Memoria de Prácticas - USC

MMeemmoorriiaa ddee

PPrrááccttiiccaass

11ºº ccuurrssoo GGrraaoo ddee BBiioollooxxííaa UUSSCC

Curso 2009-2010 Coordinadores: Óscar J. Cordero, Ana Viñas, Jaime Gómez-Márquez Autores: Emilia Rebolledo, Rosa Ana Sueiro, Francisco de la Torre, María Teresa Herrera, Javier Sampedro, Fátima Adrio, Francisco Salgado, Jesús Aboal, Carmen Leirós, Carmen Bermejo

1. MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, E BENESTAR ANIMAL……......................... 1

2. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E

MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS......................... 19

3. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E

ESPECTROFOTOMETRÍA......................... 39

4. TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA .......................................... 47

5. TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E

ELECTROFORESE . ………………............ 57

6. MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA ......................................... 69

7. MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE

MOSTRAXE................................................. 73

8. CONTIDOS DE BIBLIOTECA ................... 117

ÍÍNNDDIICCEE DDEE CCOONNTTIIDDOOSS

1. MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS, E BENESTAR ANIMAL

(código calendario de prácticas: FA)

MANEXO DE REATIVOS, APARELLOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIÓNS,…

INSTRUMENTOS BÁSICOS DE MEDIDA

BALANZAS DE LABORATORIO E PIPETAS

1. Obxectivo

1.1 Consideracións prácticas e manexo dunha balanza de precisión de calibración externa.

1.2 Consideracións prácticas e manexo de pipetas. Pipetas automáticas, fixas e variables.

Pipetas repetitivas.

2. Introdución

A fisioloxía e outras ramas da bioloxía son ciencias cuantitativas que requiren dun sistema de

medición estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medición precisa.

2.1 Balanzas de laboratorio

Un dos instrumentos de medida máis usados no laboratorio é a balanza, utilizada para medir

cantidades pequenas de masa.

A masa, propiedade característica dos corpos, é a cantidade de materia dunha sustancia

ou material. Concepto diferente ao de peso: forza da atracción gravitatoria que a Terra exerce sobre a

materia.

A balanza compara a masa descoñecida dunha sustancia coa masa dun patrón ou patróns de

referencia (internos ou externos), sometidas ambas á mesma aceleración debida á gravidade. Ao

proceso de comparar masas denomínase pesada.

O trazo que define ás balanzas de laboratorio é o da precisión xunto ao de alta resolución. Unha

vez calibradas, teñen tamén un alto grao de exactitude.

3


Exactitude: grao de concordancia entre o valor real e o valor medido.

Precisión: capacidade de dar o mesmo resultado en medicións diferentes realizadas nas mesmas

condicións. Grao de concordancia ou repetitividade dun resultado.

Unha balanza será precisa cando diferentes medidas dunha mesma magnitude sexan moi

parecidas. Unha medida común da variabilidade é a desviación estándar das medicións.

Resolución: incremento de peso máis pequeno que permite diferenciar unha medida doutra. Lexibilidade: división máis pequena na pantalla da balanza.

2.1.1 Tipos de balanzas

As balanzas de laboratorio varían na súa capacidade máxima de carga e na súa legibilidade, e

clasifícanse como:

1. Microbalanzas: capacidade de 0,5-3 g; lexibilidade de 0,001 mg

2. Balanzas semimicro: capacidade 30-150 g, según a casa comercial, e lexibilidade de 0,01 mg

3. Balanzas analíticas: 60 -250 g e lexibilidade de 0,1 mg

4. Balanzas de precisión: capacidade de carga de 80 - 600 g; lexibilidade 0,001g- 0,1 g

Microbalanza Balanza analítica Balanzas de precisión

Algunhas balanzas, do tipo 2-4, teñen capacidade e lexibilidade dual: poden aumentar a súa

capacidade diminuíndo a súa legibilidade ou diminuír a súa capacidade e aumentar a súa lexibilidade.

4


2.1.2 Consideracións prácticas en medidas de masa

1. Localización da balanza

a) Nunha sala cunha entrada, o mínimo número de fiestras. Evitar a luz directa do sol e correntes de

aire. Evitar choques e vibracións.

Se as balanzas están situadas en lugares con alto grao de vibración, recoméndase colocalas

sobre mesas antivibraciones (fabricadas en granito masivo, a amortiguación por aire evita todo tipo de

oscilacións e vibracións dunha forma efectiva).

b) Manter a temperatura da sala constante. Humidade entre 45 - 60%.

c) Realizar as medidas lonxe de fontes de calor e de aparellos que utilicen ventiladores.

2. Cuidados básicos

a) Comprobar que a cámara de medida e o prato estean limpos.

b) Verificar sempre a nivelación da balanza.

c) Conectar e esperar tempo de arrequecemento. Se se deixa no modo “stand by” evítase posteriores

esperas.

d) Usar sempre un pesasustancias ou frasco da menor medida posible, limpos e secos.

e) Non usar frascos de plástico cando a humidade estea por baixo do 30 - 40%.

f) A temperatura do frasco e o seu contido deben de estar á mesma temperatura do ambiente da cámara

de medida. As diferenzas de temperatura causan correntes de aire.

g) Evitar o contacto directo dos dedos ao pór ou sacar os pesasustancias ou frascos da cámara de

medida.

h) Pór o pesasustancias ou frasco no centro do prato de medida.

i) Verificar se o mostrador indica cero ao empezar a operación. Tarar a balanza se fose necesario.

j) Calibrar a balanza regularmente se os patróns de referencia son externos. As balanzas analíticas de

precisión que utilizan patróns internos poden calibrarse automaticamente.

Exercicio 1. Nivelación, calibración e precisión dunha balanza Denver Maxx.

Preparación de 100 mL de NaCl 1 M.

5


2.2 Pipetas

No laboratorio, a medición precisa do volume é tan importante como a medición precisa da

masa. A medición fiable do volume realízase cunha pipeta, unha bureta ou un matraz aforado.

As pipetas permiten a transferencia de volumes medidos exactamente dun recipiente a outro.

2.2.1 Tipos de pipetas de uso común no laboratorio

1. Aforadas: transfiren un só volume fixo, hainas desde 0.5 a 200 mL.

2. Graduadas: transferencia de 0.1 a 50 mL.

Ambas se enchen ata a marca de calibración. A superficie alta dun líquido contido nun tubo

estreito presenta unha marcada curvatura ou menisco. É unha práctica común usar a parte inferior do

menisco dos líquidos acuosos como o punto de referencia na calibración e emprego das pipetas.

O enchido das pipetas nunca se debe de facer aspirando coa boca. Existen accesorios auxiliares

para macropipeteado que facilitan a operación de carga e descarga.

Aspiradores de seguridade Dentalab Pipeta graduada Pipeta aforada

Aspirador Macro de Brand

A transferencia realízase apoiando a pipeta no bordo do recipiente recibidor e nunca se sopra o

líquido residual.

6


Exercicio 2. Manexo de aspiradores de seguridade de pipetas da casa Dentalab.

1. Aspiración: Vire a roda cara arriba e aspire, sen producir burbullas, ata situarse un pouco por

encima da marca de calibración. Desprace lentamente a roda en sentido contrario para o axuste da

pipeta. Preste atención ao menisco.

2. Baleirado: Presionar a panca unha vez que a pipeta estea dentro do tubo ou recipiente

recibidor.

3. Pipetas automáticas: micropipetas e macropipetas

a) Micropipetas: transferencia de volumes de microlitros de líquido.

- Monocanal de volume fixo: único volume de transferencia, existen distintas pipetas que

cobren o intervalo entre 1 mL e 1000 mL.

- Monocanal de volume variable: elección do volume de transferencia mediante

desprazamento dun micrómetro de axuste localizado na parte dianteira ou superior do

dispositivo. Posúen un indicador do volume seleccionado.

Cun número reducido de aparellos cóbrese o intervalo entre 0,1 mL e 1000 mL.

- Multicanal: igual que a anterior pero dispensando 4, 8 ó 12 veces simultaneamente o

mesmo volume. Intervalo entre 0,5-300 mL.

MicrómetroIndicador de volume

Monocanal fixa e variable Multicanal e variable

b) Macropipetas: transferencia de volumes de mililitros de líquido.

- Monocanal de volume variable: ata 2, ata 5 ou ata 10 mL.

7


O uso adecuado das pipetas automáticas está asociado á elección da punta de pipeta

correspondente.

N: 0,1 – 20 μL A: 0,5 – 20 μL B: 2 – 200 μL C: 5 – 300 μL D: 50 – 1000 μL E: 0,5 – 5 mL * As máis comúns son a B e a D, puntas

amarelas e azuis respectivamente.

Exercicio 3. Manexo de carga e descarga de pipetas automáticas.

1. Elixa unha pipeta de volume variable das dispoñibles no laboratorio.

2. Seleccione o volume desexado virando con coidado o micrómetro. Nunca supere a

capacidade máxima da pipeta.

3. Insira a punta desechable adecuada á pipeta elixida.

4. Oprima o botón pulsador situado na parte superior da pipeta ata un primeiro tope. Esta

operación despraza un volume de aire coñecido na punta desechable.

5. Insira a punta desechable dentro do líquido, auga destilada no noso caso, e libere a presión

sobre o botón pulsador. Este feito aspira o líquido pola punta.

6. Coloque a punta sobre a parede do recipiente recibidor e oprima o botón pulsador ata o

primeiro tope. Logo dun segundo, oprima o botón ata un segundo tope para baleirar completamente a

punta.

7. Expulsar a punta desechable.

8. Practique ata conseguir o dominio da pipeta.

9. Cando estea seguro pase ao exercicio seguinte.

8


Exercicio 4. Comprobación do pipeteo por medida gravimétrica (balanza Denver Maxx).

1. Utilice unha pipeta de 1 mL fixa ou variable.

2. Utilizar como líquido de transferencia auga destilada.

3. Situar un vaso de precipitados de 25 mL sobre a balanza e axustala a cero.

4. Pipetear no vaso un mililitro.

5. Anote a súa masa.

6. Volva a tarar a balanza e engada 1 mL máis.

7. Anote a súa masa.

8. Repita a operación ata completar 5 mostras.

9. Cambie a pipeta cun compañeiro e inicie o proceso desde o punto 3- 8.

O uso de pipetas automáticas esixe unha comprobación regular da exactitude e precisión das

mesmas.

Exactitude: indicada por E = diferenza entre o valor medio e o valor nominal referida ao valor nominal

en %.

O control da exactitude realízase mediante control gravimétrico e aplicando un factor de

corrección Z.

Z = 1,0032 μL/mg se o control realízase a unha temperatura de 21,5 ºC a unha presión

atmosférica de 1013 mbar e con auga destilada.

Precisión: indicada polo coeficiente de variación e definido este como a desviación estandard en %,

referida ao valor medio.

Exercicio 5. Simulación do control da exactitude da pipeta automática de 1 mL, utilizando os

datos obtidos no exercicio 4.

9


4. Pipetas automáticas repetitivas

No laboratorio disponse tamén de pipetas automáticas repetitivas para a dosificación en serie ou

para situacións que requiren transferencia repetida dun volume particular.

Permite dosificar repetitivamente un volume

determinado cunha soa carga.

O número de repeticións depende do volume

seleccionado no mando deslizante de axuste e do

combitip correspondiente (ver táboa 1).

Mando selector de volume Palanca de dosificación

Palanca de bloqueo e de llenado combinados

Táboa 1

Exercicio 6: Manexo dunha pipeta repetitiva.

10


INSTRUMENTO BÁSICO DE MEDIDA

PEACHÍMETRO O PHMETRO 1. Obxetivo

1.1 Consideracións prácticas, calibración e manexo dun pHmetro. 2. Introdución

O pHmetro, portátil ou de sobremesa, é un instrumento utilizado nos laboratorios químicos e

biolóxicos para medir o pH das disolucións. O pH determina moitas da características notables da

estrutura e actividade das biomacromoléculas e, xa que logo, o comportamento de células e organismos.

O pHmetro utilízase tamén para determinar o pH de augas, chans, bebidas e alimentos. Os

instrumentos portátiles facilitan a medida en campo.

Ao pHmetro, que mide a diferenza de potencial existente entre dous electrodos, conéctase un

electrodo combinado de pH: un electrodo de vidro (indicador) e un electrodo de referencia montados

ambos nun só corpo. Constitúese así o sistema necesario para a medida de pH, que debe ser sempre

precedida dunha calibración do equipo con disolucións tampón de pH coñecido.

Se o pHmetro ha de ser informado da temperatura da mostra conéctase tamén un sensor de

temperatura, a non ser que o electrodo dispoña do mesmo. A medida do pH vese afectada pola

temperatura.

Electrodo combinado de pH

No debuxo móstranse os compoñentes e localización das partes esenciais dun electrodo

combinado de pH, co electrodo indicador no centro e o de referencia no exterior.

11


Tipos de elementos de referencia

Conector

Cable

Cabezal De penetración

Para emulsións

Orificio de relleno

De superficie

Tipos de electrodos Para micromuestras

Electrolito interno: HCl 0,1M saturado con AgCl.

Membrana de vidrio: sensible a H3O+

Elemento de referencia: cristales de AgCl encapsulados e con barrera a iones Ag+

Electrolito de referencia: (KCl 3M) ponte salino entre o electrodo e o exterior. Impide que os compoñentes da disolución obxeto de medida mistúrense cos do electrodo de referencia.

Diafragma: punto de unión entre electrolito e mostra. De cerámica porosa, que permite un pequeno fluxo de electrolito cara ao exterior estableciendose o circuíto eléctrico para medición.

Electrodo con sensor de temperatura.

12


3. Consideracións prácticas

1. Se o electrodo de pH é rellenable, verificar o nivel de electrolito de referencia. Este debe

chegar cerca do orificio de enchido, asegurando un bo fluxo de electrolito a través do

diafragma.

2. Verificar a ausencia de burbullas de aire na zona da membrana, se se observa algunha

sacudir o electrodo cuidadosamente.

3. Limpar o electrodo con auga destilada. Non secar cun pano, utilizar un papel sen pelusa,

aplicándoo suavemente para evitar cargas electrostáticas, e retirar o exceso de auga.

4. Se as medicións realízanse a temperatura ambiente mergullar o electrodo ata cubrir como

mínimo o diafragma.

5. Se as medicións realízanse a temperatura distinta da ambiente mergullar o electrodo ata

cubrir o sensor de temperatura e o elemento de referencia.

4. Calibración

1. Recoméndase unha calibración diaria antes de proceder ás medicións. Se se realizan moitas é

aconsellable repetir a calibración cada 2 ó 3 horas, para compensar a posible deriva do

electrodo (potencial de asimetría) ou unha perda de sensibilidade do mesmo (pendente).

2. Co pHmetro conectado, e o electrodo mergullado en disolución tampón de pH coñecido

(7.02 xeralmente), esperar o tempo indicado nas instrucións do aparello antes de proceder á

calibración.

3. Calibrar sempre con disolucións tampón frescas. Estas altéranse co paso do tempo, coa calor,

a luz e, especialmente, coa contaminación.

13


4. Non devolver ao frasco do tampón a disolución utilizada. Utilizar frascos pequenos para a

calibración.

5. Entre medidas, lavar con auga destilada e utilizar un papel sen pelusa para retirar o exceso de

auga.

6. É recomendable para a calibración, así como para as medicións, utilizar axitación. Un imán e

un axitador magnético proporcionan rapidez e repetibilidade nas lecturas.

Tipos de calibración 1. Nun punto, cando se miden valores de pH próximos ao valor do tampón utilizado.

2. En dous puntos, a habitual. Recoméndase como primeiro tampón o de pH 7 e como segundo

tampón pode utilizarse o de pH 4 ó 9 dependendo de se se traballa na zona aceda ou alcalina.

Corríxese o potencial de asimetría e a perda de sensibilidade do electrodo.

3. En tres puntos: se se mide en toda a escala de pH. Primeiro punto o tampón de pH 7, segundo e

terceiro punto dous dos valores restantes (2, 4.01, 9.21, 10.9 a 25ºC). Compénsase o potencial

de asimetría e sensibilidade tanto na zona aceda como na alcalina.

Exercicio 1. Calibración en dous puntos dos equipos, marca CRISON, dispoñibles no laboratorio,

e seguindo o manual de instrucións do equipo correspondente.

DISOLUCIÓNS E CONCENTRACIÓNS

DISOLUCIÓNS STOCK, DISOLUCIÓNS DE TRABALLO, DISOLUCIÓNS TAMPÓN

1. Obxetivo

1.1 Consideracións prácticas e preparación de disolucións usadas na experimentación.

1.2 Preparación dunha disolución tampón e medida do pH.

14


2. Introdución

A experimentación biolóxica utiliza técnicas de laboratorio que poden ser de observación,

analíticas e /ou bioensaio. O bioensaio pode realizarse in vivo, utilizando organismos intactos, ou in

vitro, utilizando órganos, tecidos ou suspensións de células illadas.

O bioensaio é unha técnica moi utilizada en Fisioloxía Animal. Os estudos requiren

habitualmente o uso de disolucións cunha concentración iónica e osmolaridade que manteñan a

integridade e funcionalidade celular, e nos in vitro, ademais, que a disolución estea tamponada. É dicir,

que conteña un sistema tampón ou buffer para amortecer as variacións de pH que puidesen producirse

ao longo dun traballo experimental, do mesmo xeito que fai o plasma.

3. Disolucións e concentracións

No laboratorio a concentración das disolucións exprésase de dúas formas: concentración molar

ou concentración porcentual.

Concentración molar, é o nº de moles dunha especie contida nun litro (1L) de disolución.

Unidade de concentración molar = molaridade (M), dimensións mol.L-1 ou mmoles.mL-1 de disolución.

1 mmol = 10-3 mol.

Concentración porcentual (partes por cen): tres formas de expresala;

a) tanto por cento en peso (p/p): peso do soluto . peso da disolución -1. 100

b) tanto por cento en volume (v/v): volume do soluto . volume de disolución-1. 100

c) tanto por cento en peso/volume: peso do soluto (g) . volume da disolución (mL)-1.100

Exercicio 1. - Preparar 100 mL de NaCl 154 mM.

- Preparar unha disolución de NaCl 0.9% (p/v).

¿Qué observación destacaría?.............................................................................

4. Disolucións nai e disolucións de traballo

No laboratorio, é habitual preparar as disolucións de traballo a partir de disolucións

concentradas, ás que se lles chama disolucións nai ou disolucións stock.

As disolucións stock, ademais de proporcionar rapidez, diminúen os posibles erros que se

producirían durante continuas pesadas dos compoñentes das disolucións de traballo.

15


Para preparar disolucións diluídas a partir das concentradas utilízase a seguinte ecuación, a cal

baséase en que o nº de moles de soluto da disolución diluída é igual ao de moles no reactivo

concentrado.

Vconcentrada . Moles/L concentrada = Vdiluida . Moles/Ldiluida, , é dicir:

V1.C1 = V2.C2

Volume en litros e concentración molar en moles/L.

Ou volume en mL e concentración molar en mmoles/mL.

Exercicio 2. Tomando como disolución stock a de NaCl 1 M, calcular o volume que habería

que tomar para preparar 10 mL de NaCl 150 mM.

5. Disolucións tampón

Sistemas tampón ou buffers son aquelas disolucións cuxa [H+] apenas varía ao engadir ácidos ou

bases fortes. Adoitan ser mesturas binarias dun ácido débil e un sal do mesmo ácido con base forte, ou

ben unha base débil e o sal desa base cun ácido forte.

A eficacia amortiguadora do sistema depende da proporción relativa das formas disociada e sen

disociar, sendo máxima cando o cociente sal /ácido é próximo á unidade. Esta proporción está

relacionada co pH pola ecuación de Henderson-Hasselbach.

pH = pK + log sal / ácido

O Tris-HCl é un tampón para medios biolóxicos de uso habitual no laboratorio. Está composto da

base Tris-aminometano (Tris), e o seu sal cloruro de Tris. Con todo, non se adoita comprar o sal, senón

só a base, que se disolve e leva ao pH requirido engadindo HCl. A cantidade de HCl non se adoita

medir con precisión, senón que é a necesaria para levar a solución ao pH desexado.

Exercicio 3. Preparar 100 mL de Tris-HCl 0.1M a pH = 8, medindo no pHmetro a temperatura

ambiente.

16


6. Disolución isotónica

Unha disolución na que se poden introducir as células sen que se vexa alterado o seu volume

celular denomínase isotónica. Son disolucións isotónicas (moleculares, electrolíticas ou mixtas) as que

teñen a mesma osmolaridade que o plasma.

Osmolaridade /L = M . M = concentración molar do soluto.

= nº de partículas en que se disocia o soluto cando está en disolución.

Osmolaridade/L dunha disolución constituida por un conxunto de solutos = suma de osmolaridades parciais.

Osmolaridade

O movemento pasivo de auga a través dunha membrana semipermeable, e a favor da súa gradiente de concentración, denomínase ósmosis. O grao de presión necesario para interromper completamente a ósmosis recibe o nome de presión osmótica.

A presión osmótica é proporcional ao número de partículas disoltas / unidade de volume líquido. A concentración das disolucións osmóticas en base ao nº de partículas, exprésase en osmoles. Un osmol é a cantidade de soluto non disociado cuxa presión osmótica corresponde a un mol.

Cando os non electrolitos disólvense nun litro de auga, as moléculas individuais entran en solución separadamente, e cada unha constitúe unha partícula disolta. Como un mol de soluto ten o mesmo número de moléculas (nº de Avogadro), unha disolución de glicosa 0.1M ten o mesmo nº de partículas que unha disolución de urea 0.1M. E ambas a mesma presión osmótica = 0.1 osmoles.

Cando os electrolitos disólvense nun litro de auga, as moléculas individuais se disocian en dúas ou máis iones, cada un dos cales constitúe unha partícula disolta. Así 0.1 mol de NaCl, que se disocia en Cl- e Na+ , dá lugar a dúas partículas e, polo tanto, exerce unha presión osmótica = 0.2 osmoles.

Unha disolución que contén 1 osmol de soluto disolto por litro de auga dise que ten unha osmolaridade de 1 osmol/L.

Exercicio 4. Se a osmolaridade plasmática é de 0.3 Osmoles/L, ¿unha disolución de NaCl 0.15M é

isotónica? ¿E unha de Na2PO4 1M?

17


18

2. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

(código calendario de prácticas: MICRO)

TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN E MEDIOS DE CULTIVO E CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

PRÁCTICA 1. Preparación de medios de cultivo e solucións. Esterilización

Esterilización

A esterilización é a eliminación de todos os organismos presentes nun material, incluídas as esporas e

outros axentes infecciosos. A metodoloxía utilizada depende da natureza do material que se vai a

esterilizar. Os principais métodos para destruír ou eliminar microorganismos son os seguintes:

1. Calor húmido. Esterilización por vapor

É o método máis común, eficaz e cómodo de esterilización. O vapor de auga a elevadas temperaturas

mata os microorganismos porque degrada os ácidos nucleicos e desnaturaliza as proteínas. O tempo e a

temperatura necesarios para a esterilización dos medios de cultivo e do material dependen dos

microorganismos que se pretenden destruír, da composición química dos medios, da cantidade de

material e do volume de medio que se esteriliza.

A esterilización por vapor realízase nun autoclave, aparello similar a unha pota a presión na que o aire

presente inicialmente na cámara expúlsase quedando completamente chea de vapor de auga. A presión

de vapor interna ascende ata que se alcanzan 121º C de temperatura e 1,1 Kg/cm2 de presión. Nestas

condicións todas as formas vexetativas e endosporas destrúense en 10-12 minutos, aínda que o tempo

estándar de esterilización é de 15 minutos. Polo xeral, o autoclave emprégase para esterilizar medios de

cultivo e solucións acuosas non termolábiles, material de vidro, plástico e metal.

2. Calor seco

É menos efectivo que a calor húmida, necesitándose temperaturas máis altas e tempos máis longos que

coa calor húmida para matar aos microorganismos. A morte celular prodúcese debido á oxidación dos

compoñentes celulares e a desnaturalización de proteínas. Este tipo de esterilización realízase en fornos

especiais de esterilización e require un tempo de exposición longo do material (por exemplo, 2 horas a

160º C ou 1 hora a 180º C). Utilízase principalmente para a esterilización de material de vidro (placas

de Petri non esgotábeis, pipetas, etc.) e metal, e nalgúns casos para esterilizar produtos en po, aceites e

materiais similares.

Unha alternativa de esterilización con calor seca é a incineración, que se utiliza para a destrución de

material hospitalario contaminado, animais de experimentación, etc. No laboratorio, a incineración

emprégase para a esterilización das asas de sementa metálicas antes e logo de polas en contacto cos

cultivos.

21


3. Filtración

È o método alternativo á esterilización por calor cando se esterilizan líquidos termosensibles ou gases.

A filtración non destrúe os microorganismos, senón que os elimina mecanicamente, combinando un

proceso de retención e absorción. A técnica consiste en facer pasar o líquido ou gas a través dun

material poroso, o filtro, cun tamaño de poro demasiado pequeno para que pasen os microorganismos,

pero suficientemente grandes para permitir o paso do líquido. Estes filtros reteñen as bacterias, pero

deixan pasar os virus.

Os filtros que se utilizan normalmente na “esterilización” de líquidos son o filtro de membrana de

acetato de celulosa ou nitrato de celulosa cun tamaño de poro de 0,45 e 0,22 μm. Estes últimos son os

que garanten a eliminación das bacterias, xa que as bacterias máis pequenas coñecidas miden ao redor

de 0,3 μm. Para facilitar o paso das solucións a través dos filtros de membrana aplícase presión ou se fai

baleiro, tendo presente que os recipientes de recollida das solucións filtradas deben estar estériles. Hai

un tipo de filtro, denominado filtros de alta eficacia de retención de partículas de aire (HEPA, high-

efficiency particulate air) que se utilizan nas cabinas de fluxo laminar e de seguridade biolóxica porque

permiten eliminar o 99,9 % das partículas maiores de 0,3 μm presentes no aire.

4. Radiacións

4.1. Radiacións non ionizantes. Luz UV. A radiación ultravioleta non produce ionización ao incidir

sobre unha molécula, pero si excitación dos seus electróns, facendo que reaccione de forma anómala. A

acción bactericida máis efectiva da luz UV prodúcese a 260 nm, que é o máximo de absorción do DNA.

A capacidade de penetración da luz UV é moi baixa, non podendo atravesar o vidro ou líquidos, polo

que só se utiliza para a esterilización de superficies (as cámaras de fluxo laminar) ou a esterilización de

aire en quirófanos ou salas asépticas. Nalgúns casos específicos tamén pode usarse para a esterilización

de auga.

4.2. Radiacións ionizantes. Raios gamma e raios X. Debido á súa elevada enerxía, causan a

ionización das moléculas e a aparición de radicais libres altamente reactivos que destrúen compoñentes

celulares como o DNA e as proteínas. As radiacións ionizantes, ademais de ter un maior poder

microbicida que a radiación ultravioleta, presentan un maior poder de penetración, podendo esterilizar o

interior do material empaquetado. Aínda que son altamente efectivas contra formas vexetativas e

endosporas, non sempre o son contra virus. Debido ao perigo do equipo de radiación, este tipo de

esterilización limítase ás aplicacións industriais a gran escala, empregándose para esterilizar material

plástico, material farmacéutico (antibióticos, hormonas), etc.

22


5. Esterilización con axentes químicos

A maior parte dos axentes químicos antimicrobianos utilízanse na desinfección e non destrúen as

esporas, polo tanto non son esterilizantes. Con todo, en condicións apropiadas, compostos como o óxido

de etileno ou o glutaraldehido eliminan formas vexetativas e esporas, polo que deben clasificarse dentro

dos axentes esterilizantes. Estes compostos se empregan na esterilización de instrumentos e material de

plástico.

Medios de cultivo e solucións

Os medios de cultivo son as solucións nutritivas que se usan no laboratorio para o crecemento e

mantemento dos microorganismos. Tamén se poden empregar para demostrar unha característica

fisiolóxica ou bioquímica do microorganismo (utilización dunha fonte de carbono, produción de ácido,

produción de gas, etc). Antes do seu emprego, tanto os medios de cultivo como as solucións e todo o

material empregado para a manipulación dos microorganismos deben estar estériles para evitar a

entrada de microorganismos contaminantes.

Tipos de medios de cultivo

En función da súa composición química pódense dividir en :

Medios definidos: coñécense a composición química exacta do medio. Permite coñecer os

compostos que metaboliza o microorganismo estudado.

Medios complexos ou non definidos: conteñen algúns compoñentes cunha composición química

descoñecida. Na súa preparación adóitanse empregar peptonas (hidrolizados parciais de proteínas

do leite, carne, soia, fermentos), extractos de carne, de fermento ou outras sustancias moi nutritivas

pero non definidas quimicamente. Resultan moi útiles e son os máis utilizados porque un único

medio pode satisfacer as necesidades nutricionais de diversos microorganismos.

Tanto se se trata de medios definidos como complexos, falamos de medios de cultivo líquidos ou

caldos e medios sólidos. Para pasar un medio líquido a medio sólido tan só é necesario engadir un

axente xelificante que permita ao medio líquido solidificar: a adición de agar ao 1,5 % ao medio líquido

é o procedemento comunmente empregado.

Existen unha serie de medios de cultivo cuxa composición axuda a establecer ou pór de manifesto

determinadas propiedades dos microorganismos que poden servir para o seu illamento e ou

clasificación. Neste caso falamos de:

Medios xerais: permiten o crecemento da maioría dos microorganismos aerobios e anaerobios

facultativos (exemplo: Triptona Soja Agar, Agar Nutritivo, etc).

23


Medio de enriquecemento: favorecen o crecemento dun tipo de microorganismo en concreto pero

sen inhibir o crecemento do resto da flora acompañante. Utilízanse para favorecer o crecemento de

microorganismos esixentes.

Medios selectivos: Incorporan na súa composición compostos químicos que inhiben o crecemento

de determinados grupos de microorganismos mentres permiten o crecemento doutros, facilitando

así o seu illamento. Utilízanse para illar grupos específicos de bacterias.

Medios diferenciais: permiten distinguir tipos diferentes de microorganismos que se atopan

xeralmente relacionadas ben morfolóxica ou bioquímicamente. Incorporan compostos químicos que

tras a inoculación e incubación producen un cambio característico no aspecto do crecemento

bacteriano e ou o medio que os rodea, o que permite a súa diferenciación (exemplo: Agar Citrato de

Simons).

En numerosos casos, un mesmo medio pode ser á vez selectivo e diferencial (exemplo: Agar Eosina-

Azul de Metileno Levine, Agar Xilosa Lisina Desoxicolato, etc.), ou de enriquecemento e diferencial

(exemplo: Agar Sangre).

É importante ter en conta que distintos microorganismos poden ter requirimentos nutricionais moi

diferentes. Xa que logo, para o cultivo correcto dun microorganismo determinado é necesario coñecer

as súas esixencias nutritivas e fornecelas nos medios de cultivo cos nutrientes esenciais na forma e

proporción adecuadas.

Doutra banda, as solucións salinas non son medios de cultivo, posto que non permiten o crecemento dos

microorganismos. A súa función consiste en manter os microorganismos en suspensión sen que se vexa

afectada a súa viabilidade, debido a que son solucións isotónicas.

Obxectivo

Coñecer as técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo e solucións empregadas no

crecemento, illamento e identificación de diversos microorganismos.

Material e Procedementos

Numerosas casas comerciais fornecen aos laboratorios os medios de cultivo deshidratados, que se

reconstitúen coa adición de auga destilada. Para a súa preparación, séguense as indicacións realizadas

polas propias casas comerciais sobre o medio de cultivo.

Os medios líquidos se hidratan con auga destilada, distribúense nos recipientes adecuados (tubos de

ensaio, matraces, botellas, etc) e tápanse cun tapón metálico, de PVC ou de algodón hidrófugo. A

24


maioría deles débense esterilizar e, unha vez esterilizados, mantéñense a temperatura ambiente para que

arrefríen. Cando a temperatura do medio de cultivo é igual á temperatura ambiental, xa se poden

utilizar.

Os medios sólidos, unha vez hidratados, férvense para que o agar poida formar un xel homoxéneo co

medio cando se arrefríe. A maioría dos medios se esterilizan en autoclave. Se se van a preparar tubos

con medio sólido, o medio distribúese nos tubos antes de esterilizalo. Se a finalidade é a preparación de

placas, o medio déixase enfriar nun baño ou a temperatura ambiente unha vez estéril. Cando a

temperatura do medio alcanza aproximadamente os 50º C repártese asépticamente en placas de Petri

estériles a razón de 15-20 mL de medio por placa. O medio débese deixar solidificar antes do seu

emprego.

Algúns medios de cultivo conteñen compoñentes altamente selectivos e non é necesario esterilizalos.

Polo xeral, os medios de cultivo que non se utilizan mantéñense a 4º C ata o seu emprego.

Para a preparación das solucións salinas, disólvense os sales na auga destilada, distribúese nos

recipientes adecuados e esterilízase no autoclave.

A continuación indícanse os medios de cultivo e solucións que se van preparar así como o material

necesario e o procedemento a seguir na súa preparación. Para esta práctica, os alumnos formarán 4

grupos.

25


GRUPO I

Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidro de 5- 10 mL de capacidade.

- Dispensador para pipetas de vidro.

- Matraces ou botellas de vidro de 500 mL de capacidade.


- Placas de Petri de 90 mm de diámetro baleiras e estériles.

- Tubos de tapón de rosca de 5-10 mL de capacidade.

1. Triptona Soia Agar (TSA)

- Medio de cultivo para verter en placa.

- Cantidade a preparar: 250 mL.

- Repartir en 10-12 placas de Petri.

- Compoñentes/L:

- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidade fabricante (30 g/L)

- Agar 15 g

- Auga destilada 1.000 mL

Procedimiento: Disolver a Triptona Soja Agar na auga destilada quentando ata ebulición.

Esterilizar a 121° C/15 min. Verter en placas a razón duns 20 mL por placa.

2. Agar Citrato de Simons (Agar Citrato)

- Medio de cultivo para preparar en tubos inclinados.


- Repartir en 10 tubos (5 mL/tubo).

- Compoñentes/L:

- Agar Citrato de Simons Cantidade fabricante (24,2 g/L)


Procedemento: Disolver o Agar Citrato de Simons na auga destilada quentando ata ebulición.

Repartir en tubos e esterilizar a 121° C/15 min. Deixar solidificar en forma inclinada.

26


GRUPO II

Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidro de 5-10 mL de capacidade.






1. Triptona Soja Agar (TSA)




- Compoñentes/L:

- Triptona Soja caldo (TSB) Cantidade fabricante (30 g/L)

- Agar 15 g


Procedemiento: Disolver a Triptona Soja Agar na auga destilada quentando ata ebulición.


2. Agar semisólido

- Medio de cultivo para repartir en tubos.



- Compoñentes/L:

- Caldo Nutritivo Cantidade fabricante (8 g/L)

- Agar 7,5 g


Procedemento: Disolver os compoñentes en auga destilada quentando ata ebulición. Repartir en

tubos e esterilizar a 121° C/15 min. Deixar solidificar os tubos en vertical.

27


GRUPO III

Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidro de 5-10 mL de capacidade.






1. Medio Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD)




- Compoñentes/L:

- Medio XLD Cantidade fabricante (55 g/L)


Procedemento: Disolver o medio XLD na auga destilada quentando ata ebulición. NON

ESTERILIZAR. Verter en placas a razón duns 20 mL por placa.

2. Triptona Soja Caldo (TSB)

- Medio de cultivo para repartir en tubos.

- Cantidade a preparar: 50 ml.


- Compoñentes/L:

- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidade fabricante (30 g/L)


Procedemento: Disolver o TSB na auga destilada. Repartir en tubos. Esterilizar a 121° C/15 min.

28


GRUPO IV

Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidro de 10 mL de capacidade.





- Tubos de tapón de rosca de 10 mL de capacidade.

1. Agar Eosina-Azul de Metileno Levine (Agar EMB Levine)




- Compoñentes/L:

- EMB Levine Cantidade fabricante (37,4 g/L)


Procedemento: Disolver o medio EMB Levine na auga destilada quentando ata ebulición.


2. Solución Salina

- Solución para repartir en tubos.



- Compoñentes/L:

- NaCl 8,5 g


Procedemento: Disolver o NaCl na auga destilada. Repartir en tubos e esterilizar a 121° C/15 min.

Cuestións

A .- Indica os medios de cultivo asignados ao teu grupo de traballo e os cálculos realizados para a

preparación da cantidade especificada.

29


PRÁCTICA 2. Cultivo de microorganismos no laboratorio. Reconto de microorganismos

viables

Primeira parte. Cultivo de microorganismos no laboratorio

Unha vez preparado un medio de cultivo, pódese inocular (é dicir, engadir os microorganismos) e a

continuación incubar nas condicións que favorezan o crecemento microbiano. Para a adecuada

manipulación dos microorganismos é esencial o uso da técnica aséptica. Esta técnica consiste nunha

serie de procedementos que evitan a entrada de organismos non desexados ou contaminantes durante a

manipulación dos cultivos e dos medios de cultivo estériles (ver como exemplo Figura 1). O problema

máis común no laboratorio de microbioloxía é a contaminación a través do aire. Así pois, cando as

placas ou tubos ábrense deben manexarse de modo que os contaminantes do aire non penetren.

En numerosas ocasións, a finalidade do cultivo é obter e manter un único tipo de microorganismo para

Figura 1. Transferencia aséptica. Procedemento de toma de mostra a partir dun medio líquido. Imaxe tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

30


poder estudalo en detalle. Cando o cultivo contén un único tipo de microorganismo denomínase cultivo

axénico ou puro. Se, polo contrario, o cultivo contén varios tipos de microorganismos denomínase

cultivo mixto. A pureza dos cultivos bacterianos pódese verificar mediante a observación das

características das colonias sobre unha placa sementada porque as distintas especies forman a miúdo

colonias cunha forma e aspecto característico.

Obxectivos

Coñecer diferentes métodos de sementa empregados para o illamento, identificación e mantemento

dos microorganismos. Aprender a diferenciar entre cultivos puros e cultivos mixtos.

Coñecer e comprender as vantaxes que supón a utilización de distintos tipos de medio de cultivo

para o illamento e identificación dos microorganismos.

Nesta práctica empregaranse diferentes métodos de sementa para o cultivo de microorganismos:

1. Sementa en placa

1.1. Sementa en placa en estrías ou por esgotamento

É un método cualitativo de illamento de microorganismos procedentes dunha mostra ou dun

cultivo de laboratorio. Consiste en arrastrar co asa de sementa un número cada vez máis pequeno

de células sobre a superficie dun medio de cultivo sólido en placa de Petri. As células illadas

multiplicaranse formando colonias independentes. Unha colonia é unha formación ou agrupación

macroscópicamente visible de microorganismos nun medio sólido. É importante indicar que cada

colonia é un cultivo puro (poboación de células que procede dunha única célula).

Material e medios de cultivo

- Rotulador

- Asa de sementa curva ou de bucle

- 2 placas de medio TSA

- 1 Placas de medio XLD

- 1 placas de Agar EMB Levine

Mostra

- Cultivos líquidos: Nº 1 e Nº 2

Procedemento:

Empregaranse 2 cultivos líquidos:

31


- Cultivo Nº 1: débese sementar para illamento en estría nunha placa de TSA e nunha placa de

Agar EMB Levine.

- Cultivo Nº 2: débese sementar nunha placa de TSA e nunha placa de XLD.

Para realizar a sementa seguiranse os seguintes pasos:

1. Rotular a base das placas para poder identificalas.

2. Esterilizar o asa de sementa no chisqueiro Bunsen e deixala arrefriar.

3. Tomar una alícuota do cultivo líquido co asa de sementa e facer estrías paralelas, pero non

superpostas, nun extremo da placa de Petri sobre unha parte do medio de cultivo sólido.

4. Esterilizar o asa de sementa e deixala arrefriar.

5. Realizar unha nova serie de estrías perpendiculares ás anteriores, de forma que se arrastren

parte dos microorganismos sementados na serie anterior.

6. Esterilizar o asa de sementa e repetir o proceso indicado no punto 4 unha vez máis. Esta

terceira serie de estrías non debe superpoñerse á primeira.

7. Esterilizar o asa de sementa antes de depositala na mesa de traballo.

8. Incubar as placas sementadas en estufa a 37 º C durante 24 horas.

Cuestións

B.- Observa e anota se nas placas de TSA, Agar EMB Levine e XLD sementadas para illamento

en estría a partir dos cultivos líquidos fornecidos obtéñense cultivos puros ou mixtos.

C.- Considerando que o medio TSA é un medio xeral e os medios Agar EMB Levine e XLD son

medios selectivos e diferenciais, a obtención de cultivos puros ou mixtos nestes medios de cultivo

a partir dos cultivos líquidos sementados é coherente co que cabería esperar e por que?

1.2. Sementa en placa por inclusión ou en profundidade

Trátase dun método cuantitativo empregado para o reconto e illamento de microorganismos, polo

que se explicará no apartado correspondente a reconto de microorganismos.

2. Sementa en tubo con medio sólido

2.1. Sementa en tubo en estría

Método utilizado para o mantemento de cultivos puros, así como para a determinación dalgunhas

características fisiolóxicas e bioquímicas dun cultivo puro de microorganismos. Consiste en

arrastrar a suspensión microbiana procedente dun cultivo puro sobre a superficie inclinada do

medio de cultivo, facendo unha estría en zig-zag desde a base á parte alta.

32



- Rotulador

- Asa de sementa curva ou de bucle

- 1 tubo de Agar Citrato de Simons (tubo con agar inclinado)

- 1 tubo de TSA (tubo con agar inclinado)

Mostra

1 cultivo puro no medio sólido

Procedemento

O cultivo puro presente na placa de TSA fornecida, débese sementar en estría nos 2 tubos con agar

inclinado, tanto no que contén o medio TSA como no que contén Agar Citrato. Para iso,

seguiranse os seguintes pasos:

1. Rotular os tubos para poder identificalos.

2. Esterilizar o asa de sementa de bucle e deixala arrefriar.

3. Cargar o asa de sementa estéril coa porción do cultivo que se vai a transferir.

4. Abrir o tubo que contén o medio de cultivo estéril.

5. Flamexar a boca do tubo e introducir o asa de sementa cargada co inoculo bacteriano dentro

do tubo e realizar estrías en zig-zag sobre a superficie inclinada do medio de cultivo, dende a

base á parte alta do tubo.

6. Flamexar a boca do tubo e tapalo.

7. Esterilizar o asa de sementa.

8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas.

Cuestiones

D.- Observa e anota se nos dous medios de cultivo sólidos en tubo sementados en estría hai

crecemento continuo ou se distinguen colonias illadas. Obsérvase cambio de coloración nalgún

deles?

2.2. Sementa en tubo en picadura

Método utilizado para a determinación dalgunhas características fisiolóxicas e bioquímicas dun

cultivo puro de microorganismos. Neste caso empréganse asas de sementa de picadura. Baséase en

introducir un inoculo bacteriano procedente dun cultivo puro nun medio sólido ou semisólido.

33



- Rotulador

- Asa de sementa de picadura

- 1 tubo de agar semisólido

Mostra

1 cultivo puro no medio sólido

Procedemento

O cultivo puro presente na placa de TSA fornecida, débese sementar en picadura no tubo con

agar semisólido. Para iso, seguiranse os seguintes pasos:

1. Rotular os tubos para poder identificalos.

2. Esterilizar o asa de picadura e deixala arrefriar.

3. Cargar a punta do asa co cultivo puro que se vai transferir.

4. Abrir o tubo que contén o medio de cultivo estéril e flamexar a boca do tubo.

5. Introducir todo o filamento do asa de picadura dentro do medio de cultivo, en dirección

perpendicular á base do tubo pero sen chegar a tocar o fondo.

6. Flamexar a boca do tubo e tapalo.

7. Esterilizar o asa de picadura.

8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas.

No medio de cultivo semisólido en tubo débese observar crecemento na zona de inoculación, zona

pola que pasou o filamento do asa de picadura co cultivo bacteriano.

Cuestións

E.- No medio de cultivo semisólido en tubo sementado en picadura obsérvase desprazamento no

crecemento con respecto á liña de sementa? Que indica o resultado obtido?

34


Segunda parte. Reconto de microorganismos viables. Método de sementa en placa por

inclusión ou en profundidade

En ocasións, é necesario realizar recontos de microorganismos nunha mostra (por exemplo, en mostras

de auga, alimentos, solos, orina, sangue, etc.) para estimar o número de células viables presentes. Unha

célula viable defínese como aquela que é capaz de dividirse e dar lugar a unha descendencia. O método

habitual para realizar unha determinación de células viables baséase en contar o número de células da

mostra que é capaz de formar colonias sobre un medio de cultivo adecuado. Por esta razón, o reconto de

células viables tamén se chama reconto en placa ou reconto de colonias. Neste procedemento suponse

que cada célula viable pode formar unha colonia.

Hai dous métodos para realizar un reconto en placa de microorganismos viables: o método de sementa

por extensión, no que un determinado volume da mostra diluída esténdese sobre a superficie dunha

placa con medio sólido e o método de sementa por inclusión ou en profundidade, no que se pipetea un

volume coñecido (normalmente 1 mL) do cultivo nunha placa de Petri estéril sobre a que se engade o

medio con agar fundido (Figura 2).

Figura 2. Métodos de sementa para realizar un reconto de células viables en placa: sementa por extensión e sementa por inclusión ou vertido en placa. Imaxe tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

Antes de proceder a sementa da mostra hai unha serie de consideracións importantes. Por unha banda, o

reconto pódese realizar tanto en mostras líquidas como en sólidas, pero neste último caso será necesario

preparar unha suspensión ou dilución inicial coa mostra empregando unha solución isotónica estéril.

Adicionalmente, o número de colonias presentes nas placas non debe ser demasiado grande, pois

algunhas colonias poderíanse fusionar e as estimacións obtidas serían erróneas. Tamén é importante non

obter un número de colonias demasiado baixo, para que o cálculo sexa máis preciso e non se arrastren

erros asociados coa preparación de excesivas dilucións. En xeral, considérase que o número de colonias

por placa apropiado para o reconto oscila entre 30 e 300. Para conseguilo, case sempre se dilúe a mostra

35


(Figura 3). Tendo en conta que raramente se sabe de antemán o número de células viables, adóitanse

facer varias dilucións decimais sucesivas da mostra. Tanto a preparación da suspensión inicial (mostras

sólidas), como das dilucións decimais sucesivas, forman parte da preparación da mostra para a

análise.

Nesta práctica empregarase unha mostra líquida que contén unha concentración descoñecida de

microorganismos. Por iso, antes de proceder a súa sementa, débense preparar unha serie de dilucións

decimais sucesivas e posteriormente sementaranse en placa. Vaise a empregar un medio de cultivo

xeral, polo tanto realizarase un reconto da totalidade dos microorganismos viables presentes na mostra

líquida de partida.

Figura 3. Procedemento para a determinación de células viables usando dilucións seriadas da mostra e o método de sementa por inclusión ou vertido en placa. Imaxe tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

36


Obxectivo

Realizar o reconto de microorganismos viables presentes nunha mostra problema.

Material, solucións, medios de cultivo e mostra a empregar

1. Preparación de dilucións decimais sucesivas

Material e soluciones

- Rotulador

- Pipeta automática con capacidade para 1 mL

- Puntas de pipeta estériles con capacidade para 1 mL

- 3 tubos con 9 mL de solución salina estéril

Mostra

- Cultivo bacteriano líquido

2. Sementar en placa por inclusión ou en profundidade


- Rotulador

- Pipeta automática con capacidade para 1 mL

- Puntas de pipeta estériles

- 4 placas de Petri baleiras e estériles

- 1 botella con 100 mL de TSA licuado e mantido nun baño a 45º C

Mostras

- As dilucións 1/100 e 1/1000 obtidas a partir da mostra de partida.

Procedemento

1. Preparación de dilucións decimais sucesivas

A partir da mostra líquida fornecida, prepararanse tres dilucións da mostra: dilucións 1/10, 1/100 e

1/1000. Para iso, seguiranse os seguintes pasos:

1. Rotular os tubos coas distintas dilucións que se van a realizar.

2. Preparación de dilución 1/10: usando unha punta de pipeta estéril, tómase 1 mL da mostra e

transfírese a un tubo con 9 mL de solución salina estéril. A continuación, axítase o tubo por

rotación (nunca por investimento) para unha homoxenización completa do inoculo

incorporado co diluínte.

37


38

3. Para facer dilucións sucesivas (dilucións 1/100 e 1/1000), úsase unha nova punta de pipeta

estéril en cada paso da dilución, tómase 1 mL da dilución precedente e se leva a un tubo

con 9 mL de solución salina estéril, recordando que se debe axitar sempre o tubo unha vez

incorporado o inoculo.

2. Sementa en placa por inclusión ou en profundidade

1. Coller as dúas placas de Petri baleiras e rotulalas na base para poder identificalas. Indicar

tamén a dilución que se vai sementar.

2. Tomar unha alícuota de 1 ml da dilución 1/100, utilizar para iso unha punta de pipeta estéril.

3. Depositar a alícuota sobre o fondo das placas de Petri.

4. Verter sobre as placas inoculadas uns 20 ml de TSA fundido e mantido a 45°C.

5. Axitar as placas suavemente mediante movementos circulares e de translación.

6. Deixar solidificar, invertir as placas e incubar en estufa a 37° C durante 24 horas.

7. Proceder da mesma forma para a dilución 1/1000 empregando unha nova punta de pipeta

estéril.

Conta as dúas placas da dilución que conteñan entre 30 e 300 unidades formadoras de colonias (UFC) e

calcula a media aritmética. O resultado obtido multiplicarase polo inverso da dilución e referirase como

UFC/mL de mostra.

Cuestións

F.- Indica os cálculos realizados para obter o reconto de microorganismos viables presentes na mostra

fornecida, especificando o reconto obtido en placa e a dilución empregada. Anota tamén o resultado

final.

3. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA

(código calendario de prácticas: FV)

TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA E ESPECTROFOTOMETRÍA

TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS

Obxectivos:

a) Coñecer e comprender as variacións de cor dunha sustancia dependendo do pH.

b) Coñecer e comprender as variacións de cor dunha sustancia dependendo da

concentración.

A espectrofotometría é o método de análise óptica máis usado nas investigacións químicas e

biolóxicas.

A maioría dos problemas analíticos reais comezan cunha complexa mestura a partir da cal é

necesario illar, identificar e cuantificar un ou máis compoñentes da mesma. Pódense expor as seguintes

cuestións: unha, de carácter cualitativo (de que compoñente trátase?), e outra de carácter cuantitativo

(canto hai dese compoñente?). Para iso, pódese utilizar o método instrumental de análise, como é a

espectrofotometría para medir a absorción de radiación ultravioleta e visible que interactúa coa materia

(átomos e moléculas), a mesma é considerada unha técnica cualitativa e cuantitativa baseándose na

medición da cor ou da lonxitude de onda dunha radiación e intensidade da mesma.

Fundamento da espectrofotometría

Todas as sustancias poden absorber enerxía radiante, ata o vidro que parece ser completamente

transparente absorbe radiación de lonxitudes de ondas que non pertencen ao espectro visible e a auga

que absorbe fortemente na rexión do infravermello. A absorción das radiacións ultravioletas, visibles e

infravermellas depende da estrutura das moléculas e é característica para cada sustancia química.

Cando a luz atravesa unha sustancia, parte da enerxía é absorbida e a enerxía radiante non pode

producir ningún efecto sen ser absorbida. A cor das sustancias débese a que estas absorben certas

lonxitudes de onda da luz branca que incide sobre elas e só as lonxitudes de onda non absorbidas poden

ser visualizadas.

Denomínase espectro electromagnético á distribución enerxética do conxunto de ondas

electromagnéticas

41


A espectrofotometría ultravioleta-visible usa feixes de radiación do espectro electromagnético,

no rango UV de 80 a 400 nm, principalmente o comprendido entre 200 e 400 nm e no da luz visible de

400 a 800 nm, polo que é de gran utilidade para caracterizar os materiais na rexión ultravioleta e visible

do espectro. Ao campo de luz UV comprendido entre 200 e 400 nm coñéceselle tamén, como rango de

UV próximo, a espectrofotometría visible soamente usa o rango do campo electromagnético da luz

visible, de 400 a 800 nm.

O espectrofotómetro é un instrumento que permite comparar a radiación absorbida ou

transmitida por unha solución que contén unha cantidade descoñecida de soluto e unha que contén unha

cantidade coñecida da mesma sustancia.

As técnicas espectrofotométricas permiten determinar a identidade e a concentración de

compoñentes disoltos nunha mostra incógnita. O espectro de absorción dun material mostra a fracción

42


da radiación electromagnética incidente que un material absorbe dentro dun rango de lonxitudes de

onda, achegando información sobre a molécula, posto que está relacionado coa súa estrutura molecular.

Practica 1. Efecto do pH sobre o espectro de absorción

Os cambios nas condicións ambientais dunha molécula poden provocar cambios na súa

estrutura molecular. Así, un cambio no pH pode provocar alteracións no seu espectro de absorción. O

composto que se usará na práctica será o laranxa de metilo, que é un colorante que se utiliza como

indicador de pH.

Realizarase o espectro de absorción entre 350 e 650 nm de distintas solucións de laranxa de

metilo á mesma concentración pero con distintos pHs no medio.

Naranja de metilo

Procedemento

En primeiro lugar prepáranse as seguintes solucións de traballo, a partir das cales prepararemos

as solucións a analizar:

1) Solución de laranxa de metilo. Para iso pésase na balanza de precisión 1 mg de laranxa de

metilo empregando para iso unha espátula e un tubo de centrífuga. Posteriormente disólvese en

5 mL de H2O.

43


2) Solución de ácido cítrico 0.1 M. Determinarase a cantidade a pesar para preparar 30 mL de

solución.

3) Solución de ortofosfato bisódico 0.2 M. Determinarase a cantidade a pesar para preparar

15 mL de solución. Este sal tarda máis en disolverse que o ácido cítrico, é recomendable

comezar por ela e axudarse de axitación mecánica.

Unha vez preparadas as tres soluciones nai, procederase a mesturar as solucións 2 e 3 seguindo

a táboa seguinte, para preparar as solucións tampón:

pH aproximado Sol. Na2HPO4 (mL) Sol. Ácido cítrico (mL)

3.0 1.0 4.0

3.4 1.3 3.7

3.8 1.8 3.2

4.2 2.1 2.9

4.6 2.3 2.7

Neste punto teremos 5 tubos de ensaio que formarán un gradiente de pH. A continuación

engádense cunha micropipeta 0.1 mL da solución stock de laranxa de metilo a cada unha das

solucións tampón e axítanse as solucións. Unha vez comprobado que se xera un gradiente de

cor, realízanse os espectros de absorción entre 350 e 650 nm das distintas mostras.

Cuestións:

1. Comentar os resultados. Describir a gráfica obtida, observando as variacións nos espectros

de absorción e comentando como aumenta ou diminúe a absorbancia en función da lonxitude

de onda e o pH do medio.

2. Obsérvase un punto isosbéstico cando nunha solución coinciden dúas especies absorbentes

en equilibrio. Observa a gráfica. Podes localizar algún punto isosbéstico? Existe algún punto

no que a absorbancia non dependa do pH do medio?

3. En cada un dos tubos o pH é distinto. ¿Por qué varía o espectro de absorción do laranxa de

metilo ao variar o pH?

44


Practica 2. Efecto da concentración sobre o espectro de absorción.

Introdución:

A lei de Beer-Bougher-Lambert predicir que para unha molécula en disolución, un cambio na

súa concentración provocará un cambio proporcional na absorbancia.

O aumento na concentración dos compostos aumenta as interaccións entre as súas moléculas,

cambiando o seu espectro de absorción. Aínda que na maior parte dos casos este efecto pode

desprezarse, non ocorre así no caso do azul de metileno.

45


46

As condicións nas que se atopa unha molécula poden determinar cambios estruturais que

afecten ás súas propiedades. Nesta práctica observaremos como un aumento na concentración dunha

sustancia pode desencadear un cambio estrutural que cambie notablemente as súas propiedades de

absorción de luz.

Procedemento

Prepáranse 10 mL dunha solución stock de azul de metileno 1 mm (1x10-3 M) en auga

destilada. A partir da solución stock prepáranse 10 mL das seguintes diluciones: 1x10-4, 1x10-5, e 1x10-6

M.

Realízase un espectro de absorción entre 400 e 700 nm das solucións 1x10-4 e 1x10-6 M. A

continuación mídese a absorbancia das tres solucións a 610 e a 663 nm.

Cuestións:

1. Representar gráficamente a absorbancia ás dúas lonxitudes de onda fronte á concentración,

calculando o coeficiente de correlación lineal para cada unha das lonxitudes de onda.

2. Calcular a cociente entre a absorbancia a 610 e a absorbancia a 663 das tres solucións.

3. Comentar os resultados obtidos tanto para os espectros de absorción realizados no laboratorio

como para as gráficas do apartado 1. Obsérvase algunha desviación da Lei de Beer-Bougher-Lambert?

Cal podería ser a explicación destes resultados?

4. TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA

(código calendario de prácticas: BC)

TÉCNICAS HISTOLÓXICAS E MICROSCOPIA

INTRODUCIÓN

O procesado dunha mostra histolóxica (animal ou vexetal) para o seu estudo ao microscopio

comporta a realización dunha serie de pasos e protocolos coa fin de poñer de manifesto as estruturas

tisulares dunha forma o máis parecido posible a como se atopan en estado vivo. Cada un destes pasos

pode presentar variacións particulares dependendo das características da mostra biolóxica obxecto de

estudo, das estruturas tisulares e celulares que se van observar e do tipo de microscopio no que se

queiran observar (óptico (MO) ou electrónico (ME)).

Os pasos xerais que se seguen neste procesado son:

1.- Fixación. O obxectivo da fixación é preservar o tecido coas características estruturais e de

composición química que presentaba no estado vivo. A fixación evita a alteración da morfoloxía do

tecido detendo os procesos de degradación que teñen lugar trala morte celular, como a autólise ou a

putrefacción. Ademais, endurece o material, conferíndolle protección fronte ao dano que puidese

ocasionar a manipulación do tecido nos pasos seguintes á fixación, e fai insolubles os constituíntes

celulares que se pretenden estudar que, sen a fixación, se disolverían durante o manexo posterior. Non

existe ningún fixador que faga insolubles todos os compoñentes tisulares, polo que a elección do

fixador é importante dependendo do ou dos compoñentes obxecto de estudo. Os lípidos son os

compoñentes tisulares máis difíciles de fixar, xa que a maioría dos fixadores os disolven.

Normalmente empréganse fixadores líquidos que poden utilizarse sós (fixador simple) ou

mesturados (mestura fixadora). O fixador simple máis utilizado é o formaldehido (ou formol), pero

outros exemplos son o etanol, ácido pícrico, ácido acético, paraformaldehido, glutaraldehido, tetróxido

de osmio, etc… A mestura fixadora máis utilizada é o líquido de Bouin [ácido pícrico, formol e ácido

acético], que é considerado como o fixador universal porque conserva moi ben a estrutura tisular. Para

fixar o tecido introdúcese a peza nun bote con fixador durante un tempo limitado (fixación por

inmersión) ou aprovéitase o sistema circulatorio do animal para facer pasar o fixador (fixación por

perfusión). Na fixación por inmersión hai que ter en conta o tempo de fixación, xa que unha fixación

excesiva pode provocar, ademais dun excesivo endurecemento, a aparición de aspectos citolóxicos que

non existían in vivo observándose imaxes artificiais ou artefactos debidos a distorsións, alteracións

morfolóxicas, cristalización de compostos amorfos, desprazamentos de substancias, etc… O tempo de

fixación dependerá do tamaño da peza de tecido e do fixador empregado.

Hai moitos tipos de fixadores e a súa elección depende dunha serie de propiedades que posúen:

velocidade de penetración, velocidade de fixación, grao de endurecemento e variacións de volume que

producen, etc… Tamén hai que ter en conta as características químicas do tecido que imos estudar, o

método de seccionado que imos utilizar e a técnica que imos aplicar sobre as seccións obtidas.

49


Se a mostra se procesa para a súa observación ao ME, realízase unha dobre fixación, de forma

que primeiro se fixa con paraformaldehido ou glutaraldehido (ou cunha mestura de ambos), e a

continuación con tetróxido de osmio.

2.- Inclusión. Permite darlle consistencia aos tecidos e facilitar o seu seccionado cunha coitela.

Consiste en rodear a peza dun material, chamado medio de inclusión, que sexa o suficientemente ríxido

que permita o seu seccionado. Tras levar a cabo a inclusión, obteremos un bloque compacto da peza de

tecido rodeada polo medio de inclusión. No procesado para a observación no MO utilízanse medios de

inclusión hidrófobos (por exemplo, a parafina), que requiren a deshidratación previa do tecido, ou

medios de inclusión hidrófilos (por exemplo, a xelatina), que son mesturables coa auga. O uso de

medios de inclusión hidrófilos permite un procesado máis rápido e menos danoso para o tecido. En

ocasións, a inclusión non é un paso imprescindible, xa que a consistencia se acada coa fixación ou coa

conxelación do tecido, sen necesidade de utilizar un medio de inclusión.

Na inclusión para a observación ao ME úsanse plásticos especiais (resinas) que proporcionan

unha maior dureza que os medios de inclusión para microscopia óptica, o que permite a obtención de

seccións moi finas. Neste caso a inclusión é imprescindible para lograr a consistencia da mostra.

3.- Seccionado. Para a maioría dos procedementos e estudos histolóxicos, requírense seccións de

tecidos o suficientemente delgados para que pase a luz e poidan observarse ao MO, ou para que

penetren os electróns e poidan observarse ao ME. Os micrótomos son instrumentos que coa axuda

dunha navalla ou coitela permiten obter cortes finos dos materiais a estudar. Os micrótomos constan

dun portabloques onde se coloca a mostra, unha coitela e un sistema de avance regulado do bloque (ou

da coitela) que permite controlar o grosor dos cortes. En microscopia óptica as coitelas utilizadas son de

aceiro e obtéñense seccións de varios micrómetros (m) de grosor, mentres que en microscopia

electrónica as coitelas son de vidro ou de diamante e obtéñense seccións de varios nanómetros (nm) de

grosor, é dicir, mil veces máis finos que para o MO, debido a que o poder de penetración dos electróns é

moi inferior ao dos fotóns. Hai moitos tipos de micrótomos e o uso dun ou doutro tipo depende de se o

material se ten incluído ou non, e, no seu caso, do medio de inclusión que se utilizou. Os micrótomos

máis utilizados hoxe en día son os seguintes:

* Micrótomo de rotación ou de tipo Minot. Utilízase para seccionar pezas de tecido incluídas en

parafina e obtéñense seccións de entre 5 e 30m de grosor. Neste micrótomo a coitela permanece fixa e

perpendicular ao portabloques, en posición vertical. O movemento rotatorio dunha manivela fai que o

bloque coa mostra se desprace cara á coitela unha distancia fixa que determina o grosor do corte.

* Crióstato ou criótomo. Require a conxelación previa da peza de tecido. Utilízase para seccionar

material non incluído, ou incluído nun medio de inclusión especial para crióstato (medio de inclusión

hidrófilo). Obtéñense seccións de entre 5 e 60 m de grosor. O funcionamento é semellante ao

micrótomo de rotación pero neste caso o portabloques e a coitela atópanse nunha cámara na que

podemos controlar a temperatura do bloque e da coitela (adoita estar entre -20 e -25ºC).

50


* “Vibroslice” ou Vibrátomo. Utilízase para seccionar pezas de tecido fresco, de tecido fixado

sen incluír (a fixación xa proporciona a dureza necesaria para o seu seccionado), ou de tecido incluído

nun medio brando como, por exemplo, a xelatina. Iso comporta a vantaxe de que o procesado é máis

curto e evítase o proceso de inclusión en parafina (longo e danoso para o tecido) ou a conxelación

(implica que a peza de tecido sofra cambios de temperatura), polo que se conservan mellor as

características estruturais e funcionais do tecido. A desvantaxe é que non permite obter seccións finas,

xa que o grosor mínimo obtido é de 25 m. O funcionamento baséase en que a coitela vibra mentres

avanza sobre a peza de tecido e iso facilita o seccionado do material.

* Ultramicrótomo. É o micrótomo que se utiliza en microscopia electrónica. Pódense realizar

cortes semifinos (1m) que se usan para microscopia óptica ou para seleccionar a zona da que queremos

obter cortes ultrafinos (10-100 nm) para o seu estudo ao ME. O funcionamento é semellante ao

micrótomo de rotación pero neste caso as coitelas son de vidro ou de diamante para poder obter

seccións moi finas de material incluído en medios de inclusión moi duros (resinas).

4.- Procesado das seccións. Sobre as seccións obtidas podemos aplicar moitas técnicas

dependendo do que se queira estudar (tinguidura, técnica histoquímica, técnica inmunohistoquímica,

hibridación in situ,…). Previamente a calquera técnica que vaiamos realizar sobre as seccións dun

tecido que temos incluído e seccionado debemos extraer o medio de inclusión, coa fin de que devandito

medio non interfira cos reactivos utilizados en cada caso.

Como exemplo de procesado das seccións veremos como se leva a cabo unha tinguidura para a

observación das seccións nun MO. Normalmente os tecidos son incoloros e, debido a que o índice de

refracción da luz dos distintos compoñentes celulares é similar, é necesario colorealos para aumentar o

contraste entre as distintas estruturas e poder así diferencialos ao observalos no MO. Os métodos de

tinguidura son moi numerosos e reciben o nome do ou dos colorantes que se utilizan. Utilízase un ou

outro método dependendo do tecido ou orgánulo que se queira tinguir, xa que, cada colorante ten a

capacidade de unirse de forma selectiva a unhas estruturas do tecido e non a outras. Os colorantes

clasifícanse en colorantes básicos que teñen afinidade polos compoñentes ácidos da célula (núcleos,

hidratos de carbono, ácidos nucleicos), colorantes ácidos que teñen afinidade por compoñentes básicos

da célula (citoplasma, coláxeno); e colorantes neutros, que adoitan ser mesturas de varios colorantes.

No caso do procesado do material para a súa observación no ME non se realizan tinguiduras con

colorantes, senón que se levan a cabo técnicas de contraste que agregan átomos de metais pesados

(osmio, uranilo, chumbo) que farán as estruturas celulares máis ou menos densas aos electróns

permitindo así a obtención dunha imaxe. No ME obtéñense imaxes en branco e negro.

5.- Montaxe. Consiste en colocar un cubreobxectos sobre as seccións para protexelas durante a

observación no MO. Cando non queremos conservar a preparación podemos engadir, entre o

cubreobxectos e as seccións, unha pinga de auga, de tampón (auga cunha mestura de sales) ou de

glicerina. Neste caso, trala observación desbótase a preparación. Cando nos interesa conservar a

preparación, é necesario utilizar un medio entre as seccións e o cubreobxectos, chamado medio de

51


montaxe, que debe ser transparente, asegurar o máximo posible a conservación das preparacións e

asegurar a adherencia entre o portaobxectos e o cubreobxectos. Hai medios de montaxe hidrófilos e

medios de montaxe hidrófobos. A montaxe só se leva a cabo no procesado para o MO, xa que, no caso

do procesado para o ME as seccións sitúanse sobre pequenas reixas metálicas especiais e non necesitan

esa protección.

6.- Observación ao microscopio óptico ou electrónico. As mostras biolóxicas ou as células, en

xeral, son difíciles de observar a primeira ollada debido ao seu reducido tamaño e a súa transparencia á

luz visible, polo que para a súa observación, necesitamos os microscopios, que son instrumentos de

óptica que nos permiten ver obxectos moi pequenos ou detalles estruturais imposibles de distinguir a

simple vista.

A) O microscopio óptico utiliza a luz común (luz branca, emitida por unha fonte de luz situada

na base do microscopio) que atravesa a mostra biolóxica e ilumina o campo de observación. Conta con

tres sistemas de lentes: a) o condensador, que concentra a luz emitida sobre a mostra; b) os obxectivos

que aumentan a imaxe X veces, normalmente nos microscopios utilizados en prácticas hai catro

obxectivos de 4, 10, 40 e 100 aumentos; e c) os oculares que aumentan a imaxe 10 veces (hainos de

maior aumento) e permiten a visualización directa da mostra. Os aumentos finais obtéñense

multiplicando os aumentos do obxectivo polos do ocular (por exemplo, nun microscopio de prácticas o

maior aumento que obteriamos sería: [obxectivo 100X] x [ocular de 10X] = 1000 aumentos). Con todo,

nun microscopio óptico o importante non son os aumentos senón o seu poder de resolución (PR), é

dicir, “a capacidade de distinguir como separados dous puntos que se atopan moi próximos”. E o PR

depende do límite de resolución (LR, “distancia mínima á que dous obxectos poden ser diferenciados”)

e, de feito, o PR é inversamente proporcional ao límite de resolución (PR =1/LR).

O límite de resolución dun microscopio calcúlase mediante a fórmula de Abbe:

Limite de resolución (LR) = 0’61 x / n x sen

Nesta fórmula: 0’61 é unha constante, é a lonxitude de onda da luz utilizada (luz branca, 550

nm), e n x sen é a apertura numérica (AN) da lente obxectivo. A AN depende do índice de refracción

do medio situado entre a mostra e o obxectivo (n) e do ángulo de apertura do obxectivo utilizado ().

Normalmente o medio situado entre a mostra e o obxectivo é aire (n=1), aceite de inmersión (n=1,5) ou

auga (n=1,3). O uso do aceite de inmersión (impide a desviación dos raios máis oblicuos) aumenta o PR

porque aumenta a AN. O ángulo é a metade do ángulo formado polo cono de raios recolleitos pola

lente obxectivo sobre un punto da mostra. Como a máxima anchura é de 180º, o valor de sen (90º) é

como máximo 1 (0,93 nos microscopios actuais).

Polo tanto, o PR do microscopio depende da da luz utilizada e da AN, de forma que, canto

menor sexa e maior sexa a AN, máis pequeno é o LR e maior o PR. Os obxectivos de maior aumento

teñen maior AN debido a que o ángulo aumenta ao diminuír a distancia da mostra á lente, polo tanto,

ao subir o aumento aumentamos o PR.

52


O límite de resolución dun MO, nas condicións máis óptimas, é dicir, utilizando o obxectivo de

100 aumentos con aceite de inmersión é LR = 0,61 x 550 nm/1,5 x 0,93= 240 nm = 0,24 m. É dicir,

que nun MO podemos observar como separadas estruturas que teñen como mínimo ese diámetro, ou

que están separadas como mínimo por esa distancia (bacterias, mitocondrias, núcleo, plastos,...). Co

MO distinguiriamos a forma destas estruturas pero non os seus detalles internos. Estruturas celulares de

menor tamaño (ácidos nucleicos, ribosomas,…) teriamos que observalas ao ME, cuxo LR é mil veces

menor que o do MO (LR=2-5A=0,2 nm=0,0002 m) debido a que a dos electróns é moi pequena (=

0,004 nm). Polo tanto, o PR dun ME mil veces maior que o do MO e permítenos observar a

ultraestrutura celular. Tendo en conta que o LR do ollo humano é de 100-200 m (0,1-0,2 mm), o MO

aumentou unhas mil veces o LR do noso ollo e o ME aumentouno un millón de veces.

O diafragma do condensador (ou de apertura) é outro dispositivo importante que se atopa situado

debaixo do condensador e con el podemos graduar a cantidade de luz que chega á mostra. Cando

pechamos o diafragma a mostra recibe menos luz, de forma que aumentamos o contraste e a

profundidade de campo pero diminuímos a resolución.

O MO que se usa habitualmente é o MO de campo claro ou fotónico, utilizado para a observación

de preparacións tinguidas de células ou de seccións de órganos ou tecidos. Existen outros tipos de MO,

como o MO de campo escuro, o MO de contraste de fases e o MO de contraste diferencial de

interferencia (DIC) ou de Nomarski, que presentan dispositivos especiais (condensadores, obxectivos,

prismas) que permiten a observación de seccións de tecidos sen tinguir e de células vivas e móbiles

(bacterias, espermatozoides, protozoos, cultivos celulares, células en mitose ou en migración,…). O

MO de fluorescencia e o MO de varrido confocal presentan dispositivos especiais que permiten a

observación de mostras fluorescentes.

O MO invertido utilízase para a observación de mostras que se atopan en frascos ou placas de

fondo plano, por exemplo, os cultivos celulares, ou na manipulación de gametos e embrións vivos in

vitro en técnicas de fecundación asistida. O seu nome débese a que a fonte de luz está na parte superior

do microscopio e os obxectivos na parte inferior, baixo a platina. O feito de que estea invertido permite

achegar os obxectivos ás células, xa que nun MO convencional a distancia entre os obxectivos e o

fondo da placa sería moi grande. Independentemente de que o microscopio sexa convencional ou

invertido pode presentar os distintos dispositivos das distintas ópticas.

B) O microscopio electrónico non utiliza a luz visible (fotóns), senón electróns acelerados. Hai

dous tipos de ME:

B1.- O microscopio electrónico de transmisión (MET) consta dunha columna oca onde se fai o

baleiro para que os electróns, emitidos por un canón de electróns situado no alto da columna, non se

dispersen. Consta, ademais, de distintas lentes electromagnéticas (condensadora, obxectivo e

proxectora) e distintos diafragmas. A mostra sitúase entre a lente condensadora e a lente obxectivo. É

importante destacar que no MET as seccións ultrafinas non se colocan sobre portaobxectos, xa que os

53


electróns non son capaces de atravesar o vidro, senón sobre pequenas reixas de cobre ou níquel que non

impiden o paso dos electróns.

Os electróns pasan pola lente condensadora, que concentra o feixe de electróns procedente do

canón sobre a mostra, chegan á lente obxectivo que orixina e enfoca a imaxe, e para rematar a lente

proxectora magnifica a imaxe obtida. A imaxe obsérvase directamente nunha pantalla fluorescente, ou

indirectamente mediante a obtención dunha imaxe fotográfica ou dixitalizada. Para visualizar a imaxe

debe ter lugar a dispersión dos electróns ao atravesar a mostra e deben producirse interaccións deses

electróns cos átomos desa mostra. Na imaxe final veremos zonas claras (estruturas claras ou

transparentes aos electróns), polas que os electróns atravesaron a mostra, e zonas escuras (estruturas

densas aos electróns ou electrondensas) que corresponden ás rexións onde os electróns foron desviados.

B2.- O microscopio electrónico de varrido (MEB) utilízase para observar a superficie dunha

mostra que non foi seccionada (órganos ou partes de órganos, pequenos organismos, grans de polen,

células enteiras, orgánulos,…). Neste caso o feixe de electróns non está fixo, senón que se move e vai

rastrexando a superficie da mostra, que está recuberta dunha capa dun material metálico con gran

capacidade de transmisión de enerxía eléctrica (xeralmente utilízase ouro). A presenza dese material fai

que a superficie da mostra, ao ser varrida polo feixe de electróns, emita á súa vez outros electróns que

son recolleitos por un detector e orixinan unha imaxe en relevo da superficie da mostra que se observa

nun monitor de televisión. Do mesmo xeito que no MET, neste microscopio as imaxes obtéñense en

branco e negro.

OBXECTIVO

Que o alumno se familiarice coa metodoloxía que se leva a cabo no procesado de tecidos para a

súa observación no microscopio óptico. Para iso, nestas prácticas faremos seccións de tecidos animais,

previamente fixados, utilizando dous tipos de micrótomos: un “vibroslice” (ou vibrátomo) para

seccionar pezas de tecido sen incluír; e un micrótomo de rotación para seccionar pezas de tecido

incluído en parafina. A continuación, tinguiremos as seccións obtidas, montarémolas, e observarémolas

ao microscopio óptico de campo claro. Ademais, observaremos preparacións sen tinguir noutros tipos

de microscopios ópticos (campo escuro e contraste diferencial de interferencia (DIC) ou de Nomarski).

MATERIAL

Micrótomo de rotación, bloques de tecidos incluídos en parafina, vibroslice, placas Petri, pinceis,

placas con pocillos, cristalizadores con ponte, cubetas de vidro verticais, portaobxectos e

cubreobxectos, colorantes, auga destilada, etanol (70º, 96º, 100º), líquido intermediario (“histo-clear”),

medio de montaxe (Eukitt), microscopio óptico.

54


MÉTODOS:

Práctica 1: Seccionado, tinguidura e montaxe.

A.- Seccionado (microtomia). Manexo dun “vibroslice” e obtención de cortes de tecido animal

previamente fixado e sen incluír. Manexo dun micrótomo de rotación e obtención de cortes de tecido

animal previamente fixado e incluído en parafina.

B.- Tinguidura. B1.- Trala obtención de seccións dun tecido animal no “vibroslice” procédese a

realizar a tinguidura. Estas seccións flotantes (chamadas así porque debido ao seu grosor (50-80 m)

non se colocan nun portaobxectos para o seu procesado) tínguense en placas con pocillos. Cada pocillo

énchese cun reactivo e as seccións flotantes vanse cambiando coidadosamente de pocillo en pocillo coa

axuda dun pincel.

Con estas seccións levaremos a cabo a tinguidura con Tionina de Laskey, que é un colorante que

tingue de azul os compoñentes celulares que conteñen ácido ribonucleico (ARN). O protocolo desta

tinguidura é o seguinte:

1.- Lavar en auga destilada, 2 minutos.

2.- Etanol de 70º, 5 minutos.


4.- Tinguir con tionina de Laskey durante 10 segundos. ¡¡COIDADO!! hai que manter co pincel

as seccións para non perdelas de vista, xa que o colorante é moi escuro e tingue moi rápido.

5.- Paso rápido por auga destilada para eliminar o exceso de colorante.


7.- Etanol de 96º, tres baños de 1 minuto ata que deixe de eliminar colorante.

8.- Etanol 100º, 2 minutos.

9.- “Histo-clear”, 2 minutos.

10.- Montaxe. Colócanse as seccións nun portaobxectos, estíranse ben co pincel, cóbrense cunha

pinga de medio de montaxe (Eukitt) e ponse o cubreobxectos enriba evitando que se formen burbullas

de aire.

Práctica 2: Tinguidura, montaxe e observación.

B.- Tinguidura. B.2.- Trala obtención de seccións dun tecido animal no micrótomo de rotación

procédese a realizar a tinguidura. Previamente debemos proceder á eliminación da parafina que

impregna o tecido (desparafinado) e hidratar de novo o tecido (hidratación) que se tiña deshidratado no

proceso de inclusión. Para desparafinar e hidratar as seccións temos que pasalas polos seguintes

líquidos: “histo-clear” (10 min); etanol 100º (5 min); etanol 96º (5 min); etanol 70º (5 min) e auga

destilada (5 min).

55


56

Unha vez rehidratado o tecido procedemos a realizar a tinguidura, neste caso sobre o

cristalizador. Para iso, colócanse os portaobxectos sobre a ponte e vanse botando os diferentes líquidos

cunha pipeta Pasteur de plástico (cada reactivo coa súa pipeta correspondente) ata cubrir as seccións.

Unha vez transcorrido o tempo de tinguidura baléirase cada líquido no cristalizador e escórrese cada

porta sobre un papel de filtro antes de engadir o seguinte reactivo.

Con estas seccións levaremos a cabo a tinguidura con hematoxilina-eosina que é unha tinguidura

clásica e xeral moi utilizada en estudos de morfoloxía tisular e en anatomía patolóxica. Utilízanse dous

colorantes: a hematoxilina de Mayer, que é un colorante básico e tinguirá de azul os compoñentes

ácidos das células (ácidos nucleicos: núcleo), e a eosina é un colorante ácido e tinguirá de vermello ou

de rosa os compoñentes básicos (proteínas: citoplasma, matriz extracelular). O protocolo desta

tinguidura é o seguinte:

1.- Tinguir con hematoxilina de Mayer, 10 minutos.

2.- Lavar con auga corrente (cubeta debaixo da billa), 4 minutos.

3.- Tinguir con eosina, 35 segundos.

4.- Lavar con etanol de 96º ata eliminar o exceso de colorante. Para iso, botaremos o etanol sobre

os cortes cunha pipeta inclinando un pouco o portaobxectos para que o etanol caia ao cristalizador. A

continuación, pasamos o portaobxectos coas seccións tinguidas á batería de deshidratación.

5.- Cubeta de etanol 100º, 5 minutos.

6.- Cubeta de “histo-clear”, 3 minutos.

7.- Montaxe. Engádense unhas pingas de medio de montaxe (Eukitt) sobre as seccións e ponse o

cubreobxectos enriba evitando que se formen burbullas de aire.

C.- Observación. Observación das preparacións obtidas no microscopio óptico de campo claro.

Observación de preparacións sen tinguir no microscopio óptico de campo escuro e no microscopio

óptico de contraste diferencial de interferencia (DIC) ou de Nomarski.

CUESTIÓNS

1.- No noso laboratorio de técnicas histolóxicas pretendemos estudar a estrutura do músculo

esquelético de rato mediante a realización dunha tinguidura hematoxilina-eosina sobre seccións de 10

micrómetros de grosor.

a.- Describe con detalle os diferentes pasos do proceso que vai dende que extraemos o tecido do

animal ata que o observamos ao microscopio óptico.

b.- Tras realizar a tinguidura sobre as seccións de músculo esquelético, que compoñentes

celulares se tinguirán e por que?

c.- En que tipo de microscopio poderiamos observar as preparacións obtidas?

5. TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE

(código calendario de prácticas: BQ)

TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE

Introdución

Centrifugación e fraccionamento subcelular

A maioría dos laboratorios de Bioloxía dispoñen de centrífugas, das cales existen varios tipos.

Así, en función do rotor temos centrífugas con rotores basculantes ou con rotores de ángulo fixo, e en

base a velocidade que alcanzan teremos centrífugas (hasta ~3,000 xg), centrífugas de alta velocidade

(2,000-20,000 xg) e ultracentrífugas (15,000-600,000xg). Todas elas se empregan para separar

sustancias de masas ou densidades distintas, como por exemplo partículas sólidas (células, orgánulos,

etc) dun líquido ou ben líquidos con diferentes densidades. Os rotores basculantes manteñen os tubos en

posición vertical cando o rotor está en repouso, pero dita posición vólvese horizontal durante a

centrifugación, de xeito cas partículas sedimentan uniformemente no fondo do tubo. Nos rotores de

ángulo fixo, en cambio, os tubos están situados en ángulo (25º-52º), e as partículas van sedimentando

tanto no fondo como nos laterais dos tubos. Debido o seu deseño máis aerodinámico, este último tipo de

rotores alcanzan maiores velocidades. As microcentrífugas que imos empregar nesta práctica terán

rotores en ángulo fixo, e nos permitirán operar a 11,000-15,000 revolucións por minuto (rpm).

Finalmente, as ultracentrífugas caracterízanse por ser capaces de acadar altas velocidades (por exemplo,

100,000 rpm), tanto con rotores de ángulo fixo como basculantes.

Todas as centrífugas dispoñen dun motor eléctrico e dun rotor conectado a este a través dun

eixo. Tanto o eixo como o rotor están colocados dentro dunha cámara de seguridade; dita cámara está

pechada mediante unha tapa. No panel de control aparecen botóns de prendido/apagado, de selección de

velocidade, de nivel de freado, e nalgunhas de temperatura de traballo (entre -15ºC e 25ºC). O control

da temperatura evita incrementos debido á fricción que podería desnaturalizar as proteínas ou lisar as

células. As centrífugas dispoñen de tacómetros para coñecer a velocidade (rpm) de funcionamento, e

no caso das de alta capacidade e ultracentrífugas, de alarmas de aviso de posibles desequilibrios. Nas

ultracentrífugas, a velocidade extrema (máis de 100000 rpm) fai necesaria a existencia de sistemas de

baleiro na cámara para evitar o quecemento do rotor e mostras.

Os tubos empregados en centrifugación poden ser de vidro ou de plástico (poliestireno,

polipropileno), sendo máis resistentes os últimos. Os tubos poden ter formas (fondo cónico, fondo

redondo; sen tapa ou con tapa, etc) e capacidades diversas. O equilibrado e colocación dos tubos no

rotor é crucial, xa que se este proceso se realiza incorrectamente o proceso de centrifugación pode

pararse ou xerar sedimentos pouco compactados.

Aparte da velocidade de xiro, expresada en rpm, tamén emprégase como unidade de medida a

forza de aceleración, forza centrífuga relativa (RCF) ou número de veces que a forza de gravidade,

expresada en x g, estase a aplicar a mostra. Existe unha relación directa entre RPM e RCF: RCF= 1.12

x10-5 x r x (rpm)2, onde r é o radio do rotor (cm). Os valores en velocidade expresados en x g son

constantes entre as distintas centrífugas, pero non así os valores de rpm para un valor fixado de RCF,

pois é dependente do radio do rotor. No obstante, a maioría das centrífugas actuais permiten especificar

59


tanto RPM como RCF. Ademais, nos libros de instruccións das centrífugas aparecen táboas ou

nomogramas para determinar as rpm que debemos seleccionar para un valor fixo de RCF cando rotor e

radio son coñecidos.

O fraccionamento subcelular é un conxunto de métodos que permiten obter fraccións

enriquecidas en orgánulos (ex., mitocondrias, núcleos), fraccións de membrana (ex., membrana total,

membrana plasmática) ou complexos multiproteicos (ex., citoesqueleto) mediante dous etapas. Na

primeira ten lugar a rotura celular (lisado) mediante procedementos mecánicos suaves que poden

empregar ou non deterxentes (sonicación, homoxenizadores, etc). Nesta práctica realizaremos unha lise

hipotónica sen deterxentes, ao empregar unha solución cunha osmolalidade moi inferior o citoplasma

das células; isto xera a entrada de auga e a lise celular. Na segunda etapa sepárase a fracción desexada

mediante diversos criterios, como por exemplo diferencias en densidade (ex., centrifugación

diferencial). A centrifugación diferencial baséase na existencia de diferentes partículas na suspensión

que difiren, entre si e co medio, en canto a súa densidade. Se centrifúgase en condicións suaves (pouco

tempo, baixa velocidade) sedimentarán as partículas maiores e/ou máis densas. Cando o sobrenadante

da primeira centrifugación é centrifugado de novo en condicións máis intensas sedimentarán as

partículas máis densas; o proceso pódese continuar indefinidamente.

Na práctica de hoxe imos empregar un protocolo de centrifugación

diferencial cun modelo celular moi sinxelo: o eritrocito humano. Os eritrocitos

perderon o seu núcleo, membranas internas e mitocondrias no proceso de

maduración, de xeito que poden ser empregados para a producción de

pantasmas, vesículas obtidas despois de liberar o contido citoplasmático

mediante hemolise e que constitúen un preparado case puro de membrana

plasmática. Dentro desta membrana plasmática existen tanto proteínas

integrais como periféricas; as primeiras, embebidas na membrana plasmática, e

as segundas, unidas a súa cara interna formando un entramado de proteínas

periféricas denominado citoesqueleto. Dentro das integrais temos a proteína

transportadora de anións, o transportador de glucosa e as glicoforinas, e

dentro das citoesqueléticas a espectrina, a actina e a proteína da banda 4.1

(Figura 1).

FIGURA 1: Patrón electroforético das proteínas presentes nos pantasmas

de membrana de eritrocitos (Tomado de B.W. Shen e cols, 1986): Bandas 1

e 2: Cadeas e da Espectrina. Bandas 2.1, 2.2 e 2.3: Ankirina. Banda 3:

proteína transportadora de anións. Banda 4.1: Proteína do citoesqueleto. Banda

4.2: Paladina. Banda 4.9: Demantina. Banda 5: Actina. Banda 6: Gliceraldehido-3-fosfato

deshidroxenasa.

60


Electroforese

A electroforese baséase no movemento que provoca o establecemento dun campo eléctrico

sobre unha molécula con carga e que permite a separación, por exemplo, de proteínas, ADN ou ARN.

Según a expresión v= Ez/f, a velocidade de migración (V) destas moléculas dentro dun campo eléctrico

depende da forza do campo (E), da carga da proteína (z) e do coeficiente de fricción (f). Este último, á

súa vez, varía ca forma da molécula, o seu tamaño e a viscosidade do medio. Esto fai cunha sustancia

anfotérica como as proteínas, nun tampón de pH determinado (que non se corresponda co punto

isoeléctrico desta), presente unha carga eléctrica neta. Deste xeito, diferentes proteínas cunha relación

carga/masa distinta e en estado nativo (non desnaturalizado) poidan ser separadas o establecerse un

campo eléctrico mediante a electroforese nativa.

Sen embargo, nas electroforeses desnaturalizantes como a da práctica, a carga da proteína non

vai ser a endóxena, senón que ven dada polo dodecil sulfato sódico (SDS) do tampón de mostra. O SDS

é un deterxente aniónico que únese cunha estequiometría de aproximadamente unha molécula de SDS

por cada dous aminoácidos. Isto lle confire á proteína unha carga negativa proporcional a súa masa; é

dicir, iguala a relación carga/masa das proteínas a separar na electroforese. Ademáis, a repulsión das

cargas do SDS destrúe as interaccións non covalentes o que, xunto co calor, produce o despregamento

proteico. Deste xeito, o aplicar un campo eléctrico a mostra, os complexos proteína:SDS migrarán cara

ó polo positivo e separaranse dacordo co peso molecular (as proteínas máis pequenas migrarán máis

rápidamente cas grandes). Aparte do SDS, o tampón de mostra tamén contén -ME ou DTT, moléculas

que rompen os pontes disulfuro das proteínas, glicerol ou sacarosa, para que a mostra teña unha maior

densidade co tampón de electroforese e caia dentro dos pocillos do xel, e azul de bromofenol, un

colorante con carga negativa ca movilidade electroforética dun pequeno polipéptido e cuxa función é a

de ir por diante das proteínas (fronte da electroforese).

As separacións electroforéticas realízanse habitualmente sobre distintos medios de soporte, que

evitan as correntes de convección e serven como tamices moleculares. Estos son habitualmente de tipo

continuo, como os xeles de almidón, agarosa ou os polímeros químicos (poliacrilamida). Os xeles de

poliacrilamida son producidos mediante a polimerización de acrilamida e o seu derivado bifuncional, a

bisacrilamida. Esta última molécula establece os enlaces cruzados que permiten xerar poros cun tamaño

controlado. Empréganse como catalizadores da reacción persulfato de amonio e TEMED. Os geles de

poliacrilamida son descritos en función de dous parámetros, que son a concentración total de monómero

ou %T [(gramos de acrilamida +gramos de bisacrilamida/volume total en mL) x 100], e a porcentaxe en

peso de crosslinker ou %C [(gramos de bisacrilamida/gramos de acrilamida +gramos de bisacrilamida)

x 100]. Valores de %C do 2.6% (proporción 37.5:1), como nesta práctica, ou 3.3% (proporción 29:1)

son axeitados para separacións de proteínas, namentres que %C do 5% (proporción 19:1) o son para a

secuenciación do DNA.

61


A SDS-PAGE pode realizarse horizontalmente ou verticalmente, e pode ser continua ou

discontinua; a máis empregada, e usada na práctica, é a discontinua. Nesta modalidade prepáranse 2

xeles: o xel separador (pH 8,8), onde se resolven as proteínas e que ten un %T elexido en función do

peso molecular das proteínas a separar (menor canto maior sexa o peso da proteína), e o xel

concentrador (%T = 4%, pH 6,8), situado sobre o primeiro. Baixo a acción do campo eléctrico

aplicado á solución a través dos electrodos con distinta carga (positiva/ánodo & negativa/cátodo), os

ións (neste caso, a mistura proteica con carga negativa -e polo tanto anións- colocada sobre o xel

concentrador) migran cara o electrodo de carga oposta (o ánodo). Cando as proteínas chegan o xel

separador concéntranse, de xeito que todas inician a separación no mesmo intre; isto mellora

sensiblemente a resolución da electroforese.

En calquera sistema eléctrico, a intensidade da corrente producida é directamente proporcional

a voltaxe aplicada e inversamente proporcional a resistencia (Lei de Ohm, V=IR). A electroforese pode

ser levada a cabo fixando un valor de voltaxe (por exemplo, 100-200 V, como nesta práctica) ou de

intensidade, pero en calquera caso débese de levar a cabo o máis rapidamente posible para evitar a

difusión e maximizar a resolución. Se ben moitas electroforeses realízanse a temperatura ambiente

(RT), como a da práctica, de cando en vez as elevadas voltaxes implican moita xeración de calor, o que

fai necesario o uso de xeles moi delgados e sistemas de enfriamento.

Unha vez a electroforese remata e as bandas de proteínas foron resoltas no xel separador estas

deben de ser visualizadas. Para elo empréganse diversos métodos de tinguido con moléculas afíns as

proteínas, tales como o azul de Coomassie (como o R-250, ou o G-250 da práctica), co que se poden

visualizar 0.1-0.5 μg de proteína/banda. Outro método de tinguido son as sales de prata, con elevada

sensibilidade (hasta 0.1 ng proteína/banda) pero baixa reproducibilidade. Métodos de tinguido con

sensibilidades comparables a da prata, pero máis reproducibles, son os compostos fluorescentes, como o

SYPRO Ruby, Flamingo Ruby, Deep Purple, Pro-Q Emerald.

Finalmente, varias son as aplicaciones da SDS-PAGE, como por exemplo analizar o grao de

pureza dunha proteína, determinar o seu peso molecular (ou cambios neste por proteolise), ou coñecer a

concentración dunha proteína na mostra.

Obxectivos:

Empregar un protocolo sinxelo de fraccionamento diferencial para purificar membranas

plasmáticas de eritrocitos humanos para que os/as alumnos/as se familiaricen cas técnicas de

centrifugación.

Que o/a alumno/a poña en práctica os fundamentos teóricos adquiridos no seminario sobre

electroforese e que coñeza unha das suas posibles aplicacións: a análise de misturas complexas

de proteínas e os datos que se poden extraer de dita análise.

62


63

Instrumental:

Equipo de electroforese MiniProtean da casa comercial BioRad® (ver foto superior), que

traballa cun sistema de mini xeles que require pouca mostra, é máis rápido e mantén unha alta

resolución na separación das proteínas. Inclúe un xogo de vidros (pequenos e grandes),

separadores, peites de 10 pocillos, marcos para suxeitar os vidros e “casting stands” para xerar

8 xeles de SDS-PAGE. Tanque e tapa.

Microfuga Bata e guantes (medianos e

pequenos) Fonte de alimentación (capacidade

200V, 500 mA) Contedor de residuos biolóxicos e

químicos Axitador magnético con capacidade

para ferver mostras. Bandexa de vidro para o tinguido

dos xeles Microondas

8 kitasatos Micropipetas: p1000, p200 e p20

8 pipetas vidro 10 mL +chupóns 10

mL

Puntas azuis e amarelas + caixas

Tubos eppendorf® de 1.5 mL,

brancos

Reactivos

Cloruro sódico Solución de tinguido baseada en

azul de coomassie G-250 Biosafe® Cloruro potásico

Marcadores de peso molecular Fosfato de sodio monobásico

Acrilamida Fosfato de sodio dibásico

Bisacrilamida


Tris

SDS (sodio dodecil sulfato)

TEMED

Persulfato de amonio

2-mercaptoetanol (-ME)

Glicerol

Azul de bromofenol

Glicina

EDTA

Ácido clorhídrico (HCl)

Solucións

Solución 1: Tris/HCl 1,5 M pH 8,8, 100 mL. Pesar 18,15 g de Tris. Disolver o Tris en

50 mL de auga destilada. Engadir gota a gota HCl concentrado ata que o pH baixe a 8,8.

Compretar con auga destilada ata o volume final (100 mL). Estable por meses a 4ºC.

Solución 2: Tris/HCl 1 M pH 6,8, 100 mL. Pesar 12,1 g de Tris. Disolver o Tris en 50

mL de auga destilada. Engadir gota a gota HCl concentrado ata que o pH baixe a 6,8.

Compretar con auga destilada ata o volume final (100 mL). Estable por meses a 4ºC.

Solución 3: SDS 10% (w/v), 100 mL. Pesar 10 g de SDS. Engadir auga destilada ata

compretar o volumen de 100 mL. O SDS é un po fino neurotóxico, polo tanto débese

usar máscara, luvas e lentes de protección. Almacenar a RT.

Solución 4: Glicerol 50% (v/v), 100 mL. Misturar un volume de 50 mL de glicerol o

100% con 50 mL de auga destilada. Almacenar a RT.

Solución 5: Azul de Bromofenol 1% (w/v), 10 mL. Pesar 100 mg de azul de

bromofenol. Compretar con auga destilada ata 10 mL e misturar ata disolver. Filtrar a

solución en papel Whatman No 1 para eliminar o colorante non disolto. Almacenar a

RT.

Solución 6: Acrilamida 30% (100 mL). A solución de acrilamida o 30% (w/v) é unha

mistura de acrilamida (29,2 g) e bisacrilamida (0,8 g). Pesar ámbolos dous reactivos e

engadir auga destilada ata 100 mL. Filtrar en papel de filtro Whatman Nº1 A

acrilamida en po e en solución é neurotóxica, polo tanto débese usar máscara, luvas e

lentes de protección para a súa manipulación, ou mellor mercala xa feita. Estable por

meses a 4ºC.

Solución 7: Persulfato de amonio o 10% (w/v), 5 mL. Pesar 0,5 g de persulfato de

amonio. Disolver en 5 mL de auga destilada. Almacenar a -20ºC.

Solución 8: Tampón de electroforese 1X, 1 L. Pesar 3 g de Tris (25 mM), 14,4 g de

glicina (192 mM) e 1 g de SDS (0,1%). Engadir auga destilada ata completar 1 L. O pH

debería de ser aproximadamente 8,3. Pódese preparar unha solución 10 veces

concentrada e diluir o volumen necesario no momento da electroforese. Esta solución

pode almacenarse indefinidamente a RT.

64


Solución 9: Tampón de mostra 5X, 10 mL. Misturar 0,6 mL de Tris/HCl 1M pH 6,8

(solución 2; 60 mM), 5 mL de Glicerol 50% (solución 4; 25%), 2 mL de SDS 10%

(solución 3; 2%), 0,5 mL de 2-mercaptoetanol (14,4 mM), 1 mL de azul de bromofenol

(solución 5; 0,1%) e 0,9 mL de agua destilada. Almacenar a -20 ºC.

Solución 10: Tampón fosfato salino ou PBS, 1L. Pesar 8 g de cloruro de sodio

(NaCl), 0,2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,24 g de fosfato de potasio monobásico

(KH2PO4) e 1,44 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4). Levar ata 1L con auga

destilada. Non axustar o pH. Almacenar a 4ºC.

Solución 11: 1 M tampón fosfato pH 7.0, 200 mL. Preparamos primeiro as soluciones

nai: solución A: 2 M fosfato de sodio monobásico (2,76 g NaH2PO4 H2O en 10 mL de

auga destilada); solución B: 2 M fosfato sodico dibásico (2,84 g de Na2HPO4 en 10 mL

de auga destilada). Misturar 3,9 mL de solución A e 6,1 mL de solución B. Diluir ata 20

mL con auga destilada para xerar unha solución 1M.

Solución 12: 0.5M EDTA pH 8.0. Pesar 18,612 g de EDTA disódico 2 H2O e disolver

en 70 mL de auga destilada. Axustar a pH 8.0 con 10 N NaOH (o EDTA non se

disolverá a menos que teñamos un pH 8.0) e completar ata 100 mL con auga destilada.

Gardar a 4ºC.

Solución 13: Tampón de lise hipotónico, 100 mL. 5 mM fosfato sódico pH 7.0, 0.5

mM EDTA. Misturar 0,5 mL de 1M tampón fosfato pH 7.0 (solución 11) con 0,1 mL de

0.5M EDTA pH 8.0 (solución 12). Compretar con auga destilada ata 100 mL. Gardar a

4ºC.

Protocolo:

1er día, 2h 30 min

Obtención dos eritrocitos:

1. Coller 500 l sangue humana tratada con EDTA e a depositamos nun tubo eppendorf de

1.5 mL. Centrifugar a 1000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).

2. Eliminar o plasma sanguíneo e a primeira capa de leucocitos (que está sobre os

eritrocitos empaquetados). Lavar con 500 l de PBS pH 7.4, que é isotónico co

citoplasma das células vermellas.

3. A suspensión centrifúgase a 1,000 xg durante 10 min a RT.

4. Descartar o sobrenadante e repetir o lavado con 500 l de PBS pH 7.4 dous veces máis

para eliminar todas as proteínas do soro.

65


Lise hipotónica dos eritrocitos:

5. Empregamos un protocolo de lise hipotónica descrito por G. Fairbanks e colaboradores

en 1971. As células rómpense tomando unha fracción do volumen empaquetado (por

exemplo, 150 l) e engadindo aproximadamente 10 volúmenes (1,35 mL) de tampón

hipotónico frío (5 mM fosfato sódico pH 7.0, 0.5 mM EDTA).

6. Deixar lisar durante 15 minutos en xeo.

Fraccionamiento del lisado mediante centrifugación:

7. A suspensión centrifúgase a 12,000 xg durante 10 minutos. Tede coidado ca colocación

dos tubos!!!!!

8. O sobrenadante retírase por aspiración e gárdase etiquetado como citosol.

9. O precipitado, que contén as pantasmas de membrana, resuspéndese en 5 mM fosfato

sódico pH 7.0 frío para a realización de varios lavados máis (~3), ata que as pantasmas

de membrana sexan brancos (é dicir, ata que non conteñan hemoglobina).

10. As proteínas de membrana disólvense incubando as pantasmas con 25 l de tampón de

mostra de electroforese 1X.

11. Do sobrenadante citosólico (paso 8) tómanse 20 l, os que se lle engaden 5 l de

tampón de mostra de electroforese 5X.

12. As tapas dos eppendorf que conteñen os dous tipos de mostras son perforadas cunha

agulla. As mostras férvense durante 15 minutos, centrifúganse a 12,000 xg durante 5

minutos a RT para eliminar as proteínas precipitadas e os sobrenadantes gárdanse en

tubos eppendorf novos etiquetados (tubo 1: citosol; tubo 2: proteína de membrana) a -

20 ºC ata o día seguinte.

2º día. 2h 30 min.

SDS-PAGE y tinción.

1. Ensamblar o molde formado polos soportes, vidros e separadores.

2. Preparación dos xeles: Cada grupo vai preparar un minixel, aínda que o final

sóamente dous deles serán empregados para cargar as mostras de tódolos

grupos.

3. Prepárase o xel separador cunha porcentaxe de acrilamida do 12% misturando

nun kitasato e na mesma orde 4 mL de auga, 2,5 mL de Tris HCL 1.5 M pH 8,8,

100 l de 10% SDS e 2.5 mL de 30% acrilamida/0.8 % bisacrilamida.

Engádense 100 l de persulfato amónico o 10% e 4 l de TEMED.

4. Empregando unha micropipeta p1000 énchese o sandwich formado polos vidros

e os separadores con dita solución; non se deben formar burbullas. Deixar

66


aproximadamente 1,5 cm entre a solución de acrilamida e o vidro pequeno. Se

completa con auga con moito coidado para evitar que o borde do xel polimerice

de xeito irregular, e se deixa polimerizar durante 30 minutos a RT.

5. Unha vez polimerizado o xel separador, descartar a auga da superficie do

mesmo e preparar 4 mL de solución do xel concentrador (4%) misturando 2,7

mL de auga destilada, 0,67 mL de solución 30%Acrilamida/0.8%bisacrilamida,

0,5 mL de Tris/HCl 1 M pH 6,8, 40 μl de 10%SDS, 40 l de 10% persulfato

amónico e 4 μl de TEMED. Empregando unha micropipeta p1000, depositade a

solución sobre o xel separador xa polimerizado e insertar finalmente o peite con

coidado de non formar burbullas. Deixar polimerizar durante 30 minutos a RT.

6. Durante o transcurso desta última polimerización se desconxelan as mostras de

proteína tanto do tubo 1 (citosol) como do tubo 2 (proteína de membrana) para

ser cargadas no xel (20 l de cada unha; 4 grupos por xel). Se preparan tamén

os marcadores de peso molecular.

7. Electroforese: colocar dous dos xeles (os que quedaran mellor) no tanque de

electroforese con aproximadamente 500 mL de tampón de electroforese 1X

(solución 8). Quitar coidadosamente o peite para que queden preparados os

pocillos do xel. Os pocillos deben de ser limpados con tampón de electroforese

con micropipeta para eliminar o monómero de acrilamida non polimerizado.

8. As mostras de todos os grupos e os marcadores de peso molecular son cargados

nos dous xeles. A unidade de electroforese conéctase a fonte de alimentación, e

se aplica unha voltaxe constante de 100-200V.

9. Tinguido: Finalizada a electroforese extraénse os xeles da unidade de

electroforese e deposítanse nunha cubeta de cristal. Os xeles se fixan e lavan

duas veces con 50 mL por xel de 20% etanol en auga destilada no microondas

(de 45 segundos a 1 minuto; 50-70ºC). Axitar 5 minutos.

10. Lavar unha vez con 100 mL de auga destilada/xel a ~80ºC no microondas,

axitar durante 2 minutos e repetir o lavado.

11. Tinguir con 25 mL de solución de tinguido Biosafe por gel, suficiente como

para cubrir os xeles. Tapar con parafilm a cubeta e meter no microondas.

Quecer a 70-80ºC a máxima potencia (dous pulsos de 20 segundos; parar se

comeza a ferver). Sacar e deixar en axitación suave durante 10 minutos.

12. Eliminar a solución de tinguido. Lavar con 100 mL de 10% etanol en auga

destilada por xel en microondas a 50-70ºC. Sacar do microondas e poñer papel

adsorbente. Axitar 15 minutos (o ata que se faga o destinguido correctamente).

67


68

EXERCICIOS DA PRÁCTICA DE CENTRIFUGACIÓN E ELECTROFORESE

Pregunta 1:

Representar o logaritmo do peso molecular dos marcadores no eixo Y fronte a

movilidade relativa de ditos marcadores (distancia migrada polo

marcador/distancia migrada pola fronte de azul de bromofenol) no eixo X.

Calcular o peso molecular das bandas 1, 2, 3, 4.1 e 4.2. Empregando o Atlas

Proteico Humano (http://www.proteinatlas.org) obter os pesos moleculares das

devanditas proteínas e comparar os resultados obtidos na práctica cos da base de

datos.

Pregunta 2

A proteína representada a continuación é a proteína transportadora de anións de

eritrocitos (banda 3). Imaxine que purificou dita proteína en estado oxidado e que

as cisteínas 317 y 201 están implicadas na formación de pontes disulfuro intra- e

intermoleculares (entre diferentes monómeros). Dibuxe un esquema do patrón de

bandas, cos seus pesos moleculares correspondentes, que esperaría tras unha SDS-

PAGE desta proteína en presencia e ausencia de beta-ME.

http://www.proteinatlas.org/

6. MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA

(código calendario de prácticas: EDAFO)

MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA

PRÁCTICA

Realizarase unha saída a unha zona próxima á cidade para facer o estudo do medio físico dun

emprazamento, mediante a caracterización dos distintos factores do medio e das súas interrelacións

Para cubrir polo alumnado:

Data da saída

Área de estudo

Cartografía utilizada

Datos do emprazamento

‐ Posición fisiográfica

‐ Coordenadas xeográficas

‐ Pendente

‐ altitude

Estudo do relevo. Corte topográfico

Materiais xeolóxicos

Morfoloxía dos solos

Estudo do clima. Diagrama de Thornthwaite

Vexetación e uso do solo

Interpretación conxunta dos factores do medio físico nese emprazamento

71

MEDIO FÍSICO E TÉCNICAS DE CARTOGRAFÍA

72

7. MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE

(código calendario de prácticas: ECO)

MÉTODO CIENTÍFICO E TÉCNICAS DE MOSTRAXE

1. INTRODUCIÓN

1.1. DESENVOLVEMENTO DA PRÁCTICA.

O sistema de posicionamento global mediante satélites (GPS: Global Positioning System) supón un dos

máis importantes avances tecnolóxicos das últimas décadas. Deseñado inicialmente como ferramenta

militar para a estimación precisa de posición, velocidade e tempo (para determinar por triangulación, a

altitude, lonxitude e latitude de calquera obxecto na superficie terrestre), utilizouse tamén en múltiples

aplicacións civís, incluíndo o traballo de campo en disciplinas tales como a botánica, a zooloxía, a

ecoloxía, as ciencias da terra, etc.

Nesta práctica adquiriredes unhas nocións mínimas sobre o uso destes equipos, así como das limitacións

dos equipos que de modo máis frecuente empréganse no noso campo. A práctica consistirá en tres fases

ben diferenciadas que se realizarán en tres sesións consecutivas.

Na primeira sesión realizarase no campo (neste caso no Campus Sur da USC). A sesión efectuarase en

parellas ás que a cada unha corresponderalles o seu respectivo receptor GPS. O lugar no que se iniciará

a práctica será a porta principal da Facultade de Bioloxía. É posible que durante as horas da práctica

existan precipitacións ou condicións atmosféricas adversas, que en principio non suporán suspensión da

práctica a non ser que sexan extremas. Recomendámosvos a lectura do apartado “recomendacións

xerais para o traballo no campo” para que acudades convenientemente preparados. Do mesmo xeito é

necesario que previamente se leu o documento sobre os “Sistemas Satelitales de Navegación Global”,

que se poderá descargar da páxina da USC Virtual, correspondente a esta materia.

Durante, esta práctica primeiramente realizarase unha breve introdución a preto das recomendacións

xerais para o traballo no campo. Posteriormente explicarase o emprego dos diferentes modelos de GPS

que se van a utilizar durante o desenvolvemento da mesma, proseguindo coa asignación do GPS

correspondente a cada parella. A continuación procederase á captura de datos, tal e como se especifica

no correspondente apartado desta memoria (Sección 2.2).

A segunda sesión realizarase na sala de informática. Comezarase cun tempo para a aclaración de

dúbidas sobre o documento de “Sistemas Satelitales de Navegación Global”. A continuación

explicarállevos como configurar un porto USB como un porto COM, e como importar os datos dun

GPS a un PC, a través dun software específico da casa dos GPS empregados. Realizardes unha

importación de datos desde o GPS que se vos asignou na sesión anterior. A continuación aprenderedes a

exportar (a un arquivo de texto sen formato) desde o devandito software os arquivos de datos que

previamente importastes. Estudaremos o contido do arquivo exportado e modificarémolo para que poida

ser empregado nun Sistema de Información Xeográfica (GIS). A continuación desde un GIS (ArcMap

9.2 Esri©) importarase devandito arquivo e aprenderemos unhas mínimas nocións de edición de datos

que nos permitan crear arquivos de puntos, liñas, polilíneas e polígonos a partir de puntos, así como a

modificar arquivos de puntos. Por último aprenderemos a deseñar mostraxes desde un GIS mediante

75


“Hawth's Analysis Tools for ArcGIS”, creando arquivos de puntos. Unha vez creado estes arquivos

aprenderemos a exportalos desde o ArcMap e a importalos ao GPS.

A última sesión realizarase no campo (de novo no Campus Sur da USC). A práctica efectuarase en

parellas ás que a cada unha corresponderalles o seu respectivo receptor GPS. O lugar no que se iniciará

a práctica será a porta principal da Facultade de Bioloxía. As recomendacións climatolóxicas da

primeira sesión volven ser aplicables. Comezarase coa expiación do uso do GPS en navegación, tras o

cal procederedes a buscar neste modo as coordenadas das mostraxes xeradas na sesión anterior. Unha

vez cheguedes a estas coordenadas procederedes á adquisición de datos inmediatos (i.e. orientación,

pendente, altitude, pedregosidade, estima da cobertura vexetal por estratos), para proseguir á mostraxe

de árbores en parcelas de radio de 20 metros.

76


1.2. RECOMENDACIÓNS XERAIS PARA O TRABALLO NO

CAMPO

Aínda que para a práctica que imos realizar non abandonaremos o Campus Sur da USC, é conveniente

que coñezades algúns aspectos e medidas de seguridade importantes á hora de realizar o traballo de

campo. Non desdeñes estes consellos, si traballas no campo co paso do tempo acabarás,

desgraciadamente, coñecendo a persoas que o pasaron moi mal por desatendelos.

1.2.1. Recomendacións xerais

Non saiades nunca sós ao campo. Por cuestións de seguridade, é necesario saír como mínimo en

parellas. Non te tomes esta recomendación a treo. Informade sempre a unha persoa próxima das vosas

intencións sobre a ruta que ides seguir.

Cando vaiamos con persoas con diferente forma física, o que ten a peor forma marca o ritmo do grupo

ao que nos adecuaremos con paciencia. Dosificade os esforzos e descansade cando o necesitedes. Si

suades, non esquezades abrigarvos ao descansar.

Non esquezades nunca o teléfono móbil coa batería cargada (aínda que en moitas zonas non teredes

cobertura) nin o GPS (cando o teñades). Si non coñeces perfectamente a zona consulta antes cartografía

e leva sempre un mapa.

Non comades froitos ou fungos que non saibades con seguridade que son comestibles. Non bebades

auga que non sexa potable de forma verificada. Ollo coas augas de alta montaña; en ocasións as altas

concentracións minerais poden causar problemas gástricos.

1.2.2. Condicións meteorolóxicas

Consultade sempre unha predición meteorolóxica fiable (i.e. http://meteogalicia.es) antes de saír ao

campo. Si as condicións son adversas ou hai risco das mesmas, sempre que sexa posible aprazade a

saída. De non ser así tomade as maiores precaucións posibles.

Nos días calorosos, empezade a actividade co tempo necesario para acabala antes da hora de máis calor.

Coidado coa caída da noite, consultade previamente a hora do ocaso e tede en conta que dentro de

cubertas vexetais e/ou en vaguadas e/ou en pendentes con orientación este e/ou co ceo encapotado a luz

extínguese antes. Calculade cunha ampla marxe de seguridade - sempre pode haber imprevistos - o

tempo do camiño de retorno.

1.2.3. Recomendacións sobre a roupa e calzado

Hai que levar a roupa e o calzado adecuado e dependendo da época do ano. Selecciona sempre roupa

cómoda. Para unha saída sinxela (p.e. camiños, pistas, etc.) é suficiente un chándal e uns deportivos. Si

trátase dun traballo en campo xa teremos que levar boa roupa e calzado.

77


A roupa debe de ser lixeira, que permita o traballo físico e que transpire. Que a roupa se poida quitar

por capas é unha boa opción cando fai frío e imos realizar traballo físico. En canto á protección da

choiva no mercado hai unha gama moi ampla de tecidos impermeables. Si non ides traballar con

asiduidade no campo un impermeable e un pantalón plástico son unha opción óptima (véndeno en

calquera ferraxaría a un prezo moi razoable). O problema do plástico é a falta de transpiración, por iso

si pensades saír con frecuencia ao campo ou traballar en alí no futuro é posible que vos compense

realizar un investimento noutras opcións. Como dixemos existe unha gama amplísima de tecidos onde

elixir, ademais das características previamente comentadas (lixeiras, cómodas e que transpiren) tede en

conta a resistencia á abrasión e ás posibles roturas ocasionadas pola vexetación. Tanto o plástico como

algunhas pezas de alta montaña non están deseñadas para traballar entre vexetación que posúa petiscos

ou espiñas (o que é habitual na nosa xeografía, p.e. Ulex sp. ou Rubus, sp.), que se rasgarán rapidamente

perdendo a súa impermeabilidade. Os cortaventos encerados reúnen todas estas características e resultan

moi difíciles de rasgar (podendo ser reparados cando isto ocorre), no mercado existen multitude de

marcas e prezos tanto de chaquetas como de cubrepantalóns. É interesante que as chaquetas teñan petos

externos de rápido acceso así como petos carpeteros, etc. Cando hai choiva ou risco da mesma levade

sempre unha muda completa.

En canto ao calzado levádeo resistente e cómodo. Comprade botas que se axusten ás vosas necesidades,

prestando atención aos diferentes tipos de solas, que son a parte máis importante da bota, deben dar

agarre á vez que ser duradeiras. A selección dunha bota de calquera marca que teña sola “Vibram” é

acertada. Si optades por botas con membrana de Goretex, sede conscientes que si se vos chega a romper

a membrana, ao ter que impermeabilizar externamente a bota, os tecidos interiores dan peores

resultados que en botas sen membrana. Independentemente da opción escollida, as polainas de cordura

son moi aconsellables cando chove, protexen tanto a bota como a parte baixa do pantalón, que en

ocasións queda ao descuberto do cubrepantalón. Non uses nunca calzado novo para unha saída ao

campo. Coidádevos os pés, prestade atención a que non teñades engurras nos calcetíns para evitar as

bochas. Os calcetíns con teflón son unha correcta solución ao problema das bochas. Leva sempre uns

calcetíns de reposto.

Unha solución de emerxencia, ou para aforrar investimentos, que serve tanto para tecidos de algodón

(p.e. un pantalón vaqueiro) como para calquera calzado de pel (p.e. uns deportivos) é o uso de sprays

impermeabilizantes que poderedes atopar en calquera tenda de deportes ou armería.

Aínda que faga bo tempo é sempre aconsellable levar un chubasquero. Nos días de sol non esquezas

unha gorra ou chapeu e as lentes de sol. Nos días de frío un pescozo de tecido polar é un bo aliado, e

con frío extremo un pasamontañas.

1.2.4. Recomendacións sobre o equipamento

78


Levade unha pequena mochila impermeable cunha navalla, un cordón, unha lanterna ou frontal, mistos,

unha bolsa de plástico e papel hixiénico. Si tedes cámara de fotos levádea convosco.

É conveniente levar unha botella de auga, froitos secos, galletas e froita. Durante a xornada bebe auga e

toma algún alimento de cando en vez.

Levade convosco un pequeno botiquín con desinfectante, gasas, esparadrapo, apósitos adhesivos,

tesoiras, pinzas, analxésicos, pomada antiestamínica, pomada para as queimaduras, vaselina, protección

solar e repelente de insectos.

1.2.5. Recomendacións no caso de que nos perdamos

Procura non afastarche nunca do grupo ou parella. Si por calquera razón debes apartarche, avisa ao

resto para que espérenche. Si algunha vez pérdesche, espera, en canto alguén observe que faltas volverá

a por ti. É máis fácil atoparche por onde xa se pasou, así que é mellor esperar e non empezar a andar sen

saber onde ir. Cando alguén se perde os equipos de procura adoitan facer sinais cun chifre (óuvese máis

lonxe que a voz), procura contestar gritando.

1.2.6. Recomendacións en caso de accidente

O número de emerxencias internacional é o 112. No entanto en ocasións atopárdesvos en zonas sen

cobertura ou nas que a asistencia médica pode tardar moito en chegar por iso é conveniente que teñades

formación en primeiros auxilios (atragantamiento, corpos estraños, escordaduras, luxaciones, fracturas,

transporte de accidentados, feridas, hemorraxias, mareo, lipotimia, picaduras e mordeduras e RCP

básica). De non ser así busca onde facer un curso (consultade no Servizo de Vixilancia dá Saúde dá

USC).

1.2.7. Recomendacións para como tomar notas no campo

É conveniente que levedes sempre un cartafol ou un portafolios duro (de plástico ou metal) que vos

sirva de soporte á hora de escribir. Tomade notas sempre con lapis e sobre papel de alto gramaxe, xa

que no caso de que a folla se molle a impresión non se borra, a diferenza da tinta dun bolígrafo ou un

rotulador. Canto maior sexa o gramaxe menor será a posibilidade de que rompa ou desfaga si móllase.

Para previr a choiva no mercado existen protectores plásticos para papel normal ou papel plastificado

con calco.

1.2.8. Recomendacións para os desprazamentos

Cumpre sempre as recomendacións xerais sobre seguridade ao volante. Polo menos un dos

acompañantes debe conducir. Os desprazamentos no campo realízanse usualmente en todoterreo.

Adquirir coñecementos en condución “off-road”, emprego de cabestrantes (i.e. “winch”) seravos

79


necesario si pensades traballar no campo no futuro. Cando empreguedes un todoterreo non esquezades

equipalo cunha pa, luvas, ferros e cabestrante manual, cando o coche non o teña eléctrico.

80


2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. SESIÓN PRIMEIRA

O profesor asignarache unha das zonas do esbozo adxunto para que comeces a práctica. Debes

dirixirche a esa zona e buscar nas páxinas seguintes o código correspondente á devandita zona para

realizar a captura de datos que se sinala na correspondente tarefa para esa zona. Posteriormente

diríxeche á seguinte zona (da zona 1 á 26 en bucle pechado) e realiza a correspondente tarefa e así

sucesivamente ata esgotar o tempo da práctica. Os mapas individuais de cada zona non están orientados

nin teñen norte, así que utiliza o adxunto para orientar cada un.

81


ZONA: 01 Facultade de Química

TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 20 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do edificio que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 01) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 01_01.

NOTAS: Guíache para establecer os vértices polas esquinas do edificio

PROBLEMAS OBSERVADOS (perda de cobertura, baixa dispoñibilidade de satélites, dúbidas, etc.)

01

10

11

1213

02 03

04

05

06 07

08

09

1415

Fuente de la cartografía: http//www.usc.es/flora/index.html

20 17

18

16

19

82


ZONA: 02 Entrada Principal Campus Sur

TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta principalmente por varias especies diferentes cedros, tullas, criptomerias, magnolios, adelfas, etc. (Cedrus deodara, Euonymus japonicus, Magnolia grandiflora, Prunus cerasifera var. Pisardii, Nerium oleander, Criptomeria japonica, Cedrus atlantica, Camellia japonica, Thuja orientalis e Salix babilonica) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 02_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 02_F. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.

NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Non inclúas as árbores da beirarrúa.



83


ZONA: 03 Facultade de Dereito

TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta por cedros, álamos e un ciprés (Cedrus deodara, Cedrus atlantica, Populus alba e Cupressus lusitanica) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 03_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla “mark·” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 03_F. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo..

NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Non inclúas os tejos nin o piñeiro.



84


ZONA: 04 CESGA, CSIC, Biblioteca C.A. y Guardería

TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 10 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 04) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 10), p.e. 04_01.

Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.

NOTAS: Camiña e captura as coordenadas polo centro do camiño e/ou beirarrúa


01

10 02

04

05

06 07

08 09

03


85


ZONA: 05 Viviendas de funcionarios e antigas casas de catedráticos

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 16 platanos (Platanus orientalis) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 05) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 16), p.e. 05_01.

NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores.


06 08 16 02 04 1410 12

15 1305 07 1103 0901


86


ZONA: 06 Pistas de deportes

TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 18 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do estanque que están marcados no plano adxunto (todos os vértices e 3 puntos por cada circunferencia). Identifícaos co código da zona (i.e. 06) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 06_01. Para os 5 primeiros vértices (i.e. 01-05) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada vértice, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto.

NOTAS: Camiña e toma as coordenadas polo bordo de pedra do estanque.



15

01

10

1112

13

0203

0407

08

18

1617

14

09

05

06

87


ZONA: 07 Facultade de Políticas

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada unha das 12 camelias (Camellia japonica) que están marcadas no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 07) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 12), p.e. 07_01.

NOTAS: Toma a coordenada no centro dos pés de cada unha das cepas de camelia.


01 02 04

03

05

10

06 08

07 09 11

12


88


ZONA: 08 Xardín entre Fac. de Farmacia e Fac. Políticas

TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 19 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 08) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 19), p.e. 08_01. Para os 5 primeiros nodos (i.e. 01-05) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada nodo, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.

NOTAS: Camiña e captura as coordenadas polo centro do camiño e/ou beirarrúa.



01 10 11

12 13

02 03

04

05

06

07

08

14 15

16

17

18

19

09

89


ZONA: 09 Facultade de Farmacia

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 9 carballos americanos (Quercus rubra) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 09) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 09), p.e. 09_01.

NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e manteaa no resto das árbores.


09

08

07

06

05

04 Fuente de la cartografía: http//www.usc.es/flora/index.html

03

02

01

90


ZONA: 10 Auditorio e Observatorio Astronómico

TAREFA: Polígonos múltiples de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 28 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do sebe de aligustre (Ligustrum ovalifolium) que están marcados en en a ampliación do plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 10) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 10_01. Para os 5 primeiros vértices (i.e. 01-05) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada vértice, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto.

NOTAS: Toma as coordenadas sobre os sebes no seu punto medio.



252826

27

24

22

21 20

18 17

1615

14

09

0807

06

05 04

0302

13 23

1219 11

10

01

91


ZONA: 11 Colexios Maiores

TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 19 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 11) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 19), p.e. 11_01. Para os 7 primeiros nodos (i.e. 01-07) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada nodo, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.



01

10

1112

13

02

0304

0506

07

08

0914

15

17

16


18

19

92


ZONA: 12 Capela Universitaria e campo de hockey herba

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 14 castiñeiros de indias (Aesculus hippocastanum) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 12) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 14), p.e. 14_01.




01

02

03 04

05 06

07 08

09 10

11 12

13 14

93


ZONA: 13 Piscina

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 8 carballos (Quercus robur) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 13) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 08), p.e. 13_01. Para as 8 árbores (i.e. 01-08) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto.

NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores. No plano represéntanse tres árbores que xa non existen.


08 0102

03

04

05


07

06

94


ZONA: 14 Campo de fútbol e CIBUS

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 15 bidueiros (Betula alba) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 14) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 13), p.e. 14_01. Para os 5 primeiras árbores (i.e. 01-05) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto.



09 15 11 13 0703 0501

10 1202 04 08 14 06


95


ZONA: 15 Pavillón Estidiantil, Facultades de Bioloxía e de Matemáticas


NOTAS: Guíache para establecer os vértices pola proxección das terrazas máis saíntes.



01

10 11

12 13

02 03

04 05

06

07

09

1415

16

08

96


ZONA: 16 Casa Gradín e Pavillón de Servicios


NOTAS: Guíache para establecer os vértices polas esquinas do edificio.


13 15 12

01

10 11

02

03

0405

06

07

0809

14 17

16 1918

Fuente de la cartografía: http//www.usc.es/flora/index.html 20

97


ZONA: 17 Estadio de atletismo

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 14 perales chineses (Pyrus callery var. Cume nevado) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 17) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 14), p.e. 17_01.

NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores. No plano represéntase unha árbore que xa non existe.


01 02

03

04 05

06

10 11

12 13


08 09

14

98


ZONA: 18 FEUGA

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 13 plátanos (Platanus orientalis) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 18) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 13), p.e. 18_01.

NOTAS: Coidado cos coches, traballa sempre sobre o illote. Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores.


01

02 03

04

05

06 07

08

0910

11

12 13


99


ZONA: 19 Fac. de Enxeñería Química e Informática

TAREFA: Polígono de lados regulares. Rexistra as coordenadas de cada un dos 11 vértices (de forma ordenada e consecutiva) do edificio que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 19) seguido dun guión baixo e o número de cada vértice indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 con calquera das outras esquinas), p.e. 19_01. Para os 5 primeiros vértices (i.e. 01-05) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada vértice, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto.

NOTAS: Guíache para establecer os vértices pola proxección das terrazas.


01

10

11

0203

04

0506

07 08

09


100


ZONA: 20 Invernadoiros, CACTUS e Institutos de Investigacións

TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta principalmente por arces, plátanos e carballos americanos (Acer saccharinum, Acer platinoides e Quercus rubra) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 20_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 20_F. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.

NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa. Non inclúas as árbores da beirarrúa.



101


ZONA: 21 Animalario de Bioloxía e Ampliación de Psicoloxía

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un das 25 camelias (Camellia japonica) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 21) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 25), p.e. 21_01. Para os 5 primeiras árbores (i.e. 01-05) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto.

NOTAS: Ao rexistrar as coordenadas, localiza o GPS sobre o centro da parte superior de cada unha das camelias


ZONA: 22 Residencia “Monte da Condesa”


01 10

1112

1302

03 04

05 06

0708

09

14 15

16 18 17

20 222521

2419 23

102


TAREFA: Polilíneas. Rexistra as coordenadas de cada un dos 15 nodos que están marcados na ampliación do plano adxunto que corresponden a unha escultura. A escultura ten tres partes, correspóndenlle 5 a cada parte (dous extremos, o centro e dous intermedio). Identifícaos co código da zona (i.e. 22) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 5), p.e. 22_01. Para os 5 primeiros nodos (i.e. 01-05) toma 10 veces as coordenadas para cada un deles. Só é necesario que identifiques a primeira coordenada de cada árbore, e posteriormente pulsa 9 veces seguida a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne un código por defecto.

NOTAS:


15

03 02 0414

01

10

11 06

07

130812 05

09


103


ZONA: 23 Pavillón Polideportivo e Monte da Condesa

TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 16 nodos do camiño marcado no plano adxunto(de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 23) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano (sitúache con atención para non confundir o 1 co 23), p.e. 23_01. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.



01

11

15

13

03 04

0708

09

14 16 12

10

02

06


104


ZONA: 23B Pavillón Polideportivo e Monte da Condesa

TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta por acacias (Acacia melanoxylon) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 23B_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 23B_F. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.

NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa.



105


ZONA: 24 Facultade de Físicas

TAREFA: Puntos. Rexistra as coordenadas de cada un dos 15 madroños (Arbutus unedo) que están marcados no plano adxunto. Identifícaos co código da zona (i.e. 24) seguido dun guión baixo e o número de cada árbore indicada no plano (sitúache con atención para non confundir o 01 co 15), p.e. 24_01.

NOTAS: Elixe unha orientación do tronco da árbore para tomar a coordenada e mantenla no resto das árbores. No plano represéntanse dúas árbores que xa non existen. Non confundas os madroños cos teixos.


01

1011

1213

02 03

0405

0607

08

09

1415


106


ZONA: 25 Facultades de Filosofía, Psicoloxía e CC. Da Educación

TAREFA: Líña (camiño). Rexistra as coordenadas de cada un dos 10 nodos do camiño marcado no plano adxunto (de forma ordenada e consecutiva). Identifícaos co código da zona (i.e. 25) seguido dun guión baixo e o número de cada nodo indicado no plano, p.e. 25_01.

Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.




1001

0203

04 05 08

06 07

09

107


ZONA: 26 Almacén, Servicios e Animalario

TAREFA: Polígono de lados irregulares. Rexistra tantas coordenadas de puntos como queiras para facer un polígono que comprenda a masa de árbores composta por acacias, piñeiros e carballos (Acacia melanoxylon, Pinus pinaster e Quercus robur) que está marcado no plano adxunto. Identifica o primeiro punto o código 26_I (letra I de inicio). A continuación pulsa tantas veces como necesites a tecla “mark” ou análoga, sen incluír ningún código de forma que se lle asigne o código por defecto, até chegar de novo ao momento de inicio marcando o último punto introducido no GPS como 26_F. Realiza o mesmo tempo un “track” ou análogo.

NOTAS: Emprega a proxección ortogonal das copas para establecer o bordo da masa.



108


2.2. SESIÓN SEGUNDA:

Segue as indicacións do profesor na aula de informática.

2.3. SESIÓN TERCEIRA:

Diríxeche mediante o emprego do GPS en navegación a cada unha das coordenadas do arquivo que se

cargou previamente. Dicha coordenada será o centro dunha circunferencia de radio 20m na que se

establecerá como parcela de traballo. Sinala a localización de dicha coordenada no plano do apartado

3.3. Si a coordenada coincide cun edificio ou zona non practicable unicamente localízaa no mapa da

sección 3.3 e busca a seguinte coordenada.

Cando sexa posible, na parcela procederás a tomas os datos inmediatos, e contarás o número de árbores

cun DBH (diámetro do tronco da árbore á altura do peito, i.e. 130cm) maior de 7 cm (22 cm de

diámetro). Cando unha cepa bifúrquese a unha altura inferior á do DBH contaranse todos os pés

superiores a 7 cm de DBH.

109


3. RESULTADOS

3.1. SESIÓN PRIMEIRA:

Os resultados da primeira parte da práctica serán os arquivos obtidos ao descargar o GPS tras realizar as

tarefas sinaladas na sección 2.1 deste documento. Valorarase tanto a súa adecuada obtención como o

número de sectores realizado.

3.2. SESIÓN SEGUNDA:

Os resultados da segunda parte da práctica serán os arquivos requiridos tras editar os arquivos obtidos

co GPS na primeira parte da práctica. Devanditos arquivos enviaranse como un traballo á USC Virtual,

e consistirán en temas de ArcGis (.shp) correspondentes os diferentes tipos de elementos empregados:

polígono de lados regulares, polígonos de lados irregulares, polígonos múltiples, liñas, polilíneas e

puntos.

Do mesmo Os resultados da primeira parte da práctica serán os arquivos obtidos ao descargar o GPS

tras realizar as tarefas sinaladas na sección 2.1 deste documento. Valorarase tanto a súa adecuada

obtención como o número de sectores realizado.

modo crearase un arquivo de puntos que será utilizado na última sesión da práctica, que será igualmente

enviado como un traballo á USC Virtual.

Ademais na páxina da USC Virtual colgaranse dous traballos referidos aos erros dos GPS, que serán

explicados durante esta sesión. Para iso o alumno deberá de consultar a información que se lle

proporcione na devandita páxina. Posteriormente deberá de contestar ás seguintes preguntas:

a) Como afecto ás medicións efectuadas a xeometría da constelación de satélites. Adxunta unha gráfica

da disposición dos satélites durante a realización da práctica. Que conclusións poderías extraer sobre os

erros cometidos durante a práctica?

b) Empregando os datos que se deixarán como segundo traballo na USV Virtual para os datos

fornecidos calcula para cada conxunto de coordenadas capturadas para unha mesma posición: a) a

coordenada media; b) o erro da media do 95%; c) as coordenadas X e E, máximas e mínimas e o

correspondente rango; e d) o erro relativo do rango calculado en referencia á distancia entre as medias

previamente calculadas. Que conclusións poderías extraer para os diferentes sectores estudados?

110


3.3. SESIÓN TERCEIRA:

Cando sexa posible, de acordo co especificado no documento do manual de prácticas que se poderá

atopar na páxina correspondente da USC Virtual, enche un dos estadillos adxuntos para cada parcela.

Marca aproximadamente a posición de cada pardela no mapa adxunto.

Ademais na páxina da USC Virtual colgarase un traballo referido a estímaa do número de árbores do

campus, calculado de acordo á mostraxe realizada (para iso na segunda sesión necesitarás calcular a

extensión do campus). Contesta á seguinte pregunta: Cantas árbores estimas que hai no Campus Sur?

111


112


ID Parcela: Tamaño parcela:

Fecha/data:

Coordenada X: Coordenada Y:

Pendiente/pendente: Orientación:

Altitud/altitude: Est.Pedregos. (%):

Est.Cob.arbórea (%): Est.Cob.arbust (%):

Est. Cob.herbac (%):

Nº de árboles/árbores: Nº de pies ha-1:


Fecha/data:








Fecha/data:







113



Fecha/data:








Fecha/data:








Fecha/data:







114



Fecha/data:








Fecha/data:








Fecha/data:







115


116


Fecha/data:








Fecha/data:








Fecha/data:







8. CONTIDOS DE BIBLIOTECA

(código calendario de prácticas: BIB)

CONTIDOS DE BIBLIOTECA

PRÁCTICAS

CATÁLOGO DA BUSC

1. Fai unha busca no Catálogo da BUSC de libros de Botánica xeral.

1. Nº de rexistros:

2. Limita por ubicación “Bioloxía” e lingua “castelán”.


3. Selecciona e garda os rexistros que respondan a libros de botánica xeral publicados despois do ano

2000.


4. Busca un artigo de revista sobre liques de Portugal escrito por Graciela Paz Bermúdez e Regina

Carballal Duran e publicado na revista Nova Hedwigia.

1. Selecciónao, fai a exportación e envíao ao teu correo electrónico

2. ¿Temos o artigo en papel, onde?

3. Busca en SFX se temos o texto completo do artigo:

5. Fai unha bibliografia cós documentos seleccionados –libros e artigos- empregando o formato de

cita bibliográfica Harvard ou Vancouver e envíao á USC – Virtual.

6. Busca no Catálogo cantas edicións temos desta obra na BUSC:

Hickman, Cleveland P. Principios integrales de zoología

119

CONTIDOS DE BIBLIOTECA

120

BASES DE DATOS

7. Entra na base de datos do CSIC ICYT, e expón os pasos que deches para entrar.

8. Busca artigos sobre algas de auga doce relacionados con Galicia a partires do ano 1998

1. nº de rexistros:

2. ¿teñen enlace ao texto completo? ¿Cantos?

3. ¿Temos as revistas na Biblioteca Universitaria, onde?

4. Se queremos consultar os artigos en papel ¿como temos que facer?

Nota:

Documents

Memoria de Prácticas - USC