SPEKTROFOTOMETER UV-Visible

Spektrofotometer UV/Vis alat analisis sampel dengan

menggunakan prinsip-prinsip absorpsi radiasi gelombang

elektromagnetik oleh bahan untuk panjang gelombang sinar UV

sampai dengan sinar tampak.

Guna UV/Vis spektrofotometer

untuk menentukan kandungan zat organik/anorganik dalam

larutan.

Komponen-komponen spektrofotometer yang penting yaitu:

Sumber energi radiasi yang stabil

Monokromator (celah, lensa, cermin, dll.)

Wadah sampel transparan (cuvet)

Detektor radiasi yang dilengkapi recorder.

UV mini-1240 SHIMADZU

Hitachi dual-beam uv-vis spectrophotometer

Skema susunan UV/Vis spektrofotometer

Sb. radiasi Monokromator sampel detektor recorder

Sumber radiasi

Terdiri atas bahan yang dapat tereksitasi ke tingkat energi yang

tinggi melalui:

a. proses pemanasan dengan bantuan arus listrik

b. proses pelepasan elektron pada beda tegangan yang tinggi.

Ketika kembali ke tingkat energi yang lebih rendah, bahan akan

melepaskan sejumlah foton.

Sumber radiasi

Panjang gelombang yang dihasilkan beragam pada daerah pita

energi yang luas.

Intensitas radiasi yang dihasilkan harus sama dan tetap sehingga

tidak ada beda Po pada saat standarisasi dengan Po pada saat

pengukuran Penting untuk model single-beam.

Pada double-beam, setiap saat Po dan P selalu diukur dan

dibandingkan secara simultan sehingga kestabilan sumber radiasi tidak

terlalu penting.

Sumber radiasi UV:

Lampu hidrogen

Lampu deutorium

Radiasi yang dihasilkan mempunyai panjang gelombang 180-350 nm.

Tungsten lamp

Lampu xenon menghasilkan radiasi UV dengan intensitas

yang lebih tinggi tetapi tidak sestabil lampu hidrogen.

Lampu pijar tungsten panjang gelombang pada

daerah sinar tampak dan near infrared (panjang gelombang

350-2500 nm)

Monokromator

Fungsi :

untuk memecah radiasi polikromatis dengan pita energi yang

lebar yang dihasilkan sumber radiasi menjadi radiasi dengan

pita energi yang lebih sempit atau menjadi radiasi

monokromatis.

Keuntungan radiasi dengan lebar pita (band width) yang sempit

adalah:

•Batas daerah yang terabsorpsi sangat berdekatan sehingga

kecepatan hasil pengukuran absorbansi menjadi tinggi.

•Sensitivitas meningkat karena pengukuran dapat dilakukan

tepat pada absorpsi maksimum.

•Kecenderungan mengikuti hukum Beer lebih besar karena yang

terukur betul-betul hanya yang dapat terabsorpsi.

Monokromator mampu menghasilkan radiasi dengan lebar pita

efektif sebesar 35 - 0,1 nm.

Lebar pita efektif yaitu kisaran panjang gelombang dimana nilai

transmitansi minimal ½ dari nilai maksimalnya.

Komponen –komponen monokromator

Celah untuk masuknya radiasi polikromatis dari

sumber radiasi.

Lensa/cermin untuk menyerap cahaya

Pendispersi cahaya yang berupa prisma atau grating

yang dapat memecah radiasi menjadi komponen-

komponen panjang gelombang.

Lensa/cermin pemfokus cahaya

Celah keluar

Monochromator

Wadah sampel (cuvet)

Cuvet terbuat dari kuarsa atau silika untuk radiasi UV

dan gelas biasa atau kuarsa untuk radiasi sinar tampak.

Tebal cuvet bervariasi dari 1-10 cm.

Cuvet ditempatkan setelah monokromator supaya

kemungkinan terjadinya dekomposisi/fluorescence oleh

panjang gelombang berenergi tinggi yang masih ada di

dalam radiasi polikromatis dapat diminimalkan.

Posisi permukaan cuvet tegak lurus datangnya radiasi

sehingga kehilangan radiasi akibat pantulan/ refraksi dapat

dikurangi.

Detektor

Fungsinya adalah mengabsorpsi foton yang menumbuknya dan

mengubahnya menjadi kuantitas yang dapat diukur seperti arus listrik atau

perubahan suhu.

Sebagian besar detektor modern mengubah energi foton menjadi sinyal

listrik yang segera mengaktifkan meteran/recorder.

Syarat detektor:

Sensitivitas tinggi sehingga daya radiasi yang kecil dapat terdeteksi.

Waktu response yang singkat

Stabil.

Sinyal elektronik yang dihasilkan mudah diperkuat sehingga dapat

dipakai untuk mengoperasikan alat pembaca hasil pengukuran

Contoh: Photoelectric detector (Jumlah arus listrik yang dibangkitkan

berbanding lurus dengan daya radiasi foton yang terabsorpsi)

Operasi single-beam dan double-beam

Single-beam

Radiasi dari monokromator yang masuk didispersikan oleh prisma/

grating. Ketika alat pendispersi dirotasikan, berbagai pita radiasi yang

telah terpecah difokuskan pada celah keluar. Radiasi dilewatkan

sampel dan diterima detektor.

Double-beam

Sinar dari monokromator diarahkan ke sel blangko dan sel

sampel dengan bantuan beam splitter (chopper). Kedua sinar

dibandingkan terus menerus/ bergantian secara berulang-

ulang.

Fluktuasi pada intensitas sumber cahaya respon detektor

dan hasil penguat sinyal dikompensasi dengan mengamati

perbandingan sinyal antara blangko dengan sampel.

Double beam spectrophotometer

Pengukuran konsentrasi

Pengukuran konsentrasi zat dalam sampel dengan UV/Vis dapat

dilakukan untuk:

Single komponen mengandung satu zat terlarut dan

pelarutnya.

Multi komponen mengandung lebih dari 1 zat terlarut

dengan satu pelarut.

Sistem single komponen

Tahap penentuan konsentrasi meliputi

1. Penentuan max (panjang gelombang yang terserap paling

banyak oleh sampel)

2. Penyiapan larutan standar dan sampel

3. Pembuatan kurva standar (kurva kalibrasi)

4. Pengukuran absorbansi sampel.

Penentuan max

Zat tertentu max tertentu

Benzen : max = 254 nm

Data max untuk beberapa zat tersedia di literatur.

Bila tidak ada data max, maka harus dilakukan scanning

terhadap sampel yang akan ditentukan konsentrasinya.

Kurva standar

Untuk mengetahui hubungan konsentrasi dengan absorbansi

pada max.

A

max

Untuk membuat kurva standard perlu larutan standar

(larutan yang konsentrasinya diketahui dengan pasti).

Dibuat larutan dengan konsentrasi nol (blangko) sampai

konsentrasi tertentu.

Pelarut harus dapat melarutkan sampel dengan sempurna

dan dapat menghantarkan gelombang dengan daerah panjang

gelombang yang dipakai pada analisis.

Contoh: pelarut air (200 nm)

pelarut metanol (215 nm)

pelarut etanol 95 % (205 nm)

Absorbansi untuk tiap konsentrasi diukur pada max.

Bila larutan memenuhi hukum Beer maka kurva standar akan

berupa garis lurus.

A

Konsentrasi,ppm

Penyiapan larutan sampel

Komponen-komponen yang akan ditentukan konsentrasinya pada

daerah UV/Vis sering menunjukkan nilai absorptivitas molar yang

tinggi pada absorbansi max.

Konsentrasi tinggi % transmitansi rendah

Keakuratan hasil pengukuran yang terbaik diperoleh pada % transmitansi 36,8 %.

Hasil pengukuran dengan tingkat keakuratan yang masih dapat diterima yaitu pada % transmitansi 15 % - 65 %.

Pada % transmitansi < 15 % maka ketidakpastian hasil pengukuran sangat tinggi. Oleh karena itu sampel harus diencerkan sampai memberikan % transmitansi pada kisaran yang diinginkan.

Pelarut yang dipakai harus sama dengan yang dipakai pada pembuatan kurva standar.

Pengukuran absorbansi larutan sampel dan larutan standar harus dengan cara dan alat yang sama.

Berdasarkan absorbansi sampel konsentrasi sampel dibaca pada kurva standar.

Contoh analisis kadar amonia dalam sampel dengan UV Vis

Cara analisis

a. Siapkan 7 buah labu takar 50 mL yang sudah dibersihkan.

b. Ambil dengan teliti menggunakan pipet volume larutan standar ammonia

10 mg/L NH3-N dengan volume berturut turut 0 mL, 1 mL, 2 mL, 5 mL, dan

10 mL kemudian masukkan ke dalam labu takar 50 mL.

c. Ambil dengan teliti secara duplo (dua kali) menggunakan pipet volume

sampel yang akan diuji sebanyak 5 mL dan masukkan ke dalam masing-

masing dua buah labu takar 50 mL.

d. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL

pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan.

e. Tambahkan larutan zinc sulfate (ZnSO4) sebanyak 0,5 mL

menggunakan pipet mikro, lalu homogenkan.

f. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL

pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan.

g. Tambahkan 5 mL reagen nessler B menggunakan pipet volume ke dalam

masing-masing larutan standar, blanko, dan sampel.

h. Tambahkan sedikit aquades menggunakan botol semprot kira-kira 10 mL

pada masing-masing labu takar, kemudian homogenkan pelan-pelan.

i. Tambahkan 2 tetes larutan rochelle salt, kemudian homogenkan.

j. Tambahkan 1 mL reagen nessler A menggunakan pipet mikro ke dalam

masing-masing larutan standar, blanko, dan sampel. Encerkan dengan

aquades sampai 50 mL (tanda garis).

k. Gojog larutan hingga homogen, dan diamkan ± 30 menit. Gojog lagi agar

tetap homogen.

l. Ukur nilai absorbansi masing-masing larutan dengan alat spektrofotometer

UV-Vis pada panjang gelombang 430 nm. Lakukan kalibrasi zero dengan

larutan blanko yang dibuat.

m. Catat hasil pengukuran dalam lembar kerja dan lakukan perhitungan

kadar amonia dalam sampel.

Sistem multi komponen

Pada sistem multi komponen, lebih dari 1 komponen terlarut yang mengabsorpsi radiasi.

Tiap komponen dianggap tidak saling mempengaruhi absorbansi satu sama lain dan absorbansinya bersifat aditif.

Pada absorbansi maksimum komponen I, 1, komponen II juga punya absorbansi dalam jumlah yang berarti. Pada absorbansi maksimum komponen II, 2, komponen I juga menyerap radiasi.

Spektrum absorpsi untuk campuran I dan II merupakan jumlah dari masing-masing kurva individual.

I I

II

I + II

1 2

A

A

1 2Panjang gelombang

Dengan demikian dapat disusun persamaan berikut:

IIIIIIIII bcAdanbcAPada 1111:1

IIIIIIIII bcbcAAA 11111

IIIIIIIII bcAdanbcAPada 2222:2

IIIIIIIII bcbcAAA 22222

(1)

(2)

Dengan:

21 AdanA

21

II AdanA

21

IIII AdanA

III cdanc

2121 ,,,

IIIIII

: Absorbansi campuran yang teramati berturut-turut pada λ1 dan λ2.

: Absorbansi komponen I dalam campuran pada λ1 dan λ2.

: absorbansi komponen II dalam campuran pada λ1 dan λ2.

:Molar absorbtivity komponen I dan II pada λ1 dan λ2.

: konsentrasi komponen I dan II dalam campuran

Absorptivitas molar tiap komponen ditentukan secara terpisah dengan melakukan pengamatan terhadap spektrum absorpsi dari larutan yang telah diketahui konsentrasinya. Jadi nilai cI dan cII dapat dihitung dari persamaan (1) dan (2) berdasarkan data pengukuran A campuran pada λ1 dan λ2.

Secara umum bila ada n komponen dalam campuran, absorbansi total pada panjang gelombang λ memenuhi persamaan:

n

n

n

n

n cbAA

Pada prinsipnya pengukuran n absorbansi pada n panjang gelombang yang berbeda diperlukan untuk menentukan konsentrasi n komponen di dalam campuran maka ada n persamaan simultan dengan n besaran yang tidak diketahui.

Bila mungkin, pilih panjang gelombang sehingga hanya 1 komponen yang dapat menyerap panjang gelombang itu.

Pilih panjang gelombang yang memberikan nilai absortivitas komponen-komponen dalam campuran yang jauh berbeda satu sama lain.

Masalah yang sering timbul pada pengukuran

•Nilai absorbansi terukur negatif cuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda selalu menggunakan cuvet yang sama untuk semua pengukuran.

•Nilai absorbansi terukur > nilai sebenarnya

ocuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda

odinding cuvet tidak bersih (tersentuh jari pemakai)

ocuvet baru saja dipakai mengukur konsentrasi larutan yang lebih pekat.

Oleh karena itu maka:

•1 cuvet untuk semua pengukuran

•dinding cuvet yang dilewati sinar jangan disentuh dengan jari

•setiap selesai mengukur absorbansi suatu larutan, cuvet dicuci dengan pelarut yang dipakai untuk membuat sampel sampai benar-

benar bersih

•Nilai absorbansi terukur < nilai sebenarnya sama dengan atas.

•Titik nol yang tidak stabil -sumber radiasi tidak stabil -adanya noise pada alat penguat sinyal

cek titik nol setiap kali pengukuran

PR

Analisis nitrat dalam air dilakukan dengan metode Brucine dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis. Mula-mula dibuat dulu kurva standard dengan cara

membuat larutan standard nitrat dengan berbagai konsentrasi yaitu dengan cara

mengambil larutan yang mengandung nitrat 10 ppm yaitu berturut-turut 0,5; 1; 2,5;

5, dan 10 mL ditambah dengan aquades, brucine dan asam sulfat pekat dengan

volume tertentu. Campuran didiamkan selama waktu tertentu dalam ruang gelap

selanjutnya ditambah aquades, dibiarkan lagi selama waktu tertentu dan terakhir

diencerkan sampai 50 mL (disebut dengan standard 1, 2, 3, 4 dan 5). Masing-

masing larutan standard diukur absorbansinya pada panjang gelombang 410 nm

dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sampel air sejumlah 5 mL

diperlakukan sama dengan larutan standard. Pembacaan absorbansi dengan UV-Vis

dapat dilihat pada tabel berikut:

Absorbansi

Blangko

Standard 1

Standard 2

Standard 3

Standard 4

Standard 5

Sampel

0,0

0,01

0,03

0,13

0,28

0,52

0,46

Buatlah kurva standardnya! Berapa konsentrasi nitrat dalam sampel air?