3,5459.10-36) < α

T < Kritische T

Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,402275) > α

T > Kritische T

Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,004571) < α



INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

(eenzijdig)

TRAVEL & MALARIA

(eenzijdig)


P (T<=t) 3,56124.10-33 0,011033 0,004692



98,75%


2,5158

3,1634 3,1634



99,75%


3,0540

4,7733 4,7733

Conclusie

T > Kritische T Significant verschil** (µ1≠µ2) p(3,56124.10-33) < α

T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1) p(0,011033) < 0.05

T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,004692) < α



Appendix 4 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V monocyten)

Tabel 37: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) voor

de vier groepen.


Gemiddelde 16,83 20,22 16,91 26,13

Standaardfout 0,09 0,20 0,14 3,19

Mediaan 16,57 20,06 16,63 26,65

Modus 16,00 19,00 16 #N/B



Kurtosis 1,75 -0,52 4,23 0,97

Scheefheid 1,10 0,16 1,62 -0,94

Bereik 9,50 12,67 9,71 21,17

Minimum 13,62 14,33 14,17 12,8

Maximum 23,12 27 23,88 33,97

Som 4965,85 3559,41 2283,11 156,78

Aantal 295 176 135 6

CI (95%) 0,1756 0,3964 0,2783 8,2052

CI (99%) 0,2313 0,5231 0,3676 12,8704

Tabel 38: T-test voor de vergelijking van de van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) tussen de

groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05

betrouwbaarheidsniveau (**).

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL &

TRAVEL

NORMAAL & MALARIA

(eenzijdig)


P (T<=t) 5,63425.10-38 0,6378 0,0167



98,75%


2,5163 2,5163

3,1634



99,75%


3,0549 3,0549

4,7733

Conclusie

T > Kritische T

Significant verschil** (µ1≠µ2) p(5,63425.10-

38) < α

T < Kritische T

Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,637759) > α

T > Kritische T

Significant verschil* (µ2>µ1) p(0,016673) < 0.05



INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

(eenzijdig)

TRAVEL & MALARIA

(eenzijdig)


P (T<=t) 1,03733.10-32 0,0620 0,0172



98,75%


2,5131

3,1634 3,1634



99,75%


3,0494

4,7733 4,7733

Conclusie

T > Kritische T Significant verschil**

(µ1≠µ2) p(1,03733.10-

32) < α

T > Kritische T Geen significant verschil

(µ2>µ1) p(0,062041) > 0.05

T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1)

p(0,034382) < 0.05



Appendix 5 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (bloedplaatjes)

Tabel 39: Beschrijvende statistiek van de spreiding van de bloedplaatjes voor de vier groepen.


Gemiddelde 227 363 221 107

Standaardfout 2,64 14,03 3,68 17,82

Mediaan 225 332 218 111

Modus 190 214 201 #N/B



Kurtosis 0,09 1,76 0,44 -0,77

Scheefheid 0,47 1,21 0,003 -0,38

Bereik 261 941 253 118

Minimum 130 65 82 42

Maximum 391 1006 335 160

Som 67102 64649 30060 641

Aantal 295 178 136 6

CI (95%) 5,2015 27,6864 7,2705 45,7988

CI (99%) 6,8523 36,5310 9,6051 71,8387

Tabel 40: T-test voor de vergelijking van de van de bloedplaatjes tussen de groepen. Significant verschil op

een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**).

NORMAAL &

INFECTIE

NORMAAL &

TRAVEL

NORMAAL & MALARIA

(eenzijdig)

T- statistische gegevens -9,5076 1,4213 6,6975

P (T<=t) 8,84395.10-18 0,156368 0,000561



98,75%


2,5217 2,5141 3,1634



99,75%


3,0642 3,0512 4,7733

Conclusie


(µ1≠µ2) p(8,84395.10-

18) < α

T < Kritische T Geen significant verschil

(µ1=µ2) p(0,156368) > α

T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1)

p(0,000561) < α



INFECTIE &

TRAVEL

INFECTIE &

MALARIA

(eenzijdig)

TRAVEL & MALARIA

(eenzijdig)

T- statistische gegevens 9,8026 11,3049 6,2773

P (T<=t) 8,6385. 10-19 2,13015.10-8 0,000753



98,75%


2,5204 2,5326 3,1634



99,75%


3,0619 3,3725 4,7733

Conclusie


(µ1≠µ2) p(8,6385. 10-19) < α

T > Kritische T Significant verschil*

(µ2>µ1) p(2,13015.10-8) < 0.05

T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1)

p(0,000753) < α



Appendix 6: ‘Case study’ P.ovale infectie

In het Militair Hospitaal Koningin Astrid melde een man zich aan op de spoedafdeling. De

man had sinds twee weken last van koorts, een lopende neus en hoofdpijn. Hij

constulteerde de huisarts die hem antibiotica voorschreef. Zijn toestand verslechterde en

hij consulteerde de spoedgevallen afdeling van het Militair Hospitaal.

De man was militair en verbleef in 2011 gedurende 2 maanden in Kindu (buitenlandse

zending) en verliet Kindu in december 2011. Hij nam toen mefloquine als profylaxe tot

twee weken na het verlaten van Kindu. Sinds de zendig is hij niet ziek geweest of

vertoonde hij geen symptomen van malaria. Er was geen enkel vermoeden van malaria

en de dokter vroeg ook geen malaria onderzoek aan.

Er werd veneus bloed afgenomen in een K3EDTA-tube en geanalyseerd op de UniCel DxH

800. Er werd een leukopenie van 3,8 10³/mm³ vastgesteld (referentiewaarde 4,30-

10,60 10³/mm³) met 87% neutrofielen, 9,4% lymfocyten en 2,3% monocyten, maar ook

een trombopenie van 102 10³/mm³ (referentiewaarde 140-400 10³/mm³). Tijdens de

analyse van het bloed in een heparine tube werd een CRP van ongeveer 49 mg/L

(referentiewaarde 0,0-5,0 mg/L) waargenomen.

Het toestel gaf na de celtelling en differentiatie en malaria discriminant factor van 8,7360

aan. Na raadpleging van de supplementaire data werd een spreiding van het celvolume

van de monocyten van 33,60 waargenomen en een spreiding van het celvolume van de

lymfocyten van 26,00. Ook het witte boedcellen histogram (WBC) vertoonde de extra

populatie (hoge celfrequentie) op de 35 fL grenswaarde. De NRBC dataplot vertoonde

ook de groene populatie links onderaan, wat mogelijk malariasignalen kunnen zijn.

Omwille van het laag aantal plaatjes, de leukopenie, de verhoogde CRP, het WBC

histogram, de NRBC dataplot en de hoge malaria discriminant factor werd een sneltest

uitgevoerd. De sneltest gaf echter een negatief resultaat.

Figuur 54: Negatieve SD Bioline P.f/Pan

sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie

(later geconfirmeerd als P.ovale infectie) vier

dagen na de dag van diagnose en na

behandeling met chloroquine.

Figuur 53: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij

een vermoeden van malaria-infectie (later

geconfirmeerd als P.ovale infectie) op de dag van

diagnose



Vervolgens werd een dikdruppel en een bloeduitstrijkje bereid en microscopisch

onderzocht. Bij het bekijken van het eerste veld van het bloeduitstrijkje werd meteen al

een geparasiteerde rode bloedcel teruggevonden. Het bloeduitstrijkje bevatte trofozoïten

en schizonten. Sommige rode bloedcellen hadden polyparasitisme. Omwille van de

aanwezigheid van schizonten en de vorm van de trofozoiëten werd P.ovale infectie

vermoed. Er werden 0,1% geïnfecteerde rode bloedcellen aangetroffen in het

bloeduitstrijkje. In de dikdruppel werden ook parasieten aangetroffen en werd een

parasitemie van 3951 parasieten/µl geteld (209 parasieten per 201 witte bloedcellen en

een celtelling van 3800 witte bloedcellen per µl op de UniCel DxH 800). Er werd

onmiddellijk een behandeling gestart van 100 mg chloroquine (6 tabletten per dag op de

eerste dag van de behandeling en de daaropvolgende 3 dagen 3 tabletten per dag).

Het monster werd opgestuurd naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te

Antwerpen voor confirmatie. Ook hier bevond men de dikdruppel en het bloeduistrijkje

positief en werd de infectie van P.ovale geconfirmeerd. Ook hier was de test op het pLDH

antigen en het HRP-2 negatief. Er werd een parasitemie van 4192 aseksuele parasieten

(AP)/µl vastgesteld.

Na vier dagen behandeling met Chloroquine kwam de man opnieuw op controle en

werden opnieuw dezelfde analyses en testen uitgevoerd. De man had geen leukopenie

meer (6,5 10³/mm³) met 54,2% neutrofielen, 35,1% lymfocyten en 8,6% monocyten.

Ook was de trombopenie verdwenen (229 10³/mm³). De malaria discriminant factor was

gedaald tot 5,8307 maar nog steeds hoger dan de cut-off waarde van 4,5. Na

raadpleging van de supplementaire data werd een spreiding van het celvolume van de

monocyten van 29,11 waargenomen en een spreiding van het celvolume van de

lymfocyten van 20,03. Het witte boedcellen histogram (WBC) vertoonde niet meer de

extra populatie (hoge celfrequentie) op de 35 fL grenswaarde. De groene populatie

linksonderaan op de NRBC dataplot was ook verdwenen.

Figuur 56: WBC (witte bloedcel)

histogram vertoont een goede verdeling en

geen extra populatie op de 35 fL volume

grenswaarde.

Figuur 55: WBC (witte bloedcel) histogram

vertoont een abnormale verdeling en een

extra populatie op de 35 fL volume

grenswaarde (hoge celfrequentie).



Figuur 60: NRBC dataplot van de

militair met een P.ovale infectie na

4 dagen behandeling met

chloroquine. De groene extra

populatie is verdwenen. Nucleated

red blood cells (NRBC) zijn rood en

de witte bloedcellen blauw.

Figuur 59: NRBC surface plot van

een militair met een P.ovale infectie

vertoont een groene extra populatie

links onderaan. Nucleated red blood

cells (NRBC) zijn rood en de witte

bloedcellen blauw.

Figuur 58: NRBC dataplot van de

militair met een P.ovale infectie na 4

dagen behandeling met chloroquine.

De groene extra populatie is

verdwenen. Nucleated red blood cells

(NRBC) zijn rood en de witte

bloedcellen blauw.

Figuur 57: NRBC dataplot van een

militair met een P.ovale infectie

vertoont een groene extra populatie

links onderaan. Nucleated red blood

cells (NRBC) zijn rood en de witte

bloedcellen blauw.



Appendix 7: Invloed temperatuur en leeftijd van het bloedmonster op de malaria

discriminant factor, de dataplots en het WBC histogram.

Er werden 5 normale bloedmonsters bewaard op kamertemperatuur en op bepaalde

tijdstippen geanalyseerd op de UniCel DxH 800 (na afname, na 24u, na 48u, en na 72u).

Er werden ook 5 andere normale bloedmonsters bewaard op koelkasttemperatuur (4°C)

en op bepaalde tijdstippen geanalyseerd op de UniCel DxH 800 (na afname, na 24u, na

48u, en na 72u).

Tabel 41: De invloed van kamertemperatuur en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten)

KAMERTEMPERATUUR

Malaria discriminant factor 0u 24u 48u 72u

Staal 1 3,230136 4,571072 6,99545 8,390916

Staal 2 2,094825 3,577338 7,82565 13,2896

Staal 3 2,144214 3,845844 9,96815 15,43803

Staal 4 2,466975 3,368907 5,544105 12,8271

Staal 5 2,1168 2,822796 6,685206 10,06505

Gemiddelde 2,41059 3,637191 7,403712 12,00214

SD 0,482652 0,643131 1,650412 2,78104

SD 0,867338 (van 0u tot 24u)

3,530671 (van 0u tot 48u)

6,78225 (van 0u tot 72u)

SD V Lymfocyten 0u 24u 48u 72u

Staal 1 15,08 18,92 27,65 38,21

Staal 2 13,25 16,74 35,98 46,91

Staal 3 12,51 19,02 36,5 48,87

Staal 4 12,95 16,49 27,79 44,85

Staal 5 13,5 15,93 30,54 42,83

Gemiddelde 13,458 17,42 31,692 44,334

SD 0,978862 1,445458 4,312606 4,100083

SD

2,801557 (van 0u tot 24u)

12,89339 (van 0u tot 48u)

21,83263 (van 0u tot 72u)

SD V Monocyten 0u 24u 48u 72u

Staal 1 21,42 24,16 25,3 21,96

Staal 2 15,81 21,37 21,75 28,33

Staal 3 17,14 20,22 27,31 31,59

Staal 4 19,05 20,43 19,95 28,6

Staal 5 15,68 17,72 21,89 23,5

Gemiddelde 17,82 20,78 23,24 26,796

SD 2,426675 2,322294 2,986436 3,963601

SD

2,093036 (van 0u tot 24u)

3,832519 (van 0u tot 48u)

6,34699 (van 0u tot 72u)



Tabel 42: De invloed van koelkasttemperatuur (4°C) en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V

lymfocyten)

KOELKAST

Malaria discriminant factor 0u 24u 48u 72u

Staal 6 2,2425 3,1277 3,5577 3,9406

Staal 7 2,7621 3,2588 3,8431 4,6756

Staal 8 2,4670 3,2303 4,2372 4,3643

Staal 9 2,0699 2,8963 3,5980 3,1932

Staal 10 2,0489 2,7394 3,3211 3,9628

Gemiddelde 2,3181 3,0505 3,7114 4,0273

SD 0,2996 0,2248 0,3473 0,5570

SD 0,5179 (van 0u tot 24u)

0,9852 (van 0u tot 48u)

1,2086 (van 0u tot 72u)

SD V Lymfocyten 0u 24u 48u 72u

Staal 6 13,03 15,03 15,23 16,15

Staal 7 14,85 15,43 16,68 19,17

Staal 8 13,93 16,72 20,43 20,28

Staal 9 12,56 15,53 16,31 13,92

Staal 10 12,87 14,32 15,44 15,16

Gemiddelde 13,448 15,406 16,818 16,936

SD 0,934783 0,875117 2,106198 2,6945

SD 1,384515 (van 0u tot 24u)

2,38295 (van 0u tot 48u)

2,466388 (van 0u tot 72u)

SD V Monocyten 0u 24u 48u 72u

Staal 6 17,21 20,81 23,36 24,4

Staal 7 18,6 21,12 23,04 24,39

Staal 8 17,71 19,32 20,74 21,52

Staal 9 16,48 18,65 22,06 22,94

Staal 10 15,92 19,13 21,51 26,14

Gemiddelde 17,184 19,806 22,142 23,878

SD 1,045911 1,091343 1,079546 1,738626

SD 1,854034 (van 0u tot 24u)

3,505835 (van 0u tot 48u)

4,733373 (van 0u tot 72u)

De monsters worden het best bewaard op koelkasttemperatuur omdat deze temperatuur

minder invloed heeft op de onderzochte factoren. Hoe ouder het staal , hoe groter de SD

V monocyten en lymfocyten en dus hoe groter de malaria discriminant factor. In één van

de 5 monsters werd zelfs 72 uur na de bloedafname een malaria indicatie aangegeven

(malaria discriminant factor >4,5). De SD V lymfocyten lijkt het meeste onderhevig aan

de invloed van tijd en stijgt met de leeftijd van het monster. De monsters dienen zo snel

mogelijk na afname op het toestel geanalyseerd te worden om de meest betrouwbare

resultaten en de juiste waarschuwing voor malaria te kunnen bekomen.



Figuur 61: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de malaria discriminant factor.

Figuur 62: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V monocyten

Figuur 63: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V lymfocyten.

0

1,5

3

4,5

6

7,5

9

10,5

12

13,5

15

0 24 48 72 96

Mal

aria

fact

or

Tijd (uur)

Invloed tijd en temperatuur op de malaria discriminant factor (Beckman Coulter DxH800)

Malariafactor (Kamertemperatuur)

Malariafactor (Koelkasttemperatuur)

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96

Mal

aria

fact

or

Tijd (uur)

Invloed tijd en temperatuur op de SD V Monocyten (Beckman Coulter DxH800)



10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 24 48 72 96

SD V

Lym

focy

ten

Tijd (uur)

Invloed tijd en temperatuur op de SD V Lymfocyten (Beckman Coulter DxH800)





Figuur 64: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar

rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).

Figuur 65: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na

afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).

Figuur 66: De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links

naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).

Figuur 67 : De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar




Figuur 68: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur

(4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).

Figuur 69: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar


Voor de interpretatie van de histogrammen en de dataplots wordt het staal het beste op

koelkasttemperatuur bewaard. Hoe ouder het staal, hoe slechter de scheiding van de

populaties op de 5PD1 dataplots en verschijnt er ook een extra rode populatie horizontaal

onderaan de dataplot wat volgens de literatuur ook waargenomen wordt bij monsters

met een malaria-infectie. Op de NRBC dataplots wordt de blauwe populatie witte

bloedcellen wijder en verschijnen meer nucleated red blood cells (NRBC). Het histogram

op koelkasttemperatuur toont aan dat hoe ouder het staal hoe lager de celfrequentie van

de neutrofielen wat resulteert in geen mooie verdeling. Het histogram op

kamertemperatuur toont aan dat hoe ouder het staal hoe lager de celfrequentie van de

neutrofielen, eosinofielen en hoe groter de celfrequentie van monocyten. Deze

veranderingen in de histograms worden veroorzaakt door de slechtere differentiatie van

de witte bloedcellen met het tellen van cellen bij de verkeerde populatie.



Appendix 8: Correlatie

De malariafactor is een gecalculeerde parameter die berekend wordt uit de SD V

lymfocyten en de SD V monocyten. Door de correlatie van de malariafactor met de SD V

lyfmocyten van monsters uit de onderzoeksgroep gehospitaliseerde patiënten met een

infectie uit te zetten wordt een correlatie van 89,06% waargenomen, en met de SD V

monocyten 86,36%. De spreiding van het volume van de lymfocyten heeft een iets

betere correlatie met de malariafactor dan de spreiding van het volume van de

monocyten.

Om na te gaan of een grote spreiding van het volume van de lymfocyten gepaard gaat

met een grote spreiding van het volume de monocyten worden deze tegenover elkaar

uitgezet in een grafiek. Er wordt een correlatie waargenomen van 56,87%, d.w.z. dat er

geen groot verband is tussen deze twee variabelen. Er is geen verband tussen de

malariafactor en het aantal bloedplaatjes, dit geeft slechts een correlatie van 23,51%.

0

10

20

30

40

50

0,0000 5,0000 10,0000

SD V

lym

focy

ten


Correlatie Malaria factor en SD V lymfocyten

0

10

20

30

40

50

0,0000 5,0000 10,0000

SD V

mo

no

cyte

n

Malariafactor

Correlatie Malaria factor en SD V monocyten

0

10

20

30

40

0 20 40 60

SD V

mo

no

cyte

n

SD V lymfocyten

Correlatie SD V lymfocyten en SD V monocyten

0

500

1000

1500

0,0000 2,0000 4,0000 6,0000 8,0000 10,0000

Blo

ed

pla

atje

s


Correlatie Malaria factor en bloedplaatjes

Figuur 73: Correlatie bloedplaatjes met de malaria

discriminant factor

Figuur 72: Correlatie SD V lymfocyten met SD V

monocyten3

Figuur 71: Correlatie malaria discriminant factor

met de standaarddeviatie van de monocyten (SD V

monocyten).

Figuur 70: Correlatie malaria discriminant factor

met de standaarddeviatie van de lymfocyten (SD V

lymfocyten).



X. BIJLAGE

Bijlage 1 : Plasmodium falciparum ..........................................................................87

Bijlage 2: Plasmodium ovale ..................................................................................89

Bijlage 1 : Plasmodium falciparum

Tabel 43: Kenmerken P.falciparum (ITG)

P.falciparum

Geografie Tropisch Amerika, Tropisch Afrika, Tropisch Azië en luchthavens

Aandoening Malaria tropica (kwaadaardig)

Biologische

verschijnselen

Koorts, haemolytische anemie, trombocytopenie, hypoglycemie, verhoogd LDH

(lactaat dehydrogenase) en billirubine.

Incubatieperiode 7-21 dagen

Maximale parasitemie 2.000.000/µl

Duur schizogenie 24-48 uur

Hypnozoïeten Neen, geen herval mogelijk

BLOEDUITSTRIJKJE

Geïnfecteerde RBC Normaal met Maurer-vlekken

Stadia Trofozoïeten en jonge gametocyten, zelden schizonten.

Trofozoïeten

Ringvormig, meestal aan de rand van de RBC

Vacuole zichtbaar (1 of meer bij oude trofozoïeten

1 tot 2 chromatine korrels als kern (jonge vormen) en 1 tot 2 ‘uitgerokken’

kernen (ouder vormen)

Vaak meerdere parasieten per RBC (polyparasitisme)

Schizonten

Weinig ontwikkeld onregelmatig cytoplasma (jonge vormen), neemt 2/3 van

de RBC in (rijpe vormen).

2 tot 4 kernen (jonge vormen) en 8 tot 24 kernen (rijpe vormen)

Pigment geconcentreerd op de parasiet

Mannelijke

gametocyten (Micro)

Roze, banaanvormig, geparasiteerde RBC niet zichtbaar

Een grote chromatine vlek als kern

Donkere zwart tot goud-gele granulatie verspreid over parasiet

Vrouwelijke

gametocyten

Grijs-blauw, banaanvorming, geparasiteerde RBC niet zichtbaar

Een goed afgelijnde chromatine korrel als kern

Donkere granulatie gelegen op de kern

DIKDRUPPEL

Trofozoïeten Klein tot gemiddeld, ringvormig meestal als ‘komma’vorm, 1-2 chromatine korrels,

geconcentreerd pigment

Schizonten Klein en compact, 8-24 kernen, pigment geconcentreerd in één massa

Gametocyten Banaanvormig, een duidelijk afgelijnde vlek en donkere versprijde granulatie van het

pigment



Figuur 74: Stadia van de P.falciparum parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-18: Trofozoïeten (2-10

ringstadia); 19-26: Schizonten; 27-28: Vrouwelijke gametocyten (macrogametocyten); 29-30 Mannelijke

gametocyten (microgametocyten).



Bijlage 2: Plasmodium ovale

Tabel 44: Kenmerken P.ovale (ITG)

P.ovale

Geografie Tropisch en sub-tropsich Afrika, enkele gebieden in Zuid-Amerika

Aandoening Malaria tertiana

Biologische

verschijnselen

Koorts

Incubatieperiode 11-16 dagen

Maximale

parasitemie

160.000/µl

Duur schizogenie 48 uur

Hypnozoïeten Ja, herval mogelijk

BLOEDUITSTRIJKJE

Geïnfecteerde RBC Vergroot, normaal of verkleind, ovaal of uitgerokken

Stadia Alle

Trofozoïeten Compacte ringvorm (jonge vormen), neemt RBC niet volledig in (oude vormen)

Een chromatinekorrel als kern (jonge vormen), een tot twee grote kernen

(oude vormen)

Pigment zeldzaam

Polyparasitisme zeldzaam

Schizonten compact (jonge vormen), neemt niet de volledige RBC in (rijpe vormen).

2 tot 4 kernen (jonge vormen) en 4 tot 16 kernen aan de rand van de RBC

(rijpe vormen)

Donkere stippeling op de parasiet (jonge vormen) en een geconcentreerde

pigmentmassa in 1 of 2 massa’s in parasiet (oude vormen)

Mannelijke

gametocyten

(Micro)

Roze tot kleurloos, rond of ovaal, neemt de RBC niet volledig in

Een grote chromatine vlek

Donkere stippeling verspreid over parasiet

Vrouwelijke

gametocyten

Grijs-blauw, rond , neemt de RBC volledig in

Een goed afgelijnde chromatine korrel

Bruine stippeling verspreid over parasiet

DIKDRUPPEL

Trofozoïeten Klein tot gemiddeld, ringvormig of rond, een chromatinekorrel (kern), pigment verspreid

in grove korrels

Schizonten Gemiddelde grote, 4 tot 16 kernen met geconcentreerd pigment

Gametocyten Rond en gemiddeld groot, een duidelijk afgelijnde vlek (kern) pigment verspreid in

grove korrels



Figuur 75: Stadia van de P.ovale parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-5: Jonge trofozoïeten (ringstadia); 6-

15: Trofozoïeten; 16-13: Schizonten; 24: Vrouwelijke gametocyt (macrogametocyt); 25 Mannelijke gametocyt

(microgametocyt).



Documents

| Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het