1

2

یثسمه تعبل

یجهبدکطبوسص وصاست

سبصمبن تحقیقبت، آموصش و تشویچ کطبوسصی

کطوس یالتیضعلوم قبتیتحق موسسه

بنیآثض یهب یمبسیثهذاضت و ث ثخص

گضاسش نهبئی

: طشح ملی عنوان

يسائي آن( جذاسبزي ، شىبسبئي ي ثيمبر)مطبلع ثيمبري وكريز عصجي ييريسي

دركفبل مبيبن دريبي خسر ي ثررسي ثيمبريسائي ي احتمبل اوتقبل آن ث سبير

مبي سفيذ ي مبيبن پريرشي ( در كشر ،مبيبن ) مبيبن خبييبري

مجشی :

سیذ جلیل رسیه ص هشا

0-050-000000-08-0000-58058 ضمبسه مصوة :

:ضمبسه ثجت

43010

1389آرس مبه

3

جهبد کطبوسصی وصاست

سبصمبن تحقیقبت، آموصش و تشویچ کطبوسصی

کطوس یالتیضعلوم قبتیتحقمؤسسه

)جداسازي ، شناسائي و بيماريسائي آن( دركفال ماهيان مطالعه بيماري نكروز عصبي ويروسي : ملیطشح عنوان

ماهي سفيد و ماهيان پرورشي ( درياي خسر و بررسي بيماريسائي و احتمال انتقال آن به ساير ماهيان ) ماهيان خاوياري،

در كشور

0-050-000000-08-0000-58058 ضمبسه مصوة :

ػیذ رلیل رسی صشانبم و نبم خبنوادگی نگبسنذه/ نگبسنذگبن :

نبم و نبم خبنوادگی مجشی مسئول ) اختصبظ ثه پشوطه هب و طشحهبی ملی و مطتشك داسد ( :

ػیذ رلیل رسی صشا

هشین )اضلی(،گیالى( داخلی آثبي) پشسي آثضي پظـكذ هحذث لبػوی : گی مجشی / مجشیبن نبم و نبم خبنواد

(دادهبى دكتش خبیبسي هبیبى الوللی ثیي تحمیمبت اؼتیت)، ػوی حمیمی كبسػیذای ( اكلطي دسیبي خضسپظـكذ) لیبػی

،یسحب فیؿش یپس، هصغف فیؿش یؼیػ ،یروبل زف ،يفسیپشا ص ،يظش شضبیػل نبم و نبم خبنوادگی همكبسان :

اصغش یػل ذ،یفئ شیه ب،یػبلل، هشداداصغش یثبثک سهضب ،یسح كیراد دل ،يحؼي ظبم آثبدؿبپسكبكلكی، ،يػجبع س

هؼصم ي، هذ ضادیػل يهذ ذم،هم يثبصاس لیؿبس هبػل، ػ شضبیػل ،يصاذ يی، آر ییبی، هحوذ ث يثشص بسی، ؿش يذیػؼ

.بىیحالر یچكو دص، ػل ذىیپس، فش لیرل لیصاد ، رل

,Prof.Toshihiro Nakai, Prof. Chi Shau Chiنبم و نبم خبنوادگی مطبوسان :

Dr. Igor Shchelkunov & Prof. Giuseppe Bovo

آثبي) پشسي آثضي پظـكذ – اكلطي دسیبي خضس پظـكذ – سػلم ؿیالتی كـهػؼ تحمیمبت اجشا : محل

ضؿكی كـسداهپ ػبصهبى تـخیص هشكض - دادهبى دكتش خبیبسي هبیبى الوللی ثیي تحمیمبت اؼتیت - گیالى( داخلی

1/1/1385ع: تبسیخ ضشو

ػبل 3مذت اجشا :

کطوس یالتیضعلوم قبتیتحقنبضش : موسسه

نسخه 20تیتشاط ( : ضمبسگبن )

1392سبلانتطبس : تبسیخ

حق چبح ثشای مؤلف محفوظ است .

.نقل مطبلت ، تصبویش ، جذاول ، منحنی هب و نموداسهب ثب رکش مأخز ثالمبنع است

4

ملي :ح طر

مطبلع ثيمبري وكريز عصبجي ييريسي)جذاسببزي ، شىبسببئي ي ثيمببريسائي آن( دركفببل

خسر ي ثررسي ثيمبريسائي ي احتمبل اوتقببل آن ثب سببير مبيببن ) مبيببن مبيبن دريبي

خبييبري، مبي سفيذ ي مبيبن پريرشي ( در كشر

2-010-200000-08-0000-58018 كذ مصة:

ثب مسئليت اجرايي:

1زرا يرر ليجل ذيسآقبي دكتر

تبريخ ارزيبثي ي در مرد بنيآثس يب يمبريثذاشت ي ثتسط دايران مىتخت ثخش

مرد تأييذ قرار گرفت. رتج عبلي ي 20از 10ثب ومر 20/5/1350

معبين تحقيقبتي مسس تحقيقبت علم شيالتي كشر

دكتري ثد ي داراي مذرک تحصيلي تران در شر 1330متلذ سبل زرا يرر ليجل ذيسدكتر آقبي -1

شذ ي در زمبن اجراي طرح ملي:ثب مي بنيآثس يب يمبرياشت ي ثثذدر رشت (Ph.D)تخصصي

لایربگايست ▄ مركس لایرپژيشكذ لایردر ستبد

.ثب سمت رئيس مركس تحقيقبت مبيبن سردآثي كشر )تىكبثه( مشغل ثكبر ثد است

5

فهشست مطبلت

صفح ػاى

14 ..........................................................................................................................چكیذه فبسسی

16 ......................................................................................................................................... مقذمه

فصل اول

کلیبت

02.................................................................................................مبهیبن استخوانـی .1

.کفبل مبهیبن 1-1

02................................................................................هبیبى كفبلـخصبت ه

01 ..............................................رغ بي كفبل هبیبى.............................

01 .........................................گ بي كفبل هبیبى....................................

01 ...............................كفبل پص ثبسیک................................................-1

00 ................................كفبل عالیی.......................................................-0

00 .................................بل خبكؼتشي................................................كف -3

04...........................كلیبت هشثط ث ؿبػبیی كفبل عالیی پص ثبسیک -4

06............اختصبصبت اكلطیكی ثیلطیكی كفبل هبیبى دسیبي خضس -5

08 ................................................................................................یمعشفی ثیمبس -1-2

09 .......................................یشع ػی بي خصصیبت ػبهل ثیوبسي

32 .................................................................................اپیذهیلطي ثیوبسي

32 .................................................هیضثببي حؼبع پشاكذگی رغشافیبیی

30................................................................................سا بي اتمبل ثیوبسي

33.......................................................................ح اتمبل ثیوبسي.............

34..........................ػبهل ثیوبسي دس ثذى هبیبى هجتال گؼتشؽسابي سد

6

35................................................................ػاهل هؼتؼذ كذ ثشص ثیوبسي

36........................................................................................بسيتـخیص ثیو

36 ..............ػالئن ثبلیی...............................................................................

38 ..............................................ػالئن كبلجذگـبیی....................................

38 .......................................تغییشات ثبفت ؿبػی........................................

39 ...................................................سؿبي آصهبیـگبی ؿبػبیی یشع

42.................................................................................................ثیوبسیضایی

42............................................................... اؼبى. ساىاثیوبسیضایی دس پؼتبذ

41....................................................................دسهبى...... كتشل ، پیـگیشي

46 .....پیطینه تحقیق و تبسیخچه ثشوص ثیمبسی و مشوسی ثش کبسهبی گزضته دس ایشان -1-3

فصل دوم

مواد و سوش کبس

53 .................................................................................................................مواد .2

53 ...........................................................................................هاد هصشفی......... 2-1

53..............................................................................صیذ اتمبل هبیبى -0-1-1

53...............................................................اسي و ثشد صیؼت ػزی -0-1-0

53 .....................................صهبیؾ آػیت ؿبػی ثبفتی..........................آ -0-1-3

53.................................................................آصهبیؾ وبتلطي ػشهی -0-1-4

53...........................................................................آصهبیؾ ثبكتشیلطي -0-1-5

53.............................................................آصهبیؾ ػزؾ فلضات ػگیي -0-1-6

53 ............................................هبیؾ ایویؼتؿیوی.....................آص -0-1-7

53 .................................................................................كـت ػلل....... -0-1-8

53 ............................دسخـبى ث سؽ غیش هؼتمین.... پبدتي بيآصهبیؾ -0-1-9

54 .......................................اكؾ صزیش اي پلی هشاص..........آصهبیؾ -0-1-12

54 ...............................................هیكشػكح الكتشی..................... -0-1-11

7

54 .................................................................................. ػبصيهار -0-1-10

54 .........................................................................لاصم غیش هصشفی................... 2-2

54...............................................................................صیذ اتمبل هبیبى-0-0-1

54............................................................... و ثشداسي ؼت ػزی صی -0-0-0

54 .................................................آصهبیؾ آػیت ؿبػی ثبفتی.............. -0-0-3

54.................................................................آصهبیؾ وبتلطي ػشهی -0-0-4

54............................................................................آصهبیؾ ثبكتشیلطي-0-0-5

54..............................................................آصهبیؾ ػزؾ فلضات ػگیي-0-0-6

54.... ............................................................آصهبیؾ ایویؼتؿیوی...-0-0-7

55.. ................................................كـت ػلل..................................... -0-0-8

55 .............................دسخـبى ث سؽ غیش هؼتمین... پبدتي بيآصهبیؾ -0-0-9

55 ..................................آصهبیؾ اكؾ صزیش اي پلی هشاص............... -0-0-12

55 ..................................هیكشػكح الكتشی.................................. -0-0-11

55 ......................................... ػبصي..........................................هار -0-0-10

سوش کبس 2-3

56..............................................................................صیذ اتمبل هبیبى -0-3-1

57............................................................... و ثشداسي صیؼت ػزی -0-3-0

58.................................................................آصهبیؾ آػیت ؿبػی ثبفتی - 0-3-3

59..................................................................آصهبیؾ وبتلطي ػشهی -0-3-4

61 ..........................................آصهبیؾ ایویؼتؿیوی........................ -0-3-5

63 ...................................................كـت ػلل..................................... -0-3-6

SSN-1 ........... .....63تلمیح و ثش سي تک الی ػلل -0-3-6-1

63.. ......................................ثشسػی ػللبي تلمیح ؿذ -3-6-0 -0

63 ..............................دسخـبى ث سؽ غیش هؼتمین.. پبدتي بيآصهبیؾ -3-7 -0

65 ...................................آصهبیؾ اكؾ صزیش اي پلی هشاص................. -0-3-8

RNA........................................................... 66اػتخشاد -0-3-8-1

8

RT-PCR.......................................................... 67ازبم -0-3-8-0

Nested-PCR .................................................. 68ازبم -0-3-8-3

PCR........................................... 68الكتشفسص هحصل -0-3-8-4

68........................................................................هیكشػكح الكتشی -3-9 -0

69..........................................ؿبػی ثبكتشيتی و ازبم آصهبیـبت -0-3-12

69 ........................................بیؾ ػزؾ فلضات ػگیيآصه تی و -0-3-11

72..........................................................(. Challenge) ػبصي هار -0-3-10

70... ................................ػبصي دس هبیبى گپی هار -0-3-10-1

73....... ................دس ثچ هبیبى لش ثشى ػبصي هار -0-3-10-0

سومفصل

نتبیج

76 ............................................................. هـبذات ثبلیی صیؼت ػزی -3-1

79................................................................. پبساهتشبي وبتلطي ػشهی -3-0

85............................................................................ؿبػی ثبكتشيیبفت بي -3-3

87.............................................................یبفت بي آصهبیـبت فلضات ػگیي -3-4

88 ..............................................................ػی ثبفتی.....................آػیت ؿب-3-5

92 ...........................................................................ایویؼتؿیوی......... -3-6

91 .....................................................................................كـت ػلل....... - 3-7

94 .........................................یش هؼتمین..........دسخـبى ث سؽ غ پبدتي بي -3-8

91. .............................................................پلی هشاص........اكؾ صزیش اي -3-9

123 .....................................................................ػكح الكتشی...هیكش -3-12

124 .............................................................. ( Challenge ػبصي ) هار-3-11

124. .................................................پیگػبصي دس هبیبى هار-3-11-1

127 ....................................... ػبصي دس ثچ هبیبى لش ثشىهار-3-11-0

فصل چهبسم

9

پیطنهبدات و نتیجه گیشی ،ثحث

116................................. ............................................................تیز گیشي ثحج -4-1

134.............................................................................................................پیـبدات -4-0

136................................................................................................................................... قذسدانی

137... ......................................................................................................................................منبثع

152.................................................................................................................................پیوست هب

194....................................................................................................................... چكیذه انگلیسی

11

ضكل هب فهشست

صفحه ضمبسه ضكل

01.......................................................................................(Liza saliensهبی كفبل پص ثبسیک ) –1 ضكل

00...............................................................................................(Liza auratusی)هبی كفبل عالئ –2 ضكل

Grey mullet........................................00( یب Mugil cephalusهبی كفبل خبكؼتشي ) –3 ضكل

Abu mullet ..........................................................................................03یب (Liza abu) هبی –4 ضكل

Liza klunzingeri ...........................................................................................................03هبی –5 ضكل

05.............................................صائذ پیلسیک فلغ ػش دس كفبل عالییوبیی ؿوبتیک اص ضؼیت – 6ضكل

05......................................وبیی ؿوبتیک اص ضؼیت صائذ پیلسیک فلغ ػش دس كفبل پص ثبسیک –7ضكل

43............................................بي رذیذ الس هشاحل هختلف لغغ صزیش اتمبل ثیوبسي اص هلذیي تب –8 ضكل

عی صهؼتبى ( هبیبى ثیوبسصیذ ؿذة( داخلی)ضؼیت ظبشي)الف –9 ضكل

52......................................................................................................................................1384تبثؼتبى تب 1383

51...........................................هلؼیت رغشافیبئی ػ اػتبى هسد هغبلؼ دس حض رة دسیبي خضس –10ضكل

56..........................................ػبػت لجل اص و ثشداسي 04 - 48وبیی اص هحل گذاسي هبیبى عی -11ضكل

58............................................................................ ثب هحلل گل هیخک هحل ثیؽ ودى هبیبى -12ضكل

58................................................................................................پغ اص ثیؿی صیؼت ػزی ازبم -13ضكل

59...........................................................................هلؼیت لشاس گشفتي لة بي هغض دس هبی كفبل -14ضكل

62........................................................................................خگیشي ثب ػشگ اػتشیل اص ػبل دهی -15 ضكل

61..............................................................................اتمبل و خى ث تیثبي ارذ فبلذ پبسیي -16ضكل

61............................................................................آهبد ػبصي و بي رت لشائت وبتكشیت :17 ضكل

61........................................آهیضي ؿوبسؽ تفشیمی گلجلبي ػفیذ تی گؼتشؽ خى رت سگ- 18ضكل

66.................................................................................................................: تی و هغض اص هبیبى 19 ضكل

66................................................................................................................: تی و چـن اص هبیبى20ضكل

PCR...............................................................................66: ثشداؿت و هغض رت ازبم آصهبیؾ 21 ضكل

73......................................................پغ اص تضسیكلجل آداپتبػیى گذاس ي هبیبى دس آكاسین : 22ضكل

74................................................................آداپتبػیى گذاس ي هبیبى دس آكاسین پغ اص تضسیك : 23ضكل

74................ثچ هبی لش ثشى................................ تضسیك ػپشبتبت ػللی دس پـت حذل چـوی :24ضكل

ثبدكشدگی هحع اتؼبع (aكیؼ ؿبي ثبد كشد دس كفبل عالیی دسیبي خضس) :25 ضكل

76.................................................................................................................................................... (b) ؿكوی

77....................................................................................وبیی اص هبیبى صیذ ؿذ ارذ ػالین ثبلیی: 26 ضكل

77......................................................وبیی اص احـب داخلی، خبلی ثدى سد ب سگ پشیذگی كجذ :27 ضكل

78.................................................................................................. وبیی اص خشیضي ػغحی دس ثذى :28 ضكل

11

78...........................دس اعشاف كش چـن دس هبیبى صیذ ؿذ وبیی اص ثیشى صدگی چـن خشیضي .:29ضكل

ارذ 0 1ارذ ػالین ثبلیی گش ال هبیبى ؿوبس 3هبی ؿوبس :30 ضكل

78.................................................................................................................................. ػالین ثبلیی گش دم

دسكفبل (4 0،3 ثیوبس)هبیبى (1 ؿوبس بلن)هبیػ هبیاذاص ثیي همبیؼ :31 ضكل

78............................................................................................................................................... هبیبى ن ػي

: تشفیل، 33: وبیی كلی اص گلجلبي لشهض، تصیش 30تصیش : 34تب 32 اضكبل

82.........................................................................................................................................: هیلػیت34تصیش

82.......................................................هػیت 37تشهجػیت، 36، : لفػیت 35تصیش : 37تب 35اضكبل

87...................................: وبي كلی اص پشگ رذاؿذ اص هغض هبیبى كفبل ثش سي هحیظ آگبس خذاس 38 ضكل

87..............................................................وبیی اص ولیض كلی ثبكتشي ثش سي هحیظ اگبس خذاس: 39 ضكل

L. auratu (H&E x10 (...................................................88ئالػیى اضح دسهمغغ خبع اك : 40ضكل

ئالػیىداساي اك L. auratusثبفت ػصت ثیبیی همغغ : 41 ضكل

H&E x4).......................................................................................................................................88گؼتشد

ئلبي فشااى دسآلد داساي اك L. auratusهمغغ ثبفت چـن هبی :42ضكل

89.......................................................................................................................................(H&E x4) ؿجكی

89.......................................................( H&E, x4) ئل داساي اك L. auratusهمغغ ثبفت هغض : 43ضكل

اكئل دس ثذى حضس (A. persicusهمغغ ثبفت چـن تبع هبی ایشای ) :44ضكل

92.......................................................................................................................................(H&E, x4ؿجكی )

92......................................(H&E, x4ثذى اكئل ) (A. persicus) همغغ هغض تبع هبی ایشای :45ضكل

یوی، سگذا بي ك دس آصهبیؾ ایویؼتؿ L.auratusهمغغ ثبفت ؿجكی چـن هبی : 46ضكل

91.........................................................................(H&E, x4) دس ؿجكی چـن ـبى هی دذل اي سا -لشهض

ك دس آصهبیؾ ایویؼتؿیوی، سگذا بي L.auratusهمغغ ثبفت ؿجكی چـن هبی :47 ضكل

91...................................(H&E,40X) دس ؿجكی چـن ـبى هی دذ.بي هرد اكئلل اي سا دس -لشهض

تلمیح وطى فیلتش اصسص پغ SSN-1 ،6ئالػیى ایزبد ؿذ دس ػیتپالػن ػللبي اك : 48ضكل

90.........................................................( x20( ثیوبس ) L.auratusؿذ ثبفت هغض چـن هبیبى كفبل عالیی)

ثبفت هغض چـن سص ثؼذ اصتلمیح وطى فیلتش ؿذ SSN-1 ،7ئالػیى دس ػللبي اك:49ضكل

90...........................................................................................( x20( ثیوبس ) L.auratusهبیبى كفبل عالیی)

ػپشبتبت ػللبي اص سص ثؼذ اصالیي پبػبط SSN-1 ،5ئالػیى دس ػللبي اك: 50ضكل

SSN-1 (آلد ؿذx20 )............................................................................................................................90

ػپشبتبت ػللبي اص پبػبط دهیيسص ثؼذ اص SSN-1 ،5ئالػیى دس ػللبي اك : 51ضكل

SSN-1 (آلد ؿذx20 )............................................................................................................................93

CPE........93.ثذى آحبس ایشای هسد هغبلؼ یتلمیح ؿذ ثب و چـن هغض تبع هب SSN-1ػلل : 52ضكل

( L. auratus) دسهمغغ ؿجكی چـن هبی كفبل عالیی مبط عالیی ثشاق : 53ضكل

94..................................................................( IFAT,x4آلد ث ثتب دایشع دس آصهبیؾ ایوفلسػت )

12

( L.auratus) آصهبیؾ ایوفلسػت ثش سي همبعغ ؿجكی چـن هبی كفبل عالیی : 54ضكل

94............................................................................................(x4) ي دایشع سا ـبى داد.رد آتی طى ب

ثبفتی آلد ؿذ ثب وطى SSN-1آصهبیؾ ایوفلسػت ثش سي ػلل : 55ضكل

95.........(....................................................................................................... L.auratusعالیی ) هبی كفبل

ثبفتی آلد ؿذ ثب وطى SSN-1آصهبیؾ ایوفلسػت ثش سي ػلل : 56ضكل

95.................................................................................................................( L.auratusعالیی ) هبی كفبل

SSN-1 (X40 ).....................................95فلسػت ثش سي ػلل كتشل هفی دسآصهبیؾ ایو : 57ضكل

IFAT..............................................................96: و هفی ثش سي هلذیي تبع هبی دس آصهبیؾ 58ضكل

96...............یی دس پظـكذ آثضي پشسي() رذا ؿذ اص كفبل عالIFAT كتشل هخجت دس آصهبیؾ :59 ضكل

97......................................پظـكذ اكلطي دسیبي خضسو بي RT-PCRتصبیش :61تب 60اضكبل

98....................................................18 16دس و بي bp 479 089بل اي اص دثبذ هـبذ : 62ضكل

98........................................................دس آصهبیؾ هزذد 18 16د و PCR: وبیی اص هحصل 63ضكل

PCR...................................................................................................99 وبیی اص هحصل :65تب 64اضكبل

111..............................................................................ساوبي كیت رت چگگی اػتتبد تبیذ: 66ضكل

121............................................................دسصذ 0اػتخشاد ؿذ ثش سي طل آگبسص RNAثبذبي :67ضكل

121........................................................و بي هغض چـن تبػوبی ایشای Nested-PCR تبیذ: 68ضكل

120.....حبصل اص و هخجت ثذػت آهذ اص ػفت عجیؼی Nested-RT-PCRفسص هحصل شالكت: 69ضكل

CPE................123 داساي SSN-1حبصل اص ػللبي Nested-RT-PCRفسص هحصل شالكت: 70ضكل

آسایؾ هظن دس ؿجكی چـن هبی تصیشرسات ثتبدایشع ث عس هتشاكن داساي : 71ضكل

124............................ ( X7652 )ثضسگوبئی ثب هیكشػكح الكتشی ( L.auratusكفبل عالیی دسیبي خضس)

125..............................................هبی گپی داساي ػالین ثبدكشدگی هحع ؿكوی تیشگی چـن : 72ضكل

ػبػت ثب یشع لشاسداؿت اػت 4ك دس هار گپی همغغ ثبفت هغض هبی :73 ضكل

ل اي سا دس هبد خبكؼتشي هغض -عالئیدس آصهبیؾ ایویؼتؿیوی، سگذا بي

125.................................................................................................................( H&E, 100X) ـبى هی دذ.

اػت ػبػت ثب یشع لشاسداؿت 4ك دس هار گپی همغغ ثبفت هغض هبی :74 ضكل

126........................................................................................( H&E, 100X) آصهبیؾ ایویؼتؿیوی دس

ػكح الكتشی اص هغض هبی گپی هجتال داساي ػالئن ثبلیی تصیش هیكش : 75 ضكل

126....................................................................................................................................رسات یشػی رد

داساي ػالئن ثبلیی گپی هجتال ػكح الكتشی اص هغض هبیتصیش هیكش :76 ضكل

127...................................................................................................................................رسات یشػیوبیؾ

128....................................................................... ثؼذ اص تلف ؿذى ثچ هبی لش ثشىكبلجذ گـبیی : 77ضكل

128...............................................( x 42ئل بي هتؼذد) هبی لش ثشى داساي اك ثچ همغغ چـن : 78ضكل

129...............................دس ثخؾ خبكؼتشي داساي اكئل بي فشااىهبی لش ثشى ثچهمغغ هغض :79ضكل

13

دس ثخؾ خبكؼتشي داساي اكئل بي فشااى هبی لش ثشى ثچ هغضهمغغ :80 ضكل

(20X ،H&E ).........................................................................................................................................129

دس ثخؾ خبكؼتشي داساي اكئل بي فشااى هبی لش ثشى ثچ هغضهمغغ : 81 ضكل

(20X ،H&E ).........................................................................................................................................112

112.....................( 20X ،H&Eداساي اكئل بي فشااى ) هبی لش ثشى ثچ ثصل الخبعهمغغ : 82 ضكل

111.....................( 10X ،H&Eداساي اكئل بي فشااى ) هبی لش ثشى ثچ ثصل الخبعهمغغ :83 ضكل

هسد هخجت کی()گضاسؽ Prof.Nakaiطاپي ) OIEسفشاغ ـگبیاص آصهب یبفتیدس ذیتب: 84 ضكل

Nested-PCR).........................................................................................113 ؾیدسآصهب يبسیخب بىیدس هب

ازبم آصهبیؾ آبلیض ػكبغ ثش سي و هخجت ث هظس ؿبػبئی ػبختبس :85 ضكل

113..........................................................................................................................هسد ظشفیلطیكی یشع

تبیذ آصهبیؾ آبلیض ػكبغ و هخجت هـخص ؿذى اختالف دس :86 ضكل

114................................................................................................پذ ثبص كلئتیذي دس طم یشع هسد ظش

(Prof. Chi Shau Chi) اىیتب یداـگب هل ـگبیاص آصهب یبفتیدس ذیتب :87 ضكل

Nested-PCR))....................................................114 ؾیدس آصهب يبسیخب بىیگضاسؽ ػ هسد هخجت دس هب

14

:فبسسی چكیذه

( اص هبییبى VNNایي هغبلؼ ث هظس رذاػبصي ؿبػبیی دایشع ػبهل ثیوبسي كشص ػصجی یشػیی)

دسیبي خضس ؿبهل رة دسیبي خضس صیذ ؿذ دس صیذگببي اػتببي حبؿی (liza auratus)كفبل عالیی

د هشحلیی اي اكییؾ صزیییش اي پلیوییشاص ی،ثییب كوییک سؿییبي كـییت ػییلل لؼییتبى گگیییالى، هبصییذساى

(Nested-RT-PCR) ، پیبدتي یبي دسخـیبى آصهبیؾ) (IFAT ، ایویؼتؿییوی (IHC) ، ،یؼیتپبتلطي

هیكشػكح الكتشی ازبم ؿذ. وبتلطي، ثبكتشیلطي

) فیبت هـیبذ ػالیین ثیبلیی ؿیبهل ؿیبي بهتؼیبسف دسیبفت گضاسؿبي هتؼذد هجیی ثیش ثیشص تل پغ اص

هبسپیچی، چشخـی، خاثیذ ث پـت دس ػغح آة ( اتؼبع هحع ؿكوی دس هبیبى كفبل عالییی صییذ ؿیذ

1385اػتبى هزكس ضوي هشارؼبت هكشس ث پش بي صیبدي دس عل فصل صییذ ػیبلبي ػدس صیذگببي

و ثشداسي گشدیذذكی تؼیذادي دس گشم 052تب 52 دس هحذد صی ی كفبل عالییهب 408تؼذاد 1388تب

ذد یض اص اػتببي گلؼتبى هبصیذساى صییذ ؿیذذ كی اغلیت ػ 116دس اػتبى گیالى كفبل هبی 310حذد

.ثدذ اتؼبع هحع ؿكوی ثذى ؿبي بهتؼبدل، تیشگی سگ ػالئن ثبلیی وچى داسايآب

دس ؿشایظ اػتشیل رذاػبصي رت ازبم آصهبیـبت كـت ػللی اص هبیبى هسد هغبلؼ ثبفتبي هغض چـن

Nested-RT-PCR دس فشیضسC 12. ث عس وضهبى لغؼبتی اص ثبفتبي هزكس دس فشهبلیي ذگذاسي ؿذ – °82

دسصیذ ثیشاي 3اي دس گلتبسآلذیذ ایویؼتؿیوی لغؼ یؼتپبتلطي دسصذ رت ازبم آصهبیـبت

سص ثؼذ اص تلمیح وطى فیلتش ؿذ ثبفتبي هغض چـن ثش ؿؾآصهبیؾ هیكشػكح الكتشی تخجیت گشدیذذ.

ئالػییى هـیبذ ؿیذ كی دس ثی صیست اك ( CPEآحبس آػییت ػیللی ) ، SSN-1سي تک الی ػللی

هیبی ثبػیج 310وی اص 9زبد گشدیذ. دس هزوع تلمیح ویطى پبػبطبي دم ػم یض ثب ؿذت ثیـتشي ای

گشدیذ. CPEایزبد

SSN-1ثش سي و بي ثیبفتی ػیلل یبي Nested- RT-PCRازبم آصهبیؾ هخجیت( CPE) آلید ؿیذ

یي تویبم و هخجت ثید وچی 01تؼذاد و بي ثبفتی تبیذ هـبثی سا ث وشا داؿت. دس آصهبیؾ هؼتمین

هخجت تـخیص داد ؿذذ.هضثس دس آصهبیؾ هخجت( CPE) آلد SSN-1و بي حبصل اص ػللبي

ع آتی ثبدي هكلبل هختلف دثب اػتفبد اص پبدتي بي دسخـبىدس اداه تـخیص ع یشع، آصهبیؾ

ازیبم ؿیذك ایزیبد SSN-1آلد ؿذ ثشسي همبعغ ثبفتی هغض چـن هبیبى كفبل داساي ػالین ػلل بي

مبط دسخـبى حبكی اص رد آتی طى دا یشع تیبیذ كـیت ػیلل دس و بي هسد آصهیبیؾ ثید

Nested- RT- PCR .سا تبییذ ود

ئالػیى دس همبعغ هغض ؿجكی چـن، خیبع ػصیت ثییبیی دس اكخیش ، اكآصهبیـبت آػیت ؿبػی ثبفتیدس

ثیش سي DABثب اػتفبد اص آتی ثبدي هكلبل ضذ دا ییشع سیگ آهییضي ب هـبذ گشدیذ و

15

لی اي -دا یشع ث صست میبط لشهیض بي حضس آتی طى ،همبعغ ثبفتی دس آصهبیؾ ایویؼتؿیوی

هـخص گشدیذ.

ثیبفتی، همیبعغ ییشع ثی یبي وی ثب تر ثی پشاكیذگی ییشع دس دس آصهبیؾ هیكشػكح الكتشی

عالئی همغغ چـن هبی كفبل و اص داساي آسایؾ هظن تب دس یک nm 32صست دایشي ثب لغش حذد

.هـبذ گشدیذ

،ث گ یبي دیگیش اص هبی كفبل عالئی اهكبى اتمبل آى ثشسػی ثیوبسیضایی یشع رذاؿذ ث هظس تؼییي

) ثی صیست ثچ هبیبى لش ثشى ثب هبیبى گپی ) ث صست حوبم( CPEداساي SSN-1ػپشبتبت ػلل

داد ؿذتضسیك دس پـت حذل چـن( هار ئالػییى اك ،ثیش ثیشص ػالیین ثیبلیی ك دس ش د هسد ػیال

هـبذ ؿذ.آب یض ؿذیذ دس هغض ؿجكی چـن

آصهیبیؾ هیكشػكح الكتشیی ثب پی داساي ػالئن ثبلییهبی گي و بدس اداه هغبلؼبت ثیوبسیضائی،

تبیذ حبصل ـبى داد كی حضیس یدا ییشع ثیب ثیشص ػالیین هسد ثشسػی لشاس گشفتذ ایویؼتؿیوی

ؿیی اص بدا یشع سا ث ػاى ػبهل اصیلی تلفیبت ى ثتبكبلجذ گـبیی تلفبت دس استجبط ثد هی تا ،ثبلیی

كفبل هبیبى دسیبي خضس هحؼة ود.دس (VNN)ثشص ثیوبسي پذیذ كشص ػصجی یشػی

واطه کلیذی:

پیبدتي یبي ، آصهیبیؾ SSN-1ثیوبسي كشص ػصجی یشػی، كفبل عالیی، تییش ػیللی ، دسیبي خضس ، ایشاى

Nested-RT-PCR، ایویؼتؿیوی، دسخـبى

16

Abstract:

Viral Nervous Necrosis (VNN) is a worldwide disease affecting several species of cultured

marine fish. For the past two decades, betanodavirus infections that cause Viral Nervous

Necrosis (VNN) have emerged as major constraints on the culture and sea ranching of marine

fish in almost all parts of the world. More than forty species mainly of marine origin have

been so far affected and this number is likely to rise in future following the introduction of

new species and the increase of aquaculture trade.

Unknown acute mortality occurred in wild golden grey mullet Lisa auratus and Liza saliens

in Iranian waters of Caspian Sea in recent years. In order to isolation and confirmation of

causative agents of golden grey mullet mortality in the Caspian Sea, a complementary

research investigation project was designed in 2005 and approved immediately in Iranian

Fisheries Research Organization (IFRO). Many diagnostic aspects such as Virology (Cell

culture and Elctereone Microscopy), Hemathology, Bacteriology, Histopathology, Molecular

biology (Nested-RT-PCR), Heavy metals measuerment and Serology (IFAT and IHC) were

employed in mentioned multidiciplinary project. About 322 moribund fish samples which

revealed skin darkening, erratic swimming behavior such as spiral and belly-up at rest and

high distention of swimming bladder. Suspected samples were collected from coastal capture

sites in iranian north proviences in 2006 till 2009. Targets tissue such as brain and eye were

removed in strile condition and then kept in -80oC

frezzer for cell culture and Nested-RT-

PCR. Other tissue samples from liver, kidney, intestine, stomach, gill, skin and muscle, gall

bladder and gonads were taken and fixed in 10% buffer formalin and same parts fixed in

glutaraldehyde 3% for histopathology, IHC and EM respectively. Cytopathic effect (CPE)

was observed in those cell cultures just six days after inoculation with the dilutions of the

tested 312 homogenate supernatants. CPE in monolayers of cells cultured (SSN-1 cell line)

was characterised by thin or rounded, refractile, granular cells with vacuoles. Nine samples

were positive in virology assay. Nested- RT-PCR was done on suspected tissue samples and

supernatant of CPE positive samples and 21 tissue samples and all CPE positive samples

were positive. IFAT was selected as a confirmatory method for identifying viral strains

replicating on cell cultures and carried out with rabbit anti-betanodavirus serum on suspected

tissue samples and some smears of CPE positive samples. Some bright points approved

betanodavirus antigen and confirmed cell culture and Nested-RT-PCR findings.

In fixed tissue samples widespread and massive vacuolation were observed in brain, spinal

cord, retina and optical nerve. In order to confirmation of diagnostic findings , IHC was done

17

with monoclonal antibody anti-betanodavirus and some red-brown points were observed.

Theses findings revealed expected viral antigens and confirmed previous results. Moreover,

virus particles with 25-30 nm in diameter were visualized in infected brain and retina using

positive staining in TEM. Also pathogenicity test was employed to confirm the obtained

results. So Guppy fish Poecilia reticulata and sturgeon fry were used instead of the

experimental host due to ease of handling and susceptibility. After 15 days post infection,

guppy bathed in VNN-infected tissue culture with 104

TCID50 showed clinical signs similar

to naturally infected Golden grey mullet, and the mortality rate reached up to 100% in 75 dpi.

When target organs were examined by cell culture isolation, serology, and histopathology, all

revealed the presence of virus in the Guppy. Suspected supernatant injected to sturgeon fry

through intravitreous injection and widespread vacuolation were observed in brain and spinal

cord buy IHC and Real time PCR were negative. In conclusion, with attntion to obtained

results in this investigation such as ecological factors, clinical signs, histopathological,

virological and bacteriological results, molecular analysis, (IHC, IFAT, PCR), TEM

demonstration, serological and hematological findings, it could be confirmed that VNNV

was the main causative agent for disease outbreak in Golden grey mullet in Southern

coastline of Caspian Sea.

Key words: Viral nervous necrosis, Golden grey mullet, Liza aurata , Liza saliens,

histopathology , virology, bacteriology, IHC, IFAT, PCR,TEM, Caspian Sea, Iran

18

Ministry of Jihad – e – Agriculture

AGRICULTURAL RESEARCH, EDUCATION & EXTENTION ORGANIZATION

IRANIAN FISHERIES RESEARCH ORGANIZATION (IFRO)

Title: Study on Viral Nervouse Necrosis (Isolation, Characterisation and Pathogenesis) in

Golden grey mullet in the Caspian Sea and study of pathogenecity and possibility of

transmission to the other fish species (Sturgeon fishes, Rutilus frisii kutum and reared

Rainbow trout and Carp).

IFRO project code: 2-019-200000- 05- 0000- 85015

Author: Seyed Jalil Zorriehzahra (D.V.M) & Ph.D

Responsible Executor: Seyed Jalil Zorriehzahra

Executors: Ghasemi, M., Ghiasi, M., Haghighi Karsidani, S.,

Collaborators: Nazari, A., Saifouri, P., Najafi, J., Sharifpour, I., Rohani, M.S., Nouri,

Kakoolaki, Sh., Nezamabadi, H., Daghigh Rohi, J., Ramezani, B., Asgharnia, M., Foeid, M.,

Saiedi, A.A., Behrouzi, Sh., Binaei, M., Zahedi, A., Shenavar Masouleh, A., Bazari

Moghadam, S., Alizadeh, M., Masoumzadeh, M., Jalilpour, J., Chakmeh Douz, F., Halajian,

A.,

Advisor(s): Prof.Toshihiro Nakai, Prof. Chi Shau Chi, Dr. Igor Shchelkunov

Supervisor: Prof. Giuseppe Bovo

Location of execution: Mazandaran, Guilan and Golestan provinces Date of Beginning: 2006

Period of execution: 3 years

Publisher: Iranian Fisheries Research Organization

Circulation: 20

Date of publishing: 2013

All Right Reserved, No Part of this Publication May be Reproduced or Transmitted without

indicating the Original Reference

19

MINISTRY OF JIHAD - E - AGRICULTURE

AGRICULTURAL RESEARCH, EDUCATION & EXTENTION ORGANIZATION

IRANIAN FISHERIES RESEARCH ORGANIZATION

Final Report

Title:

Study on Viral Nervouse Necrosis (Isolation, Characterisation and

Pathogenesis) in Golden grey mullet in the Caspian Sea and study of

pathogenecity and possibility of transmission to the other fish species

(Sturgeon fishes, Rutilus frisii kutum and reared Rainbow trout and Carp).

Executor:

Seyed Jalil Zorriehzahra (D.V.M) & Ph.D

IFRO project code: 2-019-200000- 05- 0000- 85015

Registration Number:

43010

Dec.2010