2
Êëåòî÷íàÿ òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ ¹ 2(4), 2006 Íîâîñòè êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé 17 Ýêñïàíñèÿ (ðàçìíîæåíèå) ãåìîïîýòè÷åñêèõ ñòâîëîâûõ êëåòîê (ÃÑÊ) ïåðñïåêòèâíîå íàïðàâëåíèå êëåòî÷íîé òå- ðàïèè è ðàçâèòèÿ áèçíåñà, ñâÿçàííîãî ñ áàíêèðîâàíèåì ïóïîâèííîé êðîâè. Âñå èññëåäîâàíèÿ, êîòîðûå áûëè îïóá- ëèêîâàíû ïî ýòîìó âîïðîñó, îïèñûâàþò ðàçëè÷íûå ñïîñîáû ýêñïàíñèè ÃÑÊ ex vivo [1-6]. Îñíîâíîé öåëüþ ýêñïàíñèè ÃÑÊ ex vivo ÿâëÿåòñÿ ïîëó÷åíèå èõ äîñòàòî÷íîãî äëÿ òðàíñïëàí- òàöèè è ðåàëèçàöèè òåðàïåâòè÷åñêîãî ýôôåêòà êîëè÷åñòâà ïðè ñîõðàíåíèè ôóíêöèîíàëüíûõ ñâîéñòâ (ñïîñîáíîñòü ïðèæèâàòüñÿ è ïîääåðæèâàòü äëèòåëüíûé ãåìîïîýç) [1]. Îñíîâíûìè íàïðàâëåíèÿìè ðåøåíèÿ ýòîé çàäà÷è ÿâëÿþò- ñÿ: 1) âûáîð îïòèìàëüíîé ïîïóëÿöèè ÃÑÊ äëÿ ýêñïàíñèè; 2) îïðåäåëåíèå îñîáåííîñòåé ýêñïàíñèè ïîïóëÿöèé ÃÑÊ, êî- òîðûå ïîäâåðãàþòñÿ ýíãðàôòèíãó; 3) îáíàðóæåíèå íîâûõ ôàêòîðîâ (àãåíòîâ), âëèÿþùèõ íà äåëåíèå ÃÑÊ ex vivo è in vivo [2]. Óïðàâëÿåìàÿ ýêñïàíñèÿ ãåìîïîýòè÷åñêèõ ñòâîëîâûõ êëåòîê in vivo Ýòà ðàáîòà ïðîäåìîíñòðèðîâàëà íàëè÷èå íîâîãî ìåõà- íèçìà ïåðåäà÷è èíôîðìàöèè è êîíòðîëÿ ðàçâèòèÿ ìåæäó ñòâîëîâûìè è ñîñåäíèìè êëåòêàìè. Àâòîðû ïîäòâåðäèëè ãè- ïîòåçó î òîì, ÷òî MV, ïîëó÷åííûå îò ESC (ES-MV), ñîäåðæàò ðàçëè÷íûå, ñïåöèôè÷åñêèå äëÿ ñòâîëîâûõ êëåòîê ìîëåêóëû, â òîì ÷èñëå è òðàíñìåìáðàííûå, êîòîðûå ìîãóò âîçäåéñòâî- âàòü íà ðîñò è ðàçâèòèå, à òàêæå ïîääåðæèâàòü ñàìîîáíîâ- ëåíèå è «ñòâîëîâîñòü» îêðóæàþùèõ êëåòîê in vitro. ES-MV ñåëåêòèâíî îáîãàùàþòñÿ ìÐÍÊ â ïðîöåññå èõ ôîðìèðîâà- íèÿ. ES-MV ìîãóò àêòèâèðîâàòü êëåòêè ñâîèìè ìåìáðàííûìè ìîëåêóëàìè, à òàêæå ïåðåäàâàòü áåëêè è ÐÍÊ, èíäóöèðóÿ òðàíñëÿöèþ. Ýòè íàáëþäåíèÿ ìîãóò âûÿâèòü íîâûé ìåõàíèçì ãîðèçîíòàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíåòè÷åñêîé èíôîðìàöèè ìåæäó êëåòêàìè, à òàêæå âûÿâèòü òå ìîëåêóëû, êîòîðûå ëåæàò â îñíîâå áèîëîãè÷åñêîãî ôåíîìåíà ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ÿäðà çðåëîé ñîìàòè÷åñêîé êëåòêè ôàêòîðàìè îâîöèòà ïðè åãî ïåðåíîñå èëè ñëèÿíèè. [6, 8,14]. Âîçìîæíî, ÷òî òàêîé ïåðåíîñ èíôîðìàöèè îáåñïå÷èâàåò ðàñïðîñòðàíåíèå òðàíñãåíîâ èëè ìàëûõ èíòåðôåðèðóþùèõ ÐÍÊ â ñîìàòè÷åñêèõ êëåòêàõ. Òàêæå íå èñêëþ÷åíî, ÷òî â ýòèõ âåçèêóëàõ îáíàðóæàòñÿ ìàëûå ÿäåðíûå ÐÍÊ, êîòîðûå íàðÿäó ñ áåëêàìè èãðàþò ðîëü ôàêòîðîâ òðàíñêðèïöèè. ES-MV èìåþò ïðåèìóùåñòâà ïåðåä ðåêîìáèíàíòíûìè ôàê- òîðàìè ðîñòà èëè öèòîêèíàìè, òàê êàê ëó÷øå ïîääåðæèâàþò ïëþðèïîòåíòíîå ñîñòîÿíèå êëåòîê, âûçûâàÿ ýêñïðåññèþ ôàêòîðîâ òðàíñêðèïöèè, ïîýòîìó MV ìîãóò ñòàòü õîðîøèì ñðåäñòâîì ïîääåðæàíèÿ ñòâîëîâîé êëåòî÷íîé ëèíèè. Ñåé- ÷àñ åùå íå ÿñíî, íàñêîëüêî òðàíñïîðò ìîëåêóë ÷åðåç MV ðàñïðîñòðàíåí â êëåòî÷íîé áèîëîãèè. Áåçóñëîâíî, íåîá- õîäèìû äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ ñîäåðæàíèÿ ÐÍÊ è áåëêîâ â ES-MV, à òàêæå àíòèãåíîâ, êîòîðûå ìîãóò âûç- âàòü èììóííûé îòâåò. Ó÷åíûå îæèäàþò, ÷òî àíàëèç áåëêîâ ES-MV ïîìîæåò íàéòè òàêèå ìîëåêóëû, êîòîðûå îòëè÷àþò êëåòêè âíóòðåí- íåé ìàññû áëàñòîöèñòû îò áóäóùåãî òðîôîáëàñòà, à òàêæå âëèÿþò íà ðàííåå ðàçâèòèå ES-êëåòîê. Âîçìîæíî, èìåííî òà- êèå ìîëåêóëû îòâåòñòâåííû çà ïîääåðæàíèÿ «ñòâîëîâîñòè» èëè çàïóñê äèôôåðåíöèðîâêè. Áîëüøèíñòâî ïðîòîêîëîâ ýêñïàíñèè ÃÑÊ ex vivo èñïîëü- çóþò öèòîêèíû è ôàêòîðû ðîñòà [1-4]. Íåäàâíî áûëà îïè- ñàíà ãðóïïà òàê íàçûâàåìûõ àíãèîïîýòèí-ïîäîáíûõ áåëêîâ (Angptl), ñèíòåçèðóåìûõ êëåòêàìè ýìáðèîíàëüíîé ïå÷åíè è ñïîñîáíûõ ïîâûñèòü â êîëè÷åñòâî ÃÑÊ â êóëüòóðå 20-30 ðàç. Àâòîðû ïðåäïîëàãàþò, ÷òî Angptl àêòèâèçèðóþò ñèãíàëüíûå ïóòè, îòëè÷íûå îò òåõ ÷åðåç êîòîðûå äåéñòâóþò èçâåñòíûå ãåìîïîïýòè÷åñêèå ôàêòîðû - SCF, TPO, IGF-2 èëè FGF-1 [11]. Ñîâðåìåííûå ðàáîòû ïîñâÿùåíû ïîíèìàíèþ ìîëåêóëÿðíûõ ìåõàíèçìîâ, ñïîñîáíûõ âëèÿòü íà ðàçìíîæåíèå ÃÑÊ [4,5]. Òàê, áîëüøîå çíà÷åíèå èìåëî èññëåäîâàíèå Wnt-ñèãíàëüíîãî ïóòè [5], àêòèâàöèÿ êîòîðîãî ÷åðåç ýêñïðåññèþ ãåíà HoxB4 ñïîñîá- ñòâóåò ýêñïàíñèè ÃÑÊ [6]. Íåîòúåìëåìûì êîìïîíåíòîì Wnt- ìåõàíèçìà ÿâëÿåòñÿ å¸ íåãàòèâíûé ðåãóëÿòîð - ãëèêîãåí-ñèí- òàçà-êèíàçà-3 (GSK-3) [8] GSK-3 - êëþ÷åâîé ôåðìåíò, âûçûâàþùèé òàêæå ìîäóëÿöèþ Notch-ñèãíàëüíîãî ïóòè [9]. Ïîäãîòîâèëà Ò.Â. Ëîïàòèíà ïî ìàòåðèàëàì Leukemia 2006 Feb 2; Epub. doi: 10.1038/sj.leu.2404132 ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ: 1. Janowska-Wieczorek A., Majka M., Kijowski J. et al. Platelet-derived microparticles bind to hematopoietic stem/progenitor cells and enhance their engraftment. Blood 2001; 98(10): 3143-9. 2. Baj-Krzyworzeka M., Majka M., Pratico D. et al. Platelet-derived microparticles stimulate proliferation, survival, adhesion, and chemotaxis of hematopoietic cells. Exp. Hematol. 2002; 30(5): 450-9. 3. Parker M.A., Bell M.L., Barlow L.A. Cell contact-dependent mechanisms specify taste bud pattern during a critical period early in embryonic development. Dev. Dyn. 2004; 230(4): 630-42. 4. Cole F., Zhang W., Geyra A. et al. Positive regulation of myogenic bHLH factors and skeletal muscle development by the cell surface receptor CDO. Dev. Cell 2004; 7(6): 843-54. 5. Morel O., Toti F., Hugel B., Freyssinet J.M. Cellular microparticles: a disseminated storage pool of bioactive vascular effectors. Curr. Opin. Hematol. 2004; 11(3): 156-64. 6. Do J.T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells 2004; 22(6): 941-9. 7. Cowan C.A., Atienza .J, Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005; 309(5739): 1369-73. 8. Landsverk H.B., Hakelien A.M., Kuntziger T. et al. Reprogrammed gene expression in a somatic cell-free extract. EMBO Rep. 2002; 3(4): 384-9. 9. Sato N., Meijer L., Skaltsounis L. et al. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor. Nat. Med. 2004; 10(1): 55-63. 10. Reya T., Duncan A.W., Ailles L. et al. A role for Wnt signalling in self- renewal of haematopoietic stem cells. Nature 2003; 423(6938): 409-14. 11. Niwa H, Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 2000; 24(4): 372-6. 12. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M. et al. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98(11): 6407-11. 13. Holmgren L., Szeles A., Rajnavolgyi E. et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood 1999; 93(11): 3956-63. 14. Hakelien A.M., Landsverk H.B., Robl J.M. et al. Reprogramming fibroblasts to express T-cell functions using cell extracts. Nat. Biotechnol. 2002; 20(5): 460-6.

УПРАВЛЯЕМАЯ ЭКСПАНСИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК IN VIVO

  • View
    223

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: УПРАВЛЯЕМАЯ ЭКСПАНСИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК IN VIVO

������������� �����������������������������������

�������������������������� �.

:�������� ��6���4����%������9����������&���&'������� ;�%O���������&��������&����������������.��������6&����(�6����* �&�6�������(������&������)��&��������&�3`���������&����*�����'�('����)(.����&��'��9���)&�����)*����'&�5���6����'������('9�������� ;���Y������/0.U23����&���+��-59�������� ;��Y������&���������)�������������������������������.��+��������6�+��������&���������9,,������������&���� ����������,)��+�����-�'� �&����& �����(����-���4�&��-���������4�&��-������-�'� ������96% /023����&�'�������&���������8����9���6������&��5�.��_0%&'(���������-������)��+�� ;����9��������w1%��������������(��������9�����������)��+�� ;�*��.���'����&����5���9����,����)w<%�(���)4������&'�,������& ������&%*&���5?����������� ;��Y������ ������/123

^���&������9��������������9����������&���&'��������������

:����(�����������������&������������&�������.��6������������,����+�������������6&������4�)��&���&'��������������������3�&���'����&��������.����6)����*���{d*���)����'���\!" \!.{d%*�����4����6����'�*���+�,������������&���&'������������)�'*&�����������������(����'�*�����'����)�&�6�����&�.&��-���������6&����*����4�������4�&��-�����(��&.������@��&���&���-H���)4�5?�������� ����� ��\!.{d�������&���(���?�5����s��&���+������,������&�.���3\!.{d���)�����&���&��-�������&�������(����'�������)����*� ���4�������&��-(�����s��*���)+��)��������+�53:����(�5��������)�&'�&��-��&'�������6�����6�����-��������������������������,����+����4�)��������*����4�&'�&��-�������)�'*�����'���4��&����&�(�������������,��������������������&��������6�����������������������,���������&�+���������������������������3/U*L*0=23

`�6��4��*�����������������,����+���(������&���������������������������&������'������,����)5?��

s��&�������������������3���4�������5����*���&9���&�6��)����(���)4�������'������'�s��*�����'������) � (����������5����-,������& ���������+��3\!.{d���5������)?���&�����������(������'��,��.��������������+���������*�������)�8�������4�&�5���5��������������������������*&'6'&��9��������5,������&���������+��*��9���){d���)�����-����8��������&��������4������&���&����������������3;��.����?�������*������-����������������)�����6{d�������������&���������(�������3��6)���&��*���(.�����' ���-���8�� �������&���� �����4���� s�� �(����&&\!.{d*� ���4���������&*�����'����)�&'6.&��-���)��'���&��3

^���'��4���5�* ��������6(����&\!.{d����4�����������������)�'*�����'�������5�������&�)����.�������'(�����+���'��()�)?������,�(�����*����4�&���5�����������6&����\!.������3`�6��4��*��������.��������)�'��&����&���'6�������4����@��&���&����H���6��)����,,����+���&��3

���-8����&����������&9�������� ;��Y����������-.6)5�+������'�,�����'�����/0.=23����&��('�����.������)��������6'&���'��������9���.����(�'�(����& NfpkAh%*�����6��)��'���������9�(������-���������������(�'���&'���-&��������&� ;�&�)�-�)��1J.<J��63�&���'����������5�*���NfpkAh����&�6��)5�������-�'��)��*������'����������6�����'������&)5��6&����'��������9��������,�����'.!"X*$}P*YmX.1���XmX.0/0023;�&������'���(��'���&�?��'��������5�����)����'�������6��&*�����(�'�&����-����6���4���� ;�/=*>23���*(��-8��6�������������������&����xfA.������-�����)��/>2*����&�+��������������69��������5����Ze�y=�����(.��&)��9�������� ;�/U23����������'������������xfA.������6���&�������I������&�'����)�����.��������.���.��6�.����6�.< m!u.<% /L2m!u.<.��5��&��,������*&'6'&�5?�����4����)��+�5#eAQn.������-�����)�� /K23

@�:A�8�;����NC�O�9�8���9��E�8,�����E�#�U&���$��HHI�[����J�T'U�����K�HH Q\)]%�U�3H3 �

����s��^s�_

03tofeg]io.xFBQ|eEBiN3*{o�io{3*uF�eg]iFt3 BAoh3}hoABhBA.GBEFlBGCFQEekoEAFQhB]DFfGAenBCoAekeFBAFQ]ABC�kEepBfFAeEQBhh]ofGBfnofQBAnBFEBfpEozACBfA3yheeG1JJ0wKL 0J%_<0=<.K3

13 yo�.uE|[geE|Bio {3* {o�io {3* }EoAFQe v3 BA oh3 }hoABhBA.GBEFlBGCFQEekoEAFQhB]]AFCjhoABkEehFzBEoAFef* ]jElFloh* oGnB]Fef*ofGQnBCeAo�F]eznBCoAekeFBAFQQBhh]3\�k3ZBCoAeh31JJ1w<J >%_=>J.K3

<3}oEiBE{3N3*yBhh{3q3*yoEhegq3N3"BhhQefAoQA.GBkBfGBfACBQnofF]C]]kBQFz[Ao]ABDjGkoAABEfGjEFfpoQEFAFQohkBEFeGBoEh[FfBCDE[efFQGBlBhekCBfA3vBl3v[f31JJ=w1<J =%_U<J.=13

=3"ehBX3*�nofpx3*mB[EoN3BAoh3}e]FAFlBEBpjhoAFefezC[epBfFQDZqZzoQAeE]ofG]iBhBAohCj]QhBGBlBhekCBfAD[AnBQBhh]jEzoQBEBQBkAeE"vP3vBl3"Bhh1JJ=wc U%_L=<.>=3

>3{eEBhP3* $eAF X3*ZjpBhy3* XEB[]]FfBA t3{3"BhhjhoECFQEekoEAFQhB]_ oGF]]BCFfoABG]AeEopBkeehezDFeoQAFlBlo]QjhoEBzzBQAeE]3"jEE3PkFf3ZBCoAeh31JJ=w00 <%_0>U.U=3

U3vet3$3*!QnehBEZ3M3#jQhBFezBCDE[efFQ]ABCQBhh]EBkEepEoC]eCoAFQQBhh]3!ABC"Bhh]1JJ=w11 U%_K=0.K3

c3"egof"3N3*NAFBf|o3t*{BhAefv3N3*\ppofu3#jQhBoEEBkEepEoCCFfpez

]eCoAFQQBhh]ozABE zj]FefgFAnnjCofBCDE[efFQ]ABCQBhh]3!QFBfQB1JJ>w<JK >c<K%_0<UK.c<3

L3qofG]lBEiZ3y3*ZoiBhFBfN3{3*ujfA|FpBE$3BAoh3MBkEepEoCCBGpBfBB�kEB]]FefFfo]eCoAFQQBhh.zEBBB�AEoQA3\{yPMBk31JJ1w< =%_<L=.K3

K3!oAe#3*{BF�BEq3*!iohA]ejfF]q3BAoh3{oFfABfofQBezkhjEFkeABfQ[FfnjCofofGCej]BBCDE[efFQ ]ABCQBhh] AnEejpnoQAFloAFefezxfA ]FpfohFfpD[ oknoECoQehepFQohm!u.<.]kBQFzFQFfnFDFAeE3#oA3{BG31JJ=w0J 0%_>>.U<3

0J3MB[o$3*vjfQofN3x3*NFhhB]q3BAoh3NEehB zeExfA]FpfohhFfp Ff]Bhz.EBfBgoheznoBCoAekeFBAFQ]ABCQBhh]3#oAjEB1JJ<w=1< UK<L%_=JK.0=3

003#FgoZ*{F[o|oiFt3*!CFAnN3m3�jofAFAoAFlBB�kEB]]FefezPQA.<�=GBzFfB]GFzzBEBfAFoAFef*GBGFzzBEBfAFoAFefeE]Bhz.EBfBgohez\!QBhh]3#oA3mBfBA31JJJw1= =%_<c1.U3

013yBEp]CBGnN3*!|BhB]N3*ZBfEFi]]ef{3BAoh3ZeEF|efAoh AEof]zBEezefQepBfB]D[jkAoiBezokekAeAFQDeGFB]3}EeQ3#oAh3NQoG3!QF3r!N1JJ0wKL 00%_U=Jc.003

0<3ZehCpEBfq3*!|BhB]N3*Mo�folehp[F\3BAoh3ZeEF|efAohAEof]zBEezv#ND[AnBjkAoiBezokekAeAFQDeGFB]3yheeG0KKKwK< 00%_<K>U.U<3

0=3 ZoiBhFBf N3{3* qofG]lBEi Z3y3* MeDh t3{3 BA oh3 MBkEepEoCCFfpzFDEeDho]A]AeB�kEB]]$.QBhhzjfQAFef]j]FfpQBhhB�AEoQA]3#oA3yFeABQnfeh31JJ1w1J >%_=UJ.U3

Page 2: УПРАВЛЯЕМАЯ ЭКСПАНСИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК IN VIVO

������������� �����������������������������������

���������������������������/

;�&�������'�&6���������-#eAQn.�xfA.�������&&��,,����+���&���9�������� ;��6��4��&����&�����.(���vjfQof/0J23

s�(���*����&����)(����&�����&#oAjEB{BGFQFfB*���&����)���&���������&��*&�����������'&�����)���&���.���9���������'8��'������&������� ;��������3�������-������'�*����'&�5?��)������m!u.<&1.�������-�'��)���/L*K2*���)���)5?����������&� ;�*�&���'��(��'��8������&����-������-��9,,����&������(����9����(�������(�����&������&�������&���������������*&��.�5?�����9����,�������������&� ;���������3

`'������������������+�������'� ;�&!"Yv.�'8��*��,���&&����������(�����m!u.<�(�6����3���6����-*���9����,���� ;�����(?����������&�6�������-��(��-.8�&�'8������������������(�����m!u.<3̀ ��6���&��.��*��=�����-*&����,������������&�*��(�5���������).��+�5&������&��&���'�������&��������������3�����������(������m!u.<�()���&��&���)������&'�9����,������)���00�����-����������������+��*���9�����������&�������qFf.)&��������-&0J��63���������'���6)�-���'('�����)���')�I�'���&9�����������������&�������� ;� qFf.%*&'������'���6�)��&��������(���6���&���������,������������&�3T��9�����(�5���������)��+�5���������������������,�������������&*��(?����������&� ;� "v<=��"v<L.%&�6�������&1��6�3T���������&������������(��6)5?�������(���������&������� ;�*��6���.4���'����������������?�����(�����m!u.<*('��)�����&.����*�������������&����4�)&�����&�����3������(��6��*�������&�����6���5��5�*�������(����m!u.<�&������&���.�����+�,���'��������*&'6'&�5?��9�������5 ;��������*����9�������&��4��5?����,)��+�53

T��&'�������������6�������&������(�����m!u.<�������&���������6���*���9���(����)&�����&�����.������&����-��@�������&�'�H������9��������������OqFf.�Q.uFA��!Qo.0��'8��"v<=�����&����������������.?����&������������,�6�3:��('������6�������������*��������� ����������-����������'8��3̀ ���+���-�'������-�'�

9������������('������6���* ���&&����������(�����m!u.<�������)������&����-<����&�'�������-�'��)���*���)���)5?��������� ;�.xfA/0J2*#eAQn/K2�ZBGpBnep/0123���*��(�5����)���������(��'����&*�&�6���'��@&��5������HxfA.�)����1LS&qFf.�Q.uFA��!Qo.0�����.���*����qFf��!Qo.0.3��������������6���)�������9���.����������&*�&�6���'������&�+���#eAQn.�)��*���������4��������&���������&ZBGpBnep.�)��& ;�9������.������-�'� �����'�%�'8��3R��)��+��9���������-�'��).�������(������m!u.<('������&��4���������� ��3:�����.�'�����6'&�5�*���9���(�������+�,������������&��������-����@������H ;�*�����������������'����������8)3

T������������-������(�����m!u.<(�6�����������+�� ;����4����4��������-����-�'8��*���*��.&������)*��4��)��6'&��-������)��+�5���������(��&���'�*)�.�����&'���(�)����5 ;�3���������*��������������(�.����m!u.<6�������-��)�������@&'���H�6���������������������+��������*������-��������4�&���&'���)5��.���)��+�5������96�������&��6�&������������������&�������4���'�������3������*���������'������������+�.�� &������'�% ;�*��6���4���'�&&�����������(�����m!u.<*���-���8����9������������(�5����3

:���������&������������������&���&�6��4����-���)����&��-9�������5 ;��������3T�������������(���.��m!u.<6�������-��)&�����&�����������&������� ;��'8������&���*�������)��+����)5 �������%��������.�(��6)5?)5����&����- ����� ��%3���������������������.��4������4������-�����(����-9����(����)����&��-9����,����������)��+�5 ;�3T�����-�)����(���� ;�.<�����?���������&�������&������6+���������)&���.��&���&'4�&������-�'8������������������+�� ;�*��9��������(�6)���&�������(��-8�����������������.�����&'3T���(�'���������'����)��&�I����������&������������������+������������6��&��)�����������.���������������&� ;�&������4�&����(��6+�*���9�������('&���*��������*�������������+���������)��&��.������&�&6����'���+����������������3

@�:A�8�;���BO�@��9,��;9��E�8,�����E�P$ �G����HHIJ��K�Q!

����s��^s�_

03!EejE\3X3*NDefejEM3*"eEfBAAou3*$Eo[Qezz"3{3\�lFleB�kof]FefeznBCoAekeFBAFQ]ABCofGkEepBfFAeEQBhh]_oEBgBAnBEB[BA�t3ZBCoAeAnBE50KKKwL_K<O0J13

13!nFn"3."3*vFmFj]Aev3*XeECof!3t33\�lFleB�kof]FefezAEof]khofAoDhBnjCofnBCoAekeFBAFQ ]ABCQBhh]_gnBEBGegB]AofG Ff AnB [BoE1JJJ�t3ZBCoAeAnBE3�!ABC"BhhMB]BoEQn1JJJwK_U10.L3

<3ZBFiB$3*#oionoAo$3\�lFleB�kof]FefeznBCoAekeFBAFQ]ABCQBhh]D[Q[AeiFfB]3yFeQnBC3yFekn[]3NQAo11J1w0>K1_<0<3

=3#oiofe$3ZBCoAekeFBAFQ]ABCQBhh]_pBfBEoAFefofGCofFkjhoAFef3$EBfG]YCCjfeh31JJ<w1=_>LK.K=3

>3MB[o$3*vjfQofN3x3*NFhhB]q3BAoh3NEehBzeExfA]FpfohhFfpFf]Bhz.EBfBgoheznoBCoAekeFBAFQ]ABCQBhh]3#oAjEB1JJ<w=1<_=JK.0=3

U3NC]BhhBC!3*}zhjCFeX3*yoEGFfBAv3BAoh3\�lFleB�kof]FefeznjCofnBCoAekeFBAFQ]ABCQBhh]D[GFEBQAGBhFlBE[ezAnBZPVy=neCBekEeABFf3#oA3{BG3

1JJ<wK_0=1<.c3c3uEe]ht3*Nj]AFf}3*yB]hj#3BAoh3YflFAEeB�kof]FefeznBCoAekeFBAFQ]ABC

QBhh]D[EBQeCDFfofA$N$.ZPVy=kEeABFf3#oA3{BG31JJ<wK_0=1L.<13L3XEoCB!3*"enBf}3m!u.<AoiB]QBfAEB]AopBCeEBAnof1J[BoE]ozABE

FA]GF]QelBE[3yFeQnBC3t31JJ0w<>K_0O0U3K3XehA|v3M3*!ofAFope{3"3*yBEBQnFGy3\3*#[Bt3!3mh[QepBf][fAno]BiFfo]B.

<DCeGjhoAB]#eAQn]FpfohFfpofG]AoDFhFA[3"jEE3yFeh31JJ1w01_0JJU30J3vjfQofN3x3*MoAAF]X3{3*vF{o]QFeq3#3BAoh3YfABpEoAFefez#eAQnofG

xfA]FpfohFfpFfnBCoAekeFBAFQ]ABCQBhhCoFfABfofQB3#oA3YCCjfeh31JJ>wU_<0=O113

003"nBfp"3�3*{Bpofu3*mjofpAoem3 BAoh3NfpFekeFBAFf.hFiBkEeABFf]]AFCjhoABB�lFleB�kof]FefeznBCoAekeFBAFQ]ABCQBhh]3#oA3{BG31JJUw01_1=J.>3

013tFot3*NCofoFu3*xofpm3BAoh3!nopp[�m!u<ofAopefF|B]ZBGpBnep]FpfohhFfpD[EBpjhoAFfp"jDFAj]FfABEEjkAj]3#oAjEB1JJ1w=0U_>=L.>13