Upload
andrey-levin
View
3.824
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
1-Feb-13
Проточная цитофлуориметрия
2 1-Feb-13
Определение :
автоматизированная световая и флуоресцентная микроскопия единичных клеток в постоянном потоке.
1-Feb-13 3
Клеточный анализ: статистика
1, 3 или 8 бластов ???
Таблица Rümke: статистические отклонения
1-Feb-13 4
Проблемы, связанные с автоматическим подсчетом
Все клетки на одной картинке: слишком медленно
Каждая клетка отдельно: слишком медленно
Детальное рассмотрение: проблемы дуплетов и «половин» клеток
1-Feb-13 5
Решение: «выстраивание» клеток
«Бороздка» на предметном стекле
Стационарная секция изображения
© CONATEX Didactic
Непрерывная подача образца
Схема цитофлуориметра
6 1-Feb-13
Лазер
Образец
Обжимающая
жидкость
Отходы
Детектор
Предмет анализа
7 1-Feb-13
Клетки крови Хромосомы
Водоросли Простейшие
Частицы размера 0,5 – 50 мкм
Пример: иммунофенотипирование
8 1-Feb-13
Пример: научные исследования
9 1-Feb-13
X
Y
Сортировка спермы Культивирование дрожжей
Жизнеспособность бактерии
Трансдукция сигнала
Какие из этого возникают сложности?
10 1-Feb-13
• Различные составляющие образца
• Сложные технологии
• Множество пользователей
Транспортировка, хранение, приготовление образца, обработка патогенов
Адекватные условия окружающей среды, спецификация и обслуживание прибора
Обучение, подготовка к работе на инструменте, документирование
Нормативы для лабораторий
11 1-Feb-13
• Фундаментальные исследования: MIFlowCyt
• Анализ в фармацевтических исследованиях и тестированиях на безопасность лекарственных средств: GLP Good Laboratory Practice – свод международных требований к лабораторным исследованиям (законодательно регулируемо)
• Анализ последующего использования в цикле разработки лекарственных средств для мониторинга пациентов в клинических испытаниях и т.д.: схожие с GLP условия
• Анализ в виде контроля качества фармацевтической продукции: GMP Good Manufacturing Practice – свод международных требований к производству
• Медицинские диагностические лаборатории: Директивы Ассоциации Медицинских Работников, Аккредитация
Общие требования
12 1-Feb-13
Персонал: экспертиза, авторизация
Помещения: доступ, условия окружающей среды
Оборудование: обслуживание, отчеты
Реагенты, логистика
Валидированные процедуры
Внутренний и внешний контроль качества
Референсные значения
Соответствующая интерпретация
Все должно быть задокументировано!
1-Feb-13 13
MIFlowCyt
1-Feb-13 14
MIFlowCyt
Good Laboratory Praxis (GLP)
15 1-Feb-13
ВНИМАНИЕ: GLP может иметь различное значение в разных странах! США: общие положения; Европа: юридический характер!
Если это не специфичные случаи, описанные государственным законодательством, правила GLP применяются ко всем неклиническим исследованиям по охране здоровья и окружающей среды, требующие соблюдения правил регистрации или лицензирования фармацевтики, пестицидов, пищевых и кормовых добавок, косметических продуктов, ветеринарных лекарственных и схожих продуктов и для установления норм дляпромышленных химических продуктов.
Что такое GLP?
16 1-Feb-13
• Документация, Документация…
Если это не написано, значит, Вы этого не делали! Лабораторные записи могут «привести» к патентам и обеспечить финансовую основу для будущей работы!
• Стандартизация
Требует постоянных условий Повышает качество результатов и, следовательно, качество публикаций, диссертаций и т.д.
Что нужно документировать?
17 1-Feb-13
• Исходные данные
• Тестовые процедуры
• Реагенты и материалы
• Записи по подготовке
• Журналы по оборудованию и оснащению
• Записи по обслуживанию инструмента
• Записи проверки оборудования
Документы по каждодневной лабораторной
работе:
• Лабораторный журнал
• Записи в журнал инструмента
• Стандартные процедуры оператора (SOP)
Стандартные процедуры оператора
18 1-Feb-13
• Разъяснить как осуществляются рутинные каждодневные
действия
• Обеспечить взаимодействие между исследователями
• Обеспечить полезность для обучения новых пользователей
• Сформировать основу для внедрения системы управления
качества
• Обновлять каждые два года
В клинических исследованиях, SOP определяются International Conference on Harmonisation (ICH – Международной Конференцией по Согласованию) как «детальные написанные инструкции для достижения единообразия в действии специфических функций". (Wikipedia)
Основные требования: персонал
19 1-Feb-13
• Квалификация и обучение
• Предписанные установленные обязанности
• Документация о знаниях и компетенциях
• Адекватное число сотрудников (вакансия!)
• Авторизации
• Периодическое обучение и тренинги
• Документация по всем тренингам
Основные требования: помещения
20 1-Feb-13
• Использовать для необходимых подтверждений (ГМО,
биологические риски и т.д.)
• Оценка риска (лазер, патогены и т.д.)
• Соблюдение условий среды (температура, влажность,
шум, выбрасываемый воздух и т.д.)
• Исключение кросс-контаминации (молекулярная
биология)
• Очистка помещения
• Процедуры по дезинфекции
• Утилизация отходов в соответствии с правилами
• Хранение расходных материалов и реагентов
Основные требования: оборудование
21 1-Feb-13
• Регулярные инспектирование и калибровка
• Отчеты по техническому обслуживанию
• Руководства, заметки производителя и SOP
• Правила в случае неисправности системы
• Авторизация сотрудников лаборатории
• Документирование рабочего времени оборудования
(журнал учета)
• Правила для коллективного использования цитометров
различными группами
• Журнал пользователя
Факторы, влияющие на ЦФ анализы
22 1-Feb-13
Подготовка
• Фиколл или лизис
• С промывкой / без
промывки
• Антикоагулянты
Флуорохромы
• 2,3,4…32 цвета
• Коньюгаты
• Контроли
• Компенсация
Гейтирование
• Иммунологическое гейтирование
• Опознание живая/неживая
• Дискримнация дуплетов
Абсолютный подсчет
(клетки/мкл)
• Одноплатформенный или
двуплатформенный
Цитометр
• Спецификации (лазер,
фильтры…)
• Контроль лазеров и проточной
системы
Нормативные директивы
• GLP, аккредитация
• Планы исследования
• Правила компенсации
Пробоподготовка
23 1-Feb-13
Антикоагулянты
• Аммоний-гепарин: наиболее стабилен (48 ч)
• ЭДТА: удобен, но должен быть использован в
течение 12 ч
• Цитрат: воздействует на поверхностные
маркеры
Лизис
• Хлорид аммония pH- нестабилен
• Versalyse подходит также для безотмывочной пробоподготовки
(абсолютный подсчет!)
• Каждый материал для лизирования приводит к различиям в
характеристиках рассеяния клеток
• Лизис с фиксацией наиболее стабилен. ВНИМАНИЕ: оценка
жизнеспособности!
Агрегаты клеток
• Клеточные фильтры (40 мкм) предотвращают засорение
• Добавление ДНКзы или Коллагеназы / Диспазы
Пробоподготовка
24 1-Feb-13
Законы Шапиро по цитофлуориметрии
25 1-Feb-13
http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/flow-cytometry/practical-flow-cytometry/index.html
Жизнеспособность клеток
26 1-Feb-13
7-AAD в зависимости от SSC : погибшие клетки 7-AAD+ исключены
Погибшие клетки неспецифично связывают антитела и, следовательно, могут приводить к ложно-положительным результатам.
Абсолютный подсчет (клетки/ мкл)
27 1-Feb-13
Единая платформа: Двойная платформа:
FlowCount-Beads
WBC % Lymph
• Возможно только с неотмытыми образцами (потеря
клеток!)
• 2 метода: «единая платформа» и «двойная платформа»
«Золотой стандарт»; подсчет частиц известной концентрации, добавленных в ту же пробирку в качестве референсных частиц.
Абсолютный подсчет проведен по результатам цитометрических и гематологических данных.
Недостаток: 2 источника ошибок!
Референсные значения
28 1-Feb-13
• Могут зависеть от возраста
• Могут зависеть от пробоподготовки (напр. реагенты
для лизирования)
• Должны быть валидированы для каждого инструмента
Гематологические параметры при исследовании мышей показывают удовлетворительные штаммоспецифические различия! Ссылка: http://jaxmice.jax.org/findmice/index.html
Зависимость референсных значений от возраста
29 1-Feb-13
Comans-Bitter WM et al., J Pediatr 1997
Суточные ритмы
30 1-Feb-13
Работа иммунитета меняется в течение суток Суточные часы в макрофагах контролируют воспалительный иммунный ответ. Keller M, Mazuch J, Abraham U, Eom GD, Herzog ED, Volk HD, Kramer A, Maier B. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Dec 15;106(50):21407-12.
Иммунологическое гейтирование
31 1-Feb-13
For
ward
Sca
tter
Side Scatter
Sid
e S
catt
er
CD3 PC7
CD3+ 76.6% C
D8 F
ITC
CD4 Pacific Blue
CD8+ LYM 26.2%
CD4+ LYM 49.4%
Debris
Monos
Lymph
Lymphocytes
Monocytes
Granulocytes
Gran
Debris
CD45-PC7
SS
C
«Иммунологическое гейтирование» (напр. CD45 от SSC) часто позволяет лучше дискриминировать популяции, чем гейтирование по рассеянию.
Обработка сигнала
32 1-Feb-13
Time (Time Of Flight)
Voltage
Обработка сигнала
33 1-Feb-13
Time = Time of Flight (TOF) = Width (W)
Integral = Area (A)
Peak = Height (H)
Обработка сигнала
34 1-Feb-13
Дискриминация дуплетов
35 1-Feb-13
Представленные методы:
Цитометр анализирует частицы, но не может различать единичные события от дуплетов или агрегатов.
Это приводит к ошибочным результатам, особенно когда анализируется ДНК или редкие события!
Height vs. area Ratio vs. area Height vs. area
Контроль
36 1-Feb-13
Параметры, которые необходимо
контролировать:
• автофлуоресценция
• неспецифическое связывание
антител
• спектральное перекрывание
Автофлуоресценция
37 1-Feb-13
Лазеры возбуждают не только флуорохромы, но и молекулы в клетке, такие как флавопротеины, NADPH, липиды и т.д. Чем больше составляющих клетки, тем сильнее автофлуоресценция! Автофлуоресценция зависит от длины волны возбуждения.
Контроль внутренних негативных событий
38 1-Feb-13
Негативная популяция в той же пробирке. Преимущества: негативные и исследуемые клетки обработаны при равных условиях. Часто он может заменить изотипический контроль. Комбинирует автофлуоресценцию с неспецифическим связыванием.
Изотипический контроль
39 1-Feb-13
MF=1,84 MF=164
(89,13) (1,0)
• Анализ неспецифического связывания («контрольная проба»).
• Важно когда нет «внутренних» негативных популяций.
• Контрольные изотипы должны быть связаны с одними и теми же флуорохромами.
• Дополнительное преимущество: расчет относительного изменения в
интенсивности флуоресценции.
Изотипический контроль
40 1-Feb-13
• Изотип антител IgG1, IgG2a, IgM и т.д. • Количество неспецифического связывания
зависит от изотипа, особенно если клетка несет Fc рецепторы.
• Неспецифическое связывание может также
вызвать белок-белковые взаимодействия
флуорохромы могут также вногсить свой вклад.
Julian Voss-Andreae: Angel of the West, 2008 The Scripps Research Institute Florida
© Wikipedia.
Изотипический контроль:
• Из той же группы, что и антитело-мишень
• Тот же изотип
• Конъюгирован с тем же флуорохромом
• НО: без специфических мест связывания на
клетке-мишени
Изотипический контроль
41 1-Feb-13
Предварительные условия для хорошего изотипического контроля: идентичные условия для изотипического контроля и специфического антитела!
• Одинаковый изотип!
• Одинаковый флуорохром!
• Концентрация антител при процессе «окрашивания».
• Температура и время инкубации.
• Одинаковый буфер для окрашивания.
• Тандемные коньюгаты от одного производителя.
Выбор антител
42 1-Feb-13
Pacific Blue®** Biotin FITC Cyanine dyes Alexa Fluor Dyes®**
Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 647 Alexa Fluor 700
PE APC Tandem Dyes
PE-Texas Red PE-Cy5 PE-Cy5.5 PE-Cy7 APC-Alexa Fluor 700 APC-Cy7 APC-Alexa Fluor 750
500nm 800nm 700nm 600nm
FITC
PE ECD
PECy5
PECy5.5 PECy7/APCy7
APC
Emission Wavelength
Re
lati
ve
Flu
ore
sce
nce
**Registered Product from Invitrogen, Inc. (Molecular Probes, Inc)
Флуорохромы с минимальным или нулевым спектральным перекрытием упрощают компенсацию.
С участием тандемных красителей возможно возбуждать и детектировать сигнал до 5 флуорохромов одним лазером.
Спектральное перекрывание
43 1-Feb-13
525 BP 575 BP
Спектральное перекрывание
44 1-Feb-13
• Необходимо: одноцветное окрашивание для каждого флуорохрома на панели • Для анализа спектрального перекрытия должны расматриваться яркие сигналы
Компенсация зависит от настройки напряжения!
Компенсация
45 1-Feb-13
Компенсация
46 1-Feb-13
Median fluorescence
intensity
Избегать компенсации если это возможно
47 1-Feb-13
405nm
638nm
488nm
На 3-лазерном инструменте FITC, PC7, APC и Pacific Blue могут быть проанализированы без компенсации!
Спектральное перекрывание
48 1-Feb-13 Valid for Beckman Coulter Navios and Gallios
4 флуорохрома без компенсации
49 1-Feb-13
488nm
638nm
APC
405 nm
Pac Blue
Практические методы
50 1-Feb-13
Основное:
• Слабоэкспрессирующиеся антигены лучше работают с ярким красителем.
• Сильноэкспрессирующеся антигены работают со всеми красителями.
• НО: НУЖНО учитывать спектральное перекрывание!!
• Слабоэкспрессируемые антигены лучше работают на каналах, которые не подвержены воздействию спектрального перекрывания.
• Яркие антигены лучше работают на каналах, которые не воздействуют спектральным перекрыванием на другие каналы.
500nm 800nm700nm600nm
FITCFITC
PEPEECDECD
PECy5PECy5
PECy5.5PECy5.5PECy7/APCy7PECy7/APCy7
APCAPC
Emission Wavelength
Rela
tive
Flu
ore
sce
nc
e
500nm 800nm700nm600nm
FITCFITC
PEPEECDECD
PECy5PECy5
PECy5.5PECy5.5PECy7/APCy7PECy7/APCy7
APCAPC
Emission Wavelength
Rela
tive
Flu
ore
sce
nc
e
51 1-Feb-13
Допускается спектральное перекрывание…
• Между взаимоисключающими маркерами (например, CD3 и CD19, или CD4 и CD8)
Практические методы
52 1-Feb-13
Практические методы Допускается спектральное перекрывание…
• от маркеров субпопуляции к родительским маркерам (напр. CD4 к CD3)
53 1-Feb-13
Запрещается спектральное перекрытие…
• когда гейтирующий маркер перекрывает маркер субпопуляции
(напр. CD45 в CD3)
Практические методы
Переменные в цитофлуориметрии: Резюме
54 1-Feb-13
Cells
Детектирование
Клетки
Флуорохромы
Передача сигнала
1-Feb-13
1-Feb-13 56
Концеция Контроля Качества
Fluidiktest
Системная проверка (Ежедневно)
Проточная система + лазер
Стандартизация
Настройка инструмента
Компенсация
Спектральное перекрывание
Контрольный материал
Проверка результатов
Документрование
Контроль качества (QC)
Результаты
QC Модуль
Анализ образцов
пациентов
Получение
результатов
Подготовка
отчета
Обслуживание
пприбора
ОШИБКА
Call-центр
Решение проблемы
ПРОЙДЕНО
1-Feb-13 57
Построено на ISO стандартах в целях соответствия наивысшим стандартам качества конструкции и производства
Инвестирование в тестирование продукта для достижения наивысших нормативных стандартов сложного медицинского оборудования
IVD CE соответствие для всех конфигураций, включая 3-й лазер ?!
CE / IVD - одобрение
IQ/OQ (качество на входе/выходе), GMP (Good Manufacturing Practice)
58 1-Feb-13
Контроль процесса: права и обязанности
59 1-Feb-13
Многопользовательский доступ
Управление паролем пользователя
Администрирование прав пользователя
Записи пользователя/ журнал регистрации событий
Контроль процесса: штрих-коды
60 1-Feb-13
Считывание штрих-кода карусели положения в карусели пробирок
Максимально возможная
идентификация образца
Контроль процесса: удаленный доступ
61 1-Feb-13
Система PROService автоматически идентифицирует, отслеживает и решает проблемы дистанционно
PROService обеспечивает удаленный доступ к программному обеспечению, осуществляющему мониторинг всей электроники, насосов, клапанов и т.д. внутри прибора.
Ежедневная проверка системы: Flow-Check™
62 1-Feb-13
Частицы Flow-Check™ (6605359)
– проверка проточной системы и оптики
– для Cytomics FC 500 дополнительно • Flow Check 770 от PC7 Set up Kit (737664) = конфигурация с 1 лазером
• Flow Check 675 от APC Set up Kit (737663) = конфигурация с 2 лазерами
Ежедневная проверка системы
63 1-Feb-13
Отображение параметров QC в хронологическом порядке
Ежедневная проверка системы: FCS-данные
64 1-Feb-13
8.4.8 • Инструменты с лазерами: мощность лазера должна документироваться ежедневно.
ZLG
Checklist 9, Immunology
Проверка функционирования: 8-пиковые частицы(8-Peak Beads™)
65 1-Feb-13
База данных реагентов
66 1-Feb-13
– Управление каталожными номерами и номерами партии
– документирование сроков годности и получения
– связана с графиками Леви-Дженнингса
– простое добавление новых реагентов
Журнал технического обслуживания
67 1-Feb-13
Журнал сервисного обслуживания
68 1-Feb-13
1-Feb-13 69
Стандартизация
Шаг1: Стандартизация настроек детектора
Шаг2: Анализ спектрального перекрывания
1-Feb-13 70
Полностью автоматизированные процедуры
FITC PE ECD PC5
CD45 CD4 CD8 CD3
CD45 CD56+16 CD19 CD3
FITC PE ECD PC5 PC7 APC-A750
CD45 CD56+16 CD19 CD3 IgG IgG
CD45 CD4 CD8 CD3 HLA-DR CD38
4 флуоресцентных сигнала: TBNK
Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C
6 флуоресцентных сигналов: TBNK плюс маркеры активации (дополнительно*)
Для Navios 6C, Navios 8C, Navios 10C, FC500, Epics XL
* Возможны и другие дополнительные маркеры, напр. CD25-PC7 Только для исследовательских целей
1-Feb-13 71
Контрольные материалы
Использование контрольных материалов позволяет валидировать применяемые настройки инструмента и, следовательно, является контролем достоверности работы.
ImmunoTrolTM: иммунофенотипирование ImmunoTrol LowTM: ВИЧ StemTrolTM: CD34+ клетки-предшественники
1-Feb-13 72
Контрольные материалы
1-Feb-13 73
Программы внешнего QC
Программы внешнего контроля качества External Quality Assessment (EQA) приняты во всем мире как бесценные средства для оценки лабораториями работы своих тестирующих систем. Результаты объективно сравниваются с результатами других лабораторий, использующих ту же методологию для каждого параметра.
1-Feb-13 74
Проточная цитофлуориметрия в центральной лаборатории
1-Feb-13 75
Полная взаимосвязь
1-Feb-13 76
Концепция полезного QC модуля
Все приложения могут быть
•стандартизированы
• задокументированы (SOP)
• установлены без субъективного ручного ввода
Все параметры (QC реагенты, работы по обслуживанию,
настройки цитометра и результаты анализа) автоматически документируются QC модулем.
Контроль качества: цели
77 1-Feb-13
• Стандартизированные процессы
• Стандартизированное приготовление образца
• Контролируемые образцы
• Стандартизированная настройка протоколов
сбора данных
• Контроль действий и QC документация
Относительность результатов
• Меньше ручных манипуляций во время работы и
бОльшая высокопроизводительность
• Гибкая работа с образцами
• Упрощенная работа с образцами
Повышение эффективности
Для чего этот продукт?
78 1-Feb-13
Для чего этот продукт?
79 1-Feb-13
Он влияет на качество Ваших результатов!
Вопросы? Комментарии?
80 1-Feb-13
Спасибо за внимание!
Dr. Andreas Böhmler
Product Manager Flow Cytometry
Reagents and Applications
Europe, Middle East, Africa & India