Técnicas de recolección de materiales y su procesamiento en el laboratorio de Citopatología

Capítulo 2

Raquel Garza GuajardoIvette Carmelina Miranda MaldonadoMarco Antonio Ponce Camacho

Técnicas de recolección de materiales y su procesamiento en el laboratorio de citopatología

INTRODUCCIÓN

Existe gran variación en los métodos de fija-ción y preparación de los especímenes citológicos en cada laboratorio, y en eso interfieren tanto prefe-rencias institucionales como experiencia individual; en este capítulo se comentará sobre los principales especímenes citológicos, sus métodos de recolección y técnicas de citopreparación, con énfasis especial en el proceso de las técnicas de inmunohistoquímica, biología molecular y microscopia electrónica.

FIJACIÓN DEL ESPÉCIMEN

La fijación del espécimen se realiza a través de sustancias químicas que interactúan con los com-ponentes moleculares de los propios tejidos cuyos objetivos son: a) inhibir la autólisis y el sobrecreci-miento bacteriano; b) prevenir la solubilidad de los componentes celulares y mantener intacta la citoar-quitectura y ultraestructura; c) preservar las carac-terísticas de las moléculas (de suma importancia para efectuar técnicas de histoquímica e inmuno-

histoquímica); d) facilitar la adhesión de las células al portaobjeto; y e) proporcionar condiciones ópti-mas que permitan la visualización de las células al microscopio. El fijador más utilizado es el etanol al 95%. Otros de menor uso son el isopropanol al 80%, metanol al 100%, propanol al 80%, y glutaraldehido al 3% para microscopia electrónica.

La fijación puede llevarse a cabo de diversas for-mas, según el tipo de espécimen:

Extendidos directos

Extendidos inmersos en solución fijadora y Dtransportados en frascos contenedores, como los provenientes de especímenes ginecológicos, improntas, cepillados y biopsia por aspiración: estos permanecen en etanol al 95% hasta iniciar el proceso de tinción.Extendidos fijados con aerosol: la mayoría de Destos fijadores son a base de polietilenglicol en una base de alcohol que provee una capa pro-tectora a las células; estas laminillas requieren sumergirse en etanol al 95% por treinta minu-

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2 Citopatologia Diagnóstica | Parte I: Citologia Exfoliativa y Aspirativa

tos en un primer recipiente y quince minutos en otro, para remover completamente el polie-tilenglicol y continuar la técnica de tinción.Extendidos secos al aire que serán teñidos con Dtinciones de Romanovsky: se recomienda su-mergirlos en metanol al 100% hasta el proceso de tinción.

Especímenes no ginecológicos

Idealmente deben llegar al laboratorio en fresco Den un corto período de tiempo después de su recolección; de lo contrario, se requiere mante-ner el espécimen en refrigeración. No se reco-mienda añadir soluciones fijadoras; el alcohol, por ejemplo, interfiere con la adhesión de las células a la laminilla, con la penetración de los colorantes a las células y coagula las proteínas.1

A los especímenes de expectoración se les pue- Dde añadir una solución fijadora para su con-servación (alcohol etílico, Carbowax); pueden recibirse estos especímenes también en fresco si son recolectados en la sala del mismo hospital.

TIPOS DE ESPECÍMENES, TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN DEL MATERIAL Y TÉCNICAS DE CITOPREPARACIÓN

Citología cervical y vaginal

Estos especímenes prácticamente siempre lle-gan al laboratorio ya fijados; son obtenidos con es-pátula y/o cepillo endocervical y extendidos sobre la laminilla, o bien enviados en medio de transporte para base líquida.

Los siguientes son requisitos para la obtención de una muestra citológica con condiciones óptimas para su evaluación:2 el examen no debe realizarse durante la menstruación o antes de tres días de fina-lizado el último período menstrual; 48 horas previas al examen la paciente no debe haberse realizado du-chas vaginales, tenido relaciones sexuales o utilizado tampones, cremas, espermicidas o medicamentos vía vaginal, así como procedimientos ginecológicos (colposcopia, ecografía transvaginal, endoscopia ginecológica o histeroscopia). Si la paciente está en amenorrea o menopausia, se puede realizar en cual-quier momento. En caso de haberse realizado una

biopsia u otro tipo de maniobra en el cuello uterino, debe de esperarse por lo menos veinte días para rea-lizar la toma.

Procedimiento para toma del espécimen

Es necesario contar, previo a la toma, con soli- Dcitud de estudio con la identidad de la paciente y datos clínicos relevantes, así como laminillas rotuladas.La paciente debe estar en posición ginecológica Dy se coloca el espéculo para visualizar el cuello en su totalidad, sin utilizar lubricantes.Localización de la zona de transformación: pue- Dde ser fácilmente visualizada o encontrarse muy alta y no ser visible; esto varía de persona a per-sona y depende de cambios hormonales, como atrofia.2

Recolección de la muestra, para lo que existen Dvariedad de instrumentos para obtener mues-tra de exocérvix, zona de transformación y canal endocervical, que incluyen espátulas de madera y plásticas, y cepillos endocervicales.Si la muestra es de tipo convencional, se re- Dcomienda utilizar espátula sobre el exocérvix, rotándola una vez en 360°, y cepillo en el canal endocervical; hay que extender cada instru-mento inmediatamente sobre la laminilla en lugares separados, o bien en dos laminillas; la muestra proveniente de la espátula se deposita en la laminilla con un solo movimiento unifor-me; posteriormente, se gira el cepillo también en un solo movimiento. Inmediatamente se debe fijar con spray especial para citología o bien sumerjirlos en alcohol de 96°.Si la muestra es en base líquida, se utiliza el ce- Dpillo del fabricante (Rovers®, Cervex-Brush®), se coloca en el orificio cervical y haciendo presión sobre el cérvix, se dan cinco vueltas en sentido de las manecillas del reloj; el cepillo tiene una cabeza desprendible que se deposita en el medio de transporte fijador (Surepath®, ThinPrep®) para garantizar que el 100% del material recolectado llegará al laboratorio.

Entre las causas frecuentes que impiden la toma de una muestra adecuada relacionadas a la toma en citologías convencionales se encuentran: no identifi-


Capítulo 2 | Técnicas de recolección de materiales y su procesamiento en el laboratorio de citopatología 3

car el cuello uterino, no tomar la muestra de la zona de transformación, transferencia incompleta del material a la laminilla, exceso de presión al extender la muestra con la consiguiente destrucción, secado de la muestra antes de la fijación, uso insuficiente o excesivo de fijador.3

En el laboratorio, los extendidos convenciona-les pasan directamente a tinción con Papanicolaou. La preparación de los especímenes en base líquida es automatizada o semiautomatizada, siguiendo las instrucciones del fabricante; el líquido remanente se refrigera para realización de estudios especia-les o nuevas laminillas citológicas; este material se conserva adecuadamente hasta por seis meses a una temperatura de 2-10°C (Figuras 1 y 2).

Citología no ginecológica

Tracto respiratorio

Los tipos de especímenes son expectoración, líquidos de lavado bronquial y bronquioloalveolar, cepillados y aspirados bronquiales y traqueales.

Expectoración (esputo): la muestra ideal para Devaluación citológica es la primera de la maña-na. El paciente debe ser instruido de colectar

Figura 1. Laminillas de citología en base líquida y convencional. Nótense los grumos gruesos en el extendido convencional (dere-cha), en comparación con la muestra homogénea del espécimen en base líquida.

Figura 2. Citología en base líquida. Las células se disponen en una capa sin elementos que las obscurezcan.



una expectoración profunda y no saliva, es-pontánea o inducida por aerosol, enjuagando la boca con agua en varias ocasiones para disminuir la contaminación con alimentos y bacterias; se envia en fresco inmediatamente al laboratorio, de lo contrario puede conservarse en refrigeración por un máximo de 24 horas; una alternativa es la prefijación en solución de etanol al 70% con 2% de Carbowax, o bien aña-dir a la muestra 20 mL de alcohol etílico al 50%. Para la preparación de los frotis, se seleccionan pequeños fragmentos de las áreas sospechosas (purulentas, hemorrágicas, partículas densas), se depositan en el extremo de un portaobjeto y con ayuda del borde de otra laminilla se realiza un extendido delgado, se fija en alcohol de 96° por un mínimo de treinta minutos y posterior-mente se tiñe. Se recomienda realizar cuatro extendidos. En los casos en que el esputo es muy líquido, puede centrifugarse y realizarse extendidos del sedimento.Lavado bronquial y bronquioloalveolar: D ambas técnicas son realizadas por el neumólogo utili-zando broncoscopio flexible, con instilación y aspiración de solución salina. El lavado bron-quial se utiliza principalmente para diagnóstico de neoplasias, con la ventaja de que la muestra proviene de la región anatómica donde se en-cuentra la lesión. El lavado bronquioloalveolar es principalmente utilizado para diagnóstico de enfermedad intersticial pulmonar, infecciones pulmonares difusas, y su uso se ha extendido, aunque con mucho menor frecuencia, a detec-ción de neoplasias malignas y al monitoreo de receptores de transplante.Para evaluación citopatológica de ambos es-

pecímenes el proceso es el siguiente: en una cito-centrífuga (Shandon Cytospin®, Thermo Electron Corporation): a) se centrifuga a 1.500 rpm duran-te quince minutos; b) se decanta el sobrenadante; c) se extiende el sedimento en portaobjetos; y d) se fijan en alcohol de 95° para posteriormente te-ñirse; se recomienda realizar cuatro extendidos de la muestra. Cuando el espécimen tiene abundante moco, este se separa para formar un bloque celular. Por otra parte, estos especímenes también pueden ser procesados en base líquida, utilizando fijadores especiales (CytoRich Red®, Cytolyt®) y programas

específicos de centrifugación según el equipo utili-zado (ThinPrep®, Surepath®).

El recuento porcentual de las células inflamato-rias en los lavados bronquioloalveolares se usa en el diagnóstico de enfermedad intersticial difusa y como monitor de respuesta a terapia en casos de sarcoido-sis; si este es el caso, el procesamiento de la muestra varía: a) centrifugar a baja velocidad; b) decantar el sobrenadante; c) añadir 10 mL de solución salina al sedimento; d) verter 5 mL en otro tubo para realizar una o dos preparaciones en citocentrífuga; e) fijar en alcohol de 96° para teñir con Papanicolaou, o secar al aire para tinción de tipo Romanovsky. El conteo diferencial de las células puede efectuarse con ambas tinciones; se requiere valorar un total de quiñentas células y determinar el porcentaje de cada tipo.4,5 Las técnicas de obtención y procesamiento se comentan con mayor detalle en el capítulo 9 de Citopatología Respiratoria.

Cepillado bronquial y traqueal: D se realizan bajo observación directa de la lesión y tanto el ex-tendido como la fijación son realizados por el endoscopista.Los líquidos provenientes de aspirado bronquial

y traqueal se obtienen inyectando a través del fibros-copio, en el sitio de la lesión, una pequeña cantidad de suero fisiológico, la cual se aspira con jeringa y se deposita en un recipiente con suero fisiológico. El líquido resultante se centrifuga para efectuar exten-didos. (Ver capítulo 9)

Tracto urinario

Se sabe que la primera orina por la mañana es la que posee mayor celularidad; sin embargo, también tiene un gran número de células degeneradas, por eso se recomienda que el material de estudio sea la segunda muestra del día.6 Las muestras provenientes de lavado vesical y ureteral (barbotage) son enviadas en solución salina. La mayoría de los cambios dege-nerativos en citología urinaria ocurren en la vejiga antes de la colección de la muestra. La refrigeración ayuda a prevenir mayores cambios en la mayoría de los casos, y solo en los casos en que el tiempo que transcurra para su proceso sea muy largo puede añadirse alcohol al 50% en un volumen igual al uri-nario, teniendo en cuenta los inconvenientes de su uso. Previo a su procesamiento, es conveniente man-



tener el espécimen fuera de refrigeración hasta que alcance la temperatura ambiente; todas las mues-tras requieren concentración por centrifugación, y los concentrados resultantes pueden prepararse en extendidos directos, con filtros de membrana (mi-llipore o nucleopore), por citocentrifugación, o en base líquida. Los mejores resultados se obtienen con citocentrífuga.7 Por otra parte, hay estudios que es-tablecen que tiene mejores resultados la fijación con alcohol posterior a la preparación del extendido.8 Las indicaciones y técnicas en especímenes del apa-rato urinario se comentan con mayor detalle en el capítulo 7 de Citopatología Urinaria.

Tracto gastrointestinal

Los tipos de especímenes son: a) cepillados de la mucosa de cualquier parte del tracto gastrointes-tinal obtenidos por endoscopia; b) lavados con so-lución salina tanto de alguna región del tubo diges-tivo como de los conductos biliares y pancreático; y c) biopsias por aspiración guiadas por tomografía computarizada o por ultrasonido endoscópico. Los cepillados y la BAAF son especímenes de rutina. Por otra parte, los lavados, con excepción del conducto biliar, son poco frecuentes en nuestro medio.

Las muestras de cepillado son extendidas y fi-jadas por el endoscopista; los líquidos de lavado se concentran por centrifugación si la cantidad de lí-quido es abundante o la celularidad es alta; si la celu-laridad es escasa, se recomienda citocentrifugar.

Las biopsias por aspiración guiadas por ultraso-nido endoscópico requieren la valoración inmediata de la muestra por un citopatólogo con experiencia en citología en el sitio de la punción.9 (Ver capítulo 10 de Citopatología Gastrointestinal)

Líquidos de derrames cavitarios

Pueden ser líquidos de colección o de lavado peritoneal; lo más común es que envíen de 300 a 500 mL y la evaluación del 10% del volumen (30-50 mL) es suficiente para el diagnóstico. La muestra se cen-trifuga para obtener un botón del que se obtienen extendidos, citocentrifugados o preparaciones en base líquida. Para una descripción detallada de las técnicas de recolección y su procesamiento, consul-tar capítulo 5.

Líquido cefalorraquídeo

Estas muestras consisten en unos pocos milili-tros y la mejor técnica para obtener el mayor núme-ro de células es citocentrifugación. (Ver capítulo 6 de SNC para más información)

Especímenes de biopsia por aspiración

La biopsia por aspiración con aguja fina se rea-liza con fines diagnósticos, por palpación en lesiones superficiales, o guiada por métodos radiológicos en lesiones no palpables o profundas. En ambas situa-ciones es recomendable la valoración inmediata del material para suficiencia, y, en ocasiones, es durante esta valoración rápida que se detecta la necesidad de mayor número de laminillas (portaobjetos) para realización de tinciones especiales o inmunocito-química.

Material necesario para la realización de biopsia por aspiración con aguja fina de lesiones palpables (Figura 3)

Portajeringas (Cameco Syringe Pistol®). DAgujas desechables de 20-25 g. DJeringas desechables de 10 mL. DTorundas con alcohol. DPortaobjetos y cubreobjetos. DAplicadores de madera. DRecipientes con alcohol de 96° o fijador en Daerosol.Recipientes con formol para fijación de bloques Dcelulares.Coloración de Diff-Quick para valoración in- Dmediata.

Técnica de la biopsia por aspiración de lesiones palpables

La técnica se basa en introducir en la lesión agu-jas de calibre menor a 20 gauge en un portajeringas especial (Cameco Syringe Pistol®) que permite aspi-rar con una sola mano y dejar libre la otra para fijar la lesión entre dos dedos:

Colocar la jeringa en el portajeringa. DPalpar la lesión y estimar la distancia del punto Dde entrada superficial.



Una vez localizada la lesión, asear la superficie Dcon torunda con alcohol.Inmovilizar la lesión entre dos dedos cuando la Dlesión es pequeña.Introducir la aguja en la piel. El émbolo debe Destar en el fondo de la camisa de la jeringa (sin aire).Notar la diferente consistencia al penetrar la Dlesión.Con la aguja dentro de la lesión, aplicar succión Dy, sin suprimir la presión negativa, dirigirla en varias direcciones (por lo menos tres), reti-rándola unos pocos milímetros y volviéndola a insertar en un ángulo distinto, sin salir de la lesión.Liberar la presión negativa cuando se observe Dque se ha obtenido material en la base de la aguja, devolviendo el émbolo a su posición original antes de sacar la aguja.Ejercer presión sobre el sitio de punción con Dtorunda alcoholada por 1-2 minutos.

Preparar el material, hacer la coloración y Dvaloración inmediata de una laminilla en Diff-Quick o azul de toluidina.Si el material no es adecuado o insuficiente, Drepetir el procedimiento.Cuando la lesión aspirada es quística, drenar Dtodo el líquido, y en caso de persistir un com-ponente sólido, es necesario puncionarlo.

El material obtenido puede corresponder a unas pocas gotas para preparación de extendidos, lí-quidos que son enviados a centrifugación cuando se trata de lesiones quísticas, y fragmentos de tejido o coágulos para formación de bloques celulares.

Para la preparación de extendidos se aplican unas gotas sobre el portaobjetos, colocando la punta de la aguja sobre el vidrio en el centro de la laminilla; si el material contiene grumos o pequeños coágulos, es preferible retirarlos con un aplicador de madera y colocarlos en papel filtro, en formol, para su procesa-miento en parafina; se coloca otra laminilla sobre el

Figura 3. Material necesario para una biopsia por aspiración con aguja fina.



material y se extiende con suavidad, deslizando una laminilla sobre otra, y se fijan de manera inmediata.

Bloques celulares (cóagulos incluidos en parafina)

Los bloques celulares son de gran utilidad para el diagnóstico, ya que sobre ellos pueden realizar-se técnicas de histoquímica e inmunohistoquímica, además de que muchos conservan el patrón arqui-tectural de la lesión. Estos pueden obtenerse tanto de líquidos como del material de biopsia por aspira-ción. Existen diversos métodos para la preparación de bloques. El más sencillo y el más utilizado en La-tinoamérica es retirar los fragmentos de tejido y pe-queños coágulos de las muestras, fijarlos en formol y posteriormente incluirlos en parafina para técnica histológica; en nuestro laboratorio, es el método que utilizamos rutinariamente. Otros métodos incluyen añadir agaragar o trombina comercial al sedimento de los centrifugados para formar un coágulo, o bien recuperar el material de filtros de membrana.10,11

Extendidos con exceso de sangre

Existen varios métodos para destrucción de eri-trocitos en extendidos con exceso de sangre. El más utilizado es sumergir las laminillas ya fijadas por tres minutos en solución de Carnoy, preparado con seis partes de alcohol etílico, tres partes de cloroformo y una parte de acetona y posteriormente pasar las laminillas por alcohol etílico. En lo particular, no-sotros evitamos esta técnica debido a la retracción nuclear y pérdida del detalle celular que produce. Una alternativa para citología no ginecológica es la utilización de CytoRich Red® en muestras prepara-das en base líquida.12

TÉCNICAS DE COLORACIÓN

Las más utilizadas en citopatología son las tin-ciones de Papanicolaou, hematoxilina-eosina y las de tipo Romanovsky, en particular el Diff-Quik. En algunos centros es muy utilizado el azul de toluidi-na, incluso para citología intraoperatoria.

Tinción de Papanicolaou

Es un método de tinción policrómico que cons-ta de una tinción nuclear y un contraste citoplásmico, con las ventajas de que proporciona definición nuclear óptima y transparencia citoplásmica. Existen variacio-nes de la técnica (métodos progresivo y regresivo) y es común que cada laboratorio realice pequeñas modifi-caciones a la misma. La tinción nuclear es basófila y la citoplásmica azul, verde azulado, rosa o naranja, según el tipo de célula. En la tabla 1 se encuentra el protocolo que se emplea en nuestro laboratorio.

Tinciones de tipo Romanovsky

Las tinciones de Romanovsky son mezclas de dos colorantes primarios, el azul de metileno y la eosina, disueltas en metanol; los más utilizados son el

Tabla 1. Tinción de Papanicolaou. Protocolo utilizado en el Hospital Universitario “Dr. José E. González”, UANL, Monterrey, México.

G NG1 Alcohol 96° 10 inmersiones

en laminillas fijadas con alcohol o 5 minutos si son fijadas con citospray

2 Alcohol 96° 10 inmersiones3 Agua 10 inmersiones4 Hematoxilina de

Harris20-30 segundos

5 Agua 10 inmersiones6 Alcohol acidulado 1 inmersión7 Agua 10 inmersiones8 Alcohol 96° 10 inmersiones9 OG-6 1 minuto10 Alcohol 96° 10 inmersiones11 Alcohol 96° 10 inmersiones12 EA-50 1,20 minutos13 Alcohol 96° 10 inmersiones14 Alcohol 96° 10 inmersiones15 Alcohol-Xilol 10 inmersiones16 Xilol 10 inmersiones17 Xilol 10 inmersiones

G: citología ginecológicaNG: citología no ginecológica (diversa)



Diff-Quick y el azul de toluidina, disponible comer-cialmente, que se utilizan tanto en extendidos fijados como secos al aire. Son de mayor utilidad en neopla-sias hematológicas y en la valoración rápida de biopsia por aspiración con aguja fina, además de que resalta microorganismos y substancias extracelulares.13

Otras tinciones

Una gran variedad de técnicas aplicadas a la his-tología puede realizarse en especímenes citológicos, aún la hematoxilina y eosina; en lo particular y a raíz del incremento en la incidencia de pacientes con SIDA, ha aumentado el número de tinciones como Grocott, Ziehl-Neelsen y ácido periódico de Schiff para resaltar microorganismos, con muy buenos resultados.

Proceso de decoloración

Este proceso se utiliza en laminillas teñidas ge-neralmente con Papanicolaou y que ameritan des-teñirse para ser sometidas a nuevas técnicas de co-loración.

En la tabla 2 se detallan los pasos.

INMUNOCITOQUÍMICA

La inmunocitoquímica (ICQ) es una técnica que permite la identificación sobre muestras citoló-gicas, de un antígeno específico con el fin de esta-blecer su histogénesis. En las últimas décadas se ha consolidado como una herramienta fundamental especialmente en el área de la citopatología neoplá-sica,14 y más recientemente se ha utilizado para esta-

blecer tratamiento, como en el caso de los receptores hormonales y Her-2/neu en glándula mamaria.

La ICQ requiere de una metodología diferente a la del procesamiento del tejido en patología qui-rúrgica y puede realizarse sobre diversos tipos de muestras citológicas como centrifugados, citología en base líquida, extendidos y bloques celulares, ofre-ciendo cada uno de ellos sus ventajas y desventajas.

Fijación

La fijación es un paso fundamental que se es-tablece según el anticuerpo a utilizar; una fijación adecuada evita hasta el 90% de los problemas de la técnica; por el contrario, si es incorrecta, la sensibi-lidad para la detección de diversos antígenos dismi-nuye notablemente.

Los fijadores más utilizados son la acetona y el alcohol al 95%; ambos no requieren de recupera-ción antigénica, recordando que existen anticuerpos (ej., proteína S-100, la GCDFP-15) que no funcio-nan bien con fijación en alcohol. En los marcadores linfoides y para melanoma el fijador ideal es la ace-tona, mientras que para los marcadores epiteliales el fijador óptimo es el alcohol 95%.

Centrifugados

Deberán contar por lo menos con cien células problema por laminilla para considerarse adecua-dos. Requieren laminillas silanizadas sin albúmina, ya que esta ocasiona fondo; posteriormente se dejan secar al aire durante treinta minutos a temperatu-ra ambiente para facilitar la adherencia del espéci-men y evitar la pérdida del material para los pasos siguientes.

Citología en base líquida

Entre las ventajas de utilizar base líquida se en-cuentran: a) mayor cantidad de células problema con menor número de muestras no satisfactorias; b) la fijación de las células es inmediata, por lo que no hay cambios secundarios a desecación que dificul-ten su estudio, disminuyendo además la pérdida de la antigenicidad; c) ausencia de elementos que difi-culten la lectura como moco, detritus celulares y eri-trocitos; y d) debido a la disposición de las células en

Tabla 2. Técnica de decoloración de laminillas.1 Inmersión en xilol para retirar

el cubreobjeto Tiempo necesario

2 Alcohol-Xilol 10 inmersiones3 Alcohol absoluto 10 inmersiones4 Alcohol absoluto 10 inmersiones5 Alcohol 95° 10 inmersiones6 Agua 1 minuto7 Alcohol acidulado (0.5%) Hasta aclarar

(3-5 minutos)8 Agua 1 minuto



una capa, hay mayor facilidad para la interpretación y conteo de células positivas.

Sin embargo, hay que resaltar que este espéci-men tiene algunas limitaciones por el hecho de estar fijado en metanol, fijador que puede causar pérdida de antígenos, tinción de fondo, así como tinciones inespecíficas. Por otra parte, con alguna frecuencia existen grupos tridimensionales que producen que el reactivo se deposite en la parte central del grupo, con la posibilidad de un diagnóstico falso positivo.

Bloques celulares (material de cóagulo incluido en parafina)

Los bloques celulares se procesan igual que una biopsia y, por lo tanto, los resultados son compara-bles.15

Extendidos previamente teñidos

Los extendidos teñidos con Papanicolaou o Diff-Quik pueden ser utilizados para la búsqueda de antígenos, recordando que el etanol puede destruir algunos epítopes y puede no ser útil para todos los anticuerpos. Es necesario hidratar y desteñir las la-minillas para el proceso.

Método pretratamiento

De igual forma que con tejido, el material pro-veniente de bloques celulares requiere recuperación antigénica inducida por calor. El resto de los especí-menes citológicos no necesitan este paso y muy po-cos anticuerpos, como ciertas queratinas, requieren pretratamiento con digestión proteolítica con tripsi-na, pepsina o proteinasa K.

Procedimiento de la inmunoperoxidasa

El bloqueo de la peroxidasa endógena es ne-cesario cuando se emplea peroxidasa (HRP) como marcador. Las muestras son sometidas a un bloqueo con solución de H

2O

2 al 3% en agua bidestilada o

metanol por aproximadamente veinte minutos.16

Procedimiento del complejo avidina-biotina

El método del complejo avidina-biotina (ABC) es el más utilizado; se basa en la gran afinidad que poseen entre sí las moléculas de biotina y avidina para poner de manifiesto una reacción antígeno-an-ticuerpo, aplicando un complejo de avidina y enzi-

Figura 4. (A) Método directo avidina-biotina: anticuerpo primario biotinilado (B), complejo avidina(A)-biotina(B)-peroxidasa (P)-cromógeno(C). (B) Método indirecto: el anticuerpo primario no se encuentra conjugado y es detectado por un anticuerpo secundario biotinilado. Basado en Taylor R. T., Cote R. J. Immunomicroscopy: A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist, 2. ed., Philadelphia: WB Saunders, 1994.



Figura 5. Metástasis de adenocarcinoma en líquido pleural. Inmunotinción de citoqueratina revelada con 3-3`-diaminobencidina (DAB) (400x)



ma biotinilada que contenga lugares de unión libres en la avidina, para que se produzca la fijación sobre la marcación con biotina del anticuerpo primario (técnica directa) o secundario (técnica indirecta) (Fig. 4); en ambos casos existe una alta proporción de enzima/anticuerpo marcados, aumentando la sensibilidad y permitiendo que el anticuerpo pri-mario pueda emplearse muy diluido.17

Visualización

El cromógeno más utilizado es la 3-3’-diamino-benzidina (DAB), que produce una tinción amarillen-ta (Fig. 5). El 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) produce un color rojo brillante, por lo que es muy útil en los casos donde la lesión problema contiene pigmentos (melanina, lipofuscina, hemosiderina) que dificultan la interpretación con DAB; el AEC es soluble en alco-hol, por lo que requiere un montaje acuoso.

No está de más señalar que la obtención de re-sultados confiables y reproducibles en ICQ necesita

protocolos estandarizados, pruebas validadas, uso de controles positivos y negativos y experiencia en la interpretación.18

BIOLOGÍA MOLECULAR

Entre las aplicaciones de las pruebas moleculares en citología se encuentra la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), técnica citogenética altamente sensible y específica utilizada para detectar la pre-sencia o ausencia de una secuencia determinada de DNA. Las principales aplicaciones son, entre otras, la detección de alteraciones numéricas y estructura-les, determinación del estado del gen Her-2/neu en cáncer de glándula mamaria, diagnóstico de carci-noma urotelial (UroVysion) (Fig. 6), y detección de cáncer pulmonar en lavados bronquiales. Para más detalles de las aplicaciones ver el capítulo 18.

Es trascendental la calidad de la muestra, ya que este es un factor que afecta la eficiencia de la prueba y la intensidad de la reacción. La densidad celular no debe

Figura 6. Adenocarcinoma de glándula mamaria en biopsia por aspiración con aguja fina, hibridación in situ con fluorescencia para Her2-Neu (1.000x).



ser muy alta y deberá distribuirse en forma homogénea en el portaobjetos, con lo cual la citología en base líqui-da proporciona una excelente opción. (Fig. 7)

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Con el advenimiento de la inmunohistoquímica y la biología molecular en el estudio de las enferme-dades neoplásicas, se ha iniciado una nueva época en el diagnóstico citopatológico que sin duda ha facilita-do el diagnóstico no solo en el campo de la patología quirúrgica, sino también de la citopatología. Dichas técnicas auxiliares han sido integradas al arsenal de herramientas diagnósticas en la práctica diaria. Con excepción de las glomerulopatías, algunas miopatías, enfermedades por atesoramiento y neoplasias malig-nas poco diferenciadas o primitivas, el uso del mi-croscopio electrónico poco a poco ha cedido terreno ante dichas técnicas hasta llegar a ser subutilizado.19 En el contexto de la citopatología, sin embargo, la uti-lización del microscopio electrónico puede ser una potente herramienta diagnóstica si aplicada en casos de difícil diagnóstico, sobre todo en aquellos casos en los que el uso de técnicas auxiliares como la inmuno-histoquímica no pueden ayudar a dilucidar la histo-

génesis de una neoplasia determinada, ya sea porque la neoplasia no es inmunoreactiva, el inmunofeno-tipo encontrado es confuso, o simplemente porque no se cuenta con material suficiente y adecuado para ser sujeto a estudio. Afortunadamente, la técnica de ultraestructura es lo suficientemente flexible como para ser adaptada a diferentes escenarios y en manos expertas es aplicada con facilidad a la citopatología. A continuación, se describen las técnicas disponibles para la recuperación de material citológico para es-tudio ultraestructural.

Material de biopsia por aspiración y líquidos corporales

El material de la biopsia por aspiración con aguja fina, o el botón obtenido de los líquidos cor-porales se coloca en un tubo de ensayo y se fija en glutaraldehido al 3%,20 para así iniciar el proceso técnico que se describe en las figuras 8 y 9.

Material recuperado de laminillas

Es posible recuperar pequeños grupos celulares de preparaciones citológicas.21 Se requiere marcar

Figura 7. Procedimiento de hibridación in situ con fluorescencia. * 4’,6-diamidino-2-phenylindole.



Figura 8. Técnica para el procesamiento de especimenes citológicos para ultraestructura.

Figura 9. Adenocarcinoma metastásico en líquido pleural. Los adenocarcinomas (sobre todo los de origen intestinal) frecuentemente exhiben desmosomas, luces intracitoplásmicas y microvellosidades. A diferencia de los mesoteliomas bien diferenciados, las microvellosidades del adenocarcinoma generalmente son cortas, rectas y delgadas. (6.300x)



el portaobjetos con lápiz diamante en la zona que contiene las células problema, retirarle el cubreob-jetos y colocarlo en una caja de Petri con solucio-nes graduadas de etanol, enjuagar y fijar en gluta-raldehido; posteriormente se sumerge en tetróxido de osmio por quince minutos. Se llena un molde de plástico con resina y la superficie libre del molde se coloca en el portaobjetos en la zona marcada. Una vez que la resina se polimeriza, la superficie inferior del portaobjetos es enfriada con hielo seco o nitró-geno líquido. La diferencia de temperatura hará que el molde de resina se despegue limpiamente trayén-dose consigo la muestra citológica.

Bloques celulares previamente procesados en parafina

Hay que extraer el tejido del bloque de parafina, desparafinarlo en xileno, re-hidratarlo en concentra-ciones decrecientes de etanol y colocarlo en solución de fosfatos para continuar el proceso de ultraestructura.22

CONCLUSIONES

El diagnóstico citológico, en muchos casos, con-diciona el manejo, tratamiento y aún el pronóstico del paciente. Este dato resalta la importancia de una técnica adecuada de citopreparación, elemento clave para disponer de material óptimo para la interpreta-ción microscópica. Por otra parte, si bien la mayoría de los casos pueden diagnosticarse con tinciones de rutina (Papanicolaou, hematoxilina-eosina, Diff-Quick), aproximadamente el 10%-15% requieren de inmunotinciones, biología molecular o microscopia electrónica para llegar al diagnóstico final.23,24

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Tabla 3. Procedimiento de inmunotinción ABC.1 Fijar las muestras, retirar la parafina, re-hidratarlas y terminar el proceso de pretratamiento necesario para cada anticuerpo.2 Lavar con PBS ph 7.4 en dos ocasiones de 5 minutos a temperatura ambiente.3 Quitar el exceso de PBS, marcar con un bolígrafo hidrófobo la zona del portaobjetos donde se localice la muestra, con el fin

de permitir que los reactivos se mantengan sobre la muestra durante todo el procedimiento.4 Aplicar la dilución del anticuerpo primario e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda y

proteger de la luz.5 Quitar el exceso de anticuerpo primario y lavar en PBS, dos inmersiones de 5 minutos. 6 Retirar el exceso de PBS y colocar el anticuerpo secundario biotinilado e incubar durante 30 minutos temperatura ambiente

en cámara húmeda.7 Eliminar el exceso de anticuerpo y lavar en PBS, dos inmersiones de 5 minutos. 8 Retirar el exceso de PBS y colocar el complejo estrepto-avidina/ peroxidasa e incubar durante 30 minutos a temperatura

ambiente.9 Tras la incubación, quitar el exceso y lavar en PBS, dos inmersiones de 5 minutos.10 Aplicar el cromógeno 1-5 minutos hasta que aparezca tinción (marrón café con DAB y rojo intenso con etil-carbamazol))11 Detener la tinción con agua.12 Contratinción (hematoxilina de Harris de 1-3 minutos).


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Técnicas de recolección de materiales y su procesamiento en el laboratorio de Citopatología