661Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

Введение

Ядерная оболочка (ЯдО) выполняет барьер-ную функцию, пространственно отделяя аппа-раты транскрипции и репликации от аппарата трансляции (Губанова, Киселева, 2007). Морфо-логически она представляет собой две концент-рические мембраны (наружную и внутреннюю), ограничивающие перинуклеарное простран­ство, связанное с полостью эндоплазматиче­ского ретикулума (ЭПР). У высших эукариот внутренняя ядерная мембрана контактирует с ламиной, образующей вместе с ядерным мат-риксом каркас ядра. В ЯдО встроены ядерные поровые комплексы (ЯПК), обеспечивающие

связь между ядром и цитоплазмой. Ионы и мелкие макромолекулы размером менее 9 нм могут диффундировать через ассоциированные с ЯПК мелкие каналы, в то время как молекулы весом больше 40 кДа и некоторые более легкие кариофильные белки транспортируются через центральный канал ядерной поры при помощи активных механизмов, требующих потребления энергии. Интегральные белки ����, ���2 и����, ���2 и�, ���2 и���2 и2 и �BR� обеспечивают связь внутренней ядерной обеспечивают связь внутренней ядерной мембраны с ламиной (������������ et� �� ����., �997).

Одной из основных особенностей ЯдО высших эукариот является ее динамичность, проявляющаяся в клеточном цикле. В начале митоза, на стадии профазы, ядерная мембрана

ОСОБЕННОСТИ СБОРКИ ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКИ В ПРОЦЕССЕ МИТОЗА В РАННИХ ЭМБРИОНАХ

DROSOPHILA MELANOGASTER

А.А. Струнов1, Е.А. Онищенко2, Е.В. Киселева1

1 Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия, e­m�il: elk�@bio�e��.�sc.�u;

2 Лаборатория молекулярной и клеточной биологии, Калифорнийский университет, Беркли, Калифорния, США

В настоящей работе проведено ультраструктурное исследование ядерной оболочки делящихся ядер эмбрионов дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. Ранее было показано, что митоз в ранних эмбрионах Drosophi�� �e���o��st�er �������������e���o��st�er является полузакрытым и ядерная оболочка разбирает-ся полностью только на полюсах веретена деления, а в остальных участках формируется двойная (s�i��le) оболочка (�����s���om, ����e�eli�, �9�4). Нами установлено, что на стадии метафазы ядернаяs�i��le) оболочка (�����s���om, ����e�eli�, �9�4). Нами установлено, что на стадии метафазы ядерная) оболочка (�����s���om, ����e�eli�, �9�4). Нами установлено, что на стадии метафазы ядерная оболочка разбирается полностью на пузырьки/везикулы и короткие мембраны, формирующие ши-рокий слой вокруг нуклеоплазмы. Сборка ядерной оболочки дочерних ядер начинается на стадии поздней анафазы и сопровождается формированием протяженных стопок мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума при участии компонентов предшествующей оболочки. Везикулы и стопки двухслойных мембран располагаются сначала радиально по периферии ядра, а затем пе-ремещаются в нуклеоплазму и тесно контактируют с компактизованными хромосомами. Впервые обнаружено, что новые фрагменты ядерной оболочки могут формироваться с участием везикул и двухслойных мембран вокруг индивидуальных хромосом. Предполагается, что этот процесс наряду с действием других факторов способствует декомпактизации хромосом подобно тому, как это наблю­далось в условиях i� �it�ro ������it�ro. На стадии телофазы происходит полная декомпактизация хромосом, слияние окружающих их мембранных фрагментов и формирование целостных ядерных оболочек вокруг нуклеоплазмы каждого из дочерних ядер.

Ключевые слова: ядерная оболочка, эмбрионы дрозофилы, синцитиальная бластодерма, митоз, хромосомы, электронная микроскопия.

662 Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

распадается на пузырьки, а большинство белков ЯПК и ламины переходят в растворимую форму в виде мономеров или небольших комплексов (������������ et� �� ����., �997; ���s��l���s��l et� �� ����., �997). В конце митоза, на стадии телофазы, ЯдО восстанавли-вается вновь. Процессами разрушения и сборки ЯдО управляет сложная последовательность реакций фосфорилирования–дефосфорилиро-вания, главными эффекторами которой явля-ются белки семейства циклин­зависимых киназ (Wu�ze�be�ge�, �e�lic�, 20��). Разборка ЯдО на-чинается в конце профазы–начале прометафазы и заканчивается высвобождением цитозоль­мем-бранных пузырьков. Весь этот процесс можно разделить на три перекрывающихся во времени разборки: ЯПК, ламины и ядерной мембраны. Разборка ЯПК предположительно происходит вследствие фосфорилирования некоторых его белков (g�2�0, �u���� и некоторых другихg�2�0, �u���� и некоторых других2�0, �u���� и некоторых других�u���� и некоторых других��� и некоторых других нуклеопоринов) (���s��l���s��l et� �� ����., �997). Ламина деполимеризуется под действием прямого фос-форилирования киназой c�k� ламинов А, В и Сc�k� ламинов А, В и С� ламинов А, В и С в нескольких сайтах. При этом ламины А и С почти полностью переводятся в растворимую мономерную или димерную форму, а ламин В остается в мембранно­связанном состоянии с трансмембранным белком �BR� (���s��l�BR� (���s��l (���s��l���s��l et� �� ����., �997; ��u��u et� �� ����., �99�). Разборка ядерной мем-браны, судя по всему, не зависит напрямую от c�k�, а вызывается какими­то другими, пока не�, а вызывается какими­то другими, пока не известными киназами (��ll������ll���� et� �� ����., �99�). Про-цесс разборки ЯдО начинается в профазе митоза с ЯПК. В первую очередь исчезают перифери-ческие структуры ЯПК, а затем уже электрон-но­плотная центральная часть, представляющая транспортер. В конечном итоге в мембране остается пустое отверстие (����se�i������se�i�� et� �� ����., �977; Kiselev� et� �� ����., 2000). За разборкой ядерных пор следует процесс разрушения ядерной мембраны, для которого предполагаются три возможных механизма (���s��l���s��l et� �� ����., �997).

Согласно данным, полученным в экспери-ментах по сборке ЯдО i� �it�ro ������it�ro с использованием экстрактов из ооцитов амфибий (�o�k�, ��si�,�o�k�, ��si�,, ��si�,��si�,, �9��), формирование ЯдО включает три после-довательных процесса: восстановление ядерной мембраны, сборку ЯПК и восстановление лами-ны (���s��l���s��l et� �� ����., �997; �ol�be�g�ol�be�g et� �� ����., �997). Прикрепление различных мембранных пузырь-ков к хроматину и слияние их друг с другом

приводит к образованию мембранных остров-ков, в которых начинают формироваться ЯПК. Этот процесс идет параллельно со слиянием с островками новых пузырьков и образованием целостной ядерной мембраны. Показано, что прикрепление пузырьков к хроматину проис-ходит без потребления энергии, и необходимы только белки, связанные с хроматином и с этими пузырьками. В этом процессе трансмембран-ные белки либо непосредственно связываются с хроматином, либо посредником между ними выступают белки ламины (�e��ze�, We���e, 2009).�e��ze�, We���e, 2009)., We���e, 2009).We���e, 2009)., 2009). В отличие от предыдущего этапа слияние пу-зырьков – энергозависимый процесс, требующий наличия цитозоля. Показано, что слияние инги-бируется добавлением ГТФγ�, алкилирующего�, алкилирующего, алкилирующего агента ��� и хелаторов ионов кальция и цинка��� и хелаторов ионов кальция и цинка и хелаторов ионов кальция и цинка ВАРТА. Предполагается, что слияние пузырьков при формировании ядерных мембран во многом идентично слиянию пузырьков (ЭПР). Так, на-пример, на дрожжах было показано, что тот и другой процессы ингибируются ГТФγ�, ��� и�, ��� и, ��� и��� и и отсутствием АТФ (���s��l���s��l �� ��., �997). Сборка ЯПК идет через промежуточные формы (интер-медиаты) (�ol�be�g�ol�be�g et� �� ����., �997). Предполагается, что ламина собирается уже после того, как вос-становилась ядерная мембрана. Процесс сборки ламины требует наличия активного транспорта через мембранный компонент уже сформирова­вшихся ЯПК (WeiseWeise et� �� ����., �997).

Ранее было высказано предположение (�����s���om�����s���om et� �� ����., �9�4) о том, что из­за быстрого протекания клеточного цикла (9–�0 мин) митоз в ранних эмбрионах дрозофилы не открытый, как у большинства высших эукариот, а полуза-крытый, т. е. в митозе ЯдО разрушается только с полюсов веретена деления и остается целой по бокам веретена деления. ЯПК на этой стадии полностью разбираются, оставляя в двойной ядерной мембране лишь бесформенные отвер-стия. При исследовании эмбрионов дрозофилы с использованием флюоресцентной микро-скопии было описано формирование в митозе так называемой «оболочки веретена», которая располагалась над ЯдО и, возможно, состояла из мембранных пузырьков, высвободившихся в результате частичной разборки ЯдО (������������ et� �� ����., �996). Ранее нами была исследована сборка–разборка ЯПК в ядрах, изолированных из эмбрионов дрозофилы на стадии синцити-

66�Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

альной бластодермы с использованием высо-коразрешающей сканирующей электронной микроскопии (Kiselev�Kiselev� et� �� ����., 200�).

В настоящей работе проведен детальный ультраструктурный анализ динамики ЯдО в митозе в эмбрионах Drosophi�� �e���o��st�er �������������e���o��st�er на стадии синцитиальной бластодермы, поз-воливший выявить новые особенности сборки оболочек дочерних ядер на стадии анафазы.

Материалы и методы

В работе использовали лабораторную линию мух D. ������������. �������������e���o��st�er �����o� � из коллекции лабо­�����o� � из коллекции лабо­ � из коллекции лабо­� из коллекции лабо­ из коллекции лабо-ратории генетики популяций ИЦиГ СО РАН.

Получение ранних эмбрионов дрозофил

200–�00 мух в возрасте 2–7 дней помещались в цилиндрический коллектор, который сверху накрывался чашкой Петри с кормом. Коллектор помещался в термостат с температурой 2� °С, и чашки менялись с периодичностью – � час. При таком способе получения ранних эмбрионов большинство свежеснесенных яиц находилось на стадии �–� делений дробления.

Микроинъекции в ранние эмбрионы

Ранние эмбрионы очищали от хориона и покрывали фторуглеродным маслом для предот­вращения высыхания. Для остановки сборки ядерной оболочки на стадии метафазы агглю-тинин из проростков пшеницы (W��производ­W��производ­ производ­ства �igm�, США), ��­й раствор в фосфатном�igm�, США), ��­й раствор в фосфатном, США), � �­й раствор в фосфатном буфере, �� 7,2, в об�еме 0,� нл, ин�ецировали�� 7,2, в об�еме 0,� нл, ин�ецировали 7,2, в об�еме 0,� нл, ин�ецировали в цитоплазму эмбрионов под инвертированным микроскопом (���l �eiss) с помощью микрома­���l �eiss) с помощью микрома­ �eiss) с помощью микрома­�eiss) с помощью микрома­) с помощью микрома-нипулятора. После проведения ин�екций стекло с эмбрионами помещалось во влажную камеру в термостат на 2� °С, где эмбрионы инкубировали от �0 мин до � часа. Контролем служили эмбрио­ны после ин�екции такого же об�ема � �­го раствора B�� (�igm�, США) на том же буфере.B�� (�igm�, США) на том же буфере. (�igm�, США) на том же буфере.�igm�, США) на том же буфере., США) на том же буфере.

Фиксация и заливка эмбрионов для ультраструктурного анализа

Очищенные от хориона эмбрионы накапли-вали на поверхности дистиллированной воды,

а затем переносили в 2 мл фиксатора. Для его приготовления к � мл �� �­го глутарового аль-дегида (�luk�, Швейцария) на 0,�М ��­какоди­�luk�, Швейцария) на 0,�М ��­какоди­, Швейцария) на 0,�М ��­какоди­��­какоди­­какоди-латном буфере (�luk�, Швейцария), �� �� 7,2,�luk�, Швейцария), �� �� 7,2,, Швейцария), �� �� 7,2,�� �� 7,2, �� 7,2, добавляли � мл гептана, и эту смесь интен-сивно встряхивали �–� мин. Ин�ецированные эмбрионы промывали гептаном для удаления масла, а затем переносили в фиксатор. Далее нормальные и ин�ецированные эмбрионы встряхивали в течение � мин и переносили на 2,� ч в 2,� �­й глутаровый альдегид на 0,0� М ��­какодилатном буфере (буфер А). Во время­какодилатном буфере (буфер А). Во время фиксации вителлиновую оболочку убирали при помощи тонкого пинцета. Фиксированные эмбрионы отмывали в � сменах буфера А и дофиксировали в течение � ч в � �­м растворе OsO4 (ОАО Аурат, Россия) на том же буфере. После контрастирования в � �­м водном раство-ре уранилацетата (�e�v�, Германия) в течение�e�v�, Германия) в течение, Германия) в течение � ч при 4 °С эмбрионы быстро промывали в воде, обезвоживали в спиртах возрастающей концент­рации, затем в ацетоне и заключали в эпон ��2 (�e�v�, Германия) по стандартному протоколу.�e�v�, Германия) по стандартному протоколу., Германия) по стандартному протоколу. Полутонкие срезы случайно ориентированных эмбрионов окрашивали метиленовым синим, анализировали в световом микроскопе, а за-тем получали ультратонкие срезы, которые исследовали в просвечивающем электронном микроскопе ���­�00��� (��O�, Япония).���­�00��� (��O�, Япония).­�00��� (��O�, Япония).��� (��O�, Япония). (��O�, Япония).��O�, Япония)., Япония).

Результаты и обсуждение

Анализ ультраструктурной организации ядерной оболочки проводился в интерфазе, когда происходит рост ядра, в прометафазе, когда начинаются процессы разборки ЯПК и ядерной оболочки, в метафазе, соответствую-щей полному разрушению ЯдО, и телофазе, когда ЯдО вновь восстанавливается. Рис. �, а демонстрирует типичную картину интерфаз-ного ядра, имеющего округлую форму и де-конденсированный хроматин. Оболочка ядра содержит электронно­плотные ��0 нм ЯПК, имеющие типичную форму и распределенные в виде отдельных пор, а также их кластеров (Kiselev�Kiselev� et� �� ����., 2000).

Ядерная оболочка на стадии прометафазы (рис. �, б) образует инвагинации с широкими отверстиями в области формирования мик-ротрубочек веретена деления, а ее мембраны

664 Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

Рис. 1. Ультраструктура ядер из синцитиальных эмбрионов D. ������������. �������������e���o��st�er на разных стадиях клеточ­ ного цикла.

а – интерфазное ядро (стрелки указывают на кластеры ядерных пор); б – ядро на стадии профазы, содержащее ком-пактные хромосомы (черная стрелка) и ядерную оболочку с разобранными порами (белые стрелки) и инвагинациями в области проникновения микротрубочек веретена деления в нуклеоплазму (двойные стрелки). Ядро окружено слоем коротких пузырьков и цистерн (обозначено пунктиром).

приобретают прерывистый характер вследствие разборки ядерных пор. Это в определенной сте-пени напоминает поведение ядерной оболочки в прометафазе открытого митоза (����se�i������se�i�� et� ��., �977). Существенное отличие состоит в том, что ядро в ранних эмбрионах дрозофилы уже на стадии прометафазы окружается большим количеством коротких цистерн и пузырьков ЭПР, образующих четко выраженную про-слойку в виде «шубы» вокруг ядра, свободную от митохондрий и жировых гранул (рис. �, б). Толщина этой зоны составляет 0,�–2 мкм.

Очевидно, что такое количество мембран не могло образоваться в результате фрагментар-ного разрушения ядерной оболочки, и, скорее всего, они транспортируются из окружающей цитоплазмы. Наше исследование показало, что размер «шубы» вокруг каждого ядра имеет тен-денцию уменьшаться с увеличением количества ядер в эмбрионе.

В метафазе митоза хроматин конденсирует-ся и приобретает вид метафазных пластинок, ориентированных по­разному внутри эмбриона (рис. 2, а). Ядерная мембрана полностью раз-

66�Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

рушается и уже ничем не отличается от мемб-ранных цистерн и пузырьков, составляющих «шубу». Мембраны, окружающие метафазное ядро, представляют собой смесь пузырьков ЭПР и стопок прерывистых мембран. Стопки располагаются преимущественно в централь-ных участках бывшей ядерной оболочки, в то время как пузырьки занимают зоны полюсов веретена. Толщина «шубы» на стадии метафазы достигает максимальной величины и составля-

ет до �–6 мкм в участках, близких к полюсам веретена деления. Размер метафазной «шубы» уменьшается при переходе к более поздним цик-лам. Метафазные хромосомы располагаются в середине нуклеоплазмы и окружены большим количеством мелких пузырьков, а также контак-тирующих с ними микротрубочек (рис. 2, б).

При переходе к анафазе характер строения околоядерной зоны изменяется. Ядро удлиня-ется в направлении расходящихся дочерних

Рис. 2. Тонкое строение ядер из синцитиальных эмбрионов D. ������������. �������������e���o��st�er на стадиях метафазы и анафазы.

а – общий вид метафазного ядра и околоядерной зоны на малом увеличении. Нуклеоплазма окружена широким слоем, состоящим из пузырьков и скоплений коротких мембран; б – фрагмент того же ядра на большом увеличении. В нуклео­плазме видны пузырьки и микротрубочки; в – ядро на стадии поздней анафазы. По краям нуклеоплазмы располагаются протяженные пучки длинных мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума (стрелки); г – увеличенный фрагмент того же ядра. На периферии компактной хромосомы видны фрагменты формирующейся de �o�o �����o�o ядерной оболочки. Я – ядро; Х – хроматин.

666 Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

хромосом, а «шуба» сильно истончается, особенно в центральной части ядра на стадии поздней анафазы (рис. 2, в). Наиболее инте-ресным представляется формирование на этом этапе стопок длинных мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума, располага-ющихся по периферии нуклеоплазмы, ради-ально по отношению к центру ядра. Они часто контактируют с компактными хромосомами, на поверхности которых обнаруживаются двухслойные мембранные фрагменты, отлича-ющиеся по строению от центросом и сходные с ЯдО (рис. 2, г). Вблизи хромосом на этой стадии уже не наблюдается микротрубочек, а наружная мембрана формирующейся вокруг них ЯдО содержит большое количество ри-босом. Можно предположить, что фрагменты новой ЯдО формируются в результате слияния наблюдаемых вблизи хромосом мембранных компонентов ЭПР и пузырьков. Впоследствии стопки мембран изменяют направление и располагаются по периметру нуклеоплазмы (рис. �, а), а число хромосом, окруженных мембранами, увеличивается (рис. �, б–г). Наблюдаются частичная деконденсация хро-мосом, а также появление пузырьков внутри хромосом (рис. �, г).

На стадии телофазы происходит быстрая деконденсация хроматина дочерних ядер, и во­круг них, вероятно, за счет слияния мембранных фрагментов и пузырьков, формируется сплош-ная ЯдО, в которую затем встраиваются ЯПК (рис. 4, а). Интересно отметить, что пузырьки встречаются как снаружи, так и внутри ядра в контакте с внутренней мембраной ЯдО. Сначала число зрелых пор в оболочке невелико, однако наблюдаются ядра с большим количеством пор, очевидно, на более поздней стадии телофазы (рис. 4, б, в). Следует отметить присутствие в оболочке ядер не полностью сформированных ядерных пор (рис. 4, б, в), сходных с теми, что были описаны ранее в опытах i� �it�ro ������it�ro (�ol�­�ol�-be�g et� �� ����., �997). Слой пузырьков вокруг ЯдО дочерних ядер существенно уменьшается, и вблизи ядра появляются митохондрии и жиро-вые гранулы. Ядро начинает активно расти, и параллельно должна увеличиваться площадь поверхности оболочки дочерних ядер. Согласно ранее проведенным исследованиям, это проис-ходит за счет слияния пузырьков из околоядер-

ной зоны с наружной мембраной ядра (Kiselev�Kiselev� et� �� ����., 200�).

Согласно данным, полученным из экспе-риментов i� �it�ro ������it�ro с использованием грубых экстрактов из ооцитов X���pu� ������, ������,������,, W�� вW�� в в концентрации 200–�00 мкг/мл вызывает полное блокирование сборки ЯПК (WieseWiese et� �� ����., �997). В наших исследованиях мы использовали эту концентрацию для того, чтобы проверить, будет ли блокироваться сборка ЯдО и ядерных пор. Ультраструктурный анализ ранних эмбрионов D. ������������. �������������e���o��st�er показал, что после введения W�� в них происходит остановка деления в них происходит остановка деления ядер в месте ин�екции. В контроле, после ин�екции B��, все остается без существенныхB��, все остается без существенных, все остается без существенных изменений, и наблюдаются как равномерно расположенные по периферии соматические ядра, так и центральные желточные ядра. Элект­ронно­микроскопическое исследование �0 эмбрионов, ин�ецированных W��, показало,W��, показало,, показало, что митоз во всех эмбрионах останавливается приблизительно на стадии метафазы, о чем свидетельствует наличие конденсированного хроматина внутри ядер и пучков микротрубочек (рис. �, а). «Шубы» вокруг ядер были сильно увеличены в отличие от таковых в метафазе в нормальных эмбрионах и представляли зоны диаметром до �0 мкм, свободные от митохонд-рий и жировых гранул. На большом увеличении видно, что эти зоны так же, как и на стадии метафазы в нормальных эмбрионах, заполнены пузырьками и стопками прерывистых мембран (рис. �, б). Иногда стопки мембран напоминали по организации окончатые мембраны, часто встречающиеся в цитоплазме эмбрионов на стадии синцитиальной бластодермы (Губанова, Киселева, 200�), однако поровые комплексы в них не наблюдались. Принимая во внимание, что как минимум �/�­я часть митотического цикла приходится на интерфазу (когда поры собраны), можно заключить, что W�� какW�� как как i� �it�ro ������it�ro, так и i� �i�o �����i�o препятствует сборке пор, но, судя по всему, не влияет на их разборку.

Таким образом, наши исследования пока-зали, что отличительной особенностью по-лузакрытого митоза является то, что ядерная оболочка распадается на большое количество мембран и пузырьков, которые формируют широкий слой вокруг ядра в метафазе, соот-ветствующий, вероятно, «оболочке веретена»

667Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

(s�i��le e�velo�e), описанной ранее (������s�i��le e�velo�e), описанной ранее (������ e�velo�e), описанной ранее (������e�velo�e), описанной ранее (������), описанной ранее (������������ et� ��., �996). При проведении более детального ультраструктурного исследования раннего раз-вития дрозофилы (авторами предыдущих работ были изучены только последние митотические циклы (�2–�4) перед формированием клеток) мы установили, что морфология ядерной мем-браны и прилежащей к ядру цитоплазмы может

значительно варьировать в процессе полузакры-того митоза. В первых синцитиальных циклах деления (�–7), когда ядер в эмбрионе еще мало, оболочка веретена, по нашим данным, пред-ставляет собой четко очерченную зону вокруг ядра, заполненную большим количеством цистерн ЭПР, которой мы присвоили название «шуба». Диаметр «шубы» в районе центросом

Рис. 3. Особенности организации ядер из синцитиальных эмбрионов D. ������������. �������������e���o��st�er на стадии поздней анафазы.

а – пучки длинных и коротких линейно расположенных мембран лежат по периметру нуклеоплазмы и часто контакти-руют с компактными хромосомами (стрелки); б, в – фрагменты того же ядра на большом увеличении. На поверхности хромосом видны фрагменты формирующейся ядерной оболочки; г – контакт двух хромосом, содержащих фрагменты формирующейся ядерной оболочки. Два пучка мембран гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума располагаются вблизи хромосом. Х – хроматин.

66� Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

может достигать �–6 мкм. В то же время при переходе к более поздним циклам мы наблю-даем истончение «шубы» и плавный переход к ранее описанной морфологии полузакрытого митоза с формированием оболочки веретена. Полузакрытый митоз был обнаружен также в некоторых других типах митотически активных клеток у дрозофилы, таких, как фолликулярные клетки яичников, стволовые клетки, клетки моз-га (�����s���om�����s���om et� �� ����., �9�4). Это свидетельствует о том, что у дрозофилы такой тип митоза не является уникальным для состояния синцития.

Возможно, распространенность полузакрытого митоза не ограничивается только дрозофилой, поскольку подобный митоз наблюдался также при ультраструктурном анализе эмбрионов Het�eropez� p����e� p������p����e� (�u�, �974).�u�, �974)., �974).

Обнаруженный нами постепенный переход между разными формами полузакрытого митоза позволяет предположить, что все его известные морфологические варианты являются, вероят-но, одним типом процесса перестройки ЯдО, в ходе которого ядро окружается морфологи-чески различимой прослойкой цитоплазмы,

Рис. 4. Ультраструктура ядер из синцитиальных эмбрионов D. ������������. �������������e���o��st�er на стадии телофазы.

а – фрагмент оболочки ядра на стадии ранней телофазы содержит интермедиаты пор (двойные стрелки) и небольшое количество полностью собранных пор (стрелки). Пузырьки присутствуют как внутри, так и снаружи ядерной оболочки; б, в – фрагменты оболочки ядер на стадии средней телофазы на малом и большом увеличении соответственно. Коли-чество зрелых пор в ядерной оболочке увеличено по сравнению с ядром на верхнем рисунке.

669Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

несущей какую­то функцию. Эта функция может быть связана как с особенностями тех клеток, в которых наблюдается такой митоз (многоядерность, быстрота протекания мито-за), так и с особенностями регуляции митоза у дрозофилы (и, возможно, других насекомых) (��ll������ll���� et� �� ����., �99�). Одной из качественных характеристик в строении околоядерной зоны является ее четкая структурированность. Из этой зоны исключаются все крупные клеточные органеллы, такие, как митохондрии и жировые гранулы, и накапливаются мембраны ЭПР. Чет-

кую компартментализацию цитоплазмы около ядра подчеркивают также наши эксперименты с микроин�екцией W��, при которых деле­W��, при которых деле­, при которых деле-ние останавливалось в метафазе, и ядра были окружены «шубой» толщиной до �� мкм (или диаметром до �0 мкм). При суммировании наших результатов и ранее полученных дан-ных, можно сформулировать две точки зрения относительно функциональной роли оболочки веретена (околоядерной зоны).

Оболочка веретена представляет собой ЯдО, которая не успевает разобраться по причине

Рис. 5. Ультраструктура ядер и околоядерной цитоплазмы в синцитиальных эмбрионах D. ������������. �������������e���o��st�er после ин�екции W��.W��.. а – общий вид ядра и окружающей цитоплазмы (ядро и граница околоядерной зоны, состоящей из пузырьков и коротких мембран, обведены пунктиром); б – фрагмент околоядерной зоны на большом увеличении. Видно концентрическое расположение коротких мембран в околоядерной зоне. Я – ядро.

670 Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

быстрого митоза и вследствие этого не име-ет какой­либо определенной функции (���el���el et� �� ����., �9�9). Оболочка выполняет какую­то определенную функцию в митозе (или имеет несколько функций) (�����s���om�����s���om et� �� ����., �9�4; ���el���el et� �� ����., �9�9).

Первая точка зрения вряд ли имеет под собой основания, о чем свидетельствуют как наши на-блюдения, так и данные других авторов. Во­пер-вых, оболочку веретена наблюдают не только в ранних эмбрионах, где митоз очень быстрый, но и в тканях дрозофилы более поздних стадий раз-вития, таких, как эпителий, нервная ткань и т. д., где скорость митоза намного ниже (�����s���om�����s���om et� ��., �9�4, �e�z­Bo�me�e�z­Bo�me­Bo�meBo�me et� �� ����., �997). Во­вторых, наши эксперименты с остановкой митоза W��W�� и наблюдения нормального митоза на ранних циклах указывают на то, что происходит скорее накопление мембран вокруг ядра, нежели их рассредоточение. Более того, эти мембраны, возможно, имеют специфический состав, так как их количество вокруг метафазных ядер уменьшается с ростом числа ядер. Мы полага-ем, что одна из возможных функций оболочки веретена заключается в регуляции обмена ионов Са2+ вблизи ядра. Концентрация Са2+ является важным фактором, влияющим на скорость про-текания митоза (�z����, �9��). Возможная функция�z����, �9��). Возможная функция, �9��). Возможная функция цистерн ЭПР, окружающих ядро, как регуляторов обмена этого катиона исследовалась при помощи гистохимических методов (�����s���om�����s���om et� �� ����., �9�4), но четко эту функцию показать не удалось.

Следующей возможной функцией перинук-леарного пространства является депонирование белков ЯдО, необходимых для быстрого ее формирования в конце митоза. Иммуногисто-химические исследования свидетельствуют о том, что, по крайней мере, некоторые белки ЯдО способны концентрироваться в околоядерной зоне, соответствующей оболочке веретена, в то время как другие из нее исключаются. Это было показано для отефина – интегрального белка внутренней ядерной мембраны, g�2�0 –g�2�0 –2�0 – �­гликозилированного интегрального белка­гликозилированного интегрального белка ЯПК и одного из белков ламины. При изучении локализации отефина концентрация его около ядра была показана во всех фазах митоза (���el���el et� �� ����., �9�9). Исследования i� �i�o �����i�o с ин�екцией меченых ��b­фрагментов антител к ламине��b­фрагментов антител к ламине­фрагментов антител к ламине дали промежуточный результат: ламина оста-

валась связанной с оболочкой ядра вплоть до метафазы, а затем диспергировалась (������������ et� ��., �996). В то же время изучение локализации интегрального белка ЯПК g���� (аналог g�2�0g���� (аналог g�2�0��� (аналог g�2�0g�2�02�0 у дрозофилы) показало, что к метафазе он рав-номерно распределяется по цитоплазме (���el���el et� �� ����., �9�9).

На основании этих данных можно пред-положить, что около ядра концентрируются мембраны, содержащие специфический набор белков, необходимых при сборке ЯдО. Одна из возможностей их использования может быть связана с недавно обнаруженным у ранних эмб­рионов дрозофилы новым механизмом форми-рования ЯПК, при котором множество мелких пузырьков ЭПР сливаются в телофазе с ЯдО и индуцируют при этом формирование пор вдоль линии слияния (Kiselev�Kiselev� et� �� ����., 2000).

Интересно отметить, что остановка митоза при ин�екции W�� происходит в метафазе.W�� происходит в метафазе. происходит в метафазе. Если следовать тому, что W�� блокируетW�� блокирует блокирует сборку ЯПК, то он должен оказывать влияние на тот период митоза, когда необходимы функ-циональные ЯПК, т. е. как минимум в телофазе. Именно такие результаты были получены при микроин�екции W�� в культуру эпителиаль­W�� в культуру эпителиаль­ в культуру эпителиаль-ных клеток (�o�e���o�e�� et� �� ����., �9�7; Be��ve���eBe��ve���e et� ��., �9�9). Однако, согласно нашим данным, митоз после введения W�� останавливался наW�� останавливался на останавливался на стадии метафазы.

Возможное об�яснение всех этих противоре-чий состоит в том, что белки ЯПК у дрозофилы, кроме участия в ядерно­цитоплазматическом транспорте, могут дополнительно оказывать влияние на цитоплазматический клеточный цикл. Альтернативная возможность заключа-ется в том, что, кроме нуклеопоринов, у дро-зофилы существуют какие­то дополнительные белки­мишени, связанные с регуляцией кле-точного цикла. Эти регуляторы (с которыми может взаимодействовать W��), возможно,W��), возможно,), возможно, либо прямо, либо опосредованно изменяют организацию цитоскелета и таким образом оказывают влияние на структуру околоядерной зоны цитоплазмы. Для проверки этих гипотез необходимы дополнительные эксперименты с другими ингибиторами сборки ЯПК, такими, как антитела к различным нуклеопоринам.

Таким образом, нами было проведено ком-плексное исследование динамической пере-

67�Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

стройки ЯдО и окружающей ядро цитоплазмы в процессе быстрого митотического деления у ранних эмбрионов дрозофилы, позволившее представить более детальную схему митоза в ранних эмбрионах дрозофилы (рис. 6). Впервые подробно исследованы этапы сборки ЯдО на стадии поздней анафазы митоза и продемон­стрировано формирование новых ее фрагментов вокруг индивидуальных хромосом. Полученные новые данные важны для понимания механизмов динамики и функции ядра и ЯдО в митозе.

Работа выполнена при финансовой поддерж­ке грантов РФФИ: �0­04­0�426 и �0­04­0�469 и гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (6.�2).

Литература

Губанова Н.В., Киселева Е.В. Структурная органи-зация и функция ядерной оболочки // Цитология. 2007. Т. 49. № 4. С. 2�7–269.

Губанова Н.В., Киселева Е.В. Особенности дина-

Рис. 6. Схема реорганизации ядерной оболочки на разных стадиях митоза в синцитиальных эмбрионах D. ������������. �������������e���o��st�er.

Интерфаза: ядро имеет округлую форму, и ядерная оболочка содержит зрелые поровые комплексы; профаза: ядерная оболочка деформируется в области расположения центриолей, ядерные поры начинают разбираться; промета-фаза: хромосомы компактизуются, ядерная оболочка начинает распадаться в области полюсов веретена деления на пузырьки и короткие мембраны, формирующие дополнительный слой вокруг нераспавшихся участков оболочки ядра. Ядерные поры полностью разобраны, и пучки микротрубочек, контактирующих с хромосомами, выявляются в нуклео­плазме; метафаза: ядерная оболочка распадается полностью, формируя широкий слой мембран и пузырьков вокруг нуклеоплазмы; ранняя анафаза: хромосомы начинают перемещаться к полюсам веретена деления, слой мембранных и пузырьковидных компонентов вокруг нуклеоплазмы уменьшается; поздняя анафаза ��: по периферии нуклеоплазмы собираются пучки мембран, располагающиеся радиально по отношению к центру ядра, микротрубочки исчезают и на-чинается формирование новых фрагментов ЯдО вокруг индивидуальных хромосом; поздняя анафаза ����: пучки мембран меняют направление и располагаются по периметру нуклеоплазмы, наблюдается частичная деконденсация хромосом, окруженных двойными мембранами и пузырьками; телофаза: фрагменты новой ЯдО сливаются, формируется целост­ная оболочка ядра, в которой начинают собираться ядерные поры, и видно большое количество интермедиатов пор. К концу телофазы процесс сборки зрелой ядерной оболочки завершается и начинается рост ядер.

672 Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

мики пористых пластинок в синцитиальных эмбрионах дрозофилы // Цитология. 200�. Т. �0.. �0. № �. С. 6��–69�.С. 6��–69�.. 6��–69�.–69�.69�.

Be��ve���e R�., �c�ee� U., ���l�� �. �ucleo�l�smic so���i�g o� m�c�omolecules �ollowi�g mi��osis: ����e o� �ucle�� co�s��i��ue���s ����e� i��ibi��io� o� �o�e com�le� �u�c��io� // �u�. �. �ell Biol. �9�9. V. �0. �. 209–2�9.–2�9.2�9.

��u �., R�oozbe� R�., ���oc��j U. Velc�o i� ���e �ucle�� e�velo�e: �BR� ��� ���s // ��B�. �99�. V. 44�. �. �6�–�69.–�69.�69.

�u� T. ���omosome elimi����io� i� H�����p�z� p��-��e�. ��. Ul����s���uc��u�e o� s�i��le ��������us // ���omosom�. �974. V. 49. �. ��7–�60.–�60.�60.

��ll���� �., ���� �.�., �igg �.�. ��o��ei� ki��ses i� ���e co����ol o� mi��osis: �ocus o� �ucleoc����o�l�smic �����fic // �. �ell �ci. �u��l. �99�. V. �9. �. 2�–2�.–2�.2�.

�ol�be�g �.W., Weise �., �lle� T.D., Wilso� K. Dim�les, �o�es, s����­�i�gs ��� ���i� �i�gs o� g�owi�g �ucle�� e�velo�es: evi�e�ce �o� s���uc��u��l i���e�me�i-���es i� �ucle�� �o�e com�le� �ssembl�� // �. �ell �ci. �997. V. ��0. �. 409–420.–420.420.

������ T.�., Wilso� K.�. �ucle�� �ssembl�� // ���u. R�ev. Dev. Biol. �997. V. ��. �. 669–69�.

���el �., �lo��ki� �., ��i�u�el­��z��e��� �. �� ��. �e�-sis��e�ce o� m�jo� �ucle�� e�velo�e ����ige�s i� �� e�velo�e­like s���uc��u�e �u�i�g mi��osis i� D����ph��� �e���o��st�er emb���os // �. �ell �ci. �9�9. V. 94. �. 46�–470.–470.470.

�e��ze� �.W., We���e �.R�. Bo��e� co����ol ��� ���e �ucleus: bioge�esis ��� o�g��iz���io� o� ���e �ucle�� mem-b���e ��� �o�e com�le�es // Dev. �ell. 2009. V. �. �. 606–6�6.

�z���� �.�. T�e �ole o� c�lcium io�s �u�i�g mi��osis: c�lcium �����ici����es i� ���e ������se ���igge� // ���o-mosom�. �9��. V. ��. �. �–�0.

Kiselev� �., �ol�be�g �.W., ��o�s��w �., �lle� T.D. T�e �ucle�� �o�e com�le�: s���uc��u�e, �u�c��io�, ��� �����mics // ��i��. R�ev. �uk����o��. �e�e ����. 2000. V. �0. � �. �. �0�–��2.–��2.��2.

Kiselev� �., R�u���e��o�� �., �o����e� �.�. �� ��. ���e�s o� �ucle�� �o�e com�le� �is�ssembl�� ��� �e�ssembl�� �u�i�g mi��osis i� e��l�� D�oso��il� emb���os // �. �ell

�ci. 200�. V. ��4. �. �607–�6��.–�6��.�6��.�e�z­Bo�me B., Wism�� �., �uc�s �. �� ��. ��se���io��l��se���io��l

mu�����io� o� ���e D�oso��il� �ucle�� l�mi� D�0 ge�e �esul��s i� �e�ec��ive �ucle�� e�velo�es, cl�s��e­�i�g o� �ucle�� �o�e com�le�es ��� �ccumul���io� o� ���ul���e l�mell�e // �. �ell Biol. �997. V. ��7. �. �00�–�0�6.–�0�6.�0�6.

�o�k� �.�., ��sui �. �o�m���io� �� ����� o� s�e�m ��o�u-clei ��� mi��o��ic c��omosomes i��uce� b�� �m��ibi�� oo�l�smic com�o�e���s // �cie�ce. �9��. V. 220. �. 7�9–72�.–72�.72�.

���s��l �.�.B., Wilso� K.�. �ucle�� e�velo�e �s-sembl�� ����e� mi��osis // T�e��s �ell Biol. �997. V. 7. �. 20–29.–29.29.

������ �.R�., ��umwebe� �., �g��� D.�., �e���� �.W. Time­�esolve�? �� ����� s��u�ies o� mi��o��ic s�i��le �o�m���io� ��� �ucle�� l�mi�� b�e�k�ow� i� D�o-so��il� e��l�� emb���os // �. �ell �ci. �996. V. �09. �. �9�–607.–607.607.

�����s���om �.�., �����eli� �.�. ��e ���ul���e l�mell�e i� ���e D�oso��il� emb���o ���e �esul�� o� ove���o�uc��io� o� �ucle�� �o�e com�o�e���s // �. �ell Biol. �9�4. V. 9�. �. 699–70�.

�����s���om �.�., ����е�eli� �.�. D����mics o� ���e �ucle��е�eli� �.�. D����mics o� ���e �ucle���eli� �.�. D����mics o� ���e �ucle�� e�velo�e ��� o� ���e �ucle�� �o�e com�le�es �u�i�g mi��osis i� ���e D�oso��il� emb���o // �u�. �. �ell Biol. �9�4. V. �4. �. �79–��9.–��9.��9.

Wiese �., �ol�be�g �.W., �lle� T.D., Wilso� K.�. �ucle�� e�velo�e �ssembl�� i� ��e�o�us e�����c��s visu�lize� b�� sc���i�g �� �eve�ls � �����s�o���­�e�e��e��� e�velo�e smoo���i�g eve��� // �. �ell �ci. �997. V. ��0. �. �4�9–��02.–��02.��02.

Wu�ze�be�ge� �, �e�lic� D.W. ��os������ses: ��ovi�i�g s��e ��ss�ge ����oug� mi��o��ic e�i�� // ����. R�ev. �ol. �ell Biol. 20��. V. �2. � �. �. 469–4�2.

�o�e�� �., �m�mo��o­�o�obe �., ��mizumi �., Uc�i�� T. R�eve�sible i��ibi��io� o� ��o��ei� im�o��� i���o ���e �u-cleus b�� w�e��� ge�m �gglu��i�i� i�jec��e� i���o cul��u�e� cells // ���. �ell R�es. �9�7. V. �7�. �. ��6–�9�.–�9�.�9�.

����se�i�� O.V., �ol���kov V.�., ��e���sov �.�. �ome s���uc-��u��l �s�ec��s o� ���e ����e o� ���e �ucle�� e�velo�e �u�i�g mi��osis // �����obiolog��. �977. V. �6. �. ��0–�44.–�44.�44.

67�Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, Том 15, № 4

A FEATURE OF NUCLEAR ENVELOPE FORMATION DURING MITOSIS IN EARLY DROSOPHILA MELANOGASTER EMBRYOS

A.A. Strunov1, Е.А. Onischenko2, Е.V. Kiseleva1

� ��s��i��u��e o� �����olog�� ��� �e�e��ics, �B R���, �ovosibi�sk, R�ussi�, e­m�il: elk�@bio�e��.�sc.�u

2 Divisio� o� �ell ��� Develo�me����l Biolog��, U�ive�si���� o� ��li�o��i�, Be�kele��, �� 94720

Summary

T�e ul����s���uc��u�e o� ���e �ucle�� e�velo�e o� �ivi�i�g �uclei i� D�oso��il� emb���os ��� ���e s���c����i�l bl�s��o�e�m s���ge ��s bee� s��u�ie�. ��� w�s ��eviousl�� s�ow� ������ mi��osis i� e��l�� D�oso��il� emb���os is semi­close� ��� ���e �ucle�� e�velo�e com�le��el�� �is�ssemble� o�l�� ��� ���e s�i��le �oles, w�e�e�s � �ouble (s�i��le) e�velo�e �o�me� i� o���e� ��e�s (�����s���om, ����e�eli�, �9�4). We ��ve �ou�� ������ ���e �ucle�� e�velo�e com�le��el�� �is�ssembles i���o vesicles ��� s�o��� memb���es ��� ���e me������se s���ge ��o �o�m � ���ick l���e� ��ou�� ���e �ucleo�l�sm. T�e �ucle�� e�velo�e �ssembl�� ��ou�� ��ug���e� �uclei s������s ��� ���e l���e ������se s���ge. ��� is �ccom���ie� b�� ��io� �o�m���io� o� lo�g s���cks o� �oug� e��o�l�smic �e��iculum memb���es, i�volvi�g com�o�e���s o� ���e ol� e�velo�e. �i�s��, ���e vesicles ��� s���cks o� bil���e� memb���es ��e ���i�ll�� loc���e� ��� ���e �ucleo�l�sm �e�i��e��� ��� ���e� move ��o ���e �ucleo�l�sm, w�e�e ���e�� come ��o � close co����c�� wi��� co��e�se� c��omosomes. ��� is s�ow� ������ �ew ���gme���s o� ���e �ucle�� e�velo�e c�� �o�m ��ou�� i��ivi�u�l c��omosomes wi��� �����ici����io� o� vesicles ��� bil���e� memb���es. ��� is �ssume� ������ ���e vesicles ��� memb���es ��oge���e� wi��� some o���e� ��c��o�s co����ibu��e ��o c��omosome �eco��e�s���io�, �s w�s ��eviousl�� �emo�s������e� �� �����. Du�i�g ���e ��elo���se, c��omosomes �eco��e�se com�le��el��, �ucle�� e�velo�e ���gme���s �use, ��� w�ole �ucle�� e�velo�es �o�m ��ou�� e�c� ��ug���e� �ucleus.

Key words: �ucle�� e�velo�e, ��oso��il� emb���os, s���c����i�l bl�s��o�e�m, elec���o� mic�osco���, mi��osis, c��omosomes.