胡 建临床七年二系 0603 班

2008.5.2

一 实验目的 二 实验原理 三 实验材料与仪器 四 实验步骤 五 注意事项

一 实验目的

1. 学习掌握考马斯亮兰染料结合法测定蛋白质浓度的基本原理。

2. 了解考马斯亮兰法测定蛋白质含量的优缺点。

二 实验原理 考马斯亮兰 G-250 染料在酸性条件下能与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰值从 465nm 变成 595nm ，溶液的颜色由棕红色变为蓝色，在 595nm 测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质定量测定。微量法测定蛋白含量范围为 1μg-10μg ；常量法则以检测范围 10μg-100μg 为宜

三 实验材料与仪器仪器和材料 （ 1 ）玻璃仪器：试管 , 吸管 （ 2 ） 721 分光光度计

试剂 （ 1 ） 9g/L NaCl 溶液。 （ 2 ）标准蛋白质溶液（ lmg ／ ml ） （ 3 ）待测血清 （ 4 ）考马斯亮兰 G250 染液

四 实验步骤 1 ．标准曲线制备：取试管 13 只，按下表编号。将 1mg ／ ml 的标准蛋白溶液配制为 1000μg ／ ml ， 500μg ／ ml ， 250μg ／ ml， 125μg ／ ml ， 62.5μg ／ ml 和 31.25μg ／ ml 的系列稀释液，按下表操作并记录：

管号试剂 (ml)

空白管

标准管 测定管×2

1×2 2×2 3×2 4×2 5×2 6×2

标准蛋白质溶液（ lmg／ml）

— 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

生理盐水 0.1 — — — — — — —

稀释血清样品

— — — — — — — 0.1

考马斯亮兰染液

5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

光吸收值(λ=595nm)

摇匀，室温静置 3min 。以空白管调零，在波长 595nm 比色，读取各管的光吸收值。以各标准管蛋白质含量 (μg) 为横座标，各管光吸收值为纵座标作图，绘制标准曲线

2 ．未知样品测定：取试管 2 只，按上表测定管操作，摇匀，静置 3 分钟，在波长595nm 读取光吸收值。用 2 管的平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，按以下公式计算出该样品的蛋白质浓度（ g/L ）。 未知样品蛋白质浓度 (g/L) ＝标准曲线查得蛋白质浓度 × 稀释倍数 × 单位换算

五 注意事项 1 ．不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。塑料或玻璃比色皿使用后立即用少量 95% 乙醇洗去染色，防止读数误差。 2 ．塑料比色皿绝不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。