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第五章 中医细胞生物学第五章 中医细胞生物学实验研究实验研究

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本章的教学目的和要求：本章的教学目的和要求： 1 ．掌握细胞生物学的基本概念及内容。包括细胞的基本结构与功能、细胞的增殖与分化、细胞的衰老与死亡。 2 ．掌握细胞培养的概念和方法。 3 ．掌握中药血清药理学的概念和方法。 4 ．了解细胞生物学的其它常用研究技术。包括显微镜技术、细胞化学技术、细胞周期分析、细胞凋亡的测定、细胞结构成分的离心分离技术、分子生物学技术等。 5 ．了解细胞生物学技术在中医研究中应用的现状。

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细胞生物学细胞生物学是从细胞、亚细胞和分子 3 个水平研究细胞生命活动的学科。 细胞生物学研究内容广泛，主要包括：① 细胞的结构和化学组成。② 细胞及细胞器的功能。③ 细胞的增殖与分化。④ 细胞的衰老与死亡等。

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细胞生物学技术细胞生物学技术：包括形态学观察技术、细胞化学技术、分析细胞学技术、细胞培养和细胞融合技术等。 与细胞生物学相关的概念： 体外实验体外实验：又称离体实验，指脱离机体的组织、细胞实验。 体内实验体内实验：又称整体实验，指人体或动物的实验。

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中医药研究能不能采用细胞生物学技术？ 有人认为不可以不可以。依据：不是整体。如何望闻问切四诊、如何辨证、如何体现整体观、如何用药？ 也有人认为可以可以。 大家如何看这个问题？ 请看两个案例：

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11 ．二仙汤作用机制的研究．二仙汤作用机制的研究 在我国，中医药在妇女围绝经期综合征防治方面发挥着重要的作用，并形成了一些代表性临床有效方剂，例如二仙汤（淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、知母、黄柏）。以往的系列实验研究发现二仙汤具有延缓老年大鼠下丘脑 - 垂体 - 性腺轴的衰老，并具有增进其功能的作用。 问题：问题： 二仙汤是直接作用于下丘脑、垂体，还是性腺呢？ 是哪些中药或有效成分在起作用？

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最好的办法是采用细胞生物学技术，将性腺等有关细胞，体外用药、培养观察，以排除体内性腺轴等其他组织的影响。 可以采用拆方、单味中药，甚至是中药的主要成分实验，筛选其主要作用部位和配伍。后者是中药发展的重要趋势。

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以下数据引自董冰峰硕士学位课题的实验记录： （（ 11 ）不同浓度二仙汤全方及拆方直接加入对原代）不同浓度二仙汤全方及拆方直接加入对原代培养大鼠卵泡颗粒细胞分泌雌二醇（培养大鼠卵泡颗粒细胞分泌雌二醇（ EE22 ）的作用）的作用 方法方法：于 24孔培养板中培养原代培养的大鼠卵泡颗粒细胞，每组 4孔。将二仙汤全方和温肾、滋阴两个拆方分别稀释 100 倍和 1000 倍（在图中分别以 -2 、 -3 表示），设空白对照组。给药培养 24小时后，吸取上清液，采用放射免疫分析方法测定 E2 。

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结果结果：稀释 1000倍的温肾组作用最好，与空白对照组比较，有显著性差异。

二仙汤全方及拆方不同浓度直接加入对颗粒细胞分泌 E2 的作用 分析分析：拆方以温肾方（淫羊藿、仙茅、巴戟天）为好，是哪味中药有效呢？还是均有效呢？

0. 0

5. 0

10. 0

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20. 0

空白 - 2温肾 - 2滋阴 - 2全方 - 3温肾 - 3滋阴 - 3全方

E2pg/ml

浓度（

）

＊┌─────────┐

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（（ 22 ）二仙汤各单味药直接给药对原代培养卵泡颗）二仙汤各单味药直接给药对原代培养卵泡颗粒细胞分泌粒细胞分泌 EE22 的作用的作用 方法方法：按以上方法，将二仙汤全方中的每一味药单独用 M199 细胞培养液稀释 1000倍，直接加入，空白对照组仅用 M199 细胞培养液。给药培养 24小时后，吸出上清液，测 E2含量。

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结果结果：二仙汤全方中每一味药均可不同程度促进卵泡颗粒细胞分泌 E2 。温肾方的 3 味中药仙茅、巴戟天和淫羊藿与空白对照组相比，均可以显著提高颗粒细胞分泌 E2；滋阴组两味中药知母和黄柏作用弱；当归对刺激 E2 分泌也有较显著的促进作用。

中药直接加入对卵泡颗粒细胞分泌 E2 的作用0. 0

10. 0

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空白 淫羊藿 仙茅 巴戟天 当归 知母 黄柏

E2浓度（pg/ml） ＊

＊＊ ＊┌──────────┐

┌───────┐ ┌────┐

┌──┐

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（（ 33 ）个别中药成分直接给药对原代培养卵泡颗粒）个别中药成分直接给药对原代培养卵泡颗粒细胞分泌细胞分泌 EE22 的作用的作用 方法方法：按以上方法，仙茅苷（仙茅的主要成分）和淫羊藿苷（淫羊藿的主要成分）用 DMSO溶解后，加入 M199 培养基，过滤灭菌。两者浓度分别为 100μg/L （仙茅 1 、淫羊 1 ）、 300μg/L （仙茅 2 、淫羊2 ）。大鼠卵巢颗粒细胞达到贴壁伸展的状态后，直接加入含有中药有效成分的培养基 0.5ml ，继续培养3小时。吸取上清液，置 -20℃冰箱终止反应，测 E2含量。

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结果结果： 300μg/L浓度的淫羊藿苷（淫羊 2 ）具有促进卵泡颗粒细胞分泌 E2 的作用。两个浓度的仙茅苷、及低浓度的淫羊藿苷无作用。

部分中药成分直接给药对卵泡颗粒细胞分泌 E2 的作用 分析分析：（ 1 ）淫羊藿促进卵巢颗粒细胞分泌 E2 的作用，可能是淫羊藿苷的作用。（ 2 ）仙茅苷无效的原因有待分析。（ 3 ）鉴于原代细胞质量控制的困难，希望采用卵巢颗粒细胞株代替。

0. 0

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空白 DMSO 仙茅1 仙茅2 淫羊1 淫羊2

E2浓度（pg/ml）＊┌─────────────┐

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22 ．细胞角蛋白．细胞角蛋白 1818 在肝癌中的作用在肝癌中的作用 细胞角蛋白 18 （ cytokeratin 18 ， CK18 ）在大鼠肝脏中的特点是表达量较大，应具有较大的生理（或病理）功能。该基因在 DEN诱癌期间几乎是持续上调，至肝癌形成之际处于较高的表达水平。当肝癌发生后 CK18上调近 3倍，中药不同治法对其下调的作用不明显，其中健脾益气法具有轻微地下调作用，其他治法，尤其是对照西药，反而上调该基因的表达。

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010002000300040005000600070008000

正常 4周 8周 16周 肝癌

芯片读数计算值

010002000300040005000600070008000900010000

正常 肝癌 西药 全方 请热 活血 健脾

芯片读数计算值

上图 CK18 在 DEN诱导大鼠肝癌不同阶段的表达

下图 不同治法对大鼠肝癌 CK18 的作用

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以往研究发现， CK18 的 1型中级细丝链由 KRT18基因所编码，表达于单层上皮细胞组织，其突变与原因不明的肝硬化或硬化证有关。 还有研究观察到，人肝癌组蛋白 3 与 CK18 发生免疫共沉淀，推测组蛋白 3 的表达与细胞角蛋白 18改变高度相关，并在肝癌的发生中发挥重要的作用。

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问题：问题： 该基因在肝癌的发生与发展中扮演着什么样的角色？ 中医健脾益气治法下调该基因的药理意义如何？ 有没有可能筛选和优化中医药防治肝癌的方法？ 即如果该基因在肝癌的发生中确有重要的作用，可以将此基因作为疗效评价指标之一，用于筛选具有防治肝癌的中药，不断优化中药的配伍及有效成分的配伍。

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如何回答以上的问题？ 方法之一，是在肝癌细胞中把该基因关闭掉，或者令其表达后沉默，不能翻译成蛋白。如果该基因表达沉默后，肝癌细胞的增殖受到抑制，则表明肝癌细胞的增殖依赖该基因，亦即该基因具有促进肝癌细胞恶性增殖的作用（角色）。 方法：方法：采用 RNARNA 干扰干扰技术。该技术需借助细胞生细胞生物学实验物学实验。

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结果结果：电转染含 CK18 的 RNAi载体后， MTT 表明，在细胞抗生素 G418 的作用下，空白细胞增殖明显抑制、细胞数量下降； RNAi空白载体具有抗 G418 基因，使得转染该空白载体的细胞存活，并逐步开始增殖；而电转染含 CK18 的 RNAi载体后，该基因 RNAi作用比较明显，转染 6d时，与转染该空白载体比较，高、中两个不同浓度培养的肝癌细胞一致出现了细胞增殖的抑制。

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0. 0000. 2000. 4000. 6000. 8001. 0001. 2001. 400

1d 3d 6dRNAi基因转染后时间

A490

OD吸光度（

）

正电高阴性高CK18高

0. 0000. 1000. 2000. 3000. 4000. 5000. 6000. 7000. 8000. 900

1d 3d 6dRNAi基因转染后时间

A490

OD吸光度（

）

正电中阴性中CK18中

上图 高浓度肝癌细胞 CK18 RNAi 后生长曲线 下图 低浓度肝癌细胞 CK18 RNAi 后生长曲线

* 图中正电高 / 中代表经空白电击后高、中两个浓度的肝癌细胞；阴性高 /中代表电转染 RNAi空白载体； CK18 高 / 中代表电转染 CK18 的 RNAi 载体。

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分析分析： CK18似有促进肝癌细胞恶性增殖的作用。当 CK18 表达沉默后，可进一步检测组蛋白 3 表达水平是否下降；并可进一步观察其与其他基因表达的关系。 结论结论：当代的中医药研究，需要回答许多深层次的学术问题，已不仅仅是传统的临床或动物药理实验。中医药研究需要不断深入的探索和创新，由此要求不断引入新技术、新方法、新思路，其中就包含了细胞生物学技术。

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在座的同学有开展过探索性实验的，结果如何？是不是可以采用细胞生物学技术进一步深入研究呢？ 比如进一步观察和确认某中药复方有没有作用？哪些组合、配伍、药物有效？药物的有效部位、成分、及其组合如何？被调控的组织、系统、器官是什么？被调控的基因、基因组是什么？如何提高疗效……

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归纳细胞生物学技术的特点： 细胞生物学技术的优缺点细胞生物学技术的优缺点：

优点 缺点 ① 研究效率高，速度快。 ② 实验条件容易控制。 ③ 易于排除干扰因素。 ④ 重复性好。 ⑤ 方法简便。 ⑥ 经济。 ⑦ 便于采用来源于人体的细胞。 ⑧ 实验结果易于分析。

① 细胞缺少体内周边环境，如结构和压力、细胞间信息的传递等。 ② 丧失机体的完整性，没有神经、体液、脏腑、组织、药物代谢等。 ③ 不符合临床用药。

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第一节 细胞生物学的基本理论第一节 细胞生物学的基本理论 细胞分为原核细胞与真核细胞。 原核细胞原核细胞 结构简单，仅由细胞膜包绕，在细胞质内含有 DNA区域，但无被膜包围。其细胞质中没有内质网、高尔基复合体、溶酶体及线粒体等膜性细胞器，但含有核糖体。其另一特点是在细胞膜外，有一坚韧的细胞壁，其主要成分是蛋白多糖和糖脂。常见的原核细胞有支原体、细菌、放线菌和蓝绿藻等，在医学研究中，常用的大肠杆菌即属于原核细胞。 真核细胞 真核细胞 比原核细胞进化程度高，结构更复杂，有核膜包围的细胞核。 细胞生物学通常指真核细胞。

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原核细胞与真核细胞的区别

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一、细胞的基本结构与功能一、细胞的基本结构与功能 光学显微镜可见显微结构，电子显微镜可见亚显微结构。 真核细胞真核细胞可分为细胞膜、细胞质（可见各种膜性细胞器，如内质网、高尔基复合体、溶酶体、线粒体、过氧化物酶体，以及微丝、微管、中等纤维等细胞骨架系统）和细胞核（可见核仁、染色质、核骨架）。

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1 ．生物膜结构及其功能 2 ．细胞骨架结构及其功能 3 ．细胞质溶胶及其功能 4 ．细胞核及其功能

动物细胞的结构

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二、细胞的增殖与分化二、细胞的增殖与分化 细胞增殖细胞增殖是指细胞的不断生长与分裂，与细胞周期调控有关。 细胞周期细胞周期是指细胞从上一次分裂结束开始生长到下一次分裂终了所经历的过程，其所需的时间则称为细胞周期时间。

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细胞周期：细胞周期： （（ 11 ）分裂期（）分裂期（ MM期期 ））：细胞有丝分裂的过程。 （（ 22 ）分裂间期：）分裂间期： 1 ） DNADNA 合 成前期合 成前期（（ GG11 期期，又称有丝分裂后期，是调节下一轮周期时间的关键） 2 ） DNADNA 合成期（合成期（ SS期期）） 3 ） DNADNA 合成后期（合成后期（ GG22 期期，介于 S 期与 M 期之间，时间短）。 4 ）暂不增殖细胞（暂不增殖细胞（ GG00 细胞细胞））：一般情况下是不分裂，如神经、肌肉、肝、肾细胞等。

细胞周期

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周期性细胞周期性细胞：细胞周期中连续分裂的细胞，如生理状态下的上皮基底层细胞与部分骨髓细胞、肿瘤细胞等。 细胞周期的过程是严格有序的，其调控是一个极其复杂的过程。 细胞分化细胞分化：指从受精开始的个体发育过程中细胞之间逐渐产生稳定性差异的过程。细胞分化使细胞由非专一性（非特化性）状态向形态和功能的专一性（特化性）状态转变，成为具有不同表型结构的各种类型的细胞。 细胞分化的调控是一个十分复杂的过程。

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三、细胞的衰老与死亡三、细胞的衰老与死亡 细胞衰老细胞衰老的特征：① 细胞内水分减少，导致细胞硬度增加，代谢速率减慢。② 色素颗粒沉积。③ 细胞器的衰老变化，包括细胞膜上的微绒毛数目增加，细胞膜的流动性降低，线粒体的数量减少而体积增大，细胞核核膜内折。④ 化学组成与生化反应的改变，如蛋白质合成的速度下降，细胞内酶的活性与含量发生变化。 按细胞死亡的特点，可大致分为两大类：

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细胞凋亡细胞凋亡：即程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主有序的一种生理性细胞死亡，以细胞 DNA 早期降解 为特征的、无明显细胞溶解的细胞自杀过程。 细胞坏死细胞坏死：即细胞病理性死亡。

细胞凋亡与细胞坏死的形态学区别

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细胞凋亡的过程

34正常胸腺细胞 凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）

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细胞凋亡与细胞坏死的比较细胞凋亡与细胞坏死的比较 项目 细胞凋亡 细胞坏死形态学 “细胞皱缩、片断化，可见 凋亡

”小体 溶解膜的完整性 能保持 不能保持线粒体 自身吞噬 肿胀， Ca2+内吞染色质 致密 分解自吞噬 常见 缺少潜伏期 数小时 没有蛋白质合成 有 无始发因素 胚胎、变态发育 毒素、缺血、酸碱度改变典型细胞 胚胎神经元 肝细胞受毒素作用控制因素 内分泌 毒素胞质生化改变 溶酶体酶增多 溶酶体解体细胞核生化改变 DNA片段化 弥漫性降解最初表现 蛋白质合成下降 肿胀

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第二节 细胞生物学常用实验技术第二节 细胞生物学常用实验技术 一、细胞培养技术一、细胞培养技术 细胞培养技术细胞培养技术是细胞体外培养的实验技术，分原代培养和传代培养。

培养的植物细胞团

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原代培养原代培养：指来自于供体的组织或细胞在体外进行的首次培养，其培养细胞的主要特点是生物学特性与在体细胞最为接近。

大鼠超排卵卵巢组织形态与正常组织 卵泡颗粒细胞培养 72小时1 PMSG刺激后的大鼠双侧卵巢；2 正常大鼠双侧卵巢。 ——引自董冰峰硕士毕业论文

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常用的原代培养方法主要有组织块法和消化法： 组织块法组织块法：将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块，接种于培养瓶中，新生的细胞大约在 24h 后可从贴壁的组织块四周游离出来，并继续生长。 消化法消化法：指应用胰蛋白酶、胶原酶、 DETA 等生化的手段将已剪切成较小体积的组织块中妨碍细胞生长的基质、纤维等间质加以消化，使组织中结合紧密的细胞相互分离，从而形成含单细胞或细胞团的悬液，进一步培养后，便可生长出大量活细胞。

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传代培养传代培养：指细胞在培养过程中，对细胞加以及时的分离、稀释，继续培养。 根据细胞在培养瓶中的生长方式，可分为：贴壁细贴壁细胞胞和悬浮细胞悬浮细胞。对于大多数贴壁细胞，主要采用 0.25%胰蛋白酶液消化后稀释的方法进行传代。

垂体细胞前叶细胞培养 24小时 垂体细胞前叶细胞培养 72小时

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11 ．细胞体外培养的一．细胞体外培养的一般条件般条件 培养细胞一般接种于盛有 pH 7.2 ～ 7.4 的培养液的器皿中，放置在 36～ 37℃ 、 5%CO2 加 95% 空气混合气体、 95％～ 100%湿度的培养箱中。这种环境同样也适合多种细菌、支原体、真菌的生长。因此，通常在培养液中加入适量的抗生素（如青霉素、链霉素），并在细胞培养的全过程保持无菌操作。 CO2 培养箱

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细胞需要生长在具有充分营养物质的培养基中，培养基主要含有的成分有：① 含氮化合物；② 维生素和某些金属离子；③ 无机盐离子；④ 碳水化合物；⑤ 促生长因子。目前细胞培养的培养基已商品化生产。另外，大多数细胞的培养液中需加入血清，常用经 56℃、 30min灭活的胎牛血清、小牛血清，血清中含有多种细胞生长因子、促贴附因子以及其他生物活性物质。培养液中血清的含量一般为 10% ，以维持细胞的正常生长。

42倒置显微镜

43细胞计数板

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生物安全柜及工作原理

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培 养 板 培养瓶

培养皿

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22 ．细胞的冻存与复苏．细胞的冻存与复苏 为了对以扩增细胞的保种，以及实验结束后细胞的长期存放，要求对体外培养的细胞及时冻存。冻存通常是指将细胞混悬在培养液中，加入适量的二甲亚砜（ DMSO ）或甘油后，冷冻储存在 -196℃的液氮中。在细胞冻存过程中要注意采用缓慢冻存的方式，通常采用以下条件逐步冻存：首先将装细胞的冻存管置于 4℃冰箱 1h ，再置于 -20℃冰箱2h ，然后置于 -80℃冰箱 2h ，最后置于液氮长期保存。 复苏是指将 -196℃液氮中冻存的细胞取出融解，使其活力恢复的过程。在细胞复苏过程中，要注意采用快速融化的方式，通常将装细胞的冻存管直接从液氮中取出放置于 37℃水浴中，并不断摇晃，使冻存的细胞悬液尽快融化。

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33 ．培养细胞的生长与观察．培养细胞的生长与观察 医学上培养的细胞大多为贴壁细胞，贴壁细胞刚接种入培养液时多呈圆球形，几十分钟至数小时后，贴附到瓶壁上，此称为细胞贴壁。细胞一经贴壁就迅速铺展呈多形态，经过一段潜伏期后细胞即开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般在数天内就铺满瓶壁，形成致密的细胞单层。对数生长期是细胞活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的、最主要的阶段。 长成单层的细胞经过一段时间，一定要进行细胞的传代传代。传代后的细胞在新的培养瓶中约经 6～ 24h开始贴壁，再次进入新的生长周期。细胞系在体外的可传代数与细胞种类及供体的年龄等有关。

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细胞培养中的一个非常有趣的现象是细胞的 接触抑制接触抑制，当贴壁生长的细胞分裂生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，相互紧密接触的细胞不再进入 S期（一些肿瘤细胞例外一些肿瘤细胞例外） 。

肝癌 QGY-7703 细胞 400× 肺癌细胞 100×肝癌细胞有接触抑制现象。 肺癌细胞则没有接触抑制现象。

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人胚肺二倍体成纤维细胞在不冻存和反复传代条件下，可传 30～ 50 代，相当于 150～ 300 个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡；神经元一般不能传代培养，正常肝细胞及肾细胞也仅能传几代或十几代，而大多数肿瘤细胞株的传代要多得多。 细胞系细胞系：传代培养的原代细胞。 细胞株细胞株：细胞系由单细胞分离培养、增殖形成细胞群。 体外培养的细胞形态细胞形态，与体内原有细胞不同，按形态大致可分为成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。

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细胞进行生长增殖能力的测定： MTT 法最常用。MTT 的化学名称为 3- （ 4 ， 5- 二甲基噻唑 -2 ） -2 ，5- 二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，其可接收氢原子而发生显色反应。活细胞中的线粒体具有琥珀酸脱氢酶，能够使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物，蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜中，应用酶标仪在 570nm波长可以检测其光吸收值，并根据吸收值的高低判断细胞数量。

MTT 显色前后 台式摇床 酶标仪

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SMMC7721 细胞培养污染 真菌污染

常见的问题常见的问题：污染。主要原因主要原因：操作不当。其余如实验室环境、超净台污染和过滤材料陈旧、试剂污染、材料污染。无菌概念无菌概念及其执行十分重要。

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二、显微镜技术二、显微镜技术 细胞培养常用： 倒置相差显微镜倒置相差显微镜，通过将相差变为振幅差，使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，能更清晰地观察活细胞的细微结构。

倒置显微镜

53倒置相差显微镜原理

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相差显微镜观察结果

浮雕相差显微镜观察结果

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倒置显微镜和显微操作仪

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荧光显微镜荧光显微镜：以紫外线为光源，激发一些自身可发射荧光或使用荧光抗体后能发射荧光的细胞及其物质产生荧光，从而便于定性和定量观察细胞及细胞器。

微管呈绿色、微丝红色、核蓝色 尼康 E800荧光 DIC 显微镜

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激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜：在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，可以对观察样品进行断层扫描和成像，可以无损伤地观察与分析细胞三维空间结构，观察活细胞的动态及多种荧光标记。

激光共聚焦扫描显微镜 蓝色为细胞核，绿色为微管图片来自 http://www.itg.uiuc.edu

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三、中药血清药理学三、中药血清药理学 中药血清药理学实验方法中药血清药理学实验方法：是指中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液并分离血清后，用此含药物成分的血清进行体外实验的一种实验方法。该技术有利于排除体外实验直接给药可能带来的各种干扰因素，更好地模拟体内药物的真实情况。

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（一）中药血清药理学实验方法的提出（一）中药血清药理学实验方法的提出 田代真一（日本）在 20世纪 80 年代中期研究柴苓汤时提出。 为什么要采用血清药理学？ 血清药理实验方法的优点血清药理实验方法的优点：① 与中药直接给药的体外实验相比，该技术可有效避免中药粗制剂中杂质和理化特性对实验结果造成的影响；② 中药经口服后，其部分有效成分需在胃肠道内受到消化液与寄生菌群代谢转化，能反映中药在胃肠道消化吸收，再经消化系统的生物转化，最后释放到血液，产生药理效应的真实过程，并代表了药物在体内产生作用的真实有效成分。

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（二）中药血清药理学实验方法的主要内容（二）中药血清药理学实验方法的主要内容 11 ．关于供血清动物的选择．关于供血清动物的选择 对应来自某动物细胞的动物。 22 ．动物含药血清的制备方法．动物含药血清的制备方法 一般取中药或复方的粗制剂给动物灌胃，当给予一定剂量后，采血，分离血清。

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（（ 1 ）给药剂量）给药剂量：一般按以下公式计算：给药剂量= 临床常用量 × 动物等效剂量系数 × 培养基内的稀释度 = 动物等效剂量 × 培养基内的稀释度。 例如某中药临床每天的用量为 10g （即约为 0.2g/kg ），大鼠的等效剂量系数可粗略以 5计算，体外细胞培养反应系统中血清添加量以 20％为计（即含药血清被稀释 5倍），那么每天给大鼠灌胃的生药剂量应为： 0.2g/kg×5×5＝ 5g/kg 。如果是药味多、剂量大的大复方，按此公式计算可能会造成动物灌胃困难，可适当降低给药剂量。

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（（ 2 ）给药与采血）给药与采血：研究表明，在大多情况下，多次动物给药比单次给药的效果要好。李仪奎等根据大量已知中药的药动学资料的回顾性分析，提出一个对大多数中药适用的给药方案：即每日给药（灌胃） 2次，连续给药 3日，末次给药后 1h 采血。 采血必须在严格无菌操作下进行。动物麻醉后，常规皮毛消毒，采血部位一般取腹主动脉或颈总动脉，家兔可选心脏采血。采血后静置 2h 以上，再 3000r/min 离心 10～ 15min无菌分离血清或用 0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，置 4℃或 -20℃冰箱保存。

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33 ．含药血清的添加．含药血清的添加 通常，采用新鲜血清为宜。即使在 4℃环境下，也不宜超过 5 天，或在 -20℃环境下不要超过 2 个月。在体外细胞培养实验中要特别注意血清的添加量，在一般情况下，培养基中血清的含量不宜超过 20％。 44 ．中药血清药理学的注意事项．中药血清药理学的注意事项 （ 1 ）由于动物血清本身具有药效和细胞毒性等生物活性，其不含药物的正常血清可能对实验结果一定的影响，甚至发生显著的干扰作用。因此，在进行相关实验设计时，一定要设空白血清对照组，即不含药物的正常血清组。且要求血清灭活，经 55℃处理 30min 。 （ 2 ）采用一致的采血时间与方法。

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四、细胞化学技术四、细胞化学技术 细胞化学技术细胞化学技术是在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，来研究细胞乃至细胞器的结构与功能关系的一类技术。该技术包括在细胞显微或超微结构水平上的酶细胞化学技术、免疫化学技术、放射自显影技术等内容。 11 ．酶细胞化学技术．酶细胞化学技术 组织化学、酶的定位、标记酶对细胞的鉴别。

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22 ．免疫细胞化学技术．免疫细胞化学技术 免疫细胞化学技术是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。免疫组织化学。 33 ．放射自显影技术．放射自显影技术 放射自显影是利用放射性核素所放射出来的射线作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，并通过显影过程把“像”显示出来，以研究用放射性核素标记的物质在生物体内的定位和定量的一种技术。

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五、细胞周期分析五、细胞周期分析 常用的细胞周期的检测方法细胞周期的检测方法有：流式细胞术和通过分析细胞中 CDK 活性来检测细胞周期的方法。 11 ．流式细胞术．流式细胞术 流式细胞术是用流式细胞仪，集激光、光电测量、计算机技术为一体，运用荧光化学、免疫荧光技术进行细胞测量和分选的一门技术。 流式细胞仪检测细胞周期的原理是根据细胞在不同的细胞周期时相中 DNA含量存在差异的特点，应用DNA荧光染料染色，检测细胞内 DNA荧光强度变化，判断细胞所处的细胞周期。常用的染料是碘化丙锭（ PI ），为核酸嵌入型染料。因此，流式细胞术常用于细胞增殖、分化、凋亡等检测。

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流式细胞仪及其工作原理

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流式免疫荧光技术进行免疫细胞标记：以明确淋巴瘤的起源细胞类型。Thy1 （ CD3抗体）： T 细胞特异性抗体B220 （ CD45R ）： B 细胞特异性抗体J ： wild-tpye淋巴结K ： Mus81+/-T 系淋巴瘤L ： Mus81+/-B 系淋巴瘤

流式细胞计数

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22 ．． CDKCDK 的活性测定的活性测定 由于不同的细胞周期素依赖蛋白激酶（ CDK ）， CDK 在细胞周期的不同时期被激活，所以 CDK 家族成员的活性可作为判断细胞所处细胞周期状态的明确标记。例如，细胞周期蛋白细胞周期蛋白 E-E-CDK2CDK2 活性出现于晚 G1 期，消失于早 S 期；细胞周细胞周期蛋白期蛋白 A-CDK2A-CDK2 活性出现于早 S 期，消失于早 M 期；细胞周期蛋白细胞周期蛋白 B-CDK1B-CDK1 活性出现于 G2 期，消失于中M 期。

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六、细胞凋亡的测定六、细胞凋亡的测定 常用的检测方法包括： （ 1 ）形态学检测：观察凋亡小体、染色质浓缩等细胞形态学改变； （ 2 ）细胞核 DNA检测：提取细胞的基因组 DNA ，通过琼脂糖凝胶电泳检测到 DNA梯形状条带的存在； （ 3 ）细胞膜通透性检测：测定标记蛋白、标记核酸和标记酶的释放以及染料进入细胞等（流式细胞仪检测）； （ 4 ）有关细胞膜成分外露检测：如磷脂酰丝氨酸等的检测（流式细胞仪检测）。

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采用 OLYMPUS-CKX41荧光倒置相差显微镜拍摄的 SMMC-7721肝癌细胞（ ×200 ）。在荧光脂质体转染后 21小时，该细胞可见右 40％左右的细胞转染成功；镜下可见细胞质、细胞核和染色体；那些荧光亮者，可见细胞呈绿色；那些转染量大者，出现细胞凋亡和凋亡小体（图中偏右下）：

正在发生凋亡的 SMMC7721肝癌细胞（右上角）

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七、细胞结构成分的离心分离技术七、细胞结构成分的离心分离技术 不同细胞和细胞内的各种细胞器大小和密度不同，所以在同一离心场内的沉降速度是不一样的，根据该原理，可选用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡离心法等来分离细胞及细胞器。 八、分子生物学技术八、分子生物学技术

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第三节 细胞生物学技术在中医研究第三节 细胞生物学技术在中医研究中的应用中的应用 一、中药资源的开发与利用一、中药资源的开发与利用 二、中药药理研究的体外实验二、中药药理研究的体外实验 11 ．中药制剂的体外实验．中药制剂的体外实验 22 ．中药有效成分的体外实验．中药有效成分的体外实验 三、中医基础理论的探讨三、中医基础理论的探讨

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