RANGKUMAN DEMO PRAKTIKUM

IDENTIFIKASI MUTAGENIK BAKTERI Escherichia coli

DENGAN METODE AMES TEST

Oleh :

Nama : Binti Nurul Zannah

NIM : 1250901001110034

Kelompok : 2A

Asisten : Chintya Chorin

Ilham Risky

Novianti R.

Ratna Fadhillah I.

Restu Nugraha

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2014

BAB ITINJAUAN PUSTAKA

Lingkungan sekitar kita banyak terkandung senyawa yangsifatnya menyebabkan kanker atau perusakkan sel, senyawatersebut adalah senyawa karsinogenik. Amest test adalah suatumetode dalam biologi yang digunakan untuk mendeteksi potensimutagenic dari suatu senyawa kimia. Uji positifmengindikasikan bahwa senyawa kimia tersebut berperan sebagaizat karsinogenik. Zat karsinogenik adalah suatu zat yang dapatmenyebabkan terjadinya kanker. Zat – zat yang memiliki sifatkarsinogenik antara lain; sinar UV, polutan industri,petisida, food additives dan produk rokok. Zat – zat yangbersifat karsinogenik dapat memicu kanker, hal ini dikarenakansenyawa ini memiliki sifat mutagen (dapat menyebabkanterjadinya mutasi atau perubahan dari susunan DNA) (Isnawati,Ani, dkk, 2002).

1. Pengertian Mutagen Mutagen merupakan suatu zat atau senyawa yang dapat

mempengaruhi susunan dari gen atau disebut mutasi. Mutasimerupakan suatu perubahan DNA yang dapat berpengaruh terhadapreproduksi dari sel dan pertumbuhan yang tak tekendali, bahkanmenyebabkan terjadinya kerusakkan sel. Karsinogenik berbedadengan mutagen, karsinogen adalah zat-zat atau senyawa yangdapat menyebabkan terjadinya kanker, sementara mutagenmerupakan zat yang dapat menyebabkan terjadinya mutasi. Mutasidapat tejadi secara alami ataupun secara buatan, secara alamidapat disebabkan oleh panas, radiasi sinar kosmis, radiokatif,sinar ultraviolet, dan ionisasi internal mikroorganisme.Mutasi buatan merupakan mutasi yang disebabkan oleh perbuatanmanusia, contohnya penggunaan bahan radioaktif untukdiagnosis, penggunaan senjata nuklir, penggunaan roket, danpemanfaatan bahan kimia serta bahan fisika dan biologi. Contoh

mutagen fisika adalah sinar kosmis, sinar ultraviolet, radiasisinar X, α, β, dan γ. Mutagen kimia adalah mutagen yangberasal dari bahan kimia, contohnya pestisida, seperti DDT,BHC (Ames, B.N., J.Mc Can and Yamasaki, E. 1975).

Uji senyawa karsinogenik dapat dilakukan dengan ujijangka pendek (short term test), uji jangka menengah, dan ujijangka panjang.

1. Uji jangka pendek : uji ini dugunakan untukmengidentifikasi adanya senyawa yang bersifatkarsinogenik dan dapat menyebabkan terjadinya mutasipada DNA dalam sel, baik secara invitro adaupun invivo.

2. Uji jangka menengah : uji ini dilakukan selama 1 tahundengan menggunakan hewan percobaan berupa tikus.Misalnya ames test.

3. Uji jangka panjang : dilakukan selama dua tahun.

Uji jangka pendek contohnya amest test, amest testmerupakan uji yang digunakan untuk menguji apakah senyawatersebut bersifat mutagen atau tidak, dan berpotensi untukmenginduksi terjadinya mutasi pada suatu DNA dalam sel, baiksecara invitro maupun in vivo (Ames, B.N., J.Mc Can andYamasaki, E. 1975).

2. Amest Test Amest test adalah nama yang diambil dari penemunyaBruce Ames. Dasar dari tes ini adalah adanya senyawa yangbersifat mutagenik terhadap bakteri, senyawa mutagenik akandapat berubah menjadi karsinogenik atau zat yang dapatmenyebabkan kanker. Uji ames test ini sering menggunakanbakteri Salmonella typhimurium, hal ini dikarenakan bakteri inimemiliki sensitivitas yang tinggi terhadap senyawa-senyawayang bersifat mutagenik, bakteri ini tidak dapat bertahanhidup pada media tanpa asam amino histidin. Uji ames test inidilakukan dengan cara memasukkan bahan kimia yang diujibeserta bakteri yang digunakan dalam tabung tes, sampel

tersebut kemudian di letakkan pada cawan petri yang isinyamedia agar beserta histidin, media ini ditunjukkan sebagaipenyedia nutrisi bagi bakteri. Sampel yang diberikan dibiarkantumbuh selama 24 - 48 jam, dalam beberapa waktu tersebut akanterjadi penurunan volume histidin, hal ini dikarenakandigunakan oleh bakteri, sehingga lama kelamaan volumenya akanhabis, dan bakteri tersebut tidak mampu bertahan pada kondisimedia tanpa histidin. Jika hasilnya bakteri terus berkembangdalam media tanpa histidin, maka bakteri tersebut telahmengalami mutasi. Sehingga dapat hidup pada media tanpahistidin. Hasil ini menunjukkan hasil ames test positif.Sebagaimana ditunjukkan pada gambar 1 ( Langlais, 2002).

Gambar 1. Uji Ames Test

Amest test ditemukan oleh Bruce Ames, uji tersebutdigunakan untuk membuktikan senyawa kimia yang dapat menjadimutagen. Penggunaaan uji ini berdasarkan asumsi bahwasubstansi bersifat mutagenik (terhadap bakteri yang digunakan)sehingga dapat menjadi karsinogenik, zat yang memiliki sifattersebut dapat menimbulkan kanker. Beberapa substansi dapatmenyebabkan kanker di laboratorium hewan (contohnya dioksin)tidak memberikan hasil positif pada uji. Test ini perlu biayayang rendah selain itu test ini mudah dilkaukan dalam mengujibakteri yang sifatnya carsinogenik terhadap lingkungan.Bakteri yang digunakan untuk uji ini adalah strain dariSalmonella typhimurium yang membawa defective (mutan) gen membuatnya

tidak dapat mensintesis asam amino histidin (His) darikomposisi media kultur. Bagaimanapun, beberapa tipe mutasidapat di amati, hal ini ditandai dengan mudahnya tumbuh padasuatu media tanpa histidin. Suspensi histidin (His) strainSalmonella typhimurium ditempatkan pada campuran enzim dari hatitikus pada media agar tanpa histidin, paper disk dipenuhi dengan10 µg 2-aminofluorin yang diketahui sebagai karsinogen,seperti ditunjukkan pada gambar ke 3 (Langlais, 2002). Efekmutagenik dari senyawa kimia senyawa kimia dapat menyebabkanbanyak bakteri dapt hidup tanpa histidin, membentuk revertantcoloni disekitar disk. Koloni tersebar didekat margin padadisk. Banyak senyawa kimia tidak mutagenic atau karsinogenik,tetapi dapat berubah menjadi mutagenik atau karsinogeniksetelah dimetabolismenya dalam hati ini sebagai reaksi amestest pada percampuran enzim di liver. Hasilnya akanditunjukkan seperti gambar 2, dimana banyak bakteri yangtumbuh (Mortelmans K, 1994).

Gambar 2. Hasil uji Ames test

Gambar 3. Uji Ames Test

1.3 Alasan digunakannya Salmonella typhimurium Salmonella typhimurium merupakan strain bakteri yang tidak

dapat tumbuh dalam media tanpa asam amino histidin, hal inidikarenakan mutasi berada pada gen yang mengkode satu dari 9enzim yang digunakan pada jalur biosintesis histidin. Mutansendiri ada dua macam, yaitu mutan auxoprof dan mutanprototroph. Mutan yang dapat bertahan hidup pada media tanpaadanya histidin adalah mutan prototrop. Salmonella typhimuriumbukan merupakan model yang sempurna untuk pada tubuh manusia.Bakteri uji yang digunakan merupakan mikroba prokariotsedangkan manusia merupakan eukaryot sehingga perlu dilakukanpencampuran enzim liver dari organisme eukaryot. Penghitunganjumlah koloni yang tumbuh digunakan utuk mengukur aktivitasmutagenik dari senyawa yang digunakan, aktivitas mutasi akanberlangsung secara spontan pada media yang tidak diberihistidin. Salmonella typhimurium memang sering digunakan dalam ujiames test, strain lainnya adalah strain TA 1535 dan strain TA100 sensitif terhadap subtitusi pasangan basa melalui DNA.Beberapa strain lainnya yiatu TA1537, TA1538, TA98 dan straibaru yang lebih sensitif yaitu TA97 dan TA 102. Selain itujuga dapat digunakan Escherichia coli (Mortelmans K, 1994).

BAB IIMETODELOGI

2.1 Waktu dan TempatPraktikum yang Berjudul “Ames Test” dilaksanakan hari

Kamis, 01 Mei 2014 pada pukul 13.00-16.30 WIB. Bertempat diLaboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya,Malang.

2.1 Cara KerjaPraktikum tentang Ames test ini bertujuan untuk

mengetahui adanya senyawa yang dapat menyebabkan mutagenic,senyawa mutagen ini dapat bersifat karsinogenik ataumenimbulkan kanker), bakteri uji yang digunakan biasanyaSalmonella typhymuriam dan E.coli. Bakteri Salmonella typhimariummenggunakan media spesifik histidin sedangkan pada bakteriEscherichia coli menggunakan media triptofan. Ames test dilakukanmelalui tiga metode yaitu :

1. Media 2 layer2. Media Spot test3. Keberadaan warna merah

Pada praktikum kali ini digunakan metode media 2 layer,dengan komposisi layer ynag berbeda untuk tiap layer. Layerpertama dengan komposisi 15 % agar, vogel Bonner salt, dan glukosasedangkan untuk layer yang kedua komposisinya adalah softagar 0.8 %, kultur E.coli dan triptofan 10 %. Prosedurnyaadalah menyiakan 3 cawan petri yang telah berisi meida layerpertama. Disiapkan 3 cawan petri yaitu, cawan pertamadigunakan untuk kontrol yang isinya akuades 300 mikrolit,Escherichia coli, soft agar, untuk cawan kedua berisi soft agar danEscherichia coli dan untuk cawan ketiga berisi soft agar, Escherichiacoli, dan triptofan 300 mikrolit, setelah itu disiapkan 3 tabungreaksi, dan peralatan yang dibutuhkan seperti jarum ose,kultur bakteri dan media. Langkah yang dilakukan yaitu softagar dibagi menjadi 3 ml untuk setiap tabung reaksi denganmenggunakan pipet 5 ml, pada perlakuan kontrol ditambahkandengan 1 ose Escherichia coli yang diinokulasi dengan jarum osedekat api bunsen, kemudian ditambahkan dengan akuades steril300 mikrolit dan dituangkan ke cawan petri sebagai layer

kedua. Setelah itu diputar-putar tujuannya agar media tidakmemadat. Tabung 2 yang berisi soft agar ditambahkan denganE.coli dan dituangkan ke cawan dua dan tabung tiga yang berisisoft agar ditabahakan dengan E.coli dan triptofan 300 mikrolitkemudian juga dituangkan ke cawan tiga. Ketiga cawan tersebutdibiarkan hingga memadat dan diinkubasi dengan suhu 37℃selama 48 jam untuk dimati. Selanjutnya dimati pertumbuhanbakteri pada cawan tersebut.

BAB IIIHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Praktikum tentang Ames test ini bertujuan untukmengetahui adanya senyawa yang dapat menyebabkan mutagenic,senyawa mutagen ini dapat bersifat karsinogenik ataumenimbulkan kanker), bakteri uji yang digunakan biasanyaSalmonella typhymuriam dan E.coli. Bakteri Salmonella typhimariummenggunakan media spesifik histidin sedangkan pada bakteriEscherichia coli menggunakan media triptofan. Bakteri jenis inidigunakan dikarenakan karena bakteri-bakteri jenis ini dapatmengalami mutasi atau memiliki galur mutan jika tidak diberimedia yang sesuai, misalnya histidin dan triptofan. Ames testdilakukan melalui tiga metode yaitu : Media 2 layer, MediaSpot test, Keberadaan pigmen warna merah. Pada praktikum kaliini digunakan metode media 2 layer, dengan komposisi layeryang berbeda untuk tiap layer. Layer pertama dengan komposisi15 % agar, vogel Bonner salt, dan glukosa (karbohidrat dangaram-garaman) sedangkan untuk layer yang kedua komposisinyaadalah soft agar 0.8 %, kultur E.coli dan triptofan 10 %.

Prosedurnya adalah menyiakan 3 cawan petri yang telah berisimeida layer pertama. Disiapkan 3 cawan petri yaitu, cawanpertama digunakan untuk kontrol yang isinya akuades 300mikrolit, E. coli, soft agar, untuk cawan kedua berisi soft agardan Ecoli dan untuk cawan ketiga berisi soft agar, Ecoli, dantriptofan 300 mikrolit. Agar digunakan untuk penyedia nutrisibagi bakteri, sedangkan triptofan yang memungkinkan terjadinyametabolisme secara kimia. Setelah itu disiapkan 3 tabungreaksi, dan peralatan yang dibutuhkan seperti jarum ose,kultur bakteri dan media. Langkah yang dilakukan yaitu softagar dibagi menjadi 3 ml untuk setiap tabung reaksi denganmenggunakan pipet 5 ml, pada perlakuan kontrol ditambahkandengan 1 ose E.coli yang diinokulasi dengan jarum ose dekatapi bunsen, tujuannya agar tetap steril kemudian ditambahkandengan akuades steril 300 mikrolit dan dituangkan ke cawanpetri sebagai layer kedua. Setelah itu diputar-putar tujuannyaagar media tidak memadat. Perlakuan ini harus dilakukan secarakarena digunakan soft agar. Tabung 2 yang berisi soft agarditambahkan dengan Escherichia coli dan dituangkan ke cawan dua dantabung tiga yang berisi soft agar ditabahakan dengan Escherichiacoli dan triptofan 300 mikrolit kemudian juga dituangkan kecawan titermasuk salah satu asam amino. Triptofan yangdigunakan tidak boleh terkena cahaya, karena Ketiga cawantersebut dibiarkan hingga memadat dan diinkubasi dengan suhu37℃ selama 48 jam untuk dimati. Selanjutnya dimatipertumbuhan bakteri pada cawan tersebut.

4.2 Analisa HasilBeradasarkan uji ames test yang dilakukan, dihasilkan uji

amest test positif, dimana Escherichia coli dapat mengalami mutasi

dan dapat hidup pada media kontrol yang berisi aquades sterildan soft agar. Escherichia coli dapat hidup pada media yang tanpaada asam amino triptofan walaupun dalam jumlah sedikit, halini menandakan bahwa bakteri dapat mengalami mutasi, sehinggadapat tumbuh. Uji ditunjukkan dengan hasil positif dilihatdengan banyaknya atau jumlah koloni revertan dari setiapbakteri pada masing-masing cawan kontrol negatif, cawan kedua,dan cawan ketiga yang ditambah tryptofan. Bakteri Escherichia colimemanfaatkan galur mutan, sehingga bakteri ini dapat hiduppada media yang berisi aquadest steril dan soft agar. Softagar disini difungsikan sebagai sumber nutrisi bagi bakteri.Uji mutagenesitas dilakukan dengan sistem mutasi balikmenggunakan galur bakteri uji yang telah dimutasikan dengancara pergeseran kerangka dan perubahan pasangan basa DNA,untuk mendeteksi kemungkinan adanya efek mutagenik padasimplisia yang diuji. Hasil dikatakan positif jika bakteridapat tumbuh, Namun, jika sampel terus berkembang, hal inimenandakan bahwa bakteri tidak lagi tergantung pada kehadiranenzim untuk tumbuh. Hal ini berarti bahwa bakteri telahbermutasi. Dalam hal ini, jika uji Ames telah menghasilkanhasil yang positif. Tetapi , bukan berarti bahwa bahan kimiayang diuji menyebabkan kanker pada manusia. Belum sepenuhnyabenar. Hal ini hanya untuk menunjukan bahwa zat kimia tersebutperlu diteliti ulang apakah karsinogenik atau tidak,sebagaimana yan ditunjukkan pada perlakuan kontrol, bahwabakteri yang tumbuh hanya sedikit.

Gambar 4. Perlakuan Kontrol

Pada perlakuan dengan asam amino triptofanmenunjukkan pertumbuhan bakteri yang pesat, Karena mutanbakteri Escherichia coli dapat tumbuh pada medium dengan asam aminotriptofan, dalam medium lain tidak dapat tumbuh dikarenakan

tidak dapat membuat asam amino sendiri melaui jalurbiosintetis. Mutan sejenis ini dinamakan mutan auxotroph,dimana pada mutan tersebut hanya dapat tumbuh pada mediadengan penambahan triptofan. Mutan auxotroph yang disebutmutan histidine- dependent or his-. Mutan jenis ini tidak dapatmelakukan sintesis molekul organic yang diperlukan bagipertumbuhan bakteri (Hayes, 1984). Escherichia coli menyintesisasam amino triptofan dari molekul prekursor dalam jalur multilangkah. Setiap reaksi dalam jalur itu di katalisis oleh enzimspesifik, dan kelima gen yang mengodekan sub unit enzim enzimini tergugus bersama pada kromosom bakteri. Hasil ini sesuaidengan gambar yang ditunjukkan warna merah, Escherichia colimerupakan bakteri gram negatif yang berbentuk basil, sehinggaakan muncul warna merah saat pewarnaan gram. Hal inisebagaimana ditunjukkan pada gambar dibawah ini :

Gambar 5. Escherichia coli dalam Triptofan

Uji mutagenisitas bertujuan untuk mengetahui apakah suatubahan uji bersifat mutagen. Prinsip dari uji ini adalahbakteri yang digunakan sudah dimutasi sehingga tidak mampumensintesa salah satu jenis asam amino esensial misalnyahistidin dan triptofan untuk pertumbuhannya. Bakteri uji yangakan digunakan untuk uji Ames harus mempunyai sifat genotipyang telah disyaratkan. Konfirmasi sifat genotip ini harusdilakukan segera setelah menerima biakan, pada saat revertanspontan percawan terletak diluar di luar rentang normal danbila bakteri-bakteri tersebut kehilangan sensitivitas terhadapmutagen (Maron dan Ames, 1983, Rustini dkk, 2002).

Gambar 6. Perlakuan Escherichia coli dalam soft agar

BAB IVPENUTUP

5.1 Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan

bahwa ames test adalah salah satu uji yang digunakan untukmenguji senyawa yang bersifat mutagenik terhadap bakteri,senyawa mutagenik akan dapat berubah menjadi karsinogenik atauzat yang dapat menyebabkan kanker. Uji ames test ini seringmenggunakan bakteri Escherichia coli yang tidak bisa hidup tanpaasam amino triptofan. Hasil menunjukkan bakteri ini dapathidup dengan baik pada media dengan asam amino triptofanartinya bakteri tersebut mutan, dan dalam cawan lainnya yangmenggunakan soft agar dan akuades hanya ditemukan dalam jumlahsedikit.

5.2 Saran

Praktikum selanjutnya diharapkan untuk praktikum semacamdemo ini hendaknya semua praktikan mencatat dan di tempatdimana semua praktikan dapat mengamati langkah-langkah yangdilakukan.

DAFTAR PUSTAKA

Ames, B.N., J.Mc Can and Yamasaki, E. 1975. Methods for DetectionCarcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian MicrosomeMutagenicity Test, Mutation Res., 31.

Hayes, A.W, 1984, (ED), Principles and Methods of Toxicology, RavenPress, Book ltd, New York.

Isnawati, Ani, Sri Endreswari, Pudjiastuti, Murhandini. 2002.Efek Mutagen Ekstrak Etanol Buah Cabe Jawa (Piper Retrofractum Vahl.).Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 1, No. 2,Juli 2002

Langlais, Bruno. 2002. Ozone In Water Treatment Application AndEngineering. New York : Lewis Publisher.

Mortelmans K, Zeiger E. 1994. The Salmonella / Microsoome Mutagenityassay. Mutat Res. 2000. Nov 20; 455 (1-2) : 29-60