Embed Size (px)
Citation preview
MASARYKOVA UNIVERZITA
Přírodovědecká fakulta
Katedra genetiky a molekulární biologie
Lenka HUMPOLÍKOVÁ ADÁMKOVÁ
Analýza transkripce a posttranslační modifikace signálních
proteinů STAT1 a STAT3 v nádorové buňce
Disertační práce
Školitel: prof. RNDr. PhMr. Jan Kovařík, DrSc.
Brno, 2011
Bibliografická identifikace
Jméno a příjmení autora: Mgr. Lenka Humpolíková Adámková
Název disertační práce: Analýza transkripce a posttranslační modifikace signálních
proteinů STAT1 a STAT3 v nádorové buňce
Název práce anglicky: Analysis of transcription and posttranslational modifications
of signal proteins STAT1 and STAT3 in tumor cell
Studijní program: Biologie
Studijní obor (směr), kombinace oborů: Molekulární a buněčná biologie
Školitel: prof. RNDr. PhMr. Jan Kovařík, DrSc.
Rok obhajoby: 2011
Klíčová slova v češtině: Signální protein STAT1, STAT3, negativní regulátor SOCS,
interferon alfa, interferon gama, maligní melanom
Klíčová slova v angličtině: Signal protein STAT1, STAT3, negative regulator SOCS,
interferon alpha, interferon gamma, malignant melanoma
© Lenka Humpolíková Adámková, Masarykova univerzita, 2011
Ráda bych poděkovala svému školiteli prof. RNDr. PhMr. Janu Kovaříkovi, DrSc.
za moţnost pracovat v jeho skupině, za vedení mé disertační práce a nesčetné podnětné rady,
příspěvky a připomínky, trpělivost a ochotu.
Dále děkuji celému kolektivu Oddělení onkologické a experimentální patologie –
laboratoře buněčných regulací za vytvoření příjemného pracovního prostředí, pomoc a cenné
rady, které mi vţdy ochotně poskytli.
Největší díky patří mé rodině, především rodičům a Adélce, a přátelům za dlouhodobou
podporu a porozumění, nejen při přípravě této práce, ale ve všech oblastech mého ţivota.
ABSTRAKT
Buněčná homeostáza je kontrolována a regulována mnoha signálními proteiny, které
operují téměř ve všech buněčných kompartmentech. Jejich společným úkolem je předávat
regulační signály jak z extracelulárních, tak intracelulárních prostorů spouštěním kaskády
vnitrobuněčných procesů, které vedou k modulaci „downstream“ genové aktivity. Signální
dráha JAK/STAT je jednou z klíčových signálních kaskád, které zprostředkovávají přenos
signálů indukovaných cytokiny a růstovými faktory z buněčného povrchu do jádra. Odpovědí
na externí stimulaci je modulace ligand-dependentních genetických programů, které hrají
důleţitou roli v základních fyziologických procesech, jako jsou například diferenciace,
proliferace, apoptóza a angiogeneze. Intenzivní pozornost je věnována také negativním
regulátorům signální dráhy JAK/STAT. Asi největší a nejdůleţitější skupinou inhibitorů jsou
supresory cytokinové signalizace (SOCS). Dalšími negativními regulátory jsou fosfatázy
(PTP) a proteinové inhibitory aktivovaných STATů (PIAS).
Výsledky analýz signální dráhy JAK/STAT provedených u širokého spektra primárních
nádorů a stabilizovaných buněčných linií odvozených z nádorů naznačují, ţe tato dráha můţe
být u maligních buněk porušena překvapivě často a na mnoha úrovních. Dále bylo zjištěno, ţe
abnormální signalizace zprostředkovaná JAK/STAT dráhou můţe sníţit vnímavost nádorové
buňky na imunoterapeutickou léčbu. Proto je dnes věnována značná pozornost jednak
objasnění vzájemných vztahů mezi jednotlivými členy této dráhy, včetně reakce na externí
stimulaci, tak i zapojení JAK/STAT dráhy do širšího spektra buněčné signalizace. Lze
předpokládat, ţe bliţší poznání poruch v signalizačních dráhách umoţní vybrat
u onkologických pacientů vhodnou a cílenou imunoterapeuticky zaměřenou léčbu.
V předkládané práci byla studována exprese a posttranslační modifikace signálních
proteinů STAT1 a STAT3 a jejich negativních regulátorů SOCS v normálních buňkách a
buňkách maligního melanomu s vyuţitím metod western blot a northern blot.
Zjistili jsme, ţe léčba interferonem alfa můţe negativně ovlivnit progresi onemocnění
u pacientů s maligním melanomem, a to prostřednictvím hyperaktivace proteinu STAT3.
Chybějící či nedostatečná fosforylace STAT1 na tyrozinu 701 má souvislost s lepším
průběhem onemocnění u pacientů s maligním melanomem. Vývoj rezistence k interferonu
gama je v melanomových buňkách asociován s utlumením indukce genů SOCS a konstitutivní
expresí SOCS 3. Interferon gama na rozdíl od interferonu alfa indukuje expresi SOCS 3
v buněčných liniích lidských melanomů.
ABSTRACT
Homeostasis of cell is controlled and regulated by a number of signal proteins that
operate in almost all celullar compartments. Their collective task is to transmit regulation
signals from both extracelullar and intracelullar compartments by means of activation of an
intracelullar cascade of processes, which lead to modulation of the downstream gene activity.
The signal pathway JAK/STAT is one of the key signal cascades which mediate transmission
of signals induced by cytokines and growth factors from cellular surface into nucleus. The
response to external stimuli lies in modulation of ligand-dependent genetic programmes,
which play an important role in basic physiological processes such as cell differentiation,
proliferation, apoptosis and angiogenesis. There is also an intensive focus on negative
regulators of the JAK/STAT signal pathway. The suppressors of cytokine signalling (SOCS)
are possibly the largest and most important group of inhibitors. Protein tyrosine phosphatases
(PTP) and protein inhibitors of activated STATs (PIAS) represent other negative regulators.
The results of analyses of the JAK/STAT signal pathway, performed on a broad spectre
of primary tumors and stable cell lines derived from tumors suggest that this pathway may be
disrupted surprisingly often and on many levels in malignant cells. Furthermore, it was found
out that abnormal signalization mediated by JAK/STAT pathway may decrease susceptibility
of tumor cell to immunotherapeutic treatment. Therefore, significant attention has been paid
to efforts elucidating both relationships among respective members of this pathway, including
reaction to external stimuli, and involvement of the JAK/STAT pathway in broader scheme
of cellular signalling.
We can assume that deeper understanding of disorders in signalling pathways will make it
possible to select suitable and targetted immunotherapeutic treatment of oncologic patients.
This thesis presents study of expression and posttranslational modifications of signal
proteins STAT1 and STAT3, and their negative regulators SOCS, both in normal cells and
in malignant melanoma cells, utilizing the Western blot and Northern blot methodics.
We have found out that treatment with IFN-α may negatively influence the disease
progression in malign melanoma patients through hyperactivation of the STAT3 protein.
Missing or insufficient phosphorylation of STAT1 on tyrosine residue 701 is related to better
disease progression in malign melanoma patients. The development of resistence to IFN-γ
in melanoma cells is associated to inhibited induction of the SOCS genes and with
constitutive expression of SOCS 3. Unlike IFN-α, IFN-γ induces expression of SOCS 3
in human melanoma cell lines.
Obsah
ABSTRAKT ......................................................................................................... 5
ABSTRACT ......................................................................................................... 6
ÚVOD ................................................................................................................... 9
LITERÁRNÍ PŘEHLED .................................................................................. 11
1. Molekulární mechanismy STAT-dependentních signálních drah .......... 11
1.1. JAK kinázy ....................................................................................................................... 11
1.1.1. JAK v cytokinové signalizaci ....................................................................... 11
1.1.2. Struktura JAK ............................................................................................... 12
1.1.3. Jak1 ............................................................................................................... 13
1.1.4. Jak2 ............................................................................................................... 13
1.1.5. Jak3 ............................................................................................................... 14
1.1.6. Tyk2 .............................................................................................................. 14
1.2. STAT proteiny .................................................................................................................. 15
1.2.1. Strukturální vlastnosti STAT proteinů ......................................................... 16
1.2.2. N-terminální doména .................................................................................... 16
1.2.3. Coiled-coil doména ...................................................................................... 16
1.2.4. DNA-vazebná doména ................................................................................. 17
1.2.5. Spojovací (linker) doména............................................................................ 18
1.2.6. SH2 doména a tyrozin aktivační motiv ........................................................ 18
1.2.7. Transkripčně aktivační doména .................................................................... 19
1.3. Receptory pro cytokiny a růstové faktory, které hrají roli v aktivaci STAT proteinů21
1.3.1. Rodina receptorů pro interferony/IL-10 ....................................................... 21
1.3.2. IFN-γ receptor............................................................................................... 21
1.3.3. IFN-α receptor .............................................................................................. 22
1.3.4. IL-10 receptor a příbuzné receptory ............................................................. 22
2. Funkce jednotlivých členů STAT rodiny v buněčné a tkáňové
homeostaze ......................................................................................................... 23
2.1. STAT1 ............................................................................................................................... 24
2.2. STAT2 ............................................................................................................................... 25
2.3. STAT4 ............................................................................................................................... 26
2.4. STAT6 ............................................................................................................................... 27
2.5. STAT3 ............................................................................................................................... 28
2.6. STAT5 ............................................................................................................................... 29
2.7. Význam STAT proteinů v realizaci biologických účinků cytokinů ............................. 31
2.8. STAT proteiny v regulaci exprese genů ......................................................................... 32
2.8.1. Cílové geny, které jsou pod kontrolou STAT proteinů ................................ 32
3. Regulace signální dráhy JAK/STAT ......................................................... 33
3.1. Negativní regulace STAT signalizace ............................................................................. 33
3.1.1. Receptory ...................................................................................................... 34
3.1.2. Cílená degradace........................................................................................... 34
3.1.3. Defosforylace JAK ....................................................................................... 34
3.1.4. Negativní zpětná vazba ................................................................................. 35
3.1.5. Modifikace STAT ......................................................................................... 36
3.1.6. Inhibitorové proteiny STAT ......................................................................... 36
3.2. Pozitivní regulace funkce STAT ..................................................................................... 37
3.2.1. Fosforylace serinu ........................................................................................ 37
3.2.2. Interakce s dalšími transkripčními faktory a buněčnými proteiny ............... 37
4. Patologická funkce STAT/SOCS/PIAS signálních drah a její důsledky 39
4.1. Defekty v expresi a aktivaci proteinů STAT in vitro..................................................... 39
4.2. STAT proteiny a nádorové onemocnění ........................................................................ 39
4.2.1. STATy v onkogenezi. ................................................................................... 39
4.2.2. Citlivost STAT proteinů k interferonům. ..................................................... 40
4.2.3. Mechanismy aktivace STAT3 v nádorových buňkách ................................. 41
4.2.4. Klinický význam STAT v diagnostice ......................................................... 42
4.2.5. Cytokiny a jejich význam ............................................................................. 42
4.2.6. Interferony v klinické praxi .......................................................................... 42
4.2.7. STAT1 a maligní buňka ............................................................................... 43
4.2.8. Strategie zabraňující aktivaci STAT3 .......................................................... 45
4.3. Význam detekce poruch v prognóze a imunoterapii .................................................... 51
CÍLE PRÁCE .................................................................................................... 53
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................ 54
VÝSLEDKY ....................................................................................................... 55
DISKUZE ......................................................................................................... 107
ZÁVĚR ............................................................................................................. 117
LITERATURA ................................................................................................ 119
SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ........................................................... 153
SEZNAM VŠECH PUBLIKACÍ DOKTORANDKY .................................. 154
PŘÍLOHY ........................................................................................................ 155
9
ÚVOD
Objev a charakteristika
Proteiny transdukce signálů a aktivátory transkripce (STAT - signal transducers and
activators of transcription) byly popsány jako transdukční faktory rozličných polypeptidových
ligandů, které mají schopnost fungovat jako transkripční faktory modulující expresi
efektorových genů, které jsou aspoň částečně pod jejich kontrolou. Tyto proteiny jsou
v inaktivní formě lokalizovány v cytoplazmě. Jejich aktivace, po vazbě širokého spektra
ligandů na transmembránové receptory, je zajišťována Janusovými tyrozin kinázami (JAK),
které jsou konstitutivně asociovány s příslušnými receptory (Takeda and Akira, 2000).
Ligandový signál má za následek dimerizaci nebo oligomerizaci receptoru a následnou
aktivaci JAK. Jakmile je aktivován, JAK kinázový protein fosforyluje tyrozinové zbytky na
cytoplasmatickém konci receptoru a poskytuje tak vazebná místa pro molekuly rozpoznávající
fosfotyrozin vázající doménu (Briscoe et al., 1996). Tyto tyrozinové motivy receptoru jsou
rozpoznávány SH2 doménami STATů a tak zprostředkovávají zapojení STAT
k receptorovému komplexu a jeho fosforylaci na konzervovaném tyrozinu aktivovanými JAK.
V některých STAT proteinech jsou rovněţ fosforylovány zbytky serinu, coţ můţe ovlivnit
intenzitu transkripce (Kovarik et al., 2001). Nedávné studie odhalily zajímavý fakt důleţitosti
fosforylace serinu 727 u STAT1 v ovlivění apoptotické dráhy v buňkách (Janjua et al., 2002).
Při uvolnění z receptoru aktivované STATy dimerizují, přesouvají se do jádra a tam se váţou
na specifické DNA-vazebné místa v promotorech cílových genů a tak indukují specifické
programy genové exprese (Seidel et. al., 1995; Bromberg, 2001). Proces aktivace STAT je jen
přechodný a k deaktivaci dochází jak na jaderné tak na cytoplasmatické úrovni.
Jaderná tyrozin fosfatáza se zdá být základním enzymem, který zajišťuje STAT
defosforylaci v jádře a poskytuje signál pro export STAT do cytoplazmy (Aoki and Matsuda,
2002; ten Hoeve et al., 2002). Negativní regulátory aktivovaných STAT proteinů a JAK kináz
operují na cytoplasmatických a/nebo receptorových místech. Zahrnují několik fosfatáz, jako
je SH2-obsahující fosfatáza-1 a protein-tyrozin fosfatáza-1B (You et al., 1999; Aoki and
Matsuda, 2002), proteinové inhibitory aktivovaných STATů (PIAS), které přímo interagují se
STATy a blokují jejich DNA-vazebnou aktivitu (Shuai, 2000), a dále také rodinu
proteinových supresorů cytokinové signalizace (SOCS), které se váţou na receptory a kinázy
rodiny JAK, a inhibují aktivaci STAT a také fungují jako STAT-indukované STAT inhibitory
(Naka et al., 1999; Shuai, 1999; Starr and Hilton, 1999; Wormald et al., 2006b).
10
Studie pouţívající myší modely nesoucí nulovou alelu příslušného STAT genu pomohly
odhalit roli jednotlivých STAT proteinů v normální fyziologii a patofyziologii (Akira, 1999).
Aţ doposud bylo identifikováno sedm členů STAT super rodiny, nesoucí podobné proteinové
domény. Nicméně některé STATy mají unikátní funkční vlastnosti, které mají někdy aţ
antagonistické efekty na buněčné funkce. Například STAT1 a STAT3 vykazují opačné efekty
na buněčnou proliferaci a apoptózu (Bromberg and Darnell, 2000; Battle and Frank, 2002;
Stephanou and Latchman, 2005). Předpokládá se, ţe odlišnosti ve fyziologických vlastnostech
některých STAT proteinů jsou způsobeny jejich preferenční aktivací specifických genů,
a/nebo jejich rozdílnými funkčními doménami. Transkripční kapacita STATů je modulována
posttranslační fosforylací na různých tyrozinových a serinových zbytcích v polypeptidovém
řetězci. Navíc můţe být funkční specificita jednotlivých STAT proteinů významně
ovlivňována širokým spektrem molekul interagujících se STATy, jako např. SOCS, NF-κB,
SMADs, c-Jun, Sp1 atd.
11
LITERÁRNÍ PŘEHLED
1. Molekulární mechanismy STAT-dependentních signálních drah
Cytokiny regulují mnohé aspekty krvetvorby a imunitní odpovědi. Jejich působení je
zprostředkováváno skrze aktivaci signální dráhy JAK/STAT. STATy tvoří rodinu sedmi
strukturálně a funkčně příbuzných proteinů: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a,
STAT5b a STAT6. JAK (Janusovy kinázy) reprezentují rodinu čtyř nereceptorových tyrozin
kináz, Jak1, Jak2, Jak3 a Tyk2. Tyto kinázy selektivně fosforylují STAT proteiny, coţ vede
k jejich aktivaci. Po aktivaci hrají STATy kritickou roli v regulaci vrozené a získané imunitní
reakce hostitele. Deregulace nejméně dvou ze signálních kaskád STAT (tj. STAT3 a STAT5)
je asociována s buněčnou transformací.
STAT proteiny přenášejí signály velké hematopoetinové podrodiny cytokinů a
konzervované rodiny receptorů, které je váţou. Ty zahrnují rodinu interferonů (IFN)
(IFN-α/β, IFN-γ; interleukin (IL) IL-10, IL-19, IL-20, IL-22), rodinu gp130 (IL-6, IL-11,
OSM, LIF, CT-1, G-CSF, IL-12, IL-23, Leptin, CTNF, NNT-1/BSF-3), γC rodinu (IL-2, IL-
4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21) a jednořetězcovou rodinu receptorů (Epo, GH, PRL, TPO)
(shrnuto v Schindler and Strehlow, 2000). STATy mohou být aktivovány rovněţ
receptorovými tyrozin kinázami, jako je receptor pro epidermální růstový faktor (EGF-R),
receptor pro kolonie stimulující faktor-1 (CSF-1R) a receptor pro růstový faktor odvozený
z destiček (PDGF-R). Bylo prokázáno, ţe i několik členů primitivní rodiny receptorů
spárovaných s G-proteinem (G-protein-coupled receptors) vykazuje signalizaci přes STAT
proteiny (Leonard and O‟Shea, 1998; Schindler and Strehlow, 2000).
1.1. JAK kinázy
1.1.1. JAK v cytokinové signalizaci
Kdyţ se ligandy naváţou na své receptory, iniciují tak kaskádu intracelulárních
fosforylací. Nicméně členové hematopoetinové rodiny receptorů, které se váţou k cytokinům
typu I a II, nemají ţádnou katalytickou kinázovou aktivitu. Tu jim poskytují právě členové
JAK rodiny tyrozin kináz. JAK jsou konstitutivně asociovány s doménou těchto receptorů,
která je bohatá na prolin a přiléhá k membráně, často označovanou jako region box1/box2
(Ihle, 2001). Po stimulaci ligandem podstupují receptory konformační změny, které vzájemně
přiblíţí JAK, čímţ umoţní jejich aktivaci skrze trans fosforylaci (Remy et al., 1999). Po
12
aktivaci JAK zprostředkovávají přenos signálu, jak bylo naznačeno výše (Obrázek 1). Několik
studií rovněţ naznačilo, ţe JAK asociují s receptorovými tyrozin kinázami (např. CSFR-1,
EGF-R, PDGF-R) a s receptory spárovanými s G-proteinem (např. angiotensin-R), coţ těmto
receptorům umoţňuje aktivovat STATy (Schindler and Strehlow, 2000). Nicméně tato
pozorování nejsou zcela jasně podloţena.
U savců existují čtyři členové rodiny JAK: Jak1, Jak2, Jak3 a Tyk2. Jejich délka je přes
1000 aminokyselin a molekulová hmotnost se pohybuje od 120 a 130 kDa. Jak1, Jak2 a Tyk2
jsou exprimovány ve všech buňkách, zatímco exprese Jak3 je omezena na buňky myeloidní a
lymfoidní linie (shrnuto v Leonard and O‟Shea, 1998).
1.1.2. Struktura JAK
Srovnání sekvencí JAK ukazuje existenci sedmi oblastí s vysokou homologií, JH1-JH7
(Obrázek 2). Ačkoli biologická aktivita všech těchto oblastí ještě nebyla plně objasněna,
některé z těchto domén jsou jiţ dobře charakterizovány (Leonard and O‟Shea, 1998; Ihle,
2001). Ukazuje se, ţe JH1 kóduje kinázu a JH2 představuje pseudokinázovou doménu, která
se jeví být nezbytnou pro katalytickou aktivitu domény JH1 (Yeh et al., 2000).
N-koncové JAK homologické domény, JH3-JH7, jsou zřejmě zapojeny do asociace
s receptorem. Nicméně úloha oblasti JH7 v této interakci dosud nebyla potvrzena.
Obrázek 1: Signální dráha JAK/STAT (převzato z Kisselewa et al., 2002).
13
1.1.3. Jak1
Četné biochemické studie naznačují, ţe Jak1 se účastní signalizace členů rodiny receptorů
IL-2 (IL-2R, IL-7R, IL-9R a IL-15R), rodiny receptorů IL-4 (IL-4R, IL-13R), rodiny
receptorů gp130 (IL-6R, IL-11R, LIF-R, OSM-R, CT-1R, CNTF-R, NNT-1R/BSF-3R a
Leptin-R) a receptorů pro cytokiny třídy II (IFN-R typ I, IFN-R typ II, IL-10R (Schindler and
Strehlow, 2000)). V souladu s pleiotropickou funkcí těchto receptorů vykazovaly
knokautované myši raně postnatální letální fenotyp (Rodig et al., 1998). Podrobnější analýza
ukázala, ţe tyto myši trpěly neurologickými lézemi, které způsobovaly, ţe nebyly schopny
správně sát mateřské mléko. Identifikace podobného defektu u LIFRβ knokautovaných myší
naznačila, ţe za tento neurologický defekt je zodpovědná právě ztráta LIF funkce (Li et al.,
1995; Ware et al., 1995). Konzistentní s těmito fakty je zjištění, ţe odpověď na LIF a IL-6
byla v Jak1 -/- tkáních výrazně sníţená. Jak1 -/- myši rovněţ vykazovaly významné defekty
v produkci tymocytů a B-lymfocytů. Takto narušená lymfopoéza je přičítána defektní
odpovědi na IL-7, který je důleţitý v raném vývoji lymfocytů (von Freeden-Jeffry et al.,
1995). Absence Jak1, vede k hlubokým defektům v biologické odpovědi na interferony typu I
a II. Jak1 -/- myši rovněţ defektní v odpovědi na IL-10. Jak1 tak hraje klíčovou roli
v zprostředkování biologické odpovědi několika významných rodin cytokinových receptorů.
1.1.4. Jak2
Také funkce Jak2 byla zpočátku studována s pomocí biochemických přístupů. Tyto studie
naznačily, ţe Jak2 se účastní signalizace členů rodiny jednořetězcových receptorů
(např. Epo-R, Tpo-R, GH-R, PRL-R), rodiny receptorů IL-3 (IL-3R, IL-5R a GM-CSF-R),
rodiny receptorů gp130 a rodiny receptorů cytokinů třídy II (Schindler and Strehlow, 2000).
Na rozdíl od Jak1, vykazovaly Jak2 knokautované myši embryonálně letální fenotyp, hynuly
po 12,5 dnech březosti. Smrt byla přisuzována selhání v definitivní erytropoéze, analogicky
k tomu, co bylo pozorováno u Epo -/- knokautovaných myší (Wu et al., 1995; Neubauer et al.,
1998; Parganas et al., 1998). Tyto studie ukázaly, ţe aktivita Jak2 je nepostradatelná pro
signalizaci Epo. Ačkoliv hematopoetické prekurzory mohou být z Jak2 -/- jater získány,
ukazuje se, ţe tyto buňky nereagují na Tpo, IL-3 a GM-CSF. Reagují však na G-CSF, coţ
naznačuje, ţe funkce Jak2 je v granulocytové linii redundantní. Stejně tak se zdá, ţe Jak2 není
nezbytný pro přenos signalizace rodin IL-2 a IL-4. Další studie odhalily defekty v odpovědi
na IFN-γ, ale ne na IL-6 nebo IFN-α. Jak2 tak hraje klíčovou roli v přenosu signálu pro Epo,
IL-3, GM-CSF, IL-5, Tpo a IFN-γ.
14
1.1.5. Jak3
Exprese Jak3 je omezena na hematopoetické buňky, coţ naznačuje omezenou roli
v přenosu signalizace cytokinů (Leonard and O‟Shea, 1998). Příslušné biochemické studie
spojují Jak3 se signalizací všech receptorů, které vyuţívají běţný gama receptorový řetězec,
γC (např. IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-15R a IL-21R) (Leonard and O‟Shea, 1998).
Konzistentně se studiemi, které ukázaly, ţe myši mohou přeţít i při absenci lymfocytů, rostou
Jak3 -/- myši normálně ve specifickém prostředí bez patogenů (Nosaka et al., 1995;
Park et al., 1995; Thomis et al., 1995). Nicméně, Jak3 -/- myši vykazovaly závaţné defekty
v lymfopoéze, analogicky k pozorováním myší deficientních pro γC, se kterým Jak3 asociuje
(Cao et al., 1995). V souladu s důleţitou rolí Jak3 v IL-2 signalizaci, T-lymfocyty bez Jak3
jsou defektní v negativní selekci (Saijo et al., 1997). Tento myší fenotyp je nicméně v ostrém
kontrastu s Jak3-deficientními lidmi. Tito pacienti vykazují závaţnou kombinovanou
imunodeficienci (SCID), která se projevuje výrazným defektem T-lymfocytů a normálními
B-lymfocyty (Leonard and O‟Shea, 1998). Tato odlišnost je připisována IL-7, který je zásadní
pro růst pre-B-lymfocytů u myší, ale ne u lidí. Lze konstatovat, ţe Jak3 hraje klíčovou roli
v lymfoidním vývoji. Jak3 -/- myši jsou defektní v odpovědi na IL-2, IL-4 a IL-7, výsledkem
je „SCID-like” fenotyp.
1.1.6. Tyk2
Tyk2 byl první člen rodiny JAK, který byl spojován s cytokinovou signalizací, kdyţ byl
identifikován při screeningu mutací v IFN-α signalizaci (Velazquez et al., 1992). Následné
biochemické studie naznačily, ţe Tyk2 také přispívá k signalizaci IL-6, IL-10 a
IL-12 (shrnuto v Schindler and Strehlow, 2000). Relativně malé defekty u Tyk2 -/- myší,
zejména v IFN-α/β signalizaci, byly proto překvapivé a neočekávané (Karaghiosoff et al.,
2000; Shimoda et al., 2000). Tyk2 -/- MEF vykazovaly silnou (tj. wild type) antivirotickou
odpověď ke standardním dávkám IFN-α (např. 1000 U/ml). Obdobně schopnost Tyk2 -/- myší
odolávat virové infekci se od wild-type myší lišila jen málo. V kontrastu k wild-type MEF
(myší embryonální fibroblasty) buňkám ovšem Tyk2 -/- buňky vykazovaly defekt v jejich
odpovědi k nízkým dávkám IFN-α (např. 10 U/ml). Další analýzy určily, ţe odpověď na
IL-12 byla defektní, ale přítomna, a ţe odpověď na IL-10 byla téměř normální. V odpovědi na
IL-6 nebyly pozorovány ţádné změny. Poněkud překvapivě vykazovaly Tyk2 -/- makrofágy
podstatný defekt v odpovědi na LPS, ale jeho podstata nebyla objasněna (Bogdan et al.,
15
2000). Lze shrnout, ţe Tyk2 je nejspíše nejdůleţitější ve zprostředkování biologické odpovědi
na IL-12 a LPS.
Obrázek 2: Struktura JAK a STAT proteinů.
1.2. STAT proteiny
Sedm STAT proteinů identifikovaných u savců má velikost v rozmezí 750-850
aminokyselin. Jak distribuce příslušných genů na chromozomech tak identifikace STATů
u niţších eukaryot napovídají, ţe celá rodina vznikla z jediného prvotního genu. Duplikace
tohoto lokusu zřejmě odráţejí rostoucí potřebu mezibuněčné komunikace spolu s rostoucí
komplexností eukaryot. V souladu s tímto evolučním vzorcem STATy sdílejí strukturálně a
funkčně konzervované domény (Obrázek 2). Jsou jimi amino-terminální doména (NH2),
coiled coil doména (CCD), DNA-vazebná doména (DBD), spojovací doména a SH2/tyrozin
aktivační doména. Naproti tomu C-koncová transkripčně aktivační doména (TAD) je dosti
variabilní a přispívá ke specificitě STAT. I přes skutečnost, ţe více neţ 50 členů
hematopoetinové rodiny přenáší signály přes omezené mnoţství STAT proteinů, je
dosahováno významné specificity. To je z velké části způsobeno tím, ţe receptory přenášející
signál od těchto cytokinů mohou být rozděleny do pěti strukturálně a funkčně příbuzných
16
podrodin, přičemţ kaţdá z nich má tendenci přenášet signály přes jediný STAT
(viz Tabulka 1). Další specificita můţe být připsána jak tkáňově specifickým vzorcům exprese
(jak ligandů, tak receptorů), tak aktivaci přídavných signálních drah těmito receptory.
1.2.1. Strukturální vlastnosti STAT proteinů
Všech sedm členů rodiny transkripčních faktorů STAT sdílí společné rysy. Strukturální a
funkční analýzou bylo identifikováno šest konzervovaných domén (Obrázek 2). Čtyři
základní domény jsou spojeny mezi sebou velkými mezidoménovými spojkami, coţ
naznačuje, ţe strukturální změny vyvolané v jedné doméně by mohly ovlivňovat také další
domény.
1.2.2. N-terminální doména
N-terminální doména, sestávající z přibliţně 130 aminokyselin, je mezi jednotlivými
STATy značně konzervována (51% sekvenční shoda mezi STAT1 a STAT4; 20% shoda mezi
STAT5 a STAT6). Doména můţe být odštěpena z molekuly plné délky pomocí omezené
proteolýzy (Vinkemeier et al., 1996). Studium krystalické struktury N-konce STAT4
(aminokyseliny 1-124) odhalilo dimerizaci (Obrázek 3) (Vinkemeier et al., 1998). Tento
dimer je tvořen prstencovitým elementem sestávajícím z pěti kratších helixů. Několik studií
naznačilo, ţe tato N-terminální dimerizace podporuje kooperativitu vazby k tandemovým
GAS elementům (Vinkemeier et al., 1996; Xu et al., 1996; Vinkemeier et al., 1998). Další
studie ukázaly, ţe N-terminální STAT doména podporuje interakci s transkripčním
koaktivátorem CBP/p300 (Horvath, 2000), s proteinovou rodinou PIAS (Shuai, 2000),
receptorovými doménami (Leung et al., 1996; Murphy et al., 2000b), a ţe reguluje translokaci
STAT do jádra (Strehlow and Schindler, 1998).
1.2.3. Coiled-coil doména
Ohebný polypeptidový řetězec (24 aminokyselin u STAT1 a 18 aminokyselin u STAT3)
spojuje N-terminální doménu s coiled-coil doménou (Obrázek 3), která sestává ze čtyř
alfa-helixů (přibliţně aminokyseliny 135-315). Krystalická struktura STAT1 a STAT3
ukazuje, ţe tato doména vyčnívá asi 8 nm laterálně z centrální struktury (Becker et al., 1998;
Chen et al., 1998). Tím vzniká velký převáţně hydrofilní povrch, který je k dispozici pro
specifické interakce s dalšími helikálními proteiny. Mezi takové interagující proteiny patří
např. p48/IRF9, transkripční faktor c-Jun, N-myc interagující protein (Nmi) a StIP (Horvath
et al. 1996; Zhang et al., 1999a; Zhu et al., 1999; Collum et al., 2000). Nedávné studie rovněţ
17
prokázaly roli coiled-coil domény ve vazbě na receptor, fosforylaci tyrozinu a jaderném
exportu (Begitt et al., 2000; Zhang et al., 2000).
Obrázek 3: Krystalická struktura STAT proteinu (převzato z Kisselewa et al., 2002).
1.2.4. DNA-vazebná doména
DNA-vazebná doména (přibliţně aminokyseliny 320-480) má strukturu β-skládaného
listu a leţí směrem k C-konci od coiled-coil domény (Obrázek 3). Tato struktura připomíná
DNA-vazebné domény proteinů NF-κB a p53 (Chen et al., 1998). Kaţdá z komponent dimeru
STAT rozpoznává báze v nebliţší polovině GAS elementu. Počet míst přímého kontaktu mezi
aminokyselinovými zbytky a DNA je omezený, coţ má za důsledek disociační konstantu
v řádu nanomolů. Zdá se tedy, ţe kooperativa při vazbě na DNA je pravděpodobně nezbytná
pro efektivní transkripční aktivitu. Protoţe DNA-vazebná doména má pravděpodobně před
aktivací odlišnou konformaci, je lákavé zváţit moţnost, ţe má ještě další funkce (McBride et
al., 2000).
18
1.2.5. Spojovací (linker) doména
Spojovací doména (aminokyseliny 488-876 u STAT1, aminokyseliny 465-585 u STAT3)
spojuje DNA-vazebnou doménu s SH2/dimerizační doménou (Obrázek 3). Krystalická
struktura STAT1 ukazuje, ţe helix α10 spojovací domény interaguje s SH2 doménou a ţe
helix α6 interaguje s řetězcem β11 DNA-vazebné domény (Chen et al., 1998). Tato
pozorování naznačují, ţe DNA-vazebná schopnost můţe být regulována strukturálními
změnami v SH2 doméně, protoţe ta váţe fosfotyrozin. Mutační studie rovněţ naznačují roli
spojovací domény STAT1 v transkripční regulaci (Yang et al., 1999).
1.2.6. SH2 doména a tyrozin aktivační motiv
SH2 domény hrají důleţitou roli v signalizaci díky své schopnosti vázat se k specifickým
fosfotyrozinovým motivům. Konzistentně s tím je tato doména nejvíce konzervovanou STAT
doménou. SH2 doména STAT u Dictyostelium (hlenky) se zdá být jednou z „nejranějších“
identifikovaných SH2 domén (Kawata et al., 1997). Ačkoliv sekvence STAT SH2 domény
(aminokyseliny 580-680) je značně odlišná od ostatních SH2 domén, její struktura je dobře
konzervována. Sestává z antiparalelního β-skládaného listu obklopeného dvěma α-helixy,
které tvoří jakousi kapsu. Na dně této kapsy leţí absolutně konzervovaný arginin (Arg-602
u STAT1, Arg-609 u STAT3), který zprostředkovává interakci s fosfátem. Schopnost této
SH2 domény rozpoznávat specifické fosfotyrozinové motivy hraje esenciální roli ve třech
fázích STAT signalizace: (1) vazba k cytokinovému receptoru pomocí rozpoznávání
specifických fosfotyrozinových motivů receptoru (shrnuto v Kisseleva et al., 2002),
(2) asociace s aktivující JAK kinázou (Gupta et al., 1996; Barahmand-Pour et al., 1998),
a (3) STAT homo- nebo hetero dimerizace (Shuai et al., 1994; Gupta et al., 1996). Jak se
ukazuje na krystalických strukturách, dimerizace STAT závisí na interakcích mezi SH2
doménou jednoho STAT monomeru a tyrozin-fosforylovaným koncovým segmentem
druhého monomeru. Rezidua podílející se nejvíce na specificitě interakce mezi SH2 doménou
a tyrozinovým motivem se nacházejí na pozicích +1, +3, +5, +6 a +7 směrem k C-konci od
fosfotyrozinu (Chen et al., 1998). Aminokyseliny SH2 domény nacházející se v blízkosti
(např. Ala-641, Val-642) se na této interakci zřejmě podílejí. Všechny STAT proteiny,
s výjimkou STAT2, tvoří stabilní homodimery in vitro i in vivo. Mnohé STATy, včetně
STAT2, pak mohou také vytvářet heterodimery s ostatními STAT proteiny skrze tuto
reciprokou SH2-fosfotyrozinovou interakci (Schindler et al., 1995; Darnell, 1997).
19
1.2.7. Transkripčně aktivační doména
V souladu s její schopností regulovat jedinečné transkripční odpovědi je C-terminální
doména mezi jednotlivými STATy jen málo konzervována. Prvním důkazem, ţe C-konec
kóduje transkripčně aktivační doménu (TAD), přišel ze srovnávací analýzy STAT1 o plné
délce a formy STAT1β vznikající alternativním sestřihem, která postrádá posledních
38 aminokyselin na C-konci (Schindler et al., 1992b). Dobře charakterizované izoformy
zkrácené na C-konci byly identifikovány rovněţ u STAT3, STAT4 a STAT5 (Schindler and
Strehlow, 2000). Zdá se, ţe fungují jako dominantně negativní regulátory.
Ačkoliv detailní porozumění toho, jak C-konec STAT reguluje transkripci, nás teprve
čeká, byl jiţ učiněn důleţitý pokrok. Bylo například stanoveno, ţe transkripční aktivita
několika STAT proteinů můţe být modulována fosforylací serinu (shrnuto v Decker and
Kovarik, 2000). Fosforylace serinu zřejmě podporuje transkripci některých, ale ne všech
cílových genů. Bylo navrţeno, ţe fosforylace serinu můţe měnit afinitu k ostatním
transkripčním regulátorům, jako je MCM5, BRCA1, ale ne CBP/p300 (viz část 3.2.1).
Pozoruhodné je, ţe C-konec STAT2 vykazuje jisté unikátní rysy. Mezi lidmi a myšmi
není konzervován. Myší sekvence nese inzerci šestnácti-nukleotidového minisatelitu (Park et
al., 1999; Farrar et al., 2000). Přesto se zdá, ţe tyto divergentní sekvence jsou do značné míry
funkčně zaměnitelné (Park et al., 1999). Někteří autoři se domnívají, ţe tyto odlišnosti mohou
způsobovat unikátní schopnost IFN-α aktivovat STAT4 v lidských, ale nikoli v myších
T-lymfocytech (Farrar et al., 2000). Závěry těchto studií nicméně dosud nebyly potvrzeny
v lymfocytech, kde je STAT4 normálně exprimován.
20
Tabulka 1: Cytokinově specifická aktivace JAK a STAT proteinů
Ligandy JAK kinázy STAT proteiny
Rodina IFN
IFN-α/β/ω/Limitin Tyk2, Jak1 Stat1, Stat2
(Stat3, Stat4, Stat5)
IFN-γ Jak1, Jak2 Stat1, (Stat5)
IL-10 Tyk2, Jak1 Stat3
IL-19 ? ?
IL-20 ? Stat3
IL-22 ? Stat3, (Stat5)
Rodina gp130
IL-6 Jak1, Jak2 Stat3, Stat1
IL-11 Jak1, Stat3, Stat1
OSM Jak1, Jak2 Stat3, Stat1
LIF Jak1, Jak2 Stat3, Stat1
CNTF Jak1, Jak2 Stat3, Stat1
NNT-1/BSF-3 Jak1, Jak2 Stat3, Stat1
G-CSF Jak1, Jak2 Stat3
CT-1 Jak1, Jak2 Stat3
Leptin Jak2 Stat4
IL-12 Tyk2, Jak2 Stat4
IL-23 ? Stat4
Rodina γC
IL-2 Jak1, Jak3 Stat5, (Stat3)
IL-7 Jak1, Jak3 Stat5, (Stat3)
IL-9 Jak1, Jak3 Stat5, Stat3
IL-15 Jak1, Jak3 Stat5, (Stat3)
IL-21 (Jak1), Jak3 Stat3, Stat5, (Stat1)
IL-4 Jak1, Jak3 Stat6
Rodina IL-3
IL-3 Jak2 Stat5
IL-5 Jak2 Stat5
GM-CSF Jak2 Stat5
Jednořetězcová rodina
EPO Jak2 Stat5
GH Jak2 Stat5, (Stat3)
PRL Jak2 Stat5
TPO Jak2 Stat5
Tyrozinkinázový receptor
EGF (Jak1, Jak2) Stat1, Stat3, Stat5
PDGF (Jak1, Jak2) Stat1, Stat3
CSF-1 (Tyk2, Jak1) Stat1, Stat3, Stat5
HGF ? Stat1, Stat3
Receptory spojené s G-proteinem
AT1 Jak2 Stat1, Stat2
21
1.3. Receptory pro cytokiny a růstové faktory, které hrají roli v aktivaci
STAT proteinů
Strukturální studie několika hematopoetinových receptorů z cytokinové rodiny naznačují,
ţe vazba ligandu podporuje dimerizaci receptorů do aktivní konformace (Wells, 1996).
Předpokládá se, ţe aktivace vede k výraznému přiblíţení cytoplasmatických konců receptorů,
coţ umoţňuje trans-fosforylaci (tj. aktivaci) JAK asociovaných s receptorem. Aktivované
JAK pak fosforylují specifické tyrozinové motivy v endodoménách receptorů, které pak
zprostředkovávají vazbu STATů k jejich příslušným receptorům. To způsobuje schopnost
STAT SH2 domén rozpoznat fosfotyrozinové zbytky a 4-5 aminokyselin blízko C-konce,
které jsou známy jako „receptor STAT recruitment motif“ (receptorový motiv pro vazbu
STAT). Povaha vázaných STAT a jejich strukturální podobnost umoţňují rozdělit
hematopoetinové receptory do několika příbuzných rodin.
1.3.1. Rodina receptorů pro interferony/IL-10
Srovnání sekvencí ukázalo, ţe receptory IFN a IL-10 jsou vzájemně příbuzné a ţe jsou
nejvíce odlišnými členy hematopoetinové rodiny. Interferony mohou být rozděleny podle
funkce do dvou tříd, z nichţ kaţdá se váţe k unikátnímu receptoru. Mezi interferony typu I
patří IFN-α, IFN-β, INF-ω a Limitin (Diaz et al., 1993; Oritani et al., 2000), které jsou
produkovány většinou typů buněk. IFN typu II zahrnují pouze IFN-γ (Bach et al., 1997).
Receptory pro oba typy interferonů sestávají ze dvou řetězců, které heterodimerizují
(IFNαRI/IFNαRII a IFNγRI/IFNγRII) (Schindler and Strehlow, 2000). Receptor pro IL-10,
který vykazuje největší strukturální podobnost k receptoru pro IFN-γ, se rovněţ skládá ze
dvou podjednotek (IL-10R1 a IR-10RII) (Ho et al., 1993; Spencer et al., 1998).
1.3.2. IFN-γ receptor
IFN-γ, stejně jako IFN-α, hraje klíčovou roli ve vrozené a získané imunitní odpovědi
(shrnuto v Bach et al., 1997). Můţe inhibovat virovou a buněčnou proliferaci a regulovat
apoptózu. Na rozdíl od IFN-α je funkce IFN-γ potřebná pro obranu organismu proti několika
intracelulárním patogenům. IFN-γ je produkován především aktivovanými T-lymfocyty a
NK buňkami; jeho receptor je však exprimován na většině buněk. Buněčné odpovědi
následující po stimulaci IFN-γ jsou zprostředkovávány vazbou STAT1 na jediné vazebné
místo v IFNγRI řetězci, a jeho následnou aktivací pomocí Jak1/Jak2 (Greenlund et al., 1994).
22
Oba řetězce receptoru pro IFN-γ se účastní přenosu signálu, coţ bylo prokázáno cíleným
přerušením těchto řetězců (Huang et al., 1993; Lu et al., 1998).
1.3.3. IFN-α receptor
IFN-α a IFN-β, které reprezentují prototypické interferony typu I, hrají klíčovou roli ve
vrozené a časné imunitní odpovědi na virovou infekci (Schindler and Strehlow, 2000).
Receptor pro IFN-α asociuje s Jak1 a Tyk2, a společně zprostředkovávají IFN-dependentní
genovou transkripci. Tento proces zahrnuje aktivaci dvou různých STAT dependentních
signálních drah, ISGF-3 a STAT1 homodimerů. ISGF-3 je heterotrimerní komplex sestávající
ze STAT1, STAT2 a p48/IRF-9. STAT3 homodimery a STAT1/STAT3 heterodimery mohou
být aktivovány také interferony typu I, ale jejich role v signalizaci teprve bude muset být
objasněna.
1.3.4. IL-10 receptor a příbuzné receptory
IL-10 hraje důleţitou roli v negativní regulaci zánětlivých odpovědí. Je produkován Th2
subpopulací T-lymfocytů a moduluje řadu funkcí imunitních buněk, zejména funkce
monocytů, makrofágů a dendritických buněk (shrnuto v Moore et al., 2001). Receptor pro
IL-10 signalizuje pomocí sekvenční aktivace Tyk2/Jak1 a STAT1/STAT3.
V nedávné době byl identifikován receptorový komplex pro IL-22/IL-TIF, jenţ je
homologem IL-10 (Dumoutier et al., 2000; Xie et al., 2000). Tento receptor se skládá
z podjednotek IL-10RII a IL-22/CRF2-9R, coţ je nový člen rodiny interferonových receptorů.
Obdobně jako IL-10 také IL-22 můţe indukovat STAT1 a STAT3 (Dumoutier et al., 2000).
Zdá se, ţe pro aktivaci STAT jsou nezbytné oba řetězce receptoru (Xie et al., 2000).
Podjednotka IL-22R obsahuje potenciální vazebná místa pro STAT3 (YXXQ). Bylo ukázáno,
ţe funkčně IL-22 zvyšuje produkci reaktantů akutní fáze v HepG2 buňkách a inhibuje
produkci IL-4 v Th2-polarizovaných lidských T-lymfocytech (Dumoutier et al., 2000; Xie et
al., 2000).
Dalším homologem IL-10 je IL-20, ale na rozdíl od IL-22 se skládá ze dvou
receptorových řetězců, které nejsou strukturálně podobné IL-10R (tj. IL-20Rα a IL-20Rβ).
Vzhledem k tomu, ţe v některých tkáních je exprimován pouze IL-20Rα, nelze vyloučit jejich
heterodimerizaci s dalšími receptory pro cytokiny třídy II. Přesto se zdá, ţe tak jako IL-10,
také IL-20 signalizuje skrze STAT3 (Blumberg et al., 2001). Lokalizační studie a studie
transgenní IL-20 overexprese naznačují roli tohoto ligandu ve funkci epidermis (Blumberg et
al., 2001).
23
2. Funkce jednotlivých členů STAT rodiny v buněčné a tkáňové homeostaze
Na rozdíl od jejich důleţitější vývojové role u primitivních eukaryot, studie cílené na
geny naznačují, ţe u savců se STATy vyvinuly především pro zprostředkování odpovědi na
stres (shrnuto v Schindler a Strehlow, 2000; Ihle, 2001). Navíc tyto studie zdůrazňují
pozoruhodnou úroveň specificity funkce STAT. Například STAT1 a STAT2 přenášejí
především signály pro IFN typu I a II. Obdobně STAT4 a STAT6 hrají důleţitou roli
v polarizaci naivních T-lymfocytů do Th1 respektive Th2 buněk. Nicméně STAT3 a STAT5,
které jsou aktivovány větším počtem cytokinů, jsou ve své funkci více pleiotropní.
Konzistentně s tímto faktem se také jeví být blíţe příbuzné se STAT proteiny nacházejícími
se u niţších eukaryot.
STATy jsou v průběhu evoluce eukaryot dobře konzervovány a mohou kódovat
primordiální SH2 doménu. Homology byly identifikovány u Dictyostelium, Caenorhabditis
elegans, Drosophila, Anopheles, Xenopus a u Danio (Aubry and Firtel, 1999; Barillas-Mury
et al., 1999; Oates et al., 1999; Zeidler et al., 2000; Pascal et al., 2001). U Drosophily je dráha
JAK/STAT dobře geneticky charakterizována a bylo ukázáno, ţe je důleţitá pro larvální
hematopoézu, sexuální identitu, segmentaci embrya a formaci polarity oka (shrnuto v Zeidler
et al., 2000). Jediná JAK u Drosophily vykazuje 27% identitu s Jak2 a jediný STAT 37%
identitu se STAT5. Existují rovněţ homology cytokinového receptoru (Upd) a ligandu (Dom)
(Harrison et al., 1998; Strodicke et al., 2000). U Drosophily je rovněţ konzervováno několik
regulačních proteinů asociovaných se savčí JAK/STAT signalizací, včetně SOCS, PIAS a
STAM (shrnuto v Zeidler et al., 2000). Homology STAT u Dictyostelium jsou rovněţ nejblíţe
příbuzné k savčím STAT5 a STAT3 (15-19% identita). Ačkoliv hrají důleţitou roli ve vývoji
mnohobuněčného stadia u Dictyostelium, tato signální dráha není příbuzná s dráhou
nalézanou u Drosophily a obratlovců (shrnuto v Aubry and Firtel, 1999). Nedávno byly
u C. elegans identifikovány dvě STAT-like sekvence, které vykazují obdobně nízkou úroveň
homologie k savčím homologům (17 a 27% identita) (Ruvkun and Hobert, 1998; Liu et al.,
1999). Tak jako v případě Dictyostelium, ani u C. elegans nebyly nalezeny homology
cytokinového receptoru nebo JAK. Oproti tomu ryba Danio (Zebřička) nese dva geny pro
STATy, homologní k STAT1 a STAT3. Homolog STAT3 je exprimován v raném vývoji a je
synténní s myším a lidským STAT3. Homolog STAT1 je více divergentní a exprimován
v pozdějším ţivotním stadiu (Oates et al., 1999).
U savců je sedm STATů rozděleno do tří shluků. Kaţdý shluk reprezentuje tandemovou
duplikaci. STAT1 a STAT4 jsou na chromozomu 1, zatímco STAT2 a STAT6 kosegregují na
24
chromozomu 10. STAT3 a STAT5 jsou lokalizovány na chromozomu 11, ale gen STAT5
podstoupil v nedávné evoluční historii ještě další duplikaci (tj. na STAT5a a STAT5b)
(Copeland et al., 1995). Konzistentně s tím naznačuje analýza genové struktury STAT3 a
STAT5, ţe tyto dva proteiny mohly být prvními savčími STATy (Miyoshi et al., 2001), coţ se
můţe rovněţ podílet na relativní funkční pleiotropii těchto dvou STAT proteinů.
2.1. STAT1
STAT1 byl prvním objeveným členem multi-genové rodiny, která je základním cílem
interferonové (IFN) aktivace typu I a typu II (Schindler et al., 1992a; Darnell et al., 1994; Ihle
and Kerr, 1995; Stark et al., 1998). Většina, pokud ne všechny, normální funkce STAT1 úzce
souvisí s biologickými efekty interferonů, protoţe vyuţití STAT1 je in vivo značně specifické
vzhledem k IFN ligandům. Významný pokrok v našem chápání role STAT1 v buněčné
fyziologii byl umoţněn přípravou STAT -/- myší exprimujících zkrácený (tj. funkčně
poškozený) protein (Meraz et al., 1996) a myší úplně postrádajících STAT1 expresi (Durbin
et al., 2000). Tito autoři ukázali, ţe STAT1-deficientní myši ztratily vnímavost k oběma
typům interferonů a jsou citlivější k bakteriálním a virovým patogenům. Těmito experimenty
byla potvrzena primární fyziologická role STAT1 ve zprostředkování antivirálních a
imunitních efektech interferonů, která byla původně navrţena Darnellem et al. (1994). Byl
vysloven předpoklad, ţe mechanismus funkce STAT1 v imunitní obraně zahrnuje indukci
imunitních efektorových genů, např. MHC, IRF1, FcγRI atd. Další nedávné studie týkající se
role STAT1 v udrţování imunologické self-tolerance (Nishibori et al., 2004) a nálezy, ţe
STAT1 kontroluje záněty kloubů v modelových systémech (de Hooge et al., 2004), naznačují,
ţe tento transkripční faktor operuje v širším záběru homeostázy imunitního systému, neţ se
doposud myslelo.
Jak STAT1 tak STAT2, jakoţto téměř výhradní mediátory biologických efektů IFN-α
a IFN-γ, vymezují důleţitý molekulární mechanismus, který kontroluje buněčný růst
a apoptózu. Data získaná z in vitro STAT1-deficientních buněk (Durbin et al., 1996;
Meraz et al., 1996) spolu s daty z myší postrádajících gen STAT1 (Bromberg et al., 1996;
Kumar et al., 1997; Ramana et al., 2000) přinesla jasný důkaz, ţe aktivace STAT1
interferonovými ligandy spouští anti-proliferativní a pro-apoptotické efekty. Data
prezentovaná Leem et al. (2000b) prokázala, ţe přeţití, proliferace a odpověď na smrtící
stimuly u lymfocytů rovněţ vyţadují transkripčně aktivní STAT1, ale v tomto případě se zdá,
ţe jeho aktivace je jen částečně závislá na IFN signalizaci. Poznatek, ţe STAT1 můţe být
25
aktivován interleukinem IL-4 nezávisle na interferonech, a ţe je vyţadován pro růstově-
inhibiční efekty tohoto cytokinu (Chang et al., 2000), stejně jako data ukazující důleţitost
STAT1 pro formování kostí (Takayanagi et al., 2002), naznačují, ţe STAT1 ovlivňuje široké
spektrum fyziologických procesů v závislosti na aktivačních ligandech a tkáňových
soustavách.
Ačkoliv přesné molekulární mechanismy, které operují „downstream“ od STAT1
aktivace nejsou dosud příliš známy, jeho finální role v buněčné fyziologii spočívá v modulaci
STAT1-dependentní genové transkripce. Např. jeho imunitní, růstové a apoptotické regulační
aktivity jsou spojeny především s transkripční modifikací IRF-1, MHC, FcγRI, Fas a FasL
TRAIL, cyklin-dependentních kinázových inhibitorů, p21waf1 a kaspázových genů
(Battle and Frank, 2002; Ivashkiv and Hu, 2004). Nedávné analýzy vyuţívající DNA
microarray (Chip-chip) techniky přinesly nový pohled do přesné determinace STAT1-DNA
vazebných míst. Tyto studie, ačkoliv jsou dosud jen v raném stadiu, ukazují, ţe STAT1 se
váţe na mnoho míst na chromozomu 22, a odhalily mnoho nových kandidátních cílových
genů, které dříve nebyly spojovány s IFN-responzivními geny, které mohou být indukovány
pouze v určitých buněčných typech a za určitých specifických podmínek. Postupy vyuţívající
microarrayí rovněţ odhalily nové mechanismy regulace selekce STAT1-vazebných míst
(Martone et al., 2003; Hartman et al., 2005; Wormald et al., 2006a).
2.2. STAT2
STAT2 je unikátním členem rodiny STAT. Je to jediný STAT, o kterém je známo, ţe po
aktivaci neváţe GAS elementy. Dále pak lidský STAT2 je značně odlišný od myšího. Oba
proteiny sdílí 78% homologii, ale významně se liší v C-koncové TAD doméně (Park et al.,
1999). Ačkoliv biologický význam této divergence nebyla dosud plně pochopena, je jasné, ţe
jak myší tak lidský STAT2 jsou aktivovány interferony typu I a hrají kritickou roli v podpoře
antivirové imunitní odpovědi. Biochemické studie, které naznačovaly, ţe STAT2 hraje roli
v signalizaci interferonů typu I, byly potvrzeny STAT2 knokautovanými myšmi (Park et al.,
2000). Další studie STAT2 null myší naznačují, ţe STAT2/IFN-α autokrinní smyčka reguluje
bazální úroveň exprese STAT1 v primárních embryových fibroblastech (MEF), ale ne
v makrofázích.
Byly vytvořeny rovněţ STAT1/STAT2 double-knokaut myši, které nereagují na ţádný
z interferonů¨třídy I a II a vykazují vyšší citlivost k infekci neţ kterékoliv single-knokaut
myši (STAT1 nebo STAT2). To ukazuje na moţnost, ţe STAT2 přenáší některé signály
26
nezávisle na STAT1. Identifikace komplexu STAT2/STAT2/p48 ve STAT1 deficientních
buňkách podporuje hypotézu existence alternativní dráhy STAT2 (Bluyssen and Levy, 1997).
NA rozdíl od detailní znalosti vazby STAT1 na receptor IFN-γ, je vazba na receptor
IFN-α stále kontroverzní. Například receptorové tyroziny, o kterých se uvaţovalo, ţe se k nim
váţe STAT2, nejsou mezi člověkem a myší konzervovány. Obdobně pak studie
STAT2-deficientních lidských a myších fibroblastů napovídají, ţe IFN-α indukovaná aktivace
STAT1 je závislá na STAT2. Byl tak navrţen sekvenční model vazby STAT2-STAT1 (Leung
et al., 1996). Avšak ve STAT2 null makrofázích je IFN-α dependentní aktivace STAT1
normální (Park et al., 2000). Dále pak bylo nedávno navrţeno, ţe rozdíl v C-koncových
sekvencích STAT2 má význam pro unikátní schopnost IFN-α aktivovat Th1 buňky u lidí, ale
nikoliv u myší (Farrar et al., 2000). Ovšem předběţné studie STAT2 deficientních lymfocytů
tento model nepodporují (Lee and Schindler, nepublikovaná pozorování).
2.3. STAT4
STAT4 byl poprvé identifikován pomocí screeningu homologů STAT (shrnuto
v Schindler a Strehlow, 2000). Na rozdíl od všech ostatních STAT proteinů je exprese STAT4
omezena pouze do NK buněk, dendritických buněk a T-lymfocytů. Následné studie pak
určily, ţe STAT4 je aktivován interleukinem IL-12, který hraje kritickou roli ve vývoji Th1
podskupiny Th buněk (oproti podskupině Th2). Jedním z důleţitých projevů této IL-12
dependentní Th1 polarizace je sekrece IFN-γ. Obdobně pak IL-12 indukuje expresi IFN-γ
v NK buňkách (Murphy et al., 2000a).
Charakteristika STAT4 knokautovaných myší potvrdila kritickou roli, kterou STAT4
hraje v signalizaci IL-12 (Kaplan et al., 1996b; Thierfelder et al., 1996). Tak jako u IL-12
deficientních myší (Gately et al., 1998), nedokáţou STAT4 -/- lymfocyty diferencovat do Th1
buněk a produkují v odpověď na IL-12 interferon IFN-γ. Dále pak STAT4 null T-lymfocyty
vykazovaly intenzivní tendenci k polarizaci Th2, coţ odráţí schopnost Th1 buněk bránit
vývoji Th2 buněk. Zajímavé je, ţe s dostatečně silnými Th1 polarizujícími podmínkami je
moţné vytvořit STAT4 null Th1 buňky (Kaplan et al., 1998b).
U lidí, ale nikoliv u myší, je STAT4 aktivován také interferony typu I. V souladu s tím
bylo prokázáno, ţe lidské interferony typu I rovněţ směřují polarizaci T-lymfocytů směrem
k Th1 buňkám (Rogge et al., 1998). Tato druhově specifická IFN-α dependentní aktivace
STAT4 byla nedávno připsána divergenci mezi lidským a myším STAT2 (Park et al., 1999;
Farrar et al., 2000). Konkrétně pak byl navrţen model, ve kterém STAT2 slouţí jako lešení
27
pro vazbu STAT4 k lidskému receptoru pro IFN typu I (Farrar et al., 2000). Nicméně, tento
model nebyl zatím ověřen v buňkách, které exprimují STAT4 endogenně, a musí být zváţeny
i další modely. Například exprese IRF-1, jeţ je nezbytnou podmínkou normální Th1
polarizace, můţe být stimulována jak STAT4 dependentním tak IFN-α (tj. ISGF-3)
dependentním způsobem (Galon et al., 1999). Tato dichotomie by tak mohla být také
způsobena odlišnou regulací IRF-1 u myší a lidí. V souladu s tím bylo zjištěno, ţe myší IRF-1
je cílovým genem pro STAT4, a IRF-1 knokautované myši mají narušenou Th1 odpověď
(shrnuto ve Wurster et al., 2000). Celkově lze řící, ţe STAT4 zřejmě přenáší signály výhradně
pro IL-12. Proto hraje kritickou roli ve vývoji Th1 buněk. Cílové geny STAT4, které
zprostředkovávají tento důleţitý proces, však teprve musí být identifikovány.
2.4. STAT6
STAT6, který je exprimován ve všech tkáních, byl původně purifikován z buněčných
extraktů jakoţto IL-4 stimulovaný STAT (Hou et al., 1994). Aţ později bylo prokázáno, ţe je
aktivován rovněţ IL-13, který sdílí receptorový řetězec s IL-4 (Lin et al., 1995). Ačkoliv IL-4
stimuluje aktivaci STAT6, je stimulováno ještě několik dalších drah. Některé z nich jsou
závislé na adaptérovém proteinu IRS-2 (Ryan et al., 1996).
IL-4 a IL-13 hrají důleţitou roli v regulaci získané imunity. IL-4 je sekretován
aktivovanými T a B lymfocyty, ţírnými buňkami a basofily a podporuje aktivaci několika
buněčných typů, hlavně Th2 buněk. Jiným důleţitým cílem IL-4 jsou B-lymfocyty, u kterých
podporuje diferenciaci a sekreci IgE a IgG1 (shrnuto v Paul, 1997). Bylo popsáno, ţe i další
cytokiny mohou aktivovat STAT6, ale významnost těchto pozorování teprve bude muset být
ověřena.
Vytváření STAT6 knokautovaných myší poskytlo příleţitost důkladněji otestovat roli
STAT6 v imunitní odpovědi. Tyto myši vykazují rozsáhlé defekty ve schopnosti produkovat
vyvinuté Th2 buňky (Kaplan et al., 1996a; Shimoda et al., 1996; Takeda et al., 1996). Tento
defekt je výraznější ve STAT6 -/- myších neţ v IL-4 -/- myších, a to v důsledku ztráty IL-13
signalizace (vedle ztráty IL-4 signalizace). STAT6 knokautované tkáně rovněţ nedokáţí
upregulovat expresi MHC třídy II, IL-4R, receptoru IgE s nízkou afinitou. Tyto myši jsou
rovněţ defektní, co se týče schopnosti tvorby IgE. Zajímavé je, ţe IL-4 dependentní
proliferace u STAT6 deficientních lymfocytů téměř úplně vymizela, i přes normální aktivaci
IRS-2 (Kaplan et al., 1996a).
28
Nedávné studie se začaly zaměřovat na to, jak můţe STAT6 regulovat vývoj Th2 buněk.
Tyto studie naznačují, ţe STAT6 můţe regulovat expresi GATA-3 a c-maf, tedy dvou
transkripčních faktorů důleţitých pro funkci Th2 (Ouyang et al., 1998). STAT6 rovněţ
iniciuje významnou remodelaci chromatinu v lokusu IL-4, coţ naznačuje moţnou roli
v regulaci exprese IL-4 (Agarwal and Rao, 1998). Další nedávné studie se zaměřily na
potenciální roli Bcl-6 v bránění STAT6 signalizaci v B-lymfocytech (Dent et al., 1997;
Ye et al., 1997). Je jasné, ţe identifikace dalších genů řízených STAT6 nejspíše poskytne
hlubší pohled do vývoje a funkce Th2.
2.5. STAT3
STAT3 byl původně identifikován jako faktor akutní fáze imunitní odpovědi, aktivovaný
pomocí IL-6. Je rovněţ aktivován dalšími cytokiny (viz sekce 2.1.3. a Tabulka 1)
(Akira et al., 1994). STAT3 v nedávné době rovněţ získal na významu v důsledku zjištění
jeho zapojení do buněčné transformace. Nejen ţe bylo zjištěno, ţe STAT3 je konstitutivně
aktivní v rostoucím počtu myších i lidských nádorů, ale studie rovněţ ukázaly, ţe STAT3
reguluje Src dependentní transformaci fibroblastů (shrnuto v Bowman et al., 2000). Několik
studií naznačilo, ţe c-myc, Bcl-XL a Fas patří mezi důleţité cílové geny STAT3, které jsou
zapojeny do transformace. Potenciál STAT3 podporovat buněčný růst byl zdůrazněn, kdyţ
byl připraven konstitutivně aktivní mutant STAT3, který posiloval tumorgenezi
(Bromberg et al., 1999). Tato pozorování v nedávné době přitáhla rostoucí zájem o pochopení
způsobu, jakým STAT3 reguluje buněčný růst.
STAT3 je exprimován ve většině tkání, a to brzy po post-implantaci. V souladu s tím
vede narušení genu pro STAT3 k raně embryonálně letálnímu fenotypu (Takeda et al., 1997).
STAT3 -/- embrya se vyvíjela normálně do stadia E6.5, ale protoţe postrádala mezoderm,
vykazovala rychlou regresi a umírala kolem dne E7.5. Tento raný letální fenotyp zpočátku
omezoval moţnost zhodnotit roli STAT3 ve specifických signálních drahách. Vytvoření myší
s „floxed“ STAT3 alelou však umoţnilo přípravu tkáňově specifických knokautů. STAT3
deficientní T-lymfocyty tak vykazovaly ztrátu proliferativní odpovědi k IL-6, u kterého bylo
dříve zjištěno, ţe v těchto buňkách potlačuje apoptózu (Takeda et al., 1998). Delece STAT3
u makrofágů (a neutrofilů) odhalila důleţitou roli, kterou STAT3 hraje v signalizaci IL-10
a downregulaci imunitní odpovědi (Takeda et al., 1999). Tyto myši jsou výrazně citlivé
k LPS, polarizaci směrem k Th1 buňkám a jako dospělé vykazují chronickou enterokolitidu.
STAT3 null mléčné ţlázy vykazují výrazné zpomalení programované buněčné smrti, ke které
29
dochází během cyklické involuce mléčných ţláz (Chapman et al., 1999). Myši se STAT3
deficientními hepatocyty vykazují defekty ve schopnosti indukovat geny akutní fáze imunitní
odpovědi (např. SAP, FB, HP, SAA a Hpx) v odpovědi na IL-6 (Alonzi et al., 2001). Přesto
mohou být tyto geny stále indukovány kortikosteroidy, jeţ jsou dalším schopným induktorem
genů akutní fáze.
Na závěr, tkáňově specifická delece STAT3 v keratinocytech poskytla ty nejpřekvapivější
výsledky. Takové myši vykazovaly defekty jak kůţe, tak srsti (Sano et al., 1999). Patologie
kůţe zahrnovala akantózu (hyperplazii epidermis), hyperkeratózu a šupinatost. In vivo studie
primárních STAT3 null keratinocytů ukázaly defektní odpovědi na EGF, HGF, TGF-α a IL-6
při zkouškách hojení ran. Nebyl přitom ovšem zhodnocen vliv IL-20, který rovněţ signalizuje
přes STAT3 a reguluje růst keratinocytů (Blumberg et al., 2001). Fenotyp chlupů byl ještě
zajímavější. Myši vykazovaly normální primární (tj. in utero) růst ochlupení, ale měly
výrazné defekty v sekundárním růstu ochlupení (tj. postnatální den 11 a dále). Detailnější
studie naznačují, ţe regulace spontánního růstu chlupů je pod kontrolou STAT3 (Sano et al.,
2000).
2.6. STAT5
STAT5 (respektive STAT5a) byl poprvé identifikován jako transkripční faktor
indukovaný prolaktinem. Jak biochemické studie zaměřené na identifikování transkripčního
faktoru indukovaného IL-3, tak screening cDNA vedly k objevu dvou blízce příbuzných
sekvencí, STAT5a a STAT5b (Azam et al., 1995; Mui et al., 1995). Bylo zjištěno, ţe tyto
proteiny jsou kódovány dvěma příbuznými geny, STAT5a a STAT5b, které sdílí 96% identitu
a liší se pouze ve svých C-koncích (shrnuto v Schindler a Strehlow, 2000). Následné studie
ukázaly, ţe oba STAT5 proteiny jsou exprimovány ve všech tkáních. Mimo prolaktinu (PRL)
jsou proteiny STAT5 aktivovány rovněţ rodinou IL-3 (IL-3, IL-5 a GM-CSF), rodinou IL-2
(IL-2, IL-7, TSLP, IL-9, IL-15 a IL-21), růstovým hormonem (GH), Epo a Tpo (Arnould et
al., 1999; Schindler a Strehlow, 2000; Asao et al., 2001).
In vitro studie dominantně negativních STAT5 mutantů ukázaly, ţe STAT5a a STAT5b
vykazují funkční redundanci (Moriggl et al., 1996). Přes tyto strukturální a funkční
podobnosti mají STAT5a a STAT5b single-knokaut myši pozoruhodně odlišné fenotypy, a
STAT5a/b double-knokaut myši vykazují kombinovaný fenotyp. STAT5a single-knokaut
myši byly především defektní v PRL dependentním vývoji mléčných ţláz (Liu et al., 1997;
Teglund et al., 1998). STAT5a/b double-knokaut myši vykazovaly závaţnější fenotyp.
30
Připomínaly PRL receptor knokautované myši a byly jak neplodné tak defektní ve vývoji
mléčných ţláz, coţ naznačuje, ţe STAT5b můţe částečně ztrátu STAT5a kompenzovat
(Ormandy et al., 1997; Teglund et al., 1998).
STAT5b single-knokaut myši vykazovaly pouze defekty podobné GH receptor
deficientním myším (Udy et al., 1997; Teglund et al., 1998). Protoţe je STAT5b aktivován
především vysokými hladinami růstového hormonu přítomnými u samců
(Waxman et al., 1995), samice byly fenotypově normální. STAT5b null samečci byli menší
(tj. velikosti samiček), vykazovali ztrátu exprese jaterních genů specifických pro samce (např.
mup, cyp2d9) a zvýšení exprese jaterních genů specifických pro samice, jako např. cyp3a.
Tyto defekty byly opět výraznější u STAT5a/b double-knokaut myší. Ty navíc s rostoucím
věkem vykazovaly dramatický úbytek váhy těla (aţ o 40 % vzhledem k normálu). Další
analýzy naznačily, ţe STAT5a zřejmě můţe zabránit této lipolýze (Fain et al., 1999).
Nejméně očekávaným fenotypem STAT5a/b double-knokaut myší byl jejich relativně
normální krevní obraz (Teglund et al., 1998). Předchozí biochemické studie naznačovaly, ţe
STAT5 hraje důleţitou roli v přenosu signálu pro mnohé cytokiny zapojené do hematopoézy
(Tabulka 1). Pečlivější analýza nicméně odhalila významné defekty ve vývoji myeloidní
i lymfoidní linie. Tyto defekty byly zřetelné jen v podmínkách zvýšeného systémového stresu.
Například STAT5a/b deficientní buňky kostní dřeně vykazovaly poruchy liniově specifické
expanze počtu buněk v důsledku působení IL-3, IL-5, IL-7, G-CSF, Tpo a GM-CSF (Teglund
et al., 1998). V souladu s tím nedávné studie naznačily, ţe myeloidní vývoj indukovaný
GM-CSF koreluje s nezbytným procesem zpracování STAT5 proteinu (Piazza et al., 2000).
Kontroverzní studie ukázaly, ţe u STAT5a/b double-knokaut myší je přítomen defekt rychlé
expanze počtu červených krvinek během prostřední fáze gestace (Socolovsky et al., 1999;
Ihle, 2001). Další analýza naznačila, ţe STAT5 podporuje přeţívání erytroidních prekurzorů
skrze upregulaci Bcl-XL exprese. Proti tomuto zjištění však mluví nedávná zpráva
naznačující, ţe exprese Bcl-XL ve fetálních jaterních buňkách získaných ze STAT5a/b
double-knokaut myší je normální (Ihle 2001). STAT5a/b double-knokaut myši rovněţ
vykazují defekty v rychlé expanzi počtu makrofágů v zánětlivých exsudátech (Kieslinger et
al., 2000). Tento defekt rovněţ koreluje se ztrátou exprese Bcl-XL. Zajímavé je, ţe tyto
exsudáty vykazovaly relativní nárůst obsahu granulocytů, coţ naznačuje, ţe STAT5 moţná
reguluje některé programy diferenciace přímějšími cestami.
Pečlivá analýza lymfocytů ze STAT5a/b double-knokaut myší rovněţ odhalila významné
defekty. T-lymfocyty vykazovaly hluboký defekt schopnosti proliferovat v reakci na IL-2,
31
obdobně k tomu, co bylo pozorováno u IL-2R β-řetězec null myší (Suzuki et al., 1995;
Moriggl et al., 1999). Analýza periferních buněk odhalila abnormálně velkou populaci
chronicky aktivovaných T-lymfocytů, opět podobně jako u IL-2R β-řetězec null myší (Suzuki
et al., 1995). To bylo nedávno připsáno defektu v buněčné smrti indukované antigeny
(ACID), která závisí na IL-2 a ne na IL-15 (Van Parijs et al., 1999; Waldmann et al., 2001).
Naproti tomu byly počty prekurzorů B-lymfocytů ve STAT5a/b double-knokaut myších
redukovány v důsledku neschopnosti reagovat proliferací na IL-7 (Sexl et al., 2000).
Pozoruhodné je, ţe NK buňky ve STAT5a/b double-knokaut myších úplně chyběly (Teglund
et al., 1998).
Myši deficientní v obou STAT5 genech poskytly rovněţ příleţitost zhodnotit potenciální
roli STAT5 ve vývoji hematopoetických nádorů, včetně těch připisovaných onkogenům
TEL-Jak2 a v-Abl/BCR-Abl. Předchozí studie dokumentovaly pozoruhodnou prevalenci
konstitutivně aktivovaného STAT5 v takových nádorech (shrnuto v Bowman et al., 2000;
Coffer et al., 2000). Navíc bylo zjištěno, ţe konstitutivně aktivované mutanty STAT5
transformují Ba/F3 buňky způsobem závislým na Pim1 a Bcl-XL, coţ jsou dva z cílových
genů STAT5 (Nosaka et al., 1999; Ariyoshi et al., 2000). Neočekávaným zjištěním bylo, ţe
po infekci B-lymfocytů odvozených ze STAT5a/b deficientní kostní dřeně Abelsonovým
transformujícím virem se nádory vyvíjely s normální frekvencí. To naznačuje, ţe STAT5 není
nezbytný pro v-Abl (nebo BCR-Abl) dependentní tumorgenezi (Sexl et al., 2000), coţ
kontrastuje s výsledky zjištěnými pro onkogen TEL-Jak2 (Schwaller et al., 2000). Jak
myeloidní tak lymfoidní transformace je ve STAT5a/b null pozadí významně redukována.
Transformace v myeloidní linii navíc můţe být plně obnovena expresí osm (cílový gen
STAT5), coţ silně naznačuje roli OSM v patogenezi tohoto onemocnění a ukazuje na
pozoruhodné spojení se STAT3, který je pomocí OSM aktivován (Tabulka 1).
2.7. Význam STAT proteinů v realizaci biologických účinků cytokinů
Stimulace receptorů různými cytokiny včetně interferonů vede k aktivaci různých
kombinací Janus proteintyrozinkináz (JAK PTK) asociovaných s receptorem. Patří sem
proteiny Jak1, Jak2, Jak3 a Tyk2, které jsou součástí cytoplasmy a nacházejí se v blízkosti
receptorů v membráně a zprostředkovávají ligand-dependentní aktivaci STATů (Schindler a
Darnell, 1995; O´Shea et al., 2002). Zatímco Jak3 je exprimován převáţně v buňkách
hematopoetického původu, zbývající tři kinázy ve všech buněčných typech (Ihle, 1996).
32
Na rozdíl od dalších kináz, jakými jsou např. Src, neobsahují JAK SH2 ani SH3 doménu
(Schindler a Darnell, 1995; Ihle, 1996).
Je známo, ţe interferony (IFN), jako jedna ze skupiny cytokinů, představují extracelulární
signální mechanizmy, které se parakrinně i autokrinně podílejí na regulaci proliferace a
diferenciace buněk. IFN-α a IFN-β se váţou na společný receptor typu I, receptor typu II je
vazebnou strukturou pro IFN-γ (Pestka, 1997; Farrar a Schreiber, 1993). Stimulace receptoru
má za následek aktivaci Janus proteintyrozinkináz, které následně indukují ligand dependentní
aktivaci proteinů STAT. JAK/STAT signální dráha je charakterizována pro celou řadu
ligandů (Ihle, 1994; Ihle a Kerr, 1995; Schindler a Darnell, 1995; Darnell, 1997). Vazba
ligandu na receptor je provázena jeho dimerizací a následně aktivací tyrozinkináz JAK, které
katalyzují fosforylaci tyrozinu v cytoplazmatické části receptoru. Fosfotyroziny receptoru
jsou determinantou pro SH2 domény STAT proteinů a zprostředkovávají tak připojení
STATů k receptoru. Po vazbě na receptor JAK proteiny fosforylují STAT na evolučně
konzervovaném tyrozinu. Dochází tak k aktivaci STAT proteinu, jeho uvolnění z receptoru a
dimerizaci interakcí SH2 domény jednoho STAT proteinu s fosfotyrozinem druhého STATu.
Následně tyto homo- či heterodimery putují do jádra, kde se váţou na specifické enhancerové
sekvence, jimiţ jsou pro interferony skupiny I tzv. ISRE („IFN Stimulation Response
Element“) a pro IFN-γ tzv. GAS determinanty („IFN-Gamma Activation Site“). Efektorovým
mechanizmem interferonové JAK/STAT dráhy je aktivace exprese řady cílových genů.
Ačkoli fosfotyrozinová aktivace STAT proteinů je pro přenos signálů povaţována za
klíčovou, ukazuje se, ţe fosforylace proteinů STAT1 a STAT3 na serinu se rovněţ na této
dráze podílí. Nedávno Yaffe a Cantley (1999) identifikovali fosfoserinové vazebné domény,
které participují na proteinových interakcích závislých na fosforylaci a následně i na
propagaci cytokinových signálů. Lokalizace serinu 727 (Ser 727) v sekvenci rozpoznávané
MAP kinázami („Mitogen-activated Protein Kinase“) je důvodem ke spekulaci, ţe
fosfoserinová aktivace představuje mechanizmus jímţ STAT proteiny harmonizují proteinové
interakce v rámci alternativních signálních drah.
2.8. STAT proteiny v regulaci exprese genů
2.8.1. Cílové geny, které jsou pod kontrolou STAT proteinů
Přestoţe identifikace cílových genů, jejichţ transkripce je pod kontrolou STAT proteinů,
není zdaleka vyčerpávající, řada z nich je jiţ v současnosti dobře charakterizována.
Za povšimnutí stojí, ţe v řadě případů se jedná o geny, které regulují buněčný cyklus,
33
proliferaci a apoptózu, tj. procesy, jejichţ defekty jsou atributem maligní buňky. Jako příklad
je moţné uvést geny bcl-XL (Bromberg et al., 1999; Catlett-Falcone et al., 1999;
Karni et al., 1999), cyklin D1 (Bromberg et al., 1999; Sinibaldi et al., 2000), p21WAF/CIP
(Sinibaldi et al., 2000) a c-myc (Bromberg et al., 1999; Kiuchi et al., 1999). Lze předpokládat,
ţe deregulace těchto, ale pravděpodobně i řady jiných genů, jejichţ exprese je kontrolována
STATy, představuje mechanizmus, jímţ se tyto proteiny spolupodílejí na maligní přeměně
buňky. Na podporu této hypotézy lze uvést několik studií, které dokladují překvapivě vysokou
incidenci patologické aktivace STAT proteinů v různých lidských nádorech a maligních
buněčných liniích (Frank, 1999; Garcia et al., 2001; Kube et al., 2001).
3. Regulace signální dráhy JAK/STAT
Dráha JAK/STAT je důleţitá pro celou řadu odpovědí organizmu, včetně obrany,
diferenciace, proliferace a onkogeneze. Proto není překvapením, ţe pro modulaci této signální
dráhy existuje celá řada regulačních vrstev. Ty zahrnují jak negativní, tak pozitivní regulaci.
Efekt těchto regulačních procesů stanovuje úroveň (intenzitu), se kterou jsou signály STAT
přenášeny.
3.1. Negativní regulace STAT signalizace
Ve vztahu k abnormální signální dráze STAT1 lze předpokládat existenci několika
alternativních mechanizmů. Ty zahrnují aberantní autokrinní nebo parakrinní stimulaci
normálních receptorů, zvýšenou nebo nedostatečnou aktivitu tyrozinkináz a abnormální
expresi negativních regulátorů signálních drah cytokinů, které za fyziologických podmínek
inhibují STAT aktivaci. Poslední ze zmíněných mechanizmů souvisí s identifikací několika
nových proteinů, které specificky antagonizují signální dráhu JAK/STAT (Chung et al., 1997;
Endo et al., 1997; Matsumoto et al., 1997; Naka et al., 1997; Starr et al., 1997;
Hilton et al., 1998; Hilton, 1999). Jedná se o fyziologické supresory cytokinových signálů
(SOCS: „Suppressors of Cytokine Signaling“), proteinové inhibitory aktivovaných STATů
(PIAS: „Protein Inhibitors of Activated STATs“) a fosfatázy obsahující SH2 domény
(SHP: „SH2- containing Phosphatases“).
Ačkoliv se rané studie zaměřovaly především na aktivaci STAT, pomíjivá podstata těchto
signálů naznačovala, ţe regulován bude i rozpad signálu. Ve skutečnosti ukázaly nedávné
studie ukázaly, ţe STAT signály jsou downregulovány hned na několika místech signální
kaskády, včetně receptorů, JAK a samotných molekul STAT.
34
3.1.1. Receptory
Buňky běţně pouţívají několik mechanismů, kterými chrání své receptory od
prodlouţené aktivace. Mezi takové mechanismy patří vytváření solubilních receptorů, které
soutěţí o omezené mnoţství ligandů. Tyto isoformy jsou vytvářeny buď proteolýzou, nebo
alternativním sestřihem RNA. Častějším mechanismem downregulace je endocytóza
receptorů. V souladu s tím byl v intracelulární doméně gp130 identifikován konzervovaný
deseti-aminokyselinový motiv, který reguluje endocytózu (Dittrich et al., 1996).
3.1.2. Cílená degradace
Ubiquitin-proteozom dependentní degradace můţe v downregulaci cytokinové signalizace
rovněţ hrát roli. Bylo zjištěno, ţe proteozomové inhibitory způsobují degradaci jak STAT1,
tak receptorů pro IFN-γ ve stimulovaných buňkách (Haspel et al., 1996; Kim a Maniatis,
1996). Nedávné studie určily, ţe proteozomové inhibitory významně stabilizují
tyrozinfosforylované izoformy STAT4, STAT5 a STAT6, ale mají jen malý efekt na STAT1,
STAT2 a STAT3. Dále pak tyto studie identifikovaly C-terminální doménu STAT5, která
podporuje jejich degradaci (Wang et al., 2000). Proteozomové inhibitory rovněţ prodluţují
aktivitu JAK (Yu a Burakoff, 1997; Callus a Mathey-Prevot, 2000). Celkový význam cílené
degradace pro signalizaci STAT však zůstává sporný (Lee et al., 1997; Melen et al., 2001).
3.1.3. Defosforylace JAK
Aktivace JAK je závislá na fosforylaci tyrozinů. Proto není překvapením, ţe dvě příbuzné
fosfatázy obsahující SH2 doménu, a to SHP1 a SHP2, (SHP: „SH2- containing
Phosphatases“), negativně regulují aktivitu JAK. Zatímco exprese SHP1 je do značné míry
omezena na hematopoetické tkáně, SHP2 je exprimován více tkáních (Yi et al., 1993;
Jiao et al., 1997). Ztráta receptorových tyrozinových motivů, které váţou SHP1 k Epo
receptoru, prodluţuje aktivitu a signalizaci JAK (Klingmuller et al., 1995). Dále pak je
známo, ţe v přírodě se vyskytující mutace v tomto místě vede k jisté formě familiární
erytrocytózy (de la Chapelle et al., 1993). Obdobná pozorování byla učiněna i u společného
β-řetězce, který přenáší signály pro IL-3, IL-5 a GM-CSF (Yi et al., 1993). Stejně tak studie,
ve kterých byl receptor gp130 mutován přístupem knock-in, určily, ţe ztráta schopnosti vázat
a aktivovat SHP2 významně prodluţuje STAT3 signalizaci (Ohtani et al., 2000). Další studie
naznačily, ţe SHP1 a SHP2 přímo interagují a defosforylují JAK respektive STAT5
(Yi et al., 1993; Yu et al., 2000). Dále bylo zjišteno, ţe dobře charakterizovaná membránová
35
fosfatáza, CD45, negativně reguluje signalizaci JAK-STAT stimulovanou pomocí IL-3, IL-4
EPO a IFN-γ (Irie-Sasaki et al., 2001). Tato pozorování naznačují, ţe fosfatázy hrají důleţitou
roli v negativní regulaci STAT dependentní signalizace.
3.1.4. Negativní zpětná vazba
Proteiny SOCS, objevené nezávisle na sobě třemi různými výzkumnými skupinami
zhruba ve stejné době, představují zřejmě nejdůleţitější faktory v klasické negativní
zpětnovazebné smyčce, které negativně regulují JAK/STAT signální dráhu iniciovanou
mnoha cytokiny (Hilton et al., 1998; Hilton, 1999). Některé výsledky naznačují, ţe
transkripce většiny, ne-li dokonce všech genů kódujících proteiny SOCS, je indukována nebo
regulována samotnými cytokiny, a to pravděpodobně přes aktivované molekuly STAT
proteinů (Hilton, 1999). Ačkoli je jiţ známo 20 proteinů, které sdílí identickou C-terminální
sekvenci, tzv. „SOCS box“, pouze 8 z nich, které obsahují jak C-terminální SOCS box, tak
i centrální Src homologní doménu (SH2), se podílí na signální transdukci cytokinů (Endo
et al., 1997; Matsumoto et al., 1997; Naka et al., 1997; Starr et al., 1997; Hilton et al.,1998).
První člen této rodiny, označený symbolem CIS („Cytokine Inducible SH2-containing
protein“), byl identifikován jako produkt genů, jejichţ transkripce je indukována v časné fázi
cytokinové aktivace („immediate early genes“) ( Yoshimura et al., 1995; Matsumoto et al.,
1997). SOCS 1 protein, označovaný rovněţ jako JAB („JAK binding protein“) nebo SSI 1
(„STAT-induced STAT inhibitor 1“), byl identifikován na základě jeho schopností:
1. inhibovat diferenciaci buněk myeloidní leukémie linie M1 závislé na interleukinu 6
(Starr et al., 1997); 2. interagovat s doménou JH1 peptidu Jak1 (Endo et al., 1997); 3. působit
jako cílový protein specifické protilátky proti doméně SH2 (Naka et al., 1997). Další proteiny
SOCS 2-7 byly objeveny na základě jejich homologie se SOCS 1 (Starr et al., 1997;
Hilton et al., 1998).
Proteiny SOCS inhibují přenos signálu různými, ne zcela známými mechanismy. Bylo
například dokázáno, ţe SOCS 1 se váţe na všechny čtyři JAK kinázy a inhibuje jejich aktivitu
in vitro, zatímco CIS asociuje s receptorem, ale neinteraguje s ním, ani neinhibuje JAK
peptidy. SOCS 3, podobně jako SOCS 1, váţe JAK kinázy, ale s menší afinitou, a proto musí
být jeho exprese podstatně vyšší neţ v případě SOCS 1, aby dosáhl ekvivalentní inhibice
kinázové aktivity. Charakteristickou, a pro SOCS 3 specifickou, vlastností je fosforylace na
tyrozinu po stimulaci cytokiny. Inhibice signální dráhy JAK/STAT vede „feedback“
(zpětnovazebným) mechanizmem ke sníţení exprese proteinu SOCS, coţ má za následek
připravenost buňky odpovídat na další cytokinový signál. V některých případech můţe
36
indukce proteinu SOCS jedním cytokinem inhibovat signální transdukci dalšího cytokinu.
Například působení interleukinu 10 na monocyty inhibuje prostřednictvím indukce SOCS 3
následný přenos signálu IFN-α nebo IFN-γ (Ito et al., 1999). Ukazuje se, ţe proteiny SOCS
mohou zprostředkovávat komunikaci („crosstalk“) mezi různými signálními drahami. Ačkoli
přesný molekulární mechanismus, kterým peptidy SOCS blokují dráhu JAK/STAT, zůstává
stále nejasný, je pravděpodobné, ţe tyto proteiny mohou ovlivňovat prahovou hladinu
cytokinů, na níţ bude buňka významně odpovídat.
3.1.5. Modifikace STAT
Aktivita STAT můţe být rovněţ negativně regulována přímými modifikacemi, hlavně pak
defosforylací (viz sekce 3.1.3). Jinou dobře charakterizovanou modifikací je tvorba
C-terminálně zkrácených isoforem. Ačkoliv jsou tyto isoformy často produkovány na úrovni
transkripce, mohou být rovněţ tvořeny proteinovým procesováním (Meyer et al., 1998;
Lee et al., 1999a). Tyto zkrácené STAT proteiny zřejmě převáţně fungují jako dominantní
interferující isoformy (Caldenhoven et al., 1996; Kieslinger et al., 2000; Piazza et al., 2000).
V nedávné době byla oznámena rovněţ metylace STAT, ale fyziologický význam této
modifikace ještě nebyl plně objasněn (Mowen et al., 2001).
3.1.6. Inhibitorové proteiny STAT
Dvou-hybridový screening kvasinek identifikoval velké mnoţství proteinů interagujících
se STAT, včetně rodiny PIAS (proteinový inhibitor aktivovaných STATs) (shrnuto ve Shuai,
2000). Tato rodina se rozrostla na pět členů, a to PIAS1, PIAS3, PIASy, PIASxα a PIASxβ,
z nichţ kaţdý nese N-koncový LXXLL „signature“ motiv, předpokládaný Zn-vazebný motiv,
vysoce kyselou doménu a serin/treonin bohatý C-koncový motiv (Shuai, 2000). Zdá se, ţe
PIAS1 se váţe k aktivovaným dimerům STAT1, čímţ blokuje jejich schopnost vázat DNA
(Liao et al., 2000). Analogicky PIAS3 blokuje DNA vazebné aktivity STAT3
(Chung et al., 1997). Nedávno bylo ukázáno, ţe dPIAS, coţ je homolog PIAS u Drosophily,
negativně reguluje jejich STAT, jmenovitě STAT92E. Správně vyváţený poměr
dPIAS/STAT92E je rovněţ klíčový pro vývoj krevních buněk a oka Drosophily
(Betz et al., 2001). Studie cílené na geny by měly pomoci definovat celkový význam proteinů
PIAS v regulaci STAT signalizace.
37
3.2. Pozitivní regulace funkce STAT
Ačkoliv se prvotní studie soustředily na roli, kterou hrají tyroxin-kinázy při aktivaci
STAT, nedávnější studie identifikovaly také další pozitivní regulátory. Mezi ně patří
serin- kinázy a interagující proteiny.
3.2.1. Fosforylace serinu
Objev, ţe STAT proteiny mohou být modifikovány fosforylací serinu, odhalil moţnost
vzájemné komunikace mezi signálními kaskádami (Decker a Kovarik, 2000). Prvotní studie
prokázaly fosforylaci serinu 727 v PMSP motivu, a to jak ve STAT1, tak ve STAT3 (Wen et
al., 1995; Zhang et al., 1995). Konzervace motivu PMSP v C-koncích STAT1, STAT3,
STAT4 a STAT5 ukázala moţnost, ţe za tuto modifikaci jsou zodpovědné prolinem-řízené
serinové kinázy, např. MAP kinázy (Gonzalez et al., 1991). Tato záleţitost zůstává nicméně
kontroverzní, částečně proto, ţe bylo zjištěno, ţe fosforylaci STAT1 a STAT3 provádějí různé
serinové kinázy v závislosti na povaze stimulu a ko-stimulu (Decker and Kovarik, 2000).
Studie reportérových genů určily, ţe fosforylace serinů zvyšuje transkripční aktivitu STAT1 a
STAT3 (Wen et al., 1995; Decker and Kovarik, 2000). Další fyziologické studie STAT1
deficientních buněk, ke kterým byl přidáván STAT1 resp. STAT1S727A
ukázaly, ţe fosforylace
serinu zvyšuje schopnost STAT1 řídit expresi některých, ale ne všech cílových genů
(Kovarik et al., 2001). Nedávné studie rovněţ naznačují, ţe fosforylace serinů zvyšuje
transkripční aktivitu STAT4 (Visconti et al., 2000). Ačkoliv jak STAT5 tak STAT6 mohou
být fosforylovány na serinu, zvýšení jejich transkripční aktivity doposud nebylo přesvědčivě
prokázáno (Yamashita et al., 1998). Spíše se zdá, ţe fosforylace serinů u STAT5 zvyšuje
stabilitu proteinu (Beuvink et al., 2000).
3.2.2. Interakce s dalšími transkripčními faktory a buněčnými proteiny
Transkripční regulace eukaryotických genů zahrnuje specifické a uspořádané interakce
velkého počtu proteinů, včetně enhancer/promotor specifických transkripčních faktorů,
komplexů re-modelujících chromozomy a komponent bazálního transkripčního systému
(Maniatis et al., 1998; Pugh, 2000). V souladu s těmito pozorováními popisuje mnoho studií
robustní interakce mezi STATy a dalšími regulátory transkripce. První důkaz interakce mezi
STATy a dalším transkripčním faktorem byl podán ko-purifikací IRF-9 (p48) spolu se STAT1
a STAT2 v rámci komplexu ISGF-3 (Schindler a Strehlow, 2000). Následné analýzy STAT
dependentních promotorů poskytly jak funkční tak biochemické důkazy interakcí s dalšími
38
transkripčními faktory. Bylo prokázáno, ţe STAT1 interaguje s NF-κB, Sp1, USF-1, PU.1 a
glukokortikoidovým receptorem (Look et al., 1995; Ohmori et al., 1997; Muhlethaler-Mottet
et al., 1998; Aittomaki et al., 2000). STAT3 interaguje s Sp1, c-Jun a glukokortikoidovým
receptorem (Schaefer et al., 1997; Cantwell et al., 1998; Zhang et al., 1999b). STAT5
interaguje s YY-1, Sp1, C/EBPβ a glukokortikoidovým receptorem (Meier a Groner, 1994;
Stocklin et al., 1996; Martino et al., 2001; Wyszomierski a Rosen, 2001). STAT6 pak asociuje
s NF-κB a C/EBPβ (Mikita et al., 1998; Shen a Stavnezer, 1998).
Další studie ukázaly moţnost asociace mezi STATy a proteiny, které zajišťují transkripci
skrze modifikaci chromatinu. Velkou roli v těchto studiích hrál dvou-hybridový screening
kvasinek. Podle očekávání byly jako první proteiny interagující se STATy (konkrétně
STAT2) nalezeny proteiny modifikující chromozomy CBP/p300 (Bhattacharya et al., 1996).
Další studie ukázaly funkční a fyzickou asociaci mezi CBP/p300 a dalšími STATy (Horvath,
2000). Nedávno pak byla prokázána asociace STATů s dalšími proteiny modifikujícími
chromatin, konkrétně BRAC1, Mcm5, Nmi a HMG-I(Y) (Zhang et al., 1998; Zhu et al., 1999;
Ouchi et al., 2000; Kim et al., 2001). Konečně pak dvou-hybridový screening odhalil
i nejaderné proteiny asociující se STAT proteiny. Jsou to: StIP1, cytosolový WD40 protein,
který zřejmě zajišťuje interakci mezi JAK a STATy, STAM, vazebný protein JAK, a SH2-B,
vazebný protein receptoru pro růstový hormon (Takeshita et al., 1997; Carter-Su et al., 2000;
Collum et al., 2000).
Detailní analýza některých eukaryotických promotorů napovídá, ţe poměrně nízký počet
interakcí popsaných v této sekci bude postupně stoupat, jakmile budou důkladnějšímu
zkoumání podrobeny STAT dependentní promotory (Zhang et al., 1999b; Kim et al., 2001).
Tyto studie pravděpodobně také poskytnou informace o moţnostech, které poskytují
modifikace STAT (např. fosforylace serinů) pro diferenční regulaci exprese některých
vybraných genů.
39
4. Patologická funkce STAT/SOCS/PIAS signálních drah a její důsledky
4.1. Defekty v expresi a aktivaci proteinů STAT in vitro
Je pravděpodobné, ţe defektní exprese či aktivace STAT proteinů významně ovlivňuje
vnímavost buňky na interferonové signály. Wong a spol. (1997), prokázali na modelu
buněčných kultur lidského maligního melanomu úzkou souvislost mezi sníţenou expresí
a aktivací STAT1, STAT2 a p48-ISGF 3 transkripčního faktoru („Interferon-stimulated Gene
Factor 3) na jedné straně a sníţenou odpovědí na interferony na straně druhé. Podobnou
analýzu s identickými výsledky uvádí studie Kolla a spol. u buněčných linií z lidského
karcinomu mléčné ţlázy (Kolla et al., 1996).
4.2. STAT proteiny a nádorové onemocnění
Několik autorů předpokládá, ţe aberantní funkce STATů můţe přímo či nepřímo
přispívat k onkogenezi a můţe rovněţ zasahovat do citlivosti některých maligních nádorů na
terapii zaloţené na cytokinech.
4.2.1. STATy v onkogenezi.
Prvotní ukazatele asociace STAT modifikace s maligním růstem pramení z pozorování
konstitutivní aktivace STAT1, STAT3 a STAT5 v různých typech leukemií a lymfomů stejně
tak i u stabilizovaných buněčných linií z lymfoproliferativních malignit (Bowman et al.,
2000). Následující studie postupně odhalily konstitutivně aktivované STAT proteiny
u širokého spektra nehematologických malignit včetně nádoru prsu, hlavy a krku, plic,
prostaty, vaječníků, ledvin nebo slinivky břišní právě tak jako u nádoru mozku a maligního
melanomu (Turkson a Jove, 2000). Trvalá aktivace STAT transkripčních faktorů je příčinou
nepřesné exprese cílových genů a úniku buněk mechanismu kontroly růstu, coţ můţe nakonec
vyústit v maligní přeměnu. Přestoţe ne všechny mechanismy vedoucí ke konstitutivní aktivaci
STATů v nádorech jsou detailně popsány a analyzovány na molekulární úrovni, několik
moţných cest je dobře rozpoznáno. Mezi cesty vedoucí k aktivaci STAT proteinů
v nádorových buňkách patří: (a) autokrinní nebo (b) parakrinní aktivace cytokinových
receptorů, (c) onkoproteinové kinázy, pro které STATy nejsou fyziologickými substráty
(např. Bcr-Abl), (d) zmutované buněčné tyrozinkinázy (např. Src), (e) chimérické
onkoproteiny, které aktivují kinázy, které normálně fosforylují STATy (např. Tel-Jak),
(f) proteiny, které mohou aktivovat receptor nezávisle na ligandu (např. u HTLV-I
40
transformace) a (g) aktivované serinkinázy, které neaktivují STATy samy o sobě, ale mohou
přispět k nepřesné odpovědi na fyziologické signály. Navíc, s poznáním proteinů, které
negativně regulují STAT signalizaci, jako jsou SOCS rodina, se zdá pravděpodobné, ţe ztráta
jejich funkce, vadnou genovou expresí nebo mutací, můţe také přispívat k trvalé
STAT-dependentní genové transkripci a autonomnímu buněčnému růstu.
Představa o významné účasti poškozených STAT proteinů v procesu onkogeneze byla
později podpořena zjištěním, ţe STAT3 protein je konstitutivně aktivován ve v-Src
transformaci (Yu et al., 1995). Následné studie ukázaly, ţe konstitutivní aktivace specifických
STATů, zejména STAT1, STAT3 a STAT5, je spojena s transformací několika, ale
ne všech, rozličných onkogenních tyrozinkináz a také s transformací nádorovými viry
(Bowman et al., 2000). Nicméně otázka, zda je STAT aktivace nutná k maligní transformaci
nebo je pouze její následek, zůstává stále nezodpovězená.
4.2.2. Citlivost STAT proteinů k interferonům.
O značném mnoţství nádorů, zejména nehematologického původu, je známo, ţe jsou
samy o sobě rezistentní k biologickým účinkům interferonů. Bylo navrhováno, ţe chybná
STATy-mediovaná a s rakovinou asociovaná signalizace představuje jeden z mechanizmů,
který zeslabuje nebo ruší odpověď maligních buněk na interferony. Pozměněná exprese
STAT proteinů, defosforylace tyrozinu, proteazomy-mediovaná degradace a asociace
s inhibitory proteinů, to vše se můţe podílet na nepřesné funkci STATy-mediovaných
signálních drah.
Přestoţe problematika disfunkce STAT proteinů ve vztahu k rezistenci na léčbu cytokiny
nebyla u nádorů nijak obsaţně studována, několik málo dat ukazuje, ţe porucha STATů
ovlivňuje citlivost buněk k interferonům. Wong a spol. (1997) na modelu melanomových
buněčných linií popsali, ţe oslabená exprese a aktivace STAT1 a STAT2 má vztah
s buněčnou odpovědí na interferony, nedostatek STAT1 aktivity u rezistentních versus
citlivých buněk byl nejvýznamnějším pozorováním (Wong et al., 1997). Podobné spojení bylo
zaznamenáno také u buněčných linií nádoru prsu (Kolla et al., 1996). Kompletní ztráta
růstového omezení interferonem alfa byla nalezena u 3 z 9 lidských melanomových
buněčných linií, které měly poruchu ve vnitrobuněčné transdukci JAK/STAT signální dráhy
(Pansky et al., 2000). Nicméně na této úrovni jsou potřeba podrobnější a širší studie na
klinickém materiálu ke zhodnocení toho, zda analýzy funkce STAT proteinů u jednotlivých
pacientů mohou přispět k výběru těch, kteří by pravděpodobně odpovídali na léčbu cytokiny.
41
4.2.3. Mechanismy aktivace STAT3 v nádorových buňkách
Ačkoliv zvýšené hladiny fosforylovaného STAT3 byly zjištěny u většiny lidských nádorů
a buněčných linií odvozených z nádorů, nebyly dosud nalezeny ţádné přirozeně se vyskytující
mutace, které by způsobovaly konstitutivní aktivaci STAT3 (Leeman et al.; 2006). Existuje
však několik upstream leţících faktorů, které mohou potenciálně vést k aktivaci STAT3. Mezi
ně patří receptor pro lidský epidermální růstový faktor (EGF), člen ErbB/HER rodiny
receptorových tyrozinkináz (RTKs), dále rodina receptorů pro cytokiny typu IL-6, které
vytvářejí komplexy s gp130 a JAK, a několik GPCRs (Heinrich et al., 1998; Ram a Iyengar,
2001; Heinrich et al., 2003; Silva, 2004; Quesnelle et al., 2007; Wilks, 2008; Aggarwal et al.,
2009; Egloff a Grandis, 2009). Bylo prokázáno, ţe několik růstových faktorů (např. EGF,
TGFα, PDGF a CSF1) a cytokinů (např. IL-6, LIF, CT-1, CNTF, IL-10, IL-11 a OSM)
aktivuje STAT3 (Heinrich et al., 1998; Heinrich et al., 2003; Leeman et al.; 2006; Murray,
2007; Quesnelle et al., 2007; Egloff a Grandis, 2009). Dále pak kinázy rodiny Src (SFKs)
(např. Src, Lck, Hck, Lyn, Fyn a Fgr) buď aktivují STAT3 přímo, nebo downstream od
aktivace receptorových tyrozinkináz či GPCRs (Ram a Iyengar, 2001; Silva, 2004;
Egloff a Grandis, 2009). Zvýšené hladiny a/nebo konstitutivní aktivace signálních
komponent, které podporují fosforylaci STAT3, byly zjištěny u mnoha typů nádorů a jsou
často asociovány se špatnou prognózou; mezi asociované molekulární jevy patří zvýšení
expresní úrovně EGFR, mutace v EGFR, které způsobují konstitutivní aktivaci RTKs,
overexprese Src nebo jiných SFKs, a mutace, které hyperaktivují JAK (Silva, 2004; Alvarez
et al., 2006; Leeman et al.; 2006; Quesnelle et al., 2007; Croker et al, 2008; Egloff a Grandis,
2009; Santos et al., 2010; Verstovsek et al., 2010). Zvýšené hladiny STAT3-aktivujících
ligandů, jako jsou TGFα nebo IL-6, byly rovněţ zjištěny v séru a/nebo mikroprostředí nádorů
u širokého spektra pacientů s nejrůznějšími malignitami (Leeman et al.; 2006; Frank, 2007;
Quesnelle et al., 2007). Zvýšená mnoţství TGFα nebo IL-6, která v těchto případech udrţují
aktivaci STAT3, mohou být produkována způsobem autokrinním, parakrinním nebo
endokrinním (Leeman et al.; 2006; Frank, 2007; Quesnelle et al., 2007).
Dále pak byly u řady nádorů identifikovány mutace, které narušují epigenetickou kontrolu
(např. hypermetylaci genových sekvencí) endogenních regulátorů STAT3 signalizace
(Heinrich et al., 2003; Wormald a Hilton, 2004; Leeman et al.; 2006; Frank, 2007; Croker et
al, 2008). Inaktivace nebo sníţená exprese SOCS, PIAS a PTP proteinů můţe rovněţ vést
k udrţování aktivace STAT3 signalizace při tumorgenezi. Ačkoliv seznam látek, které mohou
přispívat k aktivaci STAT3 spojené s rakovinou, je svou délkou skličující, očekávané přínosy
42
protirakovinného léčiva cíleného na STAT3 vyprovokovaly celou řadu snah dosáhnout tohoto
cíle.
4.2.4. Klinický význam STAT v diagnostice
Statistické analýzy incidence a mortality onkologických onemocnění v období posledních
dvou dekád prokazují, byť s kontinentálními, regionálními specifiky a odlišnostmi pro
jednotlivé diagnózy, kontinuální nárůst incidence a nepříliš přesvědčivé ovlivnění mortality
na zhoubné novotvary. Ukazuje se, ţe stávající léčebné přístupy vyčerpaly své moţnosti a ţe
je nutné hledat nové, nestandardní terapeutické modality s větší léčebnou efektivitou. Jedním
z perspektivních přístupů je biologická léčba nádorů. Z řady přístupů, jejichţ příkladem jsou
inhibitory neoangiogeneze, induktory apoptózy, antigen specifické vakcíny a genové
reparační biotechnologie, se zatím do širšího klinického vyuţívání dostaly cytokiny ze
skupiny interleukinů a zejména pak interferony.
4.2.5. Cytokiny a jejich význam
Poznávání regulačních mechanizmů imunologických procesů ukazuje, ţe to jsou právě
cytokiny, které představují klíčové molekuly zajišťující homeostázu imunitního systému. Tyto
polypeptidy s autokrinními a parakrinními účinky se aktivně podílejí na všech rozhodujících
fázích imunitní reakce. Ovlivňují buněčnou proliferaci a diferenciaci, mohou být fyziologicky
aktivovány, ale mohou současně reprimovat aktivující signály. V souvislosti s protinádorovou
imunoterapií je moţno spekulovat, ţe nízký stupeň léčebné odpovědi můţe alespoň částečně
souviset s funkční alterací cytokinů, která provází nádorovou evoluci a progresi. Můţe
se jednat o defektní syntézu cytokinů, sníţenou expresi příslušných receptorů, změněnou
proporcionalitu cytokinů s převahou imunosupresivního působení a konečně o sníţenou
aktivitu specifických transdukčních a transkripčních faktorů rodiny JAK/STAT. Některé
z těchto abnormalit mohou tedy být příčinou patologického imunitního stavu onkologicky
nemocných.
4.2.6. Interferony v klinické praxi
Několik současných statistik incidence nádorů a mortality ukazují, ţe vedle mírného
zvýšení incidence nejběţnějších nádorů, mortalita výrazně klesá pouze u malého mnoţství
malignit. Tato data přesvědčivě ukazují na neúspěšné výsledky současných léčebných postupů
a poukazují na nutnost intenzivního hledání nových a efektivnějších způsobů kontroly
maligního procesu. Z různých biologických přístupů, jako jsou inhibitory neoangiogeneze,
43
induktory apoptózy, genová manipulace a další, pouze terapie zaloţená na cytokinech
poskytuje širší klinické vyuţití. Účinnost interferonů v léčbě malignit je vysvětlována jejich
schopností zvýšit relativně nízkou protinádorovou imunitu jak na úrovni efektorových buněk,
tak i na úrovni imunogenity buněk nádorových. V řadě experimentálních prací nedávné doby
bylo prokázáno, ţe na protinádorovém účinku interferonů se významně podílí jejich
antiproliferativní a tumoricidní aktivita, indukce zvýšené exprese adhezivních proteinů
a antigenů MHC třídy I, schopnost inhibovat nádorem indukovanou neoangiogenezu
a schopnost indukovat apoptózu (DeMaeyer a DeMaeyer-Giugnard, 1988; Von Stamm et al.,
1993; Agarwala a Kirkwood, 1995; Deiss et al., 1995; Kirkwood, 1995). Nepřekvapuje tedy,
ţe do interferonů se vkládaly naděje na zlepšení léčebných výsledků některých onkologických
diagnóz. Dnes, po více neţ 15-ti letých klinických zkušenostech s podáváním interferonů, je
zřejmé, ţe tato skupina cytokinů nesplnila optimistická očekávání. Jejich terapeutická
účinnost je s určitými limitacemi klinicky vyuţívána v léčbě leukémie z vlasatých buněk,
koţního T-buněčného lymfomu, mnohočetného myelomu a chronické myeloblastické
leukémie. U většiny solidních nádorů však terapeutický efekt nebyl prokázán. Výjimkou je
karcinom z renálních buněk a maligní melanom. Výsledky četných studií efektivity
interferonů u těchto diagnóz však udávají léčebnou odpověď pouze u 15-20 % případů bez
ohledu na typ interferonu, dávkovací reţim a způsob aplikace (Rosenberg, (1997). Navíc
zcela chybějí údaje o tom, do jaké míry ovlivňuje klinicky úspěšná léčba interferonem
celkovou dobu přeţití. Do nedávné doby byla nízká efektivita interferonů v léčbě solidních
nádorů vysvětlována funkčními poruchami imunitního systému a produkcí imunosupresivních
faktorů samotnou nádorovou populací.
4.2.7. STAT1 a maligní buňka
Objev, ţe transkripčně aktivní STAT1 je vyţadován interferony alfa a gama pro inhibici
růstu buněčných kultur (Muller et al., 1993; Shuai et al., 1993; Bromberg et al., 1996) vedl
k závěru, ţe nedostatečná funkce STAT1 můţe mít za následek deregulaci buněčného růstu
a narušení imunitních funkcí, tj. poruchy, které souvisejí s malignitou. Moţnost účasti STAT1
na vzniku rakoviny je podporována několika studiemi, které informují o nepatřičné aktivaci
STAT1 či dokonce ztrátě jeho exprese v maligních buňkách odvozených z různých
histologických typů nádorů, jako jsou rakovina prsu, hlavy a kru, melanom, leukémie
a lymfom (Bowman et al., 2000; Levy and Gilliland, 2000; Buettner et al., 2002;
Boudny et al., 2003; Kovarik et al., 2003; Kovarik et al., 2005). Nicméně přesvědčivý důkaz o
roli STAT 1 v maligních tumorech byl přinesen studiemi vyuţívajícími STAT1-knokautované
44
myši. Ačkoliv ve STAT1-deficientních myších nebylo pozorováno zvýšení spontánní
malignance, vykazovaly zvýšenou citlivost jak k chemicky indukovaným tak
k transplantovaným tumorům ve srovnání s kontrolními, STAT1-exprimujícími zvířaty
(Kaplan et al., 1998a; Lee et al., 2000a; Lee et al., 2000b). Tato data podpořila myšlenku, ţe
STAT1 můţe fungovat jako nádorový supresor (Durbin et al., 1996). Následné studie
odhalily, ţe úloha STAT1 v onkogenezi je komplexnější a ţe jen část jeho aktivity potlačující
růst nádorů lze připsat ztrátě přímých anti-proliferativních účinků interferonů způsobené
deficiencí STAT1.
Kaplan et al. (1998a) ukázal, ţe zvýšený růst nádorových buněk ve STAT1-deficientních,
tj. IFN-γ insenzitivních myších, je aspoň částečně způsoben absencí dobře známých účinků
IFN-γ na imunogenicitu nádorových buněk a/nebo odpovědí hostitele na nádorové antigeny.
Protoţe IFN-γ je kritickou komponentou imunitního systému nezbytnou pro mechanismus
vyhledávání nádorů, je pravděpodobné, ţe poruchy funkce STAT1 negativně ovlivňují
imunogenní fenotyp vyvíjejících se nádorů. Narušená responsivita k IFN-γ v důsledku
dysfunkce STAT1 tudíţ můţe zapříčinit selektivní růstovou výhodu některých maligních
buněk uţ v rané fázi vývoje nádoru, coţ je proces známý jako rakovinný immuno-editing
(Shankaran et al., 2001; Ikeda et al., 2002). Několik studií ukázalo, ţe některé spontánní
lidské nádory jsou selektivně neresponzivní k IFN-γ v důsledku narušení aktivace STAT1,
coţ naznačuje, ţe u lidí funguje mechanismus vyhledávání nádorů závislý na STAT1 obdobně
jako ve zvířecích modelech (Wong et al., 1997; Xia et al., 1998; Pansky et al., 2000;
Widschwendter et al., 2002; Boudny et al., 2005; Timofeeva et al., 2006).
Objev, ţe apoptóza v některých buněčných typech vyţaduje transkripčně aktivní STAT1
(Chin et al., 1996; Kumar et al., 1997; Su et al., 1997; Bromberg et al., 1998; Sahni et al.,
2001), otevřel cestu pro objev dalšího mechanismu, kterým můţe dysfunkční STAT1 přispět
k vývoji a progresi rakoviny. Bylo jiţ dobře zdokumentováno, ţe rakovinné buňky jsou méně
citlivé ke smrtícím stimulům/podnětům (death stimuli) a mají narušenu rovnováhu mezi
genovou expresí pro-apoptotickou a pro přeţití, přičemţ ta druhá převládá. Asociace STAT1
deficience s poruchami v apoptóze byla poprvé zjištěna ve studiích STAT1-deficientních
myší. Zvýšená citlivost těchto zvířat ke karcinogeny indukované onkogenezi je alespoň
částečně způsobena down-regulací pro-apoptotických genů, jejichţ exprese je do jisté míry
závislá na IFN-γ a transkripčně aktivním STAT1 (Kaplan et al., 1998a). Dále pak byla
u lymfocytů odvozených ze STAT1-deficientních myší zjištěna sníţená citlivost k apoptóze
a popsána korelace se sníţenými hladinami kaspáz 1 a 11 (Lee et al., 2000b). Data získaná
45
z transgenních myší potvrdila pro-apoptotickou roli STAT 1 in vivo a narušení apoptotických
drah ve STAT1-deficientních systémech (Kumar et al., 1997; Mascareno et al., 2001; Sahni et
al., 2001). Bylo navrţeno několik molekulárních mechanismů, které mohou v různých
nádorech přispívat k narušení apoptózy v důsledku ztráty a/nebo poruch STAT1 signalizace.
Nedostatek transkripčně aktivního STAT1 nebo jiné změny STAT1 mohou sniţovat expresi
genů pro kaspázy, Fas, FasL TRAIL a p21/waf1 (Chin et al., 1996; Kumar et al., 1997;
Xu et al., 1998; Huang et al., 2000; Lee et al., 2000c; Stephanou et al., 2000; Shin et al., 2001;
Suk et al., 2001). Další zprávy spojují roli STAT1 v apoptotické deregulaci blokády IFN-
signalizace s následným deficitem inducibility pro-apoptotických proteinů, Bak a Bax
(Ossina et al., 1997; Koshiji et al., 1998). Bez ohledu na to, ţe spuštění apoptózy vyţaduje
mnoho signálních drah a genových systémů, dosavadní data ukazují, ţe STAT1 je dalším
proteinem, který kontroluje buněčnou apoptózu skrze interakce STAT1/kaspázy a/nebo
konstitutivní regulací exprese kaspáz. Zajímavé je, ţe existuje experimentální důkaz, ţe
STAT1 můţe zprostředkovávat konstitutivní expresi kaspáz nezávisle na fosforylaci tyrozinů
ve STAT1 a na dimerizaci (Chatterjee-Kishore et al., 2000). Zjištění, ţe doxorubicin a cis-
platina umocňují fosforylaci STAT1, který pak následně zvyšuje léky-indukovanou apoptózu,
mohou naznačovat existenci nového mechanismu, kterým některá protinádorová léčiva
způsobují buněčnou smrt (Thomas et al., 2004; Townsend et al., 2004). Nicméně to, zda a do
jaké míry deregulace STAT sniţuje nebo zcela zamezuje apoptóze nádorových buněk
v klinických situacích, a jaké jsou druhy klíčových molekulárních či funkčních poškození, jeţ
interferují s pro-apoptotickou funkcí STAT1, teprve musí být zjištěno.
4.2.8. Strategie zabraňující aktivaci STAT3
Jedním z přístupů, jak zabránit STAT3 v podpoře transkripce, můţe být inhibice
tyrozinkinázových aktivit receptorů pro růstové faktory, JAK a intracelulárních SFK, které
aktivují STAT3; nicméně u většiny druhů nádorů je inhibice většího počtu kinázových drah
nepraktická (Leeman et al.; 2006; Quesnelle et al., 2007; Boehm et al., 2008; Wilks, 2008;
Egloff a Grandis, 2009; Sen et al., 2009a; Santos et al., 2010; Verstovsek et al., 2010;
Johnston a Grandis, 2011). Příbuznou strategií by bylo antagonizovat příslušné růstové
faktory a cytokiny detekované v séru a/nebo nádorovém mikroprostředí pacientů
(Leeman et al.; 2006; Quesnelle et al., 2007; Egloff a Grandis, 2009; Johnston a Grandis,
2011).
46
Zatím byly implementovány dvě terapeutické strategie, které blokují EGFRs. Byly
vyvinuty monoklonální protilátky (např. cetuximab a panitumumab), které se váţou na
extracelulární doménu EGFR; dále byly vyvinuty malé molekuly (např. gefitinib, erlotinib
a lapatinib), které inhibují RTK aktivitu EGFR (Leeman et al.; 2006; Quesnelle et al., 2007;
Egloff a Grandis, 2009; Chen et al., 2010; Johnston a Grandis, 2011). Monoklonální
protilátky, které antagonizují interakce ligand-EGFR, a narušují downstream signalizaci,
mohou rovněţ indukovat aktivaci protinádorové buněčné imunity (Leeman et al.; 2006;
Quesnelle et al., 2007; Egloff a Grandis, 2009; Chen et al., 2010). FDA (americký federální
úřad pro léky) schválil pouţití anti-EGFR monoklonálních protilátek pro léčbu kolorektálních
nádorů a spinocelulárních karcinomů hlavy a krku (HNSCC) (Leeman et al.; 2006; Quesnelle
et al., 2007; Egloff a Grandis, 2009). Inhibitory RTK byly schváleny pro léčbu
nádorů slinivky a nemalobuněčný karcinom plicn (NSCLC) (Leeman et al.; 2006;
Quesnelle et al., 2007; Egloff a Grandis, 2009). I přes prevalenci vysokých úrovní exprese
EGFR asociující s nejrůznějšími nádory, spolu s vysokou incidencí somatických mutací
EGFR, které konstitutivně aktivují EGFR v nádorech, klinická data ukazují, ţe u mnoha
pacientů nádory vzdorují léčbě zaloţené na inhibici EGFR (Leeman et al.; 2006; Quesnelle et
al., 2007; Egloff a Grandis, 2009; Chen et al., 2010). Bylo navrţeno několik mechanismů,
jimiţ se tato rezistence k terapii cílené na EGFR můţe vyvinout, např. sekundární mutace
EGFR, které zabraňují vazbě monoklonálních protilátek nebo nízkomolekulárních inhibitorů
RTK; alternativní mutace mohou mít za důsledek aktivaci dráhy Ras, epiteliálně-
mezenchymální tranzice nebo downstream leţících signálních drah (Chen et al., 2010).
Při aktivaci receptoru IL-6 se jeho α-podjednotka váţe se dvěmi gp130 podjednotkami
přenášejícími signál; následně se pak aktivují JAK asociované s gp130 (např. Jak1, Jak2
a Tyk2) a tím v rámci cytoplazmického konce gp130 vytvářejí pY vazebná místa pro STAT3
(Heinrich et al., 1998; Heinrich et al., 2003). Bylo testováno několik nízkomolekulárních
inhibitorů JAK (např. AG490, LS-104, ICNB18424 a CEP701) v xenotransplantátových
nádorových modelech a některých klinických zkouškách (Wilks, 2008; Santos et al., 2010;
Verstovsek et al., 2010; Johnston a Grandis, 2011). Jak in vitro, tak in vivo inhibuje AG490
aktivitu Jak2, sniţuje hladinu aktivovaného STAT3, blokuje vazbu STAT3 na DNA
a inhibuje růst leukemických buněk (Jing a Tweardy, 2005; Wilks, 2008). Blízce příbuzný
analog AG490, LS-104, jiţ postoupil do druhé fáze klinického testování pro akutní
lymfoblastickou leukémii (Wilks, 2008). INCB1824, nízkomolekulární inhibitor Jak1 i Jak2,
sniţuje hladiny fosforylovaného STAT3 u subjektů s wild-type Jak2 a nebo s gain-of-function
47
mutací V617F. To bylo odhaleno v klinických zkouškách fáze 1-2 u pacientů s myelofibrózou
(Wilks, 2008; Verstovsek et al., 2010). Zdá se, ţe INCB1824 přináší klinický benefit
pacientům s myelofibrózou, neboť produkuje mírnou myelosupresivní odpověď u deseti
procent pacientů. U studie fáze II látky CEP-701, inhibitoru Jak2, bylo zjištěno sniţování
hladiny fosforylovaného STAT3 u responderů při terapii, ačkoliv jeho niţsí úspěšnost
u pacientů s myelofibrózou je spojena jak s mírnou myelosupresí tak mírnou, ale častou GI
toxicitou (Santos et al., 2010).
Zvýšené hladiny Src a/nebo aktivity kináz byly popsány u celé řady nádorů, a aktivace
členů rodiny SFK a STAT3 probíhá downstream od růstových faktorů-RTKs a GPCRs
(Ram a Iyengar, 2001; Silva, 2004; Egloff a Grandis, 2009; Sen et al., 2009a). V současnosti
je vyvíjeno několik nízkomolekulárních inhibitorů Src a dalších SFKs pro řadu solidních
nádorů (Egloff a Grandis, 2009; Johnston a Grandis, 2011). Dasatinib inhibuje SFK a
BCR/ABL a byl schválen pro pouţití po léčbě Imatinibem u pacientů s chronickou
myelogenní leukémií a pro Ph-chromozom-pozitivní akutní lymfoblastickou leukémii (Egloff
a Grandis, 2009). Nicméně existují zprávy, ţe trvalá inhibice Src pomocí Dasatinibu inhibuje
aktivaci STAT3 jen přechodně (Sen et al., 2009a). Reaktivace STAT3 po delší léčbě
Dasatinibem je zřejmě zprostředkovaná pozměněním vazby JAK-STAT a JAK kinázové
aktivity, coţ asi reprezentuje kompenzační dráhu, která umoţňuje přeţití nádoru a proliferaci
i přes chronickou inhibici Src (Sen et al., 2009a). XL999, který inhibuje řadu růstových
faktorů-RTKs (např. VEGFR, PDGFR a FGFR) a SFKs, je spojován se závaţnou
kardiovaskulární toxicitou při zkouškách fáze 1 a 2 (Egloff a Grandis, 2009).
Relativně nízká četnost odpovědi nádorů na terapeutika, která cílí na EGFR, JAK a SFK
ukazuje, ţe inhibice jednotlivých drah nemusí dostačovat pro blokování aktivace STAT3.
Existují důkazy, ţe STAT3 přispívá ke vzniku rezistence k tyrozinkinázovým inhibitorům.
Strategie blokování protein-proteinových interakcí ve STAT3 signalizaci
Několik skupin vědců připravilo peptidové sekvence obsahující pY, mířené na SH-2
doménu STAT3 jakoţto prostředek, jímţ lze předejít vazbě STAT3 na aktivované receptory a
homodimerizaci STAT3 (Jing a Tweardy, 2005; Leeman et al., 2006; Germain a Frank, 2007;
Fletcher et al., 2009; Johnston a Grandis, 2011). První syntetický peptid obsahující pY, jenţ
byl schopen inhibovat aktivitu STAT3, obsahoval zbytek Y705, který je v nativním proteinu
STAT3 fosforylován, a tím podporuje homodimerizaci; in vitro byla prokázána schopnost
tohoto syntetického peptidu inhibovat vazbu STAT3 na DNA (Jing a Tweardy, 2005; Fletcher
48
et al., 2009). Tento přístup byl později rozvinut několika skupinami, které vytvořily několik
peptidů obsahujících pY odvozených z jiných proteinů interagujících s SH-2 doménami
STAT3 (Jing a Tweardy, 2005; Fletcher et al., 2009). Fosforylace specifických tyrozinových
zbytků v EGFR (tj. Y1068 a Y1086) je nezbytná pro vazbu monomerního STAT3
k aktivovanému EGFR (Jing a Tweardy, 2005; Leeman et al., 2006). Bylo zjištěno, ţe
fosfodekapeptid zaloţený na sekvenci obklopující Y1068 v EGFR se váţe
k nefosforylovanému STAT3 a in vitro inhibuje vazbu fosforylovaného STAT3 na DNA (Jing
a Tweardy, 2005). Obdobně byly zkoumány další motivy obsahující pY, které interagují
s SH-2 doménou STAT3. Mezi tyto motivy patří čtyři motivy obsahující pY (pYXXQ)
v gp130-signál-přenášejících podjednotkách aktivovaného IL-6 receptorového komplexu
a větší počet pY-obsahujících motivů z řetězců receptorů pro cytokiny, např. receptor pro
leukemii inhibující faktor, IL-10 receptor a receptor pro granulocytový kolonie-stimulující
faktor (Heinrich et al., 2003). Byly rovněţ identifikovány peptidové aptamery, které inhibují
fosforylaci STAT3 zprostředkovanou EGFR, a to při modifikovaném two-hybrid screeningu
kvasinek (Leeman et al., 2006). Nicméně, pro peptidové inhibitory je bohuţel charakteristická
nízká buněčná permeabilita a metabolická stabilita, coţ podnítilo vědce k hledání
peptidomimetik a nízkomolekulárních derivátů (Jing a Tweardy, 2005; Fletcher et al., 2009).
Pomocí přístupů zaloţených na peptidech a peptidomimeticích, včetně in silico výpočtových
postupů a high-throughput in vitro screeningu, bylo identifikováno několik
nízkomolekulárních inhibitorů (Jing a Tweardy, 2005; Fletcher et al., 2009). I přes pokroky
v identifikaci takových peptidů a malých molekul, které se zaměřují na SH-2 doménu STAT3,
nebyly dosud objeveny molekuly s terapeutickou protinádorovou aktivitou (Jing a Tweardy,
2005; Fletcher et al., 2009). Alternativní strategie blokování STAT3-proteinových interakcí
vychází z G-bohatých oligodeoxynukleotidů, které tvoří čtyřřetězcové struktury
závislé na draslíku (tj. G-kvartety), jeţ zaujímají místo v SH-2 doménách STAT3
(Jing a Tweardy, 2005; Leeman et al., 2006; Germain a Frank, 2007; Fletcher et al., 2009;
Johnston a Grandis, 2011). Ačkoliv G-kvartetové oligodeoxynukleotidy mohou narušovat
homodimerizaci nezbytnou pro aktivitu STAT3, jejich velikost a závislost na draslíku omezují
jejich buněčnou permeabilitu a představují tak závaţnou překáţku pro nasazení in vivo
(Jing a Tweardy, 2005).
49
Strategie blokování jaderné translokace STAT3
Role aktivovaného STAT3 jako DNA-vazebného transkripčního faktoru závisí na přenosu
homodimerů zpod plazmatické membrány do jádra (Frank, 2003; Heinrich et al., 2003;
Jing a Tweardy, 2005; Liu et al., 2005; Leeman et al., 2006; Germain a Frank, 2007;
Hermann et al., 2007). Zablokování přechodu dimerů STAT3 skrze jaderný pórový komplex
by tak poskytovalo prostředky k blokaci transkripční aktivity STAT3 (Hermann et al., 2007;
Liu et al., 2005; Johnston a Grandis, 2011). Nicméně,přesný průběh procesu a identita
komponent zprostředkovávajících translokaci STAT3 z periferie buňky do jádra musí být
teprve definovány. Velké proteinové komplexy mohou do jádra vstoupit pouze skrze jaderný
pórový komplex, v procesu zajišťovaném proteiny importinem α a β (Hermann et al., 2007;
Liu et al., 2005). Importiny α5 a α7, ve spolupráci s importinem β, zřejmě zajišťují průchod
fosforylovaného STAT3 skrze jaderný pór (Hermann et al., 2007). Byla ovšem popsána také
moţnost, ţe jaderný import STAT3 můţe být nezávislý na fosforylaci tyrozinu a můţe být
zprostředkován importinem α3 (Liu et al., 2005). Nukleocytoplazmatický transport STAT3
odráţí dynamickou rovnováhu mezi úrovní importu a exportu (Hermann et al., 2007;
Liu et al., 2005). Zajímavé však je, ţe fosforylovaný STAT3 je zřejmě importován rychleji
neţ neaktivovaný STAT3 (Hermann et al., 2007). Uvnitř jádra je STAT3 defosforylován
jadernou PTP TC45, čímţ se stává substrátem pro export zprostředkovávaný exportinem-1
(Hermann et al., 2007; Johnston a Grandis, 2011). Doposud nebyly identifikovány ţádné
nízkomolekulární inhibitory importinů α3, α5 nebo α7 a účinky (pokud vůbec jsou) nedávno
identifikovaného inhibitoru importinu β, nazvaného Karyostatin 1A, na jaderný import
STAT3, nebyly dosud popsány (Hermann et al., 2007; Liu et al., 2005). Inhibice exportinu 1
Leptomycinem B nebo Ratjadone A interferuje s jaderným exportem STAT3; průvodním
jevem je, ţe léčba sniţuje hladinu fosforylace STAT3 stejně jako STAT3-mediovanou
transkripci a způsobuje, ţe buňky vstupují do apoptózy (Hermann et al., 2007). Přes tyto
zajímavé výsledky je pravděpodobné, ţe jakékoliv nízkomolekulární léčivo, které obecně
inhibuje přenos přes jadernou membránu, bude mít zhoubné účinky (Hermann et al., 2007;
Johnston a Grandis, 2011). Musí být teprve zjištěno, zda můţe být vyvinut inhibitor přenosu
přes jaderný pór dostatečně selektivní pro STAT3.
50
Strategie blokování vazby STAT3 na DNA
Dvouřetězcové oligodeoxynukleotidy (dsODN), navrţené a syntetizované tak, aby
napodobovaly cis-regulační elementy uvnitř genů aktivovaných STAT3, soutěţí o aktivní
dimery STAT3 a tím blokují indukci STAT3-responzivní genové exprese a růst nádorových
buněk in vitro (Jing a Tweardy, 2005; Leeman et al., 2006; Germain a Frank, 2007;
Lui et al., 2007; Zhang et al., 2007; Boehm et al., 2008; Sen et al., 2009b; Johnston a Grandis,
2011). Také inhibice transkripce zprostředkované STAT3, vyvolaná denními
intratumorálními injekcemi STAT3-specifických dsODN „návnad“ vedla k redukci růstu
nádorových buněk v myších xenotransplantátových modelech (Lui et al., 2007;
Zhang et al., 2007; Boehm et al., 2008; Sen et al., 2009b). Ve studii provedené na makaku
jávském bylo zjištěno, ţe intramuskulární podání 3.2 mg/kg dsODN „návnad“ nemělo ţádné
pozorovatelné nepříznivé účinky i přes pozorované sníţení exprese cílových genů STAT3
v místě vpichu (Lui et al., 2007; Zhang et al., 2007; Boehm et al., 2008; Sen et al., 2009b).
Probíhá farmakodynamická klinická studie fáze 0, která testuje bezpečnost a biologické
účinky intratumorální injekce dsODN „návnad“ u pacientů s HNSCC. Ačkoliv předběţné
výsledky této studie ukazují, ţe „návnady“ narušují expresi cílových genů STAT3 v nádoru
po jediné intra-lézní injekci, současná forma těchto „návnad“ v séru rychle degraduje a nebyla
by pouţitelná pro systémové podávání. Ačkoliv chemická modifikace „návnady“ by
metabolickou stabilitu dsODN mohla zlepšit, a tím umoţnit systémové podávání, efektivní
podávání takto modifikovaných dsODNs do nádorových buněk zůstává velkou výzvou
(Johnston a Grandis, 2011). Peptidové aptamery, které inhibují vazbu STAT3 na DNA
in vitro, byly identifikovány modifikovaným two-hybrid screeningem u kvasinek, ale jejich
pouţitelnost jako inhibitorů STAT3 je negativně ovlivňována nízkou buněčnou permeabilitou
a metabolickou stabilitou in vivo (Leeman et al., 2006).
Inhibitory – přírodní produkty
Mnoţství přírodních produktů, jako je guggulsteron, honokiol, kurkumin, resveratrol,
flavopiridol a cucurbitacin, potlačuje aktivaci STAT3 a tím inhibuje růst nádorových
buněčných linií (Jing a Tweardy, 2005; Leeman et al., 2006; Aggarwal et al., 2009; Fletcher
et al., 2009; Leeman-Neill et al., 2009; Leeman-Neill et al., 2010; Zhang et al., 2010;
Johnston a Grandis, 2011). Několik z těchto přírodních produktů je zřejmě prospěšných také
u zvířecích nádorových modelů, ať uţ samy o sobě nebo v kombinaci s dalšími
51
protinádorovými látkami (Leeman-Neill et al., 2009; Leeman-Neill et al., 2010; Zhang et al.,
2010). Protoţe však mají tyto sloučeniny velké mnoţství pozitivních účinků nesouvisejících
s rakovinou, jejich přesný vztah mezi jakoukoliv terapeutickou aktivitou, kterou snad mají,
a inhibicí STAT3, zůstává nejasný.
High-throughput screening (HTS)
In vitro high-throughput screening více neţ 17 000 sloučenin byl proveden s pomocí
kompetiční zkoušky vazby peptidů. Kaţdá testovaná sloučenina byla zkoumána z hlediska
schopnosti soutěţit o vazbu STAT3 proti fluoresceinem značenému oligopeptidu
obsahujícímu pY, odvozenému z gp130 signální podjednotky receptoru pro IL-6
(Fletcher et al., 2009). Tímto screeningem byl identifikován Stattic, jeden z prvních
nepeptidových inhibitorů STAT3. Bylo zjištěno, ţe Stattic interferuje s fosforylací inaktivního
STAT3 a také s dimerizací a jadernou translokací aktivovaného STAT3 (Fletcher et al.,
2009). Extenzivnější HTS, zahrnující více neţ 195 000 sloučenin, byl nedávno dokončen ve
Scripps Research Institute Molecular Screening Center, jakoţto součást projektu Molecular
Library Screening Center Network (MLSCN) sponzorovaného NIH. Testy vyuţily STAT3-
depentení luciferázový reportér stabilně transfekovaný do STAT1-deficientní U3A lidské
fibrosarkomové buněčné linie, která tvořila pozadí deficientní pro STAT1 (PubChem AIDs
862, 1265 a 1399). Po HTS byly následně určité sloučeniny zhodnoceny z hlediska hodnot
koncentrační odpovědi IC50 (výsledky jsou přístupné na http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov).
Bylo identifikováno více neţ sto sloučenin, které inhibovaly STAT3-mediovanou transkripci,
s IC50 hodnotami niţšími neţ 10 µM (aniţ by významně ovlivnily aktivitu STAT1). Dodnes
však nebyly publikovány ţádné studie charakterizující chemické struktury a biologické
aktivity STAT3-selektivních inhibitorů získaných tímto protokolem. Očekává se, ţe v blízké
budoucnosti budou inhibitory funkcí STAT3 identifikovány ze sloţených knihoven pomocí
high-content fluorescenčních zobrazovacích testů.
4.3. Význam detekce poruch v prognóze a imunoterapii
Poznání úlohy STAT/SOCS proteinů v přenosu cytokinových signálů a v regulaci genů,
které kontrolují řadu fyziologických procesů buňky a zajišťují její homeostázu, vyvolává
narůstající zájem onkologického výzkumu. Není sporu o tom, ţe extracelulární cytokinové
signály šířené intracelulární JAK/STAT dráhou harmonizují procesy buněčné proliferace,
diferenciace a programované smrti buňky. Poněvadţ deregulace těchto procesů je atributem
52
většiny lidských neoplazií, je namístě představa, ţe abnormální signální transdukce
s následnou defektní transkripcí STAT-dependentních genů se můţe podílet na etiopatogenezi
maligní přeměny a na odpovědi nádoru na léčbu cytokiny (Frank, 1999). V souvislosti
s nádorovým procesem jsou předpokládány a v některých případech jiţ prokázány
abnormality, které zahrnují sníţenou expresi nebo konstitutivní syntézu STAT molekul, jejich
patologickou aktivaci a v neposlední řadě i poruchy v degradaci proteinů SOCS. O tom, ţe se
mohou normální a pravděpodobně i defektní STAT/SOCS zprostředkované cytokinové
signály manifestovat v různých systémech odlišně svědčí studie, v nichţ byl sledován vliv
indukce STAT/SOCS proteinů na apoptózu. Zatímco v některých buněčných systémech
STAT aktivace IFN-γ zvyšuje expresi induktorů apoptózy Fas a FasL, v jiných systémech,
a za ne zcela jasných podmínek, můţe STAT1 rovněţ indukovat transkripci antiapoptického
genu bcl-XL (Xu et al., 1998; Frank et al., 1999). Naka a spol. (1998) uvádějí, ţe SOCS 1
významně zvyšuje rychlost apoptózy, a to pravděpodobně přes zvýšenou expresi
proapoptického genu bax.
Aţ doposud jen několik málo prací analyzovalo úlohu signálních drah STAT proteinů
u pacientů postiţených nádorovým onemocněním ve vztahu k IFN-α indukované
antiproliferační aktivitě a k citlivosti nádorových buněk na tento cytokin (Carson, 1998; Yang
et al., 1998). Dosavadní výsledky podporují názor, ţe abnormalita v hladině proteinů
STAT1/STAT3 nebo v jejich aktivaci koreluje se sníţenou odpovědí nádorových buněk na
inhibiční aktivitu IFN-α.
53
CÍLE PRÁCE
1) Studium exprese a posttranslačních modifikací STAT1 a STAT3 proteinů
v normálních a melanomových buňkách
2) Studium přirozených negativních inhibitorů STAT (1,3) transaktivační dráhy
3) Indukce STAT1 a STAT3 faktoru interferony alfa a gama
4) Studium korelací mezi expresí a aktivitou STAT (1,3) proteinů, rezistencí
na interferonovou léčbu a průběhem onemocnění maligním melanomem
54
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Praktická část předkládané disertační práce je přiloţena ve formě čtyř publikací a příloh 1-4,
ve kterých jsou popsány i pouţité experimentální metody.
Přehled publikací:
Příloha 1: Humpolíková-Adámková L, Kovařík J, Dušek L, Lauerová L, Boudný V, Fait V,
Fojtová M, Krejčí E, Kovařík A. (2009) Interferon-alpha treatment may negatively influence
disease progression in melanoma patients by hyperactivation of STAT3 protein.
Eur. J. Cancer 45, 1315-1323.
Příloha 2: Fojtova M, Boudny V, Kovarik A, Lauerova L, Adamkova L, Souckova K,
Jarkovsky J, Kovarik J. (2007) Development of IFN-gamma resistance is associated with
attenuation of SOCS genes induction and constitutive expression of SOCS 3 in melanoma
cells. Br. J. Cancer 97, 231-237.
Příloha 3: Kovarik A, Fojtova M, Boudny V, Adamkova L, Lauerova L, Kovarik J. (2005)
Interferon-gamma, but not interferon-alpha, induces SOCS 3 expression in human melanoma
cell lines. Melanoma Res. 15, 481-488.
Příloha 4: Boudný V, Dušek L, Adámková L, Chumchalová J, Kocák I, Fait V, Lauerová L,
Krejčí E, Kovařík J. (2005) Lack of STAT 1 phosphorylation at TYR 701 by IFNgamma
correlates with disease outcome in melanoma patients. Neoplasma 52, 330-337.
55
VÝSLEDKY
Léčba interferonem alfa můţe negativně ovlivnit progresi onemocnění u
pacientů s melanomem prostřednictvím hyperaktivace proteinu STAT3
Abstrakt
Interferon alfa (IFN-α) je důleţitým léčivem pouţívaným v anti-melanomové terapii.
Nicméně, metastázy se nakonec znovuobjevují u téměř 60 procent pacientů s melanomy, kteří
podstoupili pomocnou (adjuvantní) cytokinovou terapii, coţ naznačuje, ţe IFN-α můţe
paradoxně přinejmenším v některých případech spíše napomáhat progresi choroby. V této
studii jsme zkoumali moţnost, zda protein STAT3, který podporuje růst, můţe být aktivován
interferonem alfa v melanomových buňkách. Vyšetřili jsme 24 primárních kultur odvozených
z uzlinových metastáz u pacientů s melanomy, kteří byli monitorováni v rámci následného
pětiletého klinického sledování. Pacienti se lišili průběhem nemoci a délkou přeţití.
S pouţitím Western blotových analýz ukazujeme, ţe v 17 procentech případů došlo
k fosforylaci STAT3 na tyrozinu (Y705) stimulované IFN-α. V normálních melanocytech
nebyla pozorována ţádná indukce STAT3. K aktivaci STAT1 na tyrozinu (Y701) docházelo
s podobnou četností jako u STAT3 (17 procent), i kdyţ u odlišných pacientů. Nebyla nalezena
jasná korelace s klinickým stavem. Receptory pro interferony alfa/beta (IFNAR) byly
exprimovány nezávisle na inducibilitě STATů, coţ naznačuje, ţe k poruchám signalizace
dochází „downstream“ od IFNAR. Usuzujeme, ţe v některých případech aplikace IFN-α
můţe zvyšovat pravděpodobnost progrese onemocnění v důsledku zvýšení aktivity STAT3.
Doporučovány jsou proto testy na STAT3 inducibilitu před nasazením cytokinové
imunoterapie v klinické praxi.
1. Úvod
Normální růst a diferenciace buněk závisí na průběţném toku signálů z prostředí. Jedna
z důleţitých sad signálů je poskytována rodinou cytokinů, která sestává z více neţ
40 glykoproteinů, včetně interleukinů (IL), interferonů (IFN), nádorových nekrotických
faktorů (TNF) či růstových faktorů (GF). Všechny byly jiţ dobře popsány z hlediska struktury
a cílových receptorů, na něţ se váţou. Z těchto cytokinů je IFN-α pouţíván v klinické praxi
jako protinádorový agent při léčbě leukémií a solidních nádorů, včetně maligního melanomu.
Zdůvodnění pouţití IFN-α pro léčbu melanomu spočívá v jeho dobře známé rezistenci vůči
56
chemoterapii a/nebo radioterapii. Můţe poskytovat přímou antiproliferativní
a proapoptotickou aktivitu a můţe také inhibovat nádorově indukovanou neoangiogenezi
(Agarwala and Kirkwood, 1995; Kirkwood, 1995). IFN-α sám o sobě by mohl hrát také roli
v etiologii melanomu, protoţe jeho promotor bývá v melanomových buněčných liniích často
neaktivní (Price et al., 1995). Nicméně se věří, ţe protinádorová aktivita IFN-α je dosahována
především skrze stimulaci imunitního systému pacienta, včetně up-regulace exprese
adhezivních molekul a antigenů MHC třídy I (Hague and Williams, 1998; Schindler, 1999;
Caraglia et al., 2005). Přes neoddiskutovatelné protirakovinné vlastnosti prokázaly nejrůznější
klinické zkoušky, ţe četnost odpovědi (response rate) pacientů s melanomem léčených IFN-α
byla niţší neţ se očekávalo, a příčina tohoto jevu byla a je předmětem častých debat.
Správnost pomocného (adjuvant) podávání IFN-α pro léčbu melanomu bylo v nedávné studii
rovněţ zpochybněno (Lens, 2006). Jedním moţným vysvětlením je, ţe interferony mohou
vykonávat odlišné efekty na imunitním systému a samotném nádoru.
Nedávné molekulární studie událostí, které následují po vazbě IFN na receptor a operují
„downstream“ od receptoru směrem k cílovým genům, identifikovaly mnoţství proteinů
zapojených do intracelulární signální kaskády. Mezi těmito proteiny jsou klíčové ty, které
zajišťují projev biologických efektů většiny, ne-li všech cytokinů: jsou to receptor-asociované
Janusovy tyrozinkinázy (JAK), přenašeče signálu a aktivátory transkripce (STAT), supresory
cytokinové signalizace (SOCS) a proteinové inhibitory aktivovaných STATů (PIAS) (Darnell,
1997; Greenhalg and Hilton, 2001; Fujimoto and Naka, 2003). Protoţe STAT proteiny kromě
přenosu signálu od mnoha ligandů fungují také jako transkripční faktory modulující expresi
genů řídících buněčný růst, diferenciaci, apoptózu a nádorovou angiogenezi, není
překvapením, ţe nejrůznější poruchy těchto proteinů jsou nalézány právě v lidských
nádorových buňkách a tkáních. Ze sedmi dosud známých členů rodiny STAT, byly obzvláště
pozoruhodné změny asociované s rakovinou, např. konstitutivní exprese, down-regulace a
aberantní fosforylace, detekovány zejména u STAT1 a STAT3 proteinů (Darnell, 1997;
Rawlings et al., 2004). Oba proteiny vykazují podobné DNA-vazebné specifity; zároveň ale
také vykazují odlišné vzorce vazby k přirozeným enhancerovým elementům, coţ můţe
vysvětlovat odlišnosti v jejich buněčných funkcích (Horvath et al., 1995; Seidel et al., 1995).
STAT1 se chová jako nádorový supresor, funguje jako induktor apoptózy a negativní
regulátor buněčného růstu a angiogeneze (Meraz et al., 1996; Levy, 1999). Nedávno jsme
ukázali, ţe maligní melanom asociuje s deficientní IFN-indukovanou fosforylací STAT1, a ţe
absence fosforylace STAT1 na tyrozinu 701 (Y701) v odpovědi na IFN-γ v ex vivo
57
melanomových buňkách pozitivně koreluje s průběhem choroby u pacientů s melanomem
(Kovarik et al., 2003; Boudny et al., 2005). STAT3 má opačné biologické účinky a jeho
konstitutivně aktivní (DNA-vazebná) varianta indukuje maligní transformaci a onkogenezi,
tudíţ funguje jako onkogen (Bromberg et al., 1999; Bromberg, 2002).
Jiţ bylo shromáţděno značné mnoţství dat o patofyziologii transkripčních faktorů
STAT1/STAT3, včetně jejich odlišných forem asociovaných s rakovinou. Je ovšem jen málo
známo o asociaci jejich abnormální exprese a aktivace s klinickými parametry,
tj. průběhem a výsledkem nemoci (disease outcome), metastatickým potenciálem a odpovědí
na léčbu (treatment response). V této studii jsme zkoumali aktivační odpověď STAT3 na
interferony alfa a gama v melanomových buňkách odvozených z uzlinových metastáz 24
pacientů s melanomy, a zhodnotili jsme moţnou asociaci fosforylačních odpovědí s průběhem
nemoci. Zjistili jsme pozitivní korelaci mezi absencí STAT3 aktivace interferonem alfa a lepší
prognózou u pacientů s melanomem.
2. Materiál a metody
2.1. Pacienti
Do této studie bylo zahrnuto dvacet čtyři pacientů s melanomy v klinických stadiích II a
III (klasifikace UICC TNM, páté vydání). Po místním vyříznutí lymfatické uzliny podstoupili
pacienti kvůli metastázám post-operační přídavnou imunoterapii IFN-α2b (Schering-Plough,
Kenilworth, NJ) podle následujícího reţimu: počáteční indukční fáze 10 MU podkoţně (s.c.)
denně po dobu pěti dnů během čtyř týdnů, následovaná udrţovací dávkou 10 MU s.c. třikrát
týdně po dobu 48 týdnů. Základní charakteristiky vzorku pacientů jsou v Tabulce 1. Střední
doba sledování byla 54 měsíců. Průběh nemoci od první diagnózy je ukázán na Obrázku 1.
Pro srovnání laboratorních dat s vývojem choroby u kaţdého pacienta byly pouţity
následující intervaly: 1. přeţití bez nemoci (disease-free survival, DFS), tedy počet měsíců od
počáteční diagnózy aţ k prvnímu relapsu (metastázy v lokálních mízních uzlinách); 2. přeţití
bez progrese (progression-free survival, PFS), tj. interval od prvního relapsu do následné
progrese; 3. celková doba přeţití (overall survival, OS), tj. počet měsíců od první diagnózy do
úmrtí a/nebo ukončení studie. Ve stádiu metastáz do lymfatických uzlin bylo provedeno
vynětí lokálních lymfatických uzlin a všechny uzliny byly histologicky vyšetřeny.
Melanomové buňky izolované z uzlin s masivní nádorovou infiltrací byly pouţity pro in vitro
studie aktivace STAT3.
58
Tabulka 1: Základní charakteristika pacientů
Parametr Hodnota
Vzorek N = 24
Obecná charakteristika 1
Věk (v letech) 56 (36; 71)
Breslow skóre 2.9 (1.5; 5.5)
Risk lokalizace v horních částech těla 70.8 %
Clark skóre ≥ 4 87.5 %
Medián sledovaných dob přežití
Přežití bez nemoci (DFS) 19.6 měsíců
Přežití bez progrese (PFS) 44.6 měsíců
Celkové přežití (OS) 54.3 měsíců
1 Kvantitativní proměnné shrnuty jako medián a 5%-95% percentily (v závorkách)
2.2. Melanomová buněčná kultura
Infiltrovaná lymfatická uzlina byla rozkrájena na malé kousky, jemně pomleta
a opakovaným pipetováním byla získána monocelulární suspenze. Buňky byly vysety na
Petriho misky a kultivovány v DMEM s glutaminem (PAN Biotech GmbH, Aidenbach,
Germany) s přídavkem 15% fetálního bovinního séra (FBS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach,
Germany), inzulinu (5 ng/ml) a antibiotik. Pro ověření povahy rostoucích buněk před
aktivačními experimenty byly buňky rostoucí na destičkách fixovány a imunologicky barveny
s pouţitím monoklonálních protilátek (Melan-A a tyrozináza, Novocastra; S-100
a HMB-45, BioGenex), jeţ jsou povaţovány za melanomové fenotypické markery. Jen ty
kultury, které vykazovaly pozitivitu k aspoň jedné imunoreagencii u více neţ 90 procent
buněk byly pouţity pro další studii (Obrázek 2). Aktivační experimenty byly prováděny
s kulturami, které byly udrţovány in vitro po dobu maximálně čtyř týdnů. Subkonfluentně
narostlé buňky byly před vystavením interferonům vyhladověny přes noc v DMEM.
Aktivační dávky kaţdého interferonu byly vybrány z dose-response křivek. IFN-α a IFN-γ
byly pouţity v koncentracích 5000 IU/ml resp. 10 ng/ml. Buňky byly s interferony
inkubovány po dobu 30 minut v 37°C. Kontrolní vzorky byly paralelně inkubovány bez
přídavku interferonů.
59
Obrázek 2: Typická kultura melanomových buněk připravená z metastáz lymfatických
uzlin. Imunoperoxidázové barvení protilátkou proti Melan-A (původní zvětšení: 200x). Do
studie byly zařazeny pouze vysoce homogenní populace buněk vykazujících pozitivní
imunoreakci a maligní morfologii.
2.3. Inhibice růstu
Antiproliferativní efekt IFN-α byl hodnocen ve čtyřech primárních buněčných kulturách.
Buňky byly vysety v duplikátech do 96-jamkových destiček při buněčné hustotě 2000 buněk
na jamku. Jeden den po vysetí bylo médium nahrazeno médiem obsahujícím IFN-α
s koncentracemi 1000, 5000 a 20000 U/ml. Po třech dnech kultivace byla provedena
kolorimetrická zkouška WST-1 (Roche; Mannheim, Germany) v souladu s protokolem
výrobce. Procento inhibice růstu bylo vypočteno vzhledem k růstu kontrolních buněk
neovlivněných IFN. Kaţdý experiment byl opakován třikrát.
2.4. Reagencie a protilátky
Rekombinantní lidské IFN-α a IFN-γ byly zakoupeny od Sigmy (St. Louis, USA). Pro
detekci proteinu STAT3 byly pouţity králičí polyklonální protilátky proti C-terminální
60
doméně STAT3 (C-20) a myší monoklonální protilátky rozpoznávající protein STAT3 (F-2)
(Santa Cruz Biotechnology, California, USA). Pro detekci fosforylovaných forem STAT3
byly pouţity anti-pY705 králičí polyklonální protilátka (Cell Signalling Technology, Beverly,
USA) a anti-pS727 králičí polyklonální protilátka (AbCam, Cambridge, UK). Fosforylované
formy STAT1 byly detekovány anti-pY701 králičí polyklonální protilátkou (Cell Signalling
Technology, Danvers, MA, USA) a anti-pS727 monoklonální protilátkou (PSM1). Byla
pouţita také myší monoklonální protilátka proti R1 řetězci IFN-α/β receptoru (R&D systems,
USA).
2.5. Western blotové analýzy
Proteinový obsah celých buněčných extraktů (WCEs) byl zjišťován pomocí Bradfordovy
zkoušky (Bio-Rad, Munich, Germany). Supernatanty byly inkubovány přes noc při 4°C
s polyklonální protilátkou C-20 (ředění 1:100) a protein A – Sepharose CL-4B kuličkami
(beads) (Amersham Pharmacia BIotech, Uppsala, Sweden). Imunoprecipitáty byly čtyřikrát
promývány ledově studeným Frackletonovým pufrem. Kuličky byly eluovány pětiminutovým
vařením v Laemmliho vzorkovém pufru. Stejná mnoţství proteinů byla získána
prostřednictvím 10% SDS-PAGE a přenesena na nitrocelulózovou membránu (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA). Membrány byly blokovány 5% BSA v TBS pufru obsahujícím 0,1%
Tween-20 (TBST) a inkubovány s předem určenými koncentracemi specifických protilátek.
Pro vymytí anti-STAT3 protilátek byl pouţit TBST s přídavkem 5% BSA (Sigma, St. Louis,
USA) a 0,05% NaN3. Po promytí byly bloty inkubovány s proti-králičí nebo proti-myší
sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (Amersham, UK) a vyvolány
s vyuţitím systému zesílené chemiluminiscence (ECL) (Amersham, UK) v souladu
s instrukcemi výrobce. Signály byly kvantifikovány denzitometricky s vyuţitím programu
ImageQuant (GE HealthCare, SA). Úrovně fosforylovaných STAT byly normalizovány
k celkovým STAT signálům.
2.6. Analýza RNA
Celkové RNA byly izolovány pomocí RNeasy kitu (Qiagen, Hinden, Germany)
následovaného ošetřením DNase I (TURBO DNAfree, Applied Biosystems/Ambion, Austin,
TX, USA). cDNA byly připraveny reverzní transkripcí RNA pomocí Superscript II Reverse
Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a amplifikovány s vyuţitím PCR Arrays
mastermixu a primerů IFNAR2, STAT3 resp. GAPDH (SABiosciences, Frederick, MD,
USA) v souladu s doporučením výrobců. Primery amplifikovaly 153 bp dlouhý fragment
genu IFNAR2, kódujícího R2 řetězec receptoru pro inteferon alfa/beta. 10 μl alikvoty byly
61
naneseny na 1.5% agarózové gely, barveny etidium bromidem a vizualizovány s pomocí CCD
kamery (Ultralum, Claremont, CA, USA).
2.7. Statistická analýza
Všechny statistické testy byly provedeny na základě principu „úmysl léčit“ (intention-to-
treat) a všechna selhání či případy úmrtí byly binárně zaznamenány jako plně ekvivalentní.
Hodnota p < 0,05 byla brána jako univerzální limit pro statistickou významnost. Pro popis
primárních dat byla pouţita standardní deskriptivní statistika (medián, 5-95% percentily,
frekvenční tabulky). Vrstvená Kaplan-Meierova product-limit metoda byla aplikována
pro rozlišení míry přeţití mezi dvěma či více podskupinami. Peto-Prenticeův generalizovaný
log-rank test byl pouţit jako komparativní statistický test.
3. Výsledky
3.1. Imunohistochemická charakterizace primárních melanomových buněčných kultur a
cytotoxického efektu interferonů
Primární buněčné kultury byly vytvořeny z postoperativních lokálních uzlinových
melanomových metastáz. Po jednom měsíci růstu in vitro byly buňky fenotypovány
s pouţitím protilátek proti antigenům, o nichţ je známo, ţe jsou exprimovány v koţních
neuroektodermálních buňkách. Je evidentní, ţe imunobarvení buněk protilátkou proti Melan-
A mělo za výsledek uniformní vzorce barvení, coţ naznačuje homogenitu buněčných populací
(Obrázek 2). Všechny kultury měly převáţně jeden buněčný fenotyp.
Cytotoxický efekt interferonu alfa byl hodnocen v několika buněčných populacích tak, ţe
byly počítány ţivé buňky v 24, 48 a 72 hodinových intervalech. V závislosti na pokusu a linii
byla pozorována cca 10-40% inhibice růstu.
3.2. Western blotová analýza STAT3 fosforylace
Protilátky proti STAT3 fosfoformám (pY705 a PS727) byly pouţity pro detekci
aktivovaných STAT3, o nichţ je známo, ţe asociují s rakovinným fenotypem. Informace
o dávkovém účinku léčiva byla získána analýzou úrovní STAT3 fosforylace ve dvou
vybraných primárních kulturách (Obrázek 3A). Je evidentní, ţe linie LM48/2 (na obrázku 3A
vlevo) ukazuje absenci STAT3 indukce při nízké (1x 103 U/mL) koncentraci a významnou
indukci při obou vyšších koncentracích (5x 103 U/mL a 20x 10
3 U/mL). Naproti tomu linie
VJ22 (na obrázku 3A vpravo) vykazovala relativně silný bazální STAT3-pY signál, který byl
po ovlivnění cytokiny zvýšen jen málo (IFN-γ) nebo vůbec (IFN-α).
62
Pro další experimenty zahrnující Western blotové analýzy 24 primárních kultur byla
zvolena koncentrace IFN-α 5x 103 U/mL. Imunobarvení proteinových blotů protilátkou proti
aminokyselinové determinantě (Obrázek 3B a C, STAT3 – total) naznačovalo přítomnost
exprese STAT3 proteinu ve všech vzorcích s jen malými rozdíly v intenzitě signálu.
V kontrastu k nefosforylovaným STAT3 byly mezi vzorky zjištěny rozdíly v bazálních
úrovních fosforylovaných STAT3 izoforem. Například pacienti HM68 a LM58 měli nízké
úrovně STAT3-pY, zatímco PT56 a SJ97 vykazovali silné pY-STAT3 signály (Obrázek 3B),
coţ je konzistentní s dříve popsanou variací v bazálních úrovních fosforylace STAT3
u pacientů s melanomy (Lesinski et al., 2007; Messina et al., 2008). Na základě celkového
poměru STAT3-pY/celkový STAT3 můţeme zhodnotit, ţe bazální úrovně STAT3-pY byly
u melanocytů relativně nízké ve srovnání s většinou melanomových vzorků.
Nasazení interferonů mělo za následek zvýšení signálů STAT3-pY a STAT3-pS
v některých, ale ne ve všech vzorcích (Obrázek 3B a 3C, shrnutí v Tabulce S1). V závislosti
na inducibilitě fosforylovaných Y705-STAT3 izoforem můţe být 24 melanomových vzorků
rozděleno do tří skupin (Tabulka 2). V první skupině (13 případů/54 %) nebyla pozorována
ţádná aktivace ani jedním interferonem. Druhá skupina sestává ze vzorků s indukcí STAT3
prostřednictvím IFN-γ, ale ne IFN-α (7 případů/29 %). Do této skupiny spadají normální
melanocyty. Třetí skupina (4 případy/17 %) sestává ze vzorků vykazujících indukci
fosforylace STAT3 oběma interferony. Nebyl nalezen ţádný případ indukce STAT3 IFN-α
bez současné aktivace IFN-γ. Je nezbytné zdůraznit, ţe experimenty byly prováděny
s pouţitím buněk kultivovaných jeden měsíc po chirurgické excizi (první pasáţ). Další pasáţe
a prodlouţená kultivace buněk měly v některých případech za výsledek pozměněné
STAT3-pY odpovědi.
Vztah mezi aktivační odpovědí STAT3 na pY705 indukovanou interferony a průběhem
nemoci je demonstrován v Tabulce 3. Pacienti, kteří odpovídali na aktivaci interferonem alfa
(activation responders), tedy ti, jejichţ ex vivo metastatické melanomové buňky vykazovaly
IFN-α-indukovanou STAT3 fosforylaci na Y705, vykazovali významně kratší přeţití bez
nemoci (DFS), přeţití bez progrese (PFS) a celkové přeţití (OS) ve srovnání se skupinou bez
odpovědi (non-responders). Tyto analýzy poskytují důkaz, ţe aktivace STAT3 na pY705
indukovaná IFN-α negativně koreluje s výsledkem nemoci.
V kontrastu k fosforylaci na tyrozinu, jen dva vzorky ukázaly zvýšenou fosforylaci na
serinu 727 (pS727) po stimulaci IFN-α nebo IFN-γ (Obrázek 3C a Tabulka 2). Aktivační
odpověď na pS727 u těchto pacientů nicméně neodráţela uniformně vývoj choroby, neboť
63
jeden případ byl ztracen po 51 měsících v důsledku diseminace, zatímco druhý přeţíval
62 měsíců bez progrese.
3.3. Western blotová analýza STAT1 fosforylace
Status STAT1 fosforylace na Y701 byl zhodnocen na stejných skupinách buněčných
populací pacientů jako v analýze STAT3. Příklady imunodetekcí s protilátkami proti
celkovému a fosforylovanému STAT1 jsou ukázány na Obrázku 4 a shrnuty
v Tabulkách 4 a S1. V první skupině (4 případy/17 %) nebyla pozorována aktivace ţádným
interferonem. Druhá skupina sestává ze vzorků s indukcí STAT1 interferonem gama, ale ne
alfa (16 případů/66%). Třetí skupina (4 případy/17%) sestává ze vzorků vykazujících indukci
STAT1 fosforylace oběma interferony. Obecně řečeno byl STAT1 mnohem častěji indukován
IFN-γ neţ STAT3 (88 vs. 46 %). Nicméně bazální úrovně STAT1-pY byly mnohem niţší neţ
u STAT3-pY, coţ naznačuje konstitutivní aktivaci STAT3 (ale ne STAT1) v nádorových
buňkách.
3.4. RNA a proteinová analýza receptoru pro interferon alfa/beta (IFNAR)
v melanomových buňkách
18 z 24 vzorků pacientů (75%) nevykazovalo indukci interferonem alfa ani u STAT3 ani
u STAT1. Domnívali jsme se, ţe to můţe být způsobeno deficiencemi v expresi IFNAR.
Proto jsme analyzovali expresi genů IFNAR ve vybraných vzorcích, které vykazují (VJ22,
LM48/2) nebo nevykazují (SJ97, KJ101) aktivaci STAT. Na úrovni RNA jsme studovali
expresi R2 řetězce IFNAR s vyuţitím RT PCR. Produkt o délce cca 150 bp byl amplifikován
IFNAR2-specifickými primery ve všech analyzovaných vzorcích cDNA, včetně těch
pocházejících z normálních melanocytů (Obrázek 5A). Intenzity signálů v populacích
s inducibilními i neinducibilními fenotypy byly srovnatelné, coţ naznačuje, ţe geny IFNAR2
byly v melanomových buňkách transkribovány stejnoměrně. Podobně i na proteinové úrovni
vykazovala protilátka rozeznávající R1 řetězec IFNAR imunoreaktivitu se všemi
proteinovými extrakty (Obrázek 5B). Zdá se tedy, ţe v expresi receptoru pro IFN-α/β
u melanomových buněk nebyly ţádné defekty.
64
Tabulka 2: Aktivace STAT3 proteinu jako odpověď na stimulaci IFN-α/-γ
u pacientů s melanomem
IFN-α IFN-γ
Neinducibilnía Inducibilní Neinducibilní Inducibilní
Případy/procenta Případy/procenta Případy/procenta Případy/procenta
pY 705 20/83% 4/17% 13/54% 11/46%
pS 727 22/92% 2/8% 22/92% 2/8%
Sumarizované výsledky STAT3 aktivace IFN-α/-γ u pacientů s melanomem.
a Údaje shromáţděné z Western blot analýz (Obrázek 3 a Tabulka S1).
Vzorky ukazující více jak 20% nárůst v intenzitě pY705 a pS727 signálů oproti kontrolám
byly povaţovány za „inducibilní“.
Tabulka 3: Kontrolní body přeţití ve vztahu k různým měřítkům aktivace STAT3
Parametr 1 DFS
2 PFS
2 OS
2
Indukce IFN-α:
Neinducibilní (N) vs. Inducibilní (I)
STAT3 na Tyr 705
p = 0.049 p = 0.041 p = 0.039
N: 34.9 měsíců N: 62.3 měsíců N: 78.4 měsíců
I: 5.0 měsíců I: 26.1 měsíců I: 26.5 měsíců
Indukce IFN-γ:
Neinducibilní (N) vs. Inducibilní (I)
STAT3 na Tyr 705
p = 0.693 p = 0.496 p = 0.726
N: 18.0 měsíců N: 39.2 měsíců N: 40.2 měsíců
I: 23.8 měsíců I: 43.9 měsíců I: 55.4 měsíců
1 Aktivace STAT3 na pS727 není analyzována vzhledem k velmi nízké frekvenci
inducibilních případů (N = 2)
2 Hladina významnosti log-rank testu srovnávající dvě varianty (p) a mediánové hodnoty
přeţití v měsících
65
Tabulka 4: Aktivace proteinu STAT1 jako odpověď na stimulaci IFN-α/-γ u pacientů
s melanomem
IFN-α IFN-γ
Neinducibilnía Inducibilní Neinducibilní Inducibilní
Případy/procenta Případy/procenta Případy/procenta Případy/procenta
pY 701 20/83% 4/17% 4/17% 20/83%
pS 727 20/83% 4/17% 19/79% 5/21%
Údaje shromáţděné z Western blot analýz (Obrázek 4 a Tabulka S1).
Obrázek 1: Klasifikace vzorků od pacientů podle průběhu onemocnění.
66
Obrázek 3: STAT3 exprese a aktivace v populacích melanomových buněk.
(A) Vliv dávkování IFN-α na stimulaci fosforylace na tyrozinu Y705 u STAT3 proteinu.
(B) Příklad imunoblotových analýz STAT3-pY705.
(C) Příklad imunoblotových analýz STAT3-pS727.
C, kontrola; G, interferon gama; A, interferon alfa. STAT3-pY, barvení protilátkou proti
fosfotyrozinu (pY705). STAT3-pS, barvení protilátkou proti fosfoserinu (pS727).
STAT – total, barvení protilátkou k primární aminokyselinové determinantě. Expozice
chemiluminiscenčních prouţků na film byla 1-5 minut. Signály byly hodnoceny
denzitometricky a vyjádřeny jako poměr STAT3-p/STAT3-total (čísla pod kaţdým vzorkem).
Pro kontrolní vzorky byl zvolen poměr 1.0.
67
Obrázek 4: Příklad imunoblotových analýz STAT1 v populacích melanomových buněk
a normálních melanocytů. STAT1-pY, barvení protilátkou proti fosfotyrozinu (pY701).
Pouţité symboly a jejich význam jsou stejné jako na obrázku 3. Za povšimnutí stojí poměrně
slabé bazální hladiny STAT1-pY.
Obrázek 5: Analýza exprese IFNAR na úrovni RNA (A) a proteinu (B).
(A) cDNA byla amplifikována s primery specifickými pro IFNAR2, STAT3 a GAPDH,
produkty PCR byly analyzovány na agarózovém gelu v přítomnosti ethidium bromidu.
Amplifikace GAPDH slouţila jako kontrola kvality cDNA. Při vynechání reverzní transkripce
(dráhy „-‟) nevznikal ţádný produkt.
(B) Příklad analýzy proteinových extraktů metodou Western blotu s pouţitím protilátky proti
R1 řetězci interferonového alfa/beta receptoru.
68
Tabulka S1: Souhrnná tabulka STAT1 + STAT3
Iniciály
pacientů
Inducibilita STAT 1 a STAT 3 proteinu
PY PS
STAT 1 STAT 3 STAT 1 STAT 3 STAT 1 STAT 3 STAT 1 STAT 3
IFN α IFN γ IFN α IFN γ
DM 90 I N I I N N N N
VJ 22 I N I I N N N N
LM 48/2 I I I I N N N N
OM 89 I N I N N N N N
PV 103 N N I N N N N N
RM 49 N N I N N N N N
UZ 51 N N I N N N N N
LZ 52 N N I I N N N N
LM 58 N I I I N N N N
NM 59 N N I N N N N N
RJ 61 N I I I N N N N
HM 68 N N I I N I N I
ŠJ 69 N N I I N N N N
MJ 72 N N I N N N N N
HS 74 N N I N N N N N
PO 73 N N I I I N N N
CP 60 N N I N N N I N
SO 66 N N I N N N I N
PJ 65 N N I N I N I N
MJ 67 N N I I I N I N
SJ 97 N N N N N N N N
MJ 100 N N N N N N N N
KJ 101 N N N N N N N N
PT 56 N I N I I I I I
69
Vývoj rezistence k interferonu IFN-γ je v melanomových buňkách
asociován s atenuací indukce genů SOCS a konstitutivní expresí SOCS 3
Abstrakt
Rezistence k interferonům (IFN) limituje jejich protirakovinnou léčebnou efektivitu.
Studovali jsme evoluci IFN-rezistentního stavu in vitro s vyuţitím melanomových buněčných
linií. Zjistili jsme, ţe buňky se staly méně senzitivní k antiproliferativnímu efektu IFN-γ po
prodlouţené kultivaci, coţ nám umoţnilo izolovat senzitivní a rezistentní sub-klony parentální
linie. Zkoumali jsme transkripci genů pro přenašeče signálu a aktivátorů transkripce
(STAT1-6) a supresory cytokinové signalizace (SOCS 1-3), a fosforylaci proteinu STAT1.
Rezistentní sub-linie (pojmenovaná WM 1158R) se lišila od senzitivní sub-linie (WM 1158S)
konstitutivní expresí SOCS 3, chybějící nebo slabou aktivací SOCS 1-3 po ovlivnění IFN-γ
a krátkým trváním cytokinového aktivačního signálu. Obdobné korelace byly pozorovány
i v dalších melanomových liniích, které se lišily citlivostí k IFN. Na úrovni proteinů
indukoval IFN-γ silnou a prodlouţenou aktivaci STAT1 na serinu 727 (S727) u linie WM
1158R, zatímco v buňkách WM 1158S byla fosforylace této aminokyseliny mnohem méně
výrazná. Na druhou stranu byla fosforylace tyrozinu 701 (Y701) stimulována nezávisle na
fenotypu senzitivity. Souhrnně lze říct, ţe po působení interferonů je konstitutivní exprese
SOCS 3 korelována s atenuací jeho indukce. Tyto výsledky naznačují, ţe progrese
melanomových buněk od IFN senzitivity k IFN insenzivitě asociuje se změnami v expresi
SOCS.
1. Úvod
Je dobře známo, ţe interferony (IFN) mohou inhibovat růst a proliferaci široké škály
nádorových buněk. Jejich účinek je obvykle spíše cytostatický neţ cytotoxický, a byla
prokázána inhibice progrese během fází buněčného cyklu. Terapeutická uţitečnost podávání
IFN byla primárně prokázána u některých leukémií, a co se solidních nádorů týče,
u karcinomu ledvinových buněk, Kaposiho sarkomu a maligního melanomu
(shrnuto v Lens a Dawes, 2002). Nicméně efektivita léčby je často neuspokojivá,
pravděpodobně v důsledku per se rezistence některých sub-klonů nádorových buněk a/nebo
získané rezistence k biologickým účinkům interferonů.
Biologické aktivity interferonů jsou zprostředkovány interakcemi se specifickými
receptory buněčného povrchu a aktivacemi intracelulárních signálních kaskád (Ransohoff,
70
1998). Janusovy kinázy (JAK)/přenašeče signálu a aktivátory transkripce (STAT) hrají
klíčovou roli v IFN-indukované signalizaci, která následně moduluje základní buněčné funkce
jako růst, diferenciaci a apoptózu (Brierley a Fish, 2005). STAT1 je nepochybně potřebný pro
přenos signálů IFN-γ (Durbin et al., 1996), ale ukazuje se i role dalších STATů včetně STAT3
(Ramana et al., 2005). Nedávné rozpoznání signálních drah JAK/STAT jakoţto
nevyhnutelného molekulárního mechanismu rozličných buněčných efektů vyvolaných
interferony s sebou přineslo významnou snahu osvětlit roli jejich komponent v rakovině (Calo
et al., 2003). U maligního melanomu demonstrovaly některé studie sníţenou aktivitu STAT1
v IFN-rezistentních buněčných liniích, coţ ukazuje na defekty v drahách JAK/STAT (Wong
et al., 1997; Pansky et al., 2000). Ke změnám došlo jak na úrovni proteinů tak RNA a
posttranslačních fosforylačních modifikací. Ačkoliv většina melanomových buněčných linií
vykazovala normální fosforylační odpověď Y701 na působení IFN-γ, fosforylační blok na
S727 se zdá být častější (Kovarik et al., 2003). Na druhou stranu byly popsány i proměnlivé
hladiny STAT1 bez zjevné korelace s buněčnou senzitivitou vůči interferonům (Chawla-
Sarkar et al., 2002; Jackson et al., 2003), a v klinické studii byla nalezena vysoká četnost
upregulace fosforylace STAT1 u pacientů se špatnou prognózou (Boudny et al., 2003). Kromě
vlivu STAT1 byl nedávno prokázán i příspěvek defektů regulace STAT5 k IFN rezistenci
melanomových buněk (Wellbrock et al., 2005). Zdá se, ţe účast molekul STAT v onkogenezi
je poměrně komplexním jevem.
Doba trvání funkce STAT je přísně kontrolována několika rodinami negativních
regulátorů, včetně rodiny regulátorů s klasickou zpětnou vazbou – supresorů cytokinové
signalizace (SOCSs). Doposud bylo identifikováno osm členů této rodiny indukované
cytokiny, kteří zeslabují nebo inhibují signál cytokinových růstových faktorů
(shrnuto v Hilton, 1999; Fujimoto and Naka, 2003). Dva z nich, SOCS 1 (Alexander et al.,
1999) a SOCS 3 (Ramana et al., 2005) zřejmě jsou kritickými inhibitory IFN-γ signalizace.
V nádorech můţe dysfunkce molekul SOCS způsobit hyper-responzivitu k cytokinům
a růstovým faktorům, a můţe přispívat k vývoji a/nebo progresi maligních nádorů. Například
umlčení genů SOCS 1 a/nebo SOCS 3 metylací promotoru je korelováno se ztrátou kontroly
inhibice růstu v karcinomech plic (Yoshikawa et al., 2001), slinivky (Komazaki et al., 2004),
prsu a vaječníku (Sutherland et al., 2004). Obdobný epigenetický blok zřejmě ovlivňoval
genovou expresi SOCS 3 v karcinomech plic (He et al., 2003), hlavy a krku (Weber et al.,
2005). Tyto studie naznačily, ţe aberace umlčování mohou být příčinou konstitutivní aktivace
dráhy JAK/STAT v nádorových buňkách. Nicméně další studie rovněţ naznačily, ţe maligní
71
buňky ve srovnání se svými normálními protějšky exprimují geny SOCS konstitutivně (Sakai
et al., 2002; Li et al., 2004; Evans et al., 2007) a nucená exprese transgenu SOCS často
přinášela rezistenci k interferonům. Konstitutivní exprese můţe potenciálně mařit
imunoterapii inaktivací cytokinové signalizace. Je jasné, ţe zůstává mnoho nejasností ohledně
funkce SOCS v tumorgenezi.
Náš předchozí screening melanomových buněčných linií ukázal, ţe konstitutivní exprese
SOCS 3 byla obecně nízká (Kovarik et al., 2005). Nicméně několik málo linií vykazovalo
relativně vysokou hladinu exprese SOCS 3 jak na úrovni RNA tak proteinů. Nebyly
provedeny ţádné pokusy korelovat úroveň exprese se senzitivitou k IFN. Proto jsme se nyní
zaměřili na výzkum vztahu mezi IFN senzitivitou a expresí genů STAT a SOCS. Abychom
sníţili variabilitu způsobenou variací v genetickém pozadí a pozadí buněčných typů, pouţili
jsme dvě sub-linie odvozené z parentální linie lidského maligního melanomu WM 1158, které
se lišily v senzitivitě k IFN-γ.
2. Materiál a metody
2.1. Buněčné kultury
Melanomové buněčné linie WM 1158, WM 9, WM 39, WM 1552C, 1205 Lu (Wistar
Institute, Philadelphia, PA, USA) byly pěstovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově
médiu (GIBCO USA) s hydrogenuhličitanem sodným, L-glutaminem, inzulínem, antibiotiky
a 10% fetálním bovinním sérem. Buňky byly kultivovány v inkubátoru s 5% CO2 ve zvlhčené
atmosféře. Lidské epidermální melanocyty (výrobní kód C-002-5C) izolované z lehce
pigmentované novorozenecké předkoţky byly zakoupeny od Cascade Biologics, USA.
Buňky byly pěstovány v médiu 254 doplněném růstovým doplňkem pro lidské melanocyty
(obojí od Cascade Biologics, USA). Buňky byly získány na závěr stádia sekundární kultury
a podstoupily tři aţ šest pasáţí, neţ byly pouţity pro experimenty.
2.2. Zkouška inhibice růstu a statistické analýzy
Buňky byly vysety do 96-jamkových destiček při buněčné hustotě 2000 buněk na jamku.
Jeden den po vysetí bylo médium nahrazeno médiem obsahujícím IFN-γ (Sigma, Saint Louis,
MO, USA) s koncentracemi 50, 100 a 200 ng/ml. WST-1 kolorimetrická zkouška (Roche,
Mannheim, Německo) byla provedena dle instrukcí výrobce. Absorbance byla změřena
ve třech paralelních jamkách. Inhibice růstu (cytotoxicita) byla zhodnocena v nejméně třech
nezávislých experimentech a vyjádřena jako mnoţství viabilních buněk v ovlivněných
72
a neovlivněných vzorcích (Obrázky 1A a B) nebo jako buněčná viabilita normalizovaná
na neovlivněné kontroly (Obrázek 1C). Data byla statisticky analyzována s vyuţitím
parametrického t-testu.
2.3. Analýzy westernovým přenosem
Buňky byly sklizeny a lyzovány podle standardních procedur. Obsah proteinů
v celobuněčných extraktech byl stanoven Bradfordovou zkouškou (Bio-Rad, Mnichov,
Německo). Přibliţně 20 µg celkového proteinu bylo rozděleno pomocí SDS-PAGE
(10% gely), a proteiny byly následně přeneseny na nitrocelulózové membrány (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA). Fosforylované proteiny STAT byly vizualizovány po imunoprecipitaci,
podle popisu v Kovarik et al. (2003). Po vazbě primárních protilátek byly bloty inkubovány
s buď anti-myšími nebo anti-králičími sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou
peroxidázou (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) a vyvolány
pomocí chemiluminiscenčního (ECL) detekčního systému (Amersham Biosciences) podle
instrukcí výrobce.
Pro detekci fosfoforem STAT1 byly pouţity komerční anti-pY-701 polyklonální
protilátka (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) a anti-pS-727 monoklonální
protilátka (pSM 1, vyvinuta v laboratoři autorů, Kovarik et al., 2003). Celkové hladiny
STAT1 byly určeny s pomocí králičího polyklonálního antiséra proti C-terminální doméně
STAT1, vyvinutého v laboratoři autora (S1C).
2.4. Analýzy RNA
Celková RNA byla izolovaná z buněk ovlivněných 50 ng/ml IFN-γ po různě dlouho dobu,
s pouţitím RNAeasy kitu (Qiagen, Hilden, Německo). Kaţdý vzorek byl extenzivně ošetřen
Dnázou I. Korespondující cDNA byly připraveny reverzní transkripcí s pouţitím Superscript
II polymerázy (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA byly amplifikovány s pouţitím
multigenového 12-jamkového stripu (SuperArray, Biosci Co., Frederick, MD, USA)
obsahujícího sety primerů pro sedm genů STAT, čtyři SOCS a GAPDH. PCR byla prováděna
v MJ Research termocycleru podle doporučení výrobce, s pouţitím maximálně 30 cyklů, aby
byla reakce udrţena v lineární fázi. 5-10 μl alikvoty byly naneseny na 2% agarózový gel.
Velikost bandů byla odhadnuta na základě velikostních markerů a odpovídala očekávaným
velikostem amplikonů. Fluorescenční etidiumbromidové signály byly skenovány CCD
kamerou (Ultralum) a kvantifikovány (Ultraquant). V některých případech byly výsledky
RT-PCR ověřeny northernovým přenosem s pouţitím sond pro SOCS 1 (Hebenstreit et al.,
2005) a SOCS 3 (Masuhara et al., 1997), jak bylo popsáno v Kovarik et al. (2005).
73
3. Výsledky
3.1. Diferenční senzitivita sub-linií WM 1158 k interferonu gama
Při kontinuální kultivaci melanomových buněk WM 1158 jsme pozorovali postupný
pokles senzitivity k IFN-γ. Opakované klonování mělo za následek izolaci rezistentní
(WM 1158R) a senzitivní (WM 1158S) sub-linie. Zatímco růst linie WM 1158S IFN-γ
zpomaloval o 80-90 %, růst buněk WM 1158R byl inhibován významně méně (Obrázek 1
a Tabulka 1). Růstové vlastnosti obou sub-linií v nepřítomnosti IFN-γ byly podobné (Obrázky
1A a 1B) stejně jako buněčná morfologie (data neprezentována). Antiproliferativní účinek
IFN byl dále studován na několika dalších melanomových liniích (Tabulka 1). Ty mohou být
zhruba rozděleny na hodně citlivé (WM 1158S, WM 39, WM 1552C), středně citlivé
(WM 1158R) a málo citlivé (WM 9, 1205 Lu). Nízká senzitivita linie WM 9 k IFN-γ je
v dobré shodě s předešlými publikacemi (Kortylewski et al., 2004).
3.2. Expresní profily před ovlivněním interferonem gama
RT-PCR byly prováděny v 12-jamkových stripech umoţňujících simultánní analýzu
exprese genů STAT1-6, SOCS 1-3 a SOCS 5 (Obrázky 2A-4A, horní části). Jako kontrolu
obsahoval kaţdý strip primery amplifikující konstitutivně exprimovaný gen GAPDH.
Izolované RNA byly reverzně transkribovány a odpovídající cDNA amplifikovány s pouţitím
specifických primerů. Prvních sedm drah v kaţdém stripu ukazuje amplifikační produkty
získané primery specifickými pro jednotlivé STATy. Většina STATů byla amplifikována,
produkovala silné bandy u všech buněčných linií, coţ naznačuje jejich konstitutivní expresi.
Nicméně se objevily rozdíly v intenzitě jednotlivých bandů. Například signál STAT4 byl
slabý nebo dokonce chyběl (u melanocytů) ve srovnání s ostatními STATy. Band STAT5b
byl konzistentně silnější neţ band STAT5a.
Primery SOCS byly navrţeny tak, aby umoţňovaly detekci transkriptů SOCS 1, 2, 3 a 5.
Bandy odpovídající transkriptům SOCS 1, 2 a 3 byly u linie WM 1158S sotva viditelné
(Obrázek 2A), coţ naznačuje, ţe exprese většiny SOCS před ovlivněním interferony byla
nízká nebo zanedbatelná. Naproti tomu WM 1158R vykazovala relativně silné signály
SOCS 3 (Obrázek 3A), coţ zřejmě znamená konstitutivní expresi SOCS 3 v těchto buňkách.
Pro kvantifikaci hladin transkriptů jsme měřili intenzity fluorescence jednotlivých bandů
a vyjádřili data jako poměr SOCS 3/GAPDH (Obrázky 2B-3B a Tabulka 1). Následně byla
u dalších melanomových buněčných linií prováděna RT-PCR analýza RNA genů SOCS
(Obrázek 4). Byly pozorovány relativně silné signály SOCS 3 v obou IFN-rezistentních
74
liniích WM 9 a 1205 Lu, zatímco nízkou konstitutivní expresi vykazovaly relativně citlivé
WM 39 a WM 1552C (Tabulka 1) a melanocyty (Obrázek 4A). Ve srovnání se SOCS 3 byly
signály SOCS 1 sotva detekovatelné s výjimkou linie 1205 Lu (data nejsou prezentována).
U všech buněčných linií byla zjištěna silná transkripce SOCS 5 (příklady na
Obrázcích 2A-4A).
3.3. Expresní profily po ovlivnění interferonem-γ
Po ovlivnění IFN-γ nedošlo k podstatným změnám v transkripčních profilech STAT.
U melanocytů byl detekován mírný (1,5 násobný) nárůst STAT1 (Obrázek 4), zatímco
u melanomových linií nebyl pozorován ţádný nárůst (Obrázky 2-3). Nicméně IFN-γ lehce
zvýšil signály STAT5 a STAT6 v melanomových buňkách.
Významné kvalitativní změny nastaly po ovlivnění IFN ve spektru SOCS-specifických
bandů (Obrázky 2-4). Nejvýraznější změny se týkají transkriptů SOCS 3 a SOCS 1. Exprese
SOCS 3 byla významně indukována v sub-linii WM 1158 (Obrázek 2), buňkách WM 1552C
a WM 39 (Tabulka 1) stejně jako v normálních melanocytech (Obrázek 4). Nicméně u buněk
WM 9 a 1205 Lu (Tabulka 1) a sub-linie WM 1158R (Obrázek 3) nebyly detekovány ţádné
nebo jen slabé signály SOCS 3. Úrovně indukce byly vyjádřeny jako poměr normalizovaných
signálů v buňkách ovlivněných IFN a neovlivněných IFN (Obrázky 2C-4C, Tabulka 1).
Detailní kinetická analýza (Obrázky 2-4) odhalila, ţe ve WM 1158S i v melanocytech byl
signál SOCS 3 nejsilnější do 24 hodin od ovlivnění IFN-γ, zatímco u WM 1158 byla slabá
indukce časově omezená a dosáhla maxima v 30 min. intervalu. Po 72 hodinách nebyl ţádný
zjevný rozdíl mezi neovlivněnými a ovlivněnými buňkami WM 1158R, zatímco WM 1158S
si stále udrţovaly zvýšenou expresi SOCS 3.
Intenzity bandů SOCS 1 byly obecně výrazně niţší neţ u SOCS 3. I tak je evidentní, ţe
bandy SOCS 1 byly viditelné po ovlivnění IFN-γ u WM 1158S i WM 1158R i melanocytů.
Ve srovnání se SOCS 3 byla indukce posunuta k delšímu času od expozice. Ovlivnění IFN
nemělo ţádný zjevný efekt na hladiny RNA SOCS 2.
3.4. Fosforylace STAT 1
Několik studií naznačilo důleţitost aktivovaných (fosforylovaných) molekul STAT1
v rezistenci k interferonům. Zkoumali jsme fosforylační status STAT1 v buněčných
extraktech senzitivních a rezistentních sub-linií odvozených z melanomových buněk WM
1158 izolovaných v různých časových intervalech po ovlivnění IFN (Obrázek 5).
75
V rezistentní sub-linii WM 1158R signál odpovídající S727 fosforylované izoformě prudce
vzrostl do 30 minut po indukci IFN-γ a poté zůstal stabilní. V kontrastu k tomu senzitivní
buňky WM 1158S vykazovaly relativně uniformní pS727 bandy, nikterak významně
ovlivněné IFN. Obě sub-linie vykazovaly zvýšené a stabilní signály pY701 v přítomnosti
IFN-γ. Hladiny STAT1 nebyly významně ovlivněny IFN, coţ bylo ukázáno barvením blotů
protilátkou rozpoznávající primární determinantu (Obrázek 5, spodní část). Obdobné výsledky
fosforylace STAT1 byly pozorovány rovněţ v dalších melanomových buněčných liniích
WM 9 a WM 39 stejně jako v melanocytech (data nejsou prezentována).
Obrázek 5: Hladiny fosforylace STAT1 u IFN-rezistentní a IFN-senzitivní sub-linie
WM 1158.
Proteiny byly extrahovány (získány) ze stejných buněčných vzorků jako ty pouţité pro
analýzu RNA a byly analyzovány pomocí Western blotu. Všechny experimenty byly
provedeny 3x.
76
Obrázek 1: Antiproliferativní efekt IFN- u WM 1158S a WM 1158R sub-linií.
(A, B) Růst je vyjádřen jako mnoţství ţivých buněk v IFN ovlivněných a neovlivněných
vzorcích. Kaţdá hodnota reprezentuje průměr ze tří nezávislých pokusů.
(C) Ţivotaschopnost buněk normalizovaná k neovlivněným kontrolám. Rozdíly mezi
sub-liniemi WM 1158S a WM 1158R byly statisticky významné (P <0.01) ve všech časových
intervalech (24, 48 a 72 h). Měřeno pomocí WST-1 kolorimetrického testu.
77
Obrázek 2: Analýzy transkriptů STAT a SOCS u senzitivní sub-linie WM 1158S.
(A) Celkové RNA byly připraveny z buněk ovlivněných IFN-γ po dobu 30 min, 24 a 72 h
a z neovlivněných kontrol. DNA produkty z RT-PCR reakcí byly separovány
na 2% agarózových gelech.
(B) Transkripce je vyjádřena jako podíl (poměr) SOCS/GAPDH nebo
(C) násobek nárůstu nad bazální hladinu. Je ukázán průměr ze tří nezávislých experimentů.
78
Obrázek 3: Analýzy transkriptů STAT a SOCS u rezistentní sub-linie WM 1158R.
Podmínky a nastavení experimentů je stejné jako na obrázku 2.
79
Obrázek 4: Analýzy transkriptů STAT a SOCS v lidských melanocytech.
Popis bandů a panelů je stejný jako na obrázku 2. Jsou ukázány výsledky jednoho
experimentu.
80
Tabulka 1: Vztah mezi buněčnou senzitivitou k interferonu IFN-γ, hladinami SOCS 3
mRNA a inducibilitou SOCS 3.
Linie aRezistence
k IFN-γ
bKonstitutivní exprese SOCS 3
cIndukce SOCS 3 (násobek nárůstu)
1205 Lu 90-100 0.7 1.0
WM 9 86-98 0.5 1.3
WM 1158R 68-80 0.4 2.4
WM 39 28-38 0.03 9.5
WM 1552C 39-43 0.03 12.7
WM 1158S 10-20 0.05 7.5
a Vyjádřena jako procento ţivotaschopných (viabilních) buněk po vystavení IFN-γ po dobu 72
hodin ve srovnání s kontrolními buňkami bez přidání IFN. Rozsah hodnot cytotoxicity je
uveden z nejméně tří paralelních experimentů.
b Provedeno pomocí RT-PCR jak je popsáno u obrázku 2. Fluorescenční signály byly
vztaţeny ke GAPDH. Je ukázán průměr z nejméně dvou nezávislých experimentů.
c Násobek nárůstu nad hladinu kontrol po 30 minutovém působení IFN-γ.
81
Interferon-γ na rozdíl od interferonu-α indukuje expresi SOCS 3
v buněčných liniích lidských melanomů
Abstrakt
Přenašeče signálu a aktivátory transkripce (STAT) a jejich endogenní inhibitory z rodiny
supresorů cytokinové signalizace (SOCS) jsou hlavní proteiny regulující přenos vnějších
signálů z povrchové membrány k cílovým genům v jádře. Pro korelování indukce SOCS 3
pomocí interferonů na úrovni mRNA a proteinů se STAT1 fosforylací v lidských
melanomových buněčných liniích jsme pouţili unikátní sbírku 18 stabilních maligních
melanomových buněčných linií a šest vzorků lidských normálních buněk (dva melanocyty,
dva koţní keratinocyty a dva fibroblasty). IFN-γ indukoval SOCS 3 v 83 % melanomových
buněčných linií, zatímco IFN-α stimuloval expresi SOCS 3 jen v 11 % případů. Obdobně
i melanocyty vykazovaly silnou indukci SOCS 3 interferonem gama a do menší míry také
interferonem alfa. Ve většině případů byla exprese SOCS 3 doprovázena fosforylací STAT1
na tyrozinových zbytcích (Y701). V několika liniích však SOCS 3 nebyl indukován i přes
fosforylaci STAT1 a v několika málo liniích došlo k indukci SOCS 3 bez detekovatelné
fosforylace STAT1, coţ naznačuje, ţe STAT1 nemusí být výhradním induktorem
(aktivátorem) SOCS 3. Rovněţ normální buňky vykazovaly aktivaci STAT1 a vysoké úrovně
exprese SOCS 3 po ovlivnění IFN-γ (ne však IFN-α). Shrneme-li to, IFN-γ (na rozdíl od
IFN-α) indukoval SOCS 3 zřejmě na úrovni transkripce a vykazoval vyšší cytotoxické účinky
nezávisle na původu buněk.
1. Úvod
Transdukčním drahám JAK/STAT byla připsána ţivotně důleţitá role v signálních
kaskádách indukovaných cytokiny a následně v transkripci genů. Byly popsány tři hlavní
skupiny proteinů, které regulují přenos vnějších signálů z povrchové membrány k cílovým
genům v jádře. Mezi ně patří receptor-asociované JAK, STATy a jejich negativní regulátory
(supresory cytokinové signalizace, SOCS) (Darnell, 1997; Fujimoto and Naka, 2003) a
proteinové inhibitory aktivovaných STAT (PIAS) (Greenhalg and Hilton, 2001) působící na
komplexu receptor/JAK nebo v jádře.
STATy patří do multigenní rodiny latentních cytoplazmatických proteinů lokalizovaných
v neaktivní formě v cytoplazmě. Tato rodina je tvořena sedmi doposud identifikovanými
členy (STAT1-4, 5a, 5b a 6). Aktivované STATy se přemisťují do jádra, kde se váţou
82
na specifické DNA sekvence v promotorech responzivních genů a následně modulují jejich
expresi (Schindler and Darnell, 1995; Frank, 1999; O´Shea et al., 2002). Fosforylace
tyrozinových a serinových zbytků jednotlivých STATů, včetně STAT1, je důleţitá pro přenos
signálů interferonů (IFN) a trans-aktivaci (Kovarik et al., 2001; Decker and Kovarik, 2000).
In vivo STATy zprostředkovávají široký rozsah reakcí indukovaných IFN, interleukiny
a růstovými faktory. Skrze trans-aktivaci cílových genů a ve spolupráci s dalšími aktivátory
transkripce modulují STATy vývojové procesy, buněčný růst, diferenciaci, senescenci
a apoptózu v různých buněčných typech. Zvláště důleţitou roli hrají proteiny STAT
v koordinované signalizaci mnoha komponent imunitního systému, jehoţ vývoj, maturace,
diferenciace a funkce jsou indukovány a řízeny IFN a interleukiny, tj. ligandy, které vyuţívají
signální dráhy STAT (Agaisse and Perrimon, 2004). Navíc pak nedávné studie ukázaly, ţe
proteiny STAT fungují v mnoha sloţkách imunitního systému, včetně dendritických buněk a
T-lymfocytů (Wang et al., 2004; Anderson et al., 2005).
Proteiny SOCS reprezentují největší a zřejmě nejdůleţitější faktory klasické smyčky
negativní zpětné vazby, která reguluje transdukční dráhy JAK/STAT iniciované různými
exogenními stimuly (Cooney, 2002; Fujimoto and Naka, 2003). V mnoha případech je
transkripční upregulace genů SOCS zprostředkována aktivovanými STATy. V kontrastu
k tomu suprese JAK/STAT drah vede ke sníţení exprese proteinů SOCS, čímţ přispívá
k procesu obnovy responzivity buňky. Ačkoliv přesný buněčný mechanismus, kterým
molekuly SOCS blokují dráhy JAK/STAT, zůstává prozatím značně nejasný, je
pravděpodobné, ţe proteiny SOCS kontrolují iniciaci, intenzitu a trvání cytokinových signálů
a mohou určovat prahovou úroveň cytokinů, na niţ bude buňka smysluplně reagovat.
Postupné pochopení signalizace STAT/SOCS můţe mít významné praktické důsledky
v onkologii. Soudí se, ţe abnormální přenos signálů a indukce genové transkripce
zprostředkované dráhami STAT/SOCS jsou zapojeny do biologie nádorů a do jejch odpovědi
na terapii zaloţenou na cytokinech (Calo et al., 2003). Mezi několik navrţených změn
v těchto systémech, které souvisí s rakovinou, patří rovněţ down-regulovaná exprese nebo
konstitutivní tvorba STATů a jejich nepřiměřená aktivace. Dále pak byly jako moţné příčiny
pokračující signalizace při rakovině označeny abnormální degradace SOCS v proteazomech
a/nebo umlčení lokusu pro SOCS gen prostřednictvím metylace (Cacalano et al., 2001;
He et al., 2003). Doposud jen několik zpráv analyzovalo roli STAT signalizace
u onkologických pacientů v souvislosti s přímou antiproliferativní aktivitou indukovanou
IFN-α a s citlivostí melanomových buněk k exogennímu IFN-α (Pansky et al., 2000). Tato
83
data podporují moţnost, ţe abnormalita v hladině STAT1 nebo v jeho aktivaci můţe souviset
se sníţenou citlivostí nádorových buněk k inhibiční aktivitě IFN-α. Byla popsána i data
mluvící proti asociaci abnormalit statusu STAT a reakce pacientů na IFN-α. Např. Lesinski et
al. (2005) ve svých klinických studiích ukázali, ţe hladiny STAT1 a STAT2 uvnitř nádoru
nijak významně neovlivňují reakci pacienta na doplňkovou terapii IFN-α. Vztah mezi
abnormalitami STAT a reakcí pacienta na terapii IFN-α tak zůstává nejasný. Není nám
známo, ţe by jakékoliv přesvědčivé studie popisovaly moţné defekty SOCS proteinů
asociované s nádory a jejich moţné důsledky.
V této studii jsme analyzovali expresi genu SOCS 3 v odpovědi na působení IFN
v několika dobře definovaných maligních melanomových buněčných liniích, melanocytech,
normálních koţních keratinocytech a fibroblastech. Exprese byla zkoumána na úrovni RNA
(northernový přenos) a proteinů (westernový přenos) a korelovala s fosforylačním statusem
proteinu STAT1.
2. Materiál a metody
2.1. Buňky, aplikace IFN a zkouška inhibice růstu
Buněčné modely
Jakoţto model byla pouţita unikátní sbírka 18 lidských maligních melanomových
buněčných linií (Herlyn et al., 1985), poskytnuta profesorem M. Herlynem (Wistar Institute,
Philadelphia, Pennsylvania, USA). Charakteristika jednotlivých linií je uvedena v Tabulce 1.
Buňky byly pěstovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM; PAN Biotech
GmbH, Aidenbach, Německo) s L-glutaminem (PAN Biotech GmbH) s 10% fetálním
bovinním sérem (FBS; Pan Biotech GmbH), inzulínem (5 ng/ml) a antibiotiky. Melanocyty
byly zakoupeny od TCS CellWorks (Botolph Claydon, Buckinghamshire, UK) a pěstovány
v doporučeném komerčním médiu (M-254) s růstovými doplňky pro lidské melanocyty
(HMGS). Buňky byly expandovány na minimálních pasáţích, coţ zachovalo jejich dobré
růstové charakteristiky a poskytlo dostatečné mnoţství materiálu. Kůţe z ucha zdravých dárců
a lidské koţní fibroblasty byly pouţity pro vytvoření primárních kultur keratinocytů
a fibroblastů, a ty byly pěstovány v DMEM (viz výše).
84
Tabulka 1: Charakteristika buněčných linií lidských maligních melanomů.
Rezistence k interferonům.
Buněčná linie
Původ Stádium Histopatolog. charakteristiky IFN γ* IFN α*
Fáze růstu Clark Breslow (ng/ml) (U/ml)
Inhibice růstu 50%
WM1158 M 2 RGP/VGP III 2.75 2.V 10 000
WM1552C P 3 RGP/VGP IV 5.92 2.V 500
WM1617 M n.a. n.a. n.a. n.a. 10 rez.
WM164 M 3 VGP III 2.7 10 rez.
WM35 P 1 RGP/VGP II 0.69 100 rez.
WM983A P n.a. RGP/VGP IV 25 50 rez.
WM3211 P 1 RGP/VGP n.a. n.a. rez. 10 000
WM852 M 3 VGP III 2.7 rez. >10 000
Inhibice růstu 30 %
WM902B P n.a. VGP n.a. n.a. 2.V rez.
WM239A M n.a. n.a. n.a. n.a. 2.V >10 000
451Lu M n.a. n.a. n.a. n.a. 10 >10 000
WM9 M n.a. n.a. n.a. n.a. 50 rez.
WM1341D P n.a. RGP/VGP IV 25 50 >10 000
WM852 M 3 VGP III 12 100 >10 000
WM115 P n.a. RGP/VGP IV 2.24 100 >10 000
WM373 M n.a. n.a. n.a. n.a. 200 >10 000
WM3211 P 1 RGP/VGP n.a. n.a. 200 10 000
Rezistence
1205Lu M n.a. n.a. n.a. n.a. rez. rez.
WM39 P n.a. n.a. n.a n.a. rez. rez.
WM278 P 2 VGP IV 3.7 rez. rez.
WM793 P 1 RGP/VGP II 0.55 rez. rez.
P – primární melanom, M – metastatické buňky, RGP - fáze radiálního růstu, VGP - fáze
vertikálního růstu, rez. – rezistentní, n.a. – informace není k dispozici
*Melanomové buňky byly ovlivněny různými dávkami IFN po dobu 4 dní. Dávky IFN
(ng/ml, U/ml) představují minimální koncentrace potřebné pro inhibici růstu ve srovnámí
s neovliněnými buňkami.
85
2.2. Aplikace IFN
Subkonfluentní buňky byly vyhladověny přes noc před vystavením interferonům.
Aktivační dávky obou interferonů byly odvozeny z dose-response křivek. IFN-γ byl pouţit
při koncentraci 10 ng/ml a IFN-α při koncentracích 1000 a 5000 IU/ml. Buňky byly
inkubovány s interferony po 30 minut při 37° C ve zvlhčené 5% CO2 atmosféře. Kontrolní
vzorky byly inkubovány paralelně bez přídavku interferonů. Buňky byly sklizeny a lyzovány
podle standardních procedur pro westernové a northernové analýzy.
2.3. Zkouška inhibice růstu
Antiproliferativní efekt rekombinantního lidského IFN-α a IFN-γ (Sigma, St. Louis,
Missouri, USA) byl zhodnocen na 18 melanomových buněčných liniích. Buňky byly vysety
duplikovaně do 96-jamkových destiček při buněčné hustotě 2000 buněk na jamku. Jeden den
po vysetí bylo médium nahrazeno médiem obsahujícím IFN s koncentracemi 2.5, 5, 10, 50,
100, 200 a 400 ng/ml pro IFN-γ a 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 a 20000 U/ml
pro IFN-α. Po čtyřech dnech kultivace byla provedena WST-1 kolorimetrická zkouška
(Roche, Mannheim, Německo) dle instrukcí výrobce. Bylo vypočteno procento růstové
inhibice vzhledem k růstu neovlivněných kontrolních buněk.
2.4.Westernové přenosy a protilátky
Westernový přenos
Obsah proteinů v celobuněčných extraktech byl stanoven Bradfordovou zkouškou
(Bio-Rad, Mnichov, Německo). Mnoţství cca 20 – 50 µg celkového proteinu bylo rozděleno
pomocí SDS-PAGE. Pro analýzy STAT1 a SOCS 3 byly pouţity 10% resp. 15% gel,
a proteiny byly následně přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Bio-Rad, Hercules,
California, USA) a detekovány s pomocí příslušných protilátek. Protein SOCS 3 byl přímo
detekován na blotech; fosforylovaný STAT1 byl vizualizován po imunoprecipitaci, jak je
popsáno v Kovarik et al. (2003). Pro normalizaci signálu byly westernové bloty znovu
analyzovány protilátkou (pan-ERK) proti extracelulárním signál-regulovaným protein
kinázám 1 a 2 (ERK1 o velikosti 44 kDa a ERK2 o velikosti 42 kDa), o nichţ je známo,
ţe nejsou ovlivněny IFN (Kovarik et al., 1998; Kovarik et al., 2001; Ramsauer et al., 2002;
Pilz et al., 2003). Po vazbě primárních protilátek byly bloty inkubovány s buď anti-myšími
nebo anti-králičími sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou
(Amersham Biosciences, Little Chalfon, Buckinghamshire, UK) a vyvolány pomocí
86
chemiluminiscenčního (ECL) detekčního systému (Amersham Biosciences) podle instrukcí
výrobce. Signály byly kvantifikovány denzitometricky s vyuţitím programu ImageQuant
(Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA).
Protilátky
Pro detekci proteinu SOCS 3 byly zakoupeny anti-SOCS 3 králičí polyklonální protilátky
od AbCam (Cambridge, Cambridgeshire, UK). Jako kontrola pro SOCS 3 westernové bloty
byla pouţita komerční myší monoklonální protilátka k pan-ERK (BD Transduction
Laboratories, San Diego, California, USA). Pro detekci fosforylovaných izoforem STAT1
byly pouţity anti-pY-701 polyklonální protilátka (Cell Signaling Technology, Beverly,
Massachusetts, USA) a anti-pS-727 monoklonální protilátka (pSM 1, vyvinuta v laboratoři
autorů) (Kovarik et al., 2003).
2.5. Northernové přenosy
Izolace RNA a hybridizace northernových blotů
Celková RNA byla izolovaná ze zmrazených buněčných pelet (počet buněk 8 x 107)
s pouţitím Rneas Mini Kitu (Qiagen, Hilden, Německo) v souladu s instrukcemi výrobce.
Kvalita RNA byla ověřena elektroforézou v 1% agarózovém gelu. RNA pak byla podrobena
elektroforéze v 1.2% formaldehyd-agarózových gelech a blotována na nylonovou membránu
(Hybond-XL, Amersham Biosciences) podle protokolu doporučeného Qiagenem. Sonda byla
radioaktivně značena α-[32
P]-deoxycytidintrifosfátem (dCTP) (ICN, Irvine, California, USA)
v náhodně primované reakci s vyuţitím kitu Decaprime (Fermentas, Vilnius, Litva).
Hybridizace se značenými sondami byla prováděna v 0.25 Na-fosfátovém pufru, pH 7.0,
se 7% SDS, při 65 °C po nejméně 16 hodin. Následovalo promývání 2x SSC a 0.1% SDS
(1x SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Na3-citrát, pH 7.0) (65 °C, dvakrát 15 minut). Hybridizační
prouţky byly vizualizovány s pouţitím fosforimageru (STORM; Molecular Dynamics).
Radioaktivita v prouţcích byla kvantifikována s vyuţitím programu ImageQuant (Molecular
Dynamics). Kaţdý blot obsahoval standardní vzorek RNA, umoţňující srovnání intenzit
signálů mezi jednotlivými bloty. Data byla shromáţděna ze tří nezávislých experimentů.
87
2.6. DNA sondy
V hybridizačních experimentech byly pouţity následující sondy a plazmidy: sonda
SOCS 3 byla inzertem plazmidu pcDNA nesoucího cca 1.2 kb lidské cDNA pro SOCS 3
(Masuhara et al., 1997); sonda GAPDH byla inzertem plazmidu pV2 (GADPH) nesoucích
cca 350 bp myší cDNA pro glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázu (sbírky Cancer Research
Campaign, Londýn, UK)
3. Výsledky
3.1. Zkouška inhibice růstu
Jednotlivé buněčné linie vykazovaly značné odlišnosti v citlivosti k interferonům.
Citlivost fluktuovala od zjevně citlivých buněk reagujících více neţ 50% inhibicí růstu
(osm linií) přes částečně citlivé buňky s inhibicí růstu aţ 30 % (devět linií) po čtyři úplně
rezistentní linie (Tabulka 1). Odpověď buněk na IFN-α při klinicky relevantních dávkách
(< 250 U/ml) byla u většiny buněčných linií nízká. Nebyla zjištěna korelace mezi
histopatologickými vlastnostmi původních nádorů a citlivostí k interferonům.
3.2. Stimulace exprese SOCS 3 pomocí interferonů
Exprese genu SOCS 3 na úrovních RNA a proteinů byla stanovena northernovým
respektive westernovým přenosem (Tabulka 2, Obrázek 1). RNA byly izolovány z 18
melanomových buněčných linií, dvou primárních melanocytů, dvou normálních keratinocytů
a dvou fibroblastů, a následně hybridizovány na bloty s radioaktivně značenými SOCS 3
cDNA sondami. Hybridizační signál SOCS 3 (1.3 kb) byl v nestimulovaných buňkách téměř
nedetekovatelný (Obrázek 1A), s výjimkou několika málo buněčných linií (např. linie
1205Lu), které vykazovaly slabý hybridizační signál. Po ovlivnění IFN-γ většina linií
vykázala zvýšený SOCS 3 hybridizační signál, ale mezi jednotlivými buněčnými liniemi byly
rozdíly v intenzitě (Obrázek 1A, Tabulka 2). Po ošetření vzorků IFN-α byly prouţky SOCS 3
slabé (např. u M2 melanocytů) nebo zanedbatelné u všech vzorků. Hladiny RNA zůstaly
zanedbatelné dokonce i po prodlouţené expozici (4 hodiny) buněk k IFN-α (linie WM 1341D
a 451Lu), coţ napovídá nedostatečnost indukce transkriptů SOCS 3 tímto cytokinem.
Pro kvantifikaci hybridizačních signálů jsme provedli fosforimaging signálů SOCS 3 a
GAPDH, a vyjádřili indukci jakoţto násobky zvýšení signálu proti neovlivněným buňkám
(Tabulka 2 a čísla pod kaţdou dráhou v Obrázku 1).
88
Pro stanovení hladin proteinů jsme pouţili westernový přenos s vyuţitím polyklonální
protilátky proti primární aminokyselinové determinantě proteinu SOCS 3, rozpoznávající
28 kDa polypeptid. Intenzita specifického prouţku byla u většiny linií po ovlivnění IFN-γ
výrazně zvýšena, v souladu s výsledky analýz RNA u stejných vzorků. Nebyly zjištěny ţádné
(nebo jen marginální) rozdíly v intenzitách signálu mezi neovlivněnými buňkami a buňkami
ovlivněnými IFN-α, coţ naznačuje téměř úplnou absenci indukce SOCS 3 pomocí IFN-α.
Pro kvantifikaci proteinových signálů jsme provedli fosforimaging signálů SOCS 3 a ERK,
a vyjádřili indukci jakoţto násobky zvýšení signálu proti neovlivněným buňkám (čísla pod
kaţdou dráhou v obrázku 1B). Obecně byla na úrovni proteinů pozorována poněkud vyšší
frekvence SOCS 3 pozitivních linií neţ na úrovni RNA (Tabulka 2), coţ můţe být vysvětleno
vyšší citlivostí imunoblottingu.
Aktivace transkripční schopnosti STAT1 je zřejmě zprostředkována fosforylací
tyrozinových a serinových aminokyselinových zbytků. Pro studium moţné indukce SOCS 3
transkripčním faktorem STAT1 jsme vyhodnotili úrovně fosforylace v neovlivněných a
IFN-ovlivněných buňkách. Proteiny byly imunoblotovány s protilátkami rozpoznávajícími
fosforylovaný tyrozin 701 a serin 727, a výsledky jsou shrnuty v Tabulce 2. Data pro
melanomové buněčné linie jsou převzata z našeho předchozího článku (Kovarik et al., 2003);
primární melanocyty, keratinocyty a fibroblasty byly nově testovány v rámci této studie.
Obecně vzato byla konstitutivní fosforylace STAT1 pozorována na serinových, ale ne
na tyrozinových zbytcích. Je nutno zdůraznit, ţe v relevantních kontrolních buňkách
(tj. melanocytech) indukoval IFN-α fosforylaci STAT1 na obou aminokyselinových zbytcích,
zatímco fosforylační odpověď na serinu 727 po ovlivnění IFN-γ chyběla. Stimulace
fosforylace tyrozinu 701 v normálních keratinocytech a fibroblastech byla pozorována pouze
po ovlivnění IFN-γ. Tato data demonstrují rozdíly mezi jednotlivými buněčnými typy v jejich
schopnosti aktivovat STAT1 v odpovědi na různé stimuly.
89
Tabulka 2: Shrnuté výsledky ukazující IFN-indukovanou fosforylaci STAT 1 a expresi
SOCS 3 u melanomových a normálních buněk.
IFNα IFNγ
SOCS 3 mRNA
SOCS 3 protein
STAT 1 fosforylace
PS/PY**
SOCS 3 mRNA
SOCS 3 protein
STAT 1 fosforylace
PS/PY**
Melanomové buněčné linie (n = 18)
WM 9 - - -/+ + + +/+
WM 793B - - -/+ ++ ++ -/+
WM 278 - - -/+ ++ ++ +/+
WM 1617 - - -/+ + - -/+
1205 Lu* - +/- -/+ ++ ++ -/+
WM 164 - - -/- + + +/-
WM 983A - - -/- + ++ -/+
WM 373 - - -/+ + + -/+
WM 1341D - - -/- + ++ -/-
WM 39 - - -/+ + ++ -/+
451 Lu - - -/- + + -/+
WM 35 - - -/+ - - -/+
WM 1158* - +/- -/+ + ++ -/+
WM 852 - - +/+ + - +/+
WM 902B - + -/+ - + +/+
WM 115 - - +/+ ++ ++ +/+
WM 239A - - -/+ - ++ +/+
WM 1552C* - - -/+ + + +/+
Indukce (%) 0 11.1***
11.1/77.8 83.3***
83.3 44.4/88.9
Normální buňky (n = 6)
keratinocyty K1 - - -/- + ++ -/-
keratinocyty K2 - - -/- ++ ++ -/+
fibroblasty F1 - - -/- ++ ++ -/+
fibroblasty F2 - - -/- + + -/+
melanocyty M1 +/- - +/+ ++ + -/+
melanocyty M2 + +/- +/+ ++ + -/+
Indukce (%) 25.0***
8.3***
33.3/33.3 100 100 0/83.3
Hladiny mRNA a proteinu SOCS 3 byly vyhodnoceny pomocí fosforimiging a vyjádřeny jako poměr
SOCS 3/GAPDH, resp. SOCS 3/ERK.
Pro kontrolní vzorky byly vybrány poměry 1.0 (Obrázek 1).
1.1 – 1.4: zanedbatelná (nepatrná) exprese SOCS 3 (-)
1.5 – 3.0: inducibilní, pozitivní signál (+)
3.0: silně inducibilní, výrazně pozitivní signál (++) * Buněčné linie s konstitutivní expresí SOCS 3 RNA.
** Výsledky aktivace STAT1 jsou ukázány jen pro srovnání, byly publikovány v předchozí práci
(Kovarik et al., 2003) ***
+/- buněčné linie zhodnocené jako polovičně pozitivní
90
Obrázek 1A: Exprese genu SOCS 3 na úrovni RNA.
Normální buňky: M1, M2 – melanocyty; K1, K2 – keratinocyty; F1, F2 – fibroblasty
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
WM 9 WM 793B WM 278 WM 1617 1205Lu WM 164 WM 983A
A: Melanoma cell lines
SOCS 3
1 2.4 1.1 1 3.3 1.0 1 >5 1.1 1 1.5 1.0 1 3.3 1.0 1 1.5 1.0 1 1.5 1.0
GAPDH
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
WM 373 WM 1341D WM 39 451Lu WM 35 WM 1158
IFN
alp
ha
240
min
IFN
alp
ha
240
min
1 2.0 1.0 1 2.5 1.0 1.0 1 2.0 1.1 1 1.6 1.0 1.0 1 1.3 1.0 1 2.7 1.0
SOCS 3
GAPDH
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
K1 K2
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
F1 F2
Normal cells
1 1.8 1.0 1 3.5 1.0 1 >5 1.0 1 2.2 1.0 1 3.5 1.4 1 >5 1.6
SOCS 3
GAPDH
* *C
ontr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
M1 M2
91
Obrázek 1B: Exprese genu SOCS 3 na úrovni proteinu.
Normální buňky: M1, M2 – melanocyty; K1, K2 – keratinocyty; F1, F2 – fibroblasty.
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
K1 K2 F2
B: Melanoma cell lines
ERK
SOCS 3
1 1.9 0.6 1 4.5 1.4 1 3.8 0.5 1 0.5 0.6 1 3.0 1.8 1 5.0 1.2
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
WM 1341D WM 39 541Lu WM 35 WM 1158
1 4.0 1.2 1 3.6 1.0 1 2.5 1.3 1 0.9 1.0 1 3.5 1.8
SOCS 3
ERK
Normal cells
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
WM 9 WM 793B WM 278 WM 1617 1205Lu WM 983A
F1
1 4.5 1.0 1 3.0 1.1 1 3.8 1.3 1 2.8 1.0
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
M1 M2
1 1.7 0.5 1 2.5 1.3
Contr
ol
SOCS 3
ERK
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
K1 K2 F2
B: Melanoma cell lines
ERK
SOCS 3
1 1.9 0.6 1 4.5 1.4 1 3.8 0.5 1 0.5 0.6 1 3.0 1.8 1 5.0 1.2
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
WM 1341D WM 39 541Lu WM 35 WM 1158
1 4.0 1.2 1 3.6 1.0 1 2.5 1.3 1 0.9 1.0 1 3.5 1.8
SOCS 3
ERK
Normal cells
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
IFN
alp
ha
WM 9 WM 793B WM 278 WM 1617 1205Lu WM 983A
F1
1 4.5 1.0 1 3.0 1.1 1 3.8 1.3 1 2.8 1.0
Contr
ol
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
IFN
gam
ma
IFN
alp
ha
M1 M2
1 1.7 0.5 1 2.5 1.3
Contr
ol
SOCS 3
ERK
92
Chybějící či nedostatečná fosforylace STAT1 na tyrozinu 701 má souvislost
s průběhem onemocnění u pacientů s maligním melanomem
Abstrakt
STAT1, člen rodiny přenašečů signálů a transkripčních aktivátorů, je klíčovým
downstream mediátorem interferonové (IFN) signalizace. Jeho funkční aktivace vyţaduje
fosforylaci na zbytcích Tyr 701 a Ser 727. V nádorových buňkách byly nalezeny nejrůznější
abnormality STAT, ale jejich vztah k onkogenezi, chování nádoru a výsledku nemoci zůstává
převáţně nejasný. Studovali jsme inducibilitu fosforylace STAT1 interferony α/γ
v primárních kulturách odvozených z melanomových metastáz v mízních uzlinách při první
progresi, a korelovali jsme naše výsledky s průběhem onemocnění a celkovou dobou přeţití.
Do studie vstoupilo 44 pacientů v klinických stádiích I-III při počáteční diagnóze. Inducibilita
fosforylace STAT1 interferony byla zhodnocena v lyzátech melanomových buněk pomocí
standardní imunoprecipitace a westernového přenosu s pouţitím polyklonálních
a monoklonálních protilátek. Chybějící fosforylace Ser 727 po účinku obou interferonů byla
zjištěna u 75 % pacientů, ale nemohla být prokázána jakákoliv korelace s vývojem choroby.
Oproti tomu fosforylační odpověď Tyr 701 po působení IFNα se objevila u 13 (29.5 %) a po
působení IFNγ u 32 (73 %) pacientů. Inducibilita aktivace STAT1 na Tyr 701, ale ne
na Ser 727, navozená IFNγ, ale ne IFNα, výrazně a nepříznivě ovlivňovala délku období bez
projevu onemocnění (disease-free interval) a celkovou dobu přeţití. V souhrnu tyto výsledky
ukazují, ţe absence IFNγ inducibility fosforylace STAT1 na Tyr 701 pozitivně koreluje
s průběhem nemoci u pacientů s maligním melanomem, a můţe představovat nový nezávislý
prognostický marker.
1. Úvod
Přenašeče signálu a aktivátory transkripce (STAT) jsou multigenní rodina latentních
cytoplazmatických proteinů, které fungují jako důleţité downstream mediátory mnoha
extracelulárních signálních molekul, jako jsou cytokiny, růstové faktory, hormony
a onkoproteiny (Bowman et al., 2000; Horvath, 2000). Je dobře popsáno, ţe různí členové
STATů jsou kriticky důleţití pro udrţování buněčné homeostáze. Sedm doposud známých
členů proteinů STAT bylo strukturálně charakterizováno a byla určena funkce různých domén
a oblastí, které se účastní procesů signálně indukované aktivace, transdukce a vazby na DNA
(Decker and Kovarik, 1999; Levy and Darnell, 2002). Základní děje na molekulární úrovni,
93
které následují po interakcích ligand-receptor, zahrnují fosforylaci tyrozinů na receptorech
pomocí receptor-asociovaných Janusových tyrozinkináz (JAKs), čímţ se vytvářejí
receptorová vazebná místa pro vazbu cytoplazmatických proteinů STAT. Po asociaci
s fosforylovaným receptorem jsou STATy aktivovány fosforylací konzervovaných
tyrozinových zbytků, a homodimerizují nebo heterodimerizují skrze SH2 doménové
fosfotyrozinové interakce. Aktivované STATy se translokují do jádra, kde se váţou na
rozpoznávací sekvence v promotorech specifických buněčných genů a modulují jejich
transkripci (Darnell, 1997; Yeh and Pellegrini, 1999; Levy and Darnell, 2002). Nedávné
výzkumy mechanismů regulujících STAT-mediované transkripční schopnosti odhalily, ţe
fosforylace STATů na konzervovaných serinových zbytcích rovněţ aktivně působí
v signalizačních drahách, čímţ se zvyšuje transkripční potenciál zprostředkovaný
aktivovanými STATy a zřejmě působí jako defosforylační signál (Decker and Kovarik, 1999;
Horvath, 2000; Kovarik et al., 2001; Levy and Darnell, 2002). Molekulární stav a aktivita
STATů jsou kontrolovány skrze své interakce s celou řadou cytoplazmatických a jaderných
proteinů včetně řady transkripčních faktorů, a skrze vzájemnou komunikaci STATů (Decker
and Kovarik, 1999; Levy and Darnell, 2002). Ačkoliv mezi jednotlivými členy STAT existuje
blízká homologie, liší se ve své odpovědi k jednotlivým dominantním ligandům a následně se
liší svými downstream skupinami cílových genů, které jsou transkribovány. Obecně řečeno
STAT1 a STAT2 v principu zprostředkovávají in vivo odpověď na interferony (IFNs), STAT3
je hlavním cílem pro IL-6, STAT4 a STAT6 jsou dominantními mediátory diferenciace
Th-buněk kontrolované IL-12 a IL-4, zatímco STAT5 v podobě dvou izoforem je
nepostradatelný pro růstové hormony a prolaktin (Levy, 1999). Nicméně mezi odpověďmi
jednotlivých STATů jak na dominantní ligandy, tak také na další ligandy, existují časté
překryvy. Jakoţto mediátory širokého spektra externích podnětů a modulátory genové exprese
hrají STATy důleţitou roli v regulaci buněčného cyklu, proliferace, diferenciace, stárnutí a
apoptózy. Poruchy proteinů STAT byly popsány při několika lidských patologických stavech,
včetně imunitních či vývojových poruch a u rakoviny.
Down-regulovaná exprese a/nebo konstitutivní uvolňování STAT proteinů a jejich
nesprávná aktivace jsou nejčastěji se vyskytující odchylky pozorované u mnoha lidských
malignit (Bowman and Jove, 1999; Frank, 1999; Bowman et al., 2000; Pansky et al., 2000).
Zprávy ohledně onkogenní aktivity trvale aktivovaných STAT3 (Bromberg et al., 1999) spolu
s abnormalitami aktivace STAT pozorovanými v některých maligních buňkách (Wong et al.,
1997; Pansky et al., 2000; Kovarik et al., 2003) podporují tvrzení, ţe deregulace STAT je
94
zapojena v biologii nádorů a její reaktivity na terapii zaloţené na cytokinech (Calo et al.,
2003). Pokud víme, je jen málo známo o tom, zda deregulace STAT asociované s rakovinou,
jeţ byly popsány v in vitro modelových systémech, fungují rovněţ in vivo, a zda některé
z nich mohou mít spojitost s biologickým chováním nádorů a průběhem onemocnění.
Studovali jsme inducibilitu fosforylace STAT1 v primárních kulturách melanomových
buněk odvozených z lokálních metastáz lymfatických uzlin. Tyto kultury byly in vitro
vystaveny IFN-α respektive IFN-γ, a korelovali jsme zjištěné abnormality s průběhem
onemocnění a celkovou dobou přeţití u 44 melanomových pacientů. Naše výsledky odhalily
významnou pozitivní korelaci mezi nedostatečnou inducibilitou fosforylace STAT1
na Tyr 701 interferonem gama, a průběhem onemocnění. Protoţe jsme předešli moţnému
ovlivnění výsledků vyloučením vlivu známých rizikových faktorů, soudíme, ţe absence IFN-γ
inducibility fosforylace STAT1 na Tyr 701 u melanomových buněk můţe představovat nový
nezávislý pozitivní prognostický marker pro pacienty s melanomem. Tento prognostický vliv
byl ověřen multivariabilními Cox regresními modely, které braly za základní body jak
celkovou dobu přeţití, tak raný vývoj onemocnění.
2. Materiál a metody
2.1.Pacienti.
Do studie vstoupilo 44 pacientů s maligním melanomem v klinických stadiích I-III
(klasifikace UICC TNM, 5. vydání, 1997) bez uzlinových metastáz v době stanovení
počáteční diagnózy, s mediánem věku 56 let. Základní charakteristika vzorku je uvedena
v Tabulce 2. Medián doby sledování činil 61 měsíců. Při první progresi choroby, většinou do
lokálních lymfatických uzlin, byly metastázy chirurgicky odstraněny a pacienti byli dále
léčeni podle standardních protokolů. Byly vytvořeny primární kultury z metastatických
mízních uzlin kaţdého pacienta, a byly zkoumány z hlediska inducibility fosforylace STAT1
na tyrozinových (Y701) a serinových (S727) zbytcích, po ovlivnění melanomových buněk
interferonem gama (IFN-γ) resp. interferonem alfa (IFN-α). Fosforylační odpověď STAT1
byla korelována s následujícími proměnnými: časový interval od počáteční diagnózy k první
progresi onemocnění (EFS1), doba přeţití bez nemoci (disease-free interval) od data první
progrese po datum následného relapsu (EFS2), doba přeţití od data první progrese do data
smrti (Sp), celková doba přeţití od prvotní diagnózy aţ do data poslední kontroly respektive
data úmrtí (OS).
95
Tabulka 2: Základní charakteristika vzorků a vývoj onemocnění
Parametry Hodnoty
Pacienti
N 44
Pohlaví (muţi) 63.6 %
Věk v době diagnózy (roky)1 56 (36; 76)
Follow-up (měsíce)1 61 (24; 114)
Primární nádor – lokalizace
Trup, hlava, krk 59.1 %
Jiné 40.9 %
Primární nádor – Breslow
Souhrnné statistiky1 2.4 (1.0; 9.4)
Kategorie: Breslow < 1.0 11.7 %
Kategorie: Breslow > 3.0 35.3 %
Primární nádor – Clark
Kategorie: Clark ≤ III 35.7 %
Kategorie: Clark > III 64.3 %
První progrese onemocnění
Interval bez událostí (EFS1 v měsících)2 21 (4; 44)
Vzdálené metastázy v játrech, mozku nebo v plících N=21 (47.7 %)
Přeţití po první progresi onemocnění
Interval bez událostí (EFS2 v měsících)2 3 (1; 7)
Přeţití po první progresi (Sp v měsících)2 18 (8; 35)
Celková doba přeţití (OS v měsících)2 55 (20;125)
1Souhrnné statistiky: odhad mediánu spolu s 10% a 90% percentilem (v závorkách).
2Medián doby přeţití odhadovaný na základě Kaplan-Meierovy analýzy, spolu
s 25% a 75% percentilem (v závorkách).
2.2. Melanomové buněčné kultury.
Melanomové buňky byly odvozeny z biopsie mízní uzliny masivně infiltrované
metastatickými melanomovými buňkami. Bioptický materiál byl rozřezán na malé kousky,
jemně pomlet a opakovaným pipetováním byla získána jednobuněčná suspenze. Buňky
ze 44 vzorků byly pěstovány v médiu DMEM s L-glutaminem (PAN Biotech GmbH,
96
Německo) s přídavkem 10% FBS (PAN Biotech, GmbH, Německo), inzulínu (5 ng/ml) a
antibiotik. Pro ověření povahy rostoucích buněk před aktivačními experimenty byly buňky
rostoucí na destičkách fixovány a imunobarveny s pouţitím monoklonálních protilátek
(NCL-L-MelanA, Novocastra; NCL-L-Tyrosinase, Novocastra; HMB 45, BioGenex), které
jsou povaţovány za fenotypové markery melanomů. Pouze kultury vykazující pozitivitu
k nejméně jednomu imunoreagentu u více neţ 80 % buněk byly pouţity pro studii. Primární
kultury byly udrţovány in vitro maximálně čtyři týdny.
2.3. Reagencie a protilátky.
Rekombinantní lidské IFN-α a IFN-γ byly zakoupeny od Sigma (USA). Pro detekci
proteinu STAT1 a jeho fosforylovaných forem jsme vyvinuli polyklonální antisérum proti
C-terminální doméně STAT1 (S1C) a monoklonální protilátky rozpoznávající protein STAT1
(SM1) a jeho S727 fosforylovanou formu (pSM1). Pro analýzu IFN-indukované aktivace
STAT1 byla pouţita polyklonální protilátka anti-pY 701 STAT1 (Sigma, USA).
2.4. Analýza fosforylace STAT1.
Metodika byla jiţ dříve popsána (Boudny et al., 2003; Kovarik et al., 2003). Stručně
řečeno, IFN-γ byl pouţit při koncentraci 10 ng/ml a IFN-α při koncentracích 1000 IU/ml a
5000 IU/ml. Buňky byly s interferony inkubovány 30 minut při 37 °C. Kontrolní vzorky
nebyly ovlivněny IFN. Indukce fosforylace STAT1 na Y701 a S727 byla hodnocena
v buněčných lyzátech pomocí westernových blotů (Tabulka 1).
2.5. Buněčné lyzáty, imunoprecipitace a westernový přenos.
Buněčná lyze, imunoprecipitace a westernový přenos byly prováděny dle standardní dříve
popsané metodiky (Boudny et al., 2003; Kovarik et al., 2003). Buňky byly lyzovány 5 minut
na ledu ve Frackletonově pufru. Koncentrace proteinů byla stanovena Bradfordovou zkouškou
(Bio-Rad, Německo). Pro imunoprecipitaci byly pouţity polyklonální protilátka S1C a protein
A-Sepharose kuličky (Amersham Pharmacia Biotech, Švédsko). Pro westernový přenos byly
pouţity protilátky SM1, pSM1 a anti-pY 701.
2.6. Statistické analýzy.
Všechny statistické analýzy byly prováděny dle principu „záměr léčit“
(intention-to-treat), ţádný případ nebyl z analýz předem vyloučen a všechny případy úmrtí
97
či selhání byly zaznamenány jako plně ekvivalentní. Hodnota α<0.05 byla brána jako
univerzální limit statistické významnosti ve všech jedno- a vícerozměrných analýzách.
Ačkoliv studie zkoumala maximum dosaţitelných případů v běţném klinickém získávání
pacientů, můţe být omezena velikostí vzorků. Proto jsou jmenovitě výsledky
multiproměnných analýz prezentovány jako pilotní odhady, které budou vyţadovat další
potvrzení nezávislými studiemi. Byly pouţity standardní popisné statistiky pro vyjádření
rozdílů mezi podskupinami případů (průměr je poskytován s 95% intervaly spolehlivosti nebo
s relativními četnostmi). Standardní jednorozměrné statistické techniky byly vyuţity
k testování rozdílů mezi vybranými podskupinami pacientů: Fisherův přesný test u binárních
proměnných, ML chi square test pro ordinální kategorické proměnné, nepárový Studentův
t-test pro normálně rozloţené kontinuální proměnné a Man-Whitney test pro ne-normálně
rozloţené kontinuální proměnné. Vrstvená Kaplan-Meierova product-limit metoda byla
pouţita pro rozlišení úrovně přeţití mezi dvěma či více podskupinami. Standardní zobecněný
Peto-Prenticeův pořaďový test byl pouţit jako srovnávací statistický test. Jak jednorozměrné,
tak vícerozměrné analytické strategie byly pouţity pro kvantifikaci prediktivní síly
zkoumaných proměnných vzhledem k pre-definovaným cílovým bodům: celkové době přeţití
a přeţití bez choroby k první progresi. Veškeré potenciální prediktory byly kódovány jako
binární faktory podle jejich rizikových hodnot a následně zpracovány v jednorozměrných
a vícerozměrných Cox regresních modelech. Kroková vícerozměrná Cox proporční analýza
rizika byla pouţita jako finální model identifikující významné prediktory přeţití bez choroby
nebo celkové doby přeţití. Poměr rizika byl odhadnut s příslušnými 95% intervaly
spolehlivosti a podporován hladinou významnosti. Závěrečná sada nezávislých
prognostických faktorů byla identifikována zpětným krokovým selekčním algoritmem.
3. Výsledky
Tabulka 1 shrnuje výsledky aktivace STAT1 ve vzorcích ovlivněných a neovlivněných
interferony od 44 pacientů. Intenzita signálů byla srovnána s referenčními signály kontrol
přítomných na téţe membráně. Základní statistický popis vyšetřovaného vzorku včetně
obvyklých následných charakteristik vývoje choroby je ilustrován v Tabulce 2. Doba
sledování (medián 61 měsíců) byla dostatečně dlouhá pro vrstvenou analýzu přeţití a všechny
zkoumané koncové body přeţití dosáhly úrovně mediánu. Byla definována čtyři hlavní
kritéria přeţití, aby bylo moţno zmapovat jednotlivé fáze vývoje nemoci, tj. čas od primární
diagnózy po první progresi a následné fáze přeţití bez choroby nebo přeţití. Celková doba
98
přeţití (OS) pokryla všechny tyto fáze a můţe být povaţována za hlavní integrující bod
studie.
Vrstvené analýzy přeţití provedené standardní Kaplan-Meierovou metodou jsou uvedeny
v Tabulce 3. Zjistili jsme, ţe EFS1 coby raný indikátor rizika vývoje stejně jako OS významně
koincidují s většinou rizikových faktorů, coţ je v souladu s daty uvedenými jinde. Naproti
tomu detailní analýzy zaměřené na vývoj choroby po první progresy nevykázaly ţádné
významné asociace.
Intervaly bez choroby a přeţití po první progresi se jevily jako nepředvídatelné na základě
zkoumaných faktorů a jsou uvedeny v Tabulce 3. Věk, lokalita primárního nádoru a Breslow
skóre byly rozpoznány coby potenciální rizikové faktory pro EFS1 i pro OS, coţ je ve shodě
se známými daty a se známými melanomovými prognostickými indexy. Dále pak rizikový
raný rozvoj onemocnění (vzdálené metastázy do ţivotně důleţitých orgánů, první progrese do
12 měsíců od diagnózy) výrazně přispíval k rizikové zátěţi a negativně ovlivnil celkovou
dobu přeţití.
Tabulka 4: Inducibilita fosforylace STAT1 na tyrozinu (Tyr 701) a serinu (Ser 727) po
působení interferony (IFN-α a IFN-γ)
Fosforylace
STAT1
Pacienti
s odpovědí
(inducibilní)
Pacienti bez odpovědi
(neinducibilní)
Celkový rozdíl
v inducibilitě po IFNα
nebo IFNγ1
Tyr 701
IFNα 29.5% (n = 13) 71.5% (n = 31) p = 0.013
IFNγ 72.7% (n = 32) 27.3% (n = 12) (IFNα < IFNγ)
Ser 727
IFNα 25.0% (n = 11) 75.0% (n = 33) p = 0.819
IFNγ 20.5% (n = 9) 79.5% (n = 35) (IFNα = IFNγ)
Binomický test srovnávající inducibilitu (responzivitu) k IFNα a IFNγ, coby kvantitativní test
odlišnosti mezi těmito dvěma variantami.
Pro zhodnocení interferonové inducibility fosforylace STAT1 na Tyr 701 a Ser 727
jakoţto potenciálních prediktorů vývoje choroby byla stanovena aktivační odpověď ve
vzorcích pacientů a vztaţena k výsledku onemocnění u jednotlivých pacientů (Tabulky 4 a 5).
Četnost fosforylace STAT1 na Ser 727 byla víceméně stejná u IFN-α i IFN-γ
99
(11 vs. 9 inducibilních případů) a oba STAT1 aktivující signály vykazovaly dominantní podíl
non-responderů (33 vs. 35 případů). Na druhé straně byly zjištěny významné odlišnosti mezi
IFN-α a IFN-γ indukcí fosforylace STAT1 na Tyr 701 (13 vs. 32 inducibilních případů – viz
Tabulka 4). IFN-γ tak poskytoval významně zvýšený podíl inducibilních responderů (73 %),
coţ koresponduje se studiemi, které popisují IFN-γ jako hlavní aktivátor STAT1
(Ramana et al, 2000).
Tabulka 5: Sledované doby přeţití rozdělené podle IFN inducibility fosforylace STAT1
Sledované parametry Sledované doby přeţití
1
EFS1 EFS2 Sp OS
Medián doby přeţití a statistické testy
Aktivace IFNα
na Tyr 701
inducibilní 21 6 14 32
neinducibilní 25 3 15 44
Statistická významnost p = 0.487 p = 0.157 p = 0.669 p = 0.446
na Ser 727
inducibilní 21 3 14 46
neinducibilní 22 3 16 39
Statistická významnost p = 0.456 p = 0.959 p = 0.663 p = 0.696
Aktivace IFNγ
na Tyr 701
inducibilní 16 3 12 25
neinducibilní 45 4 27 80
Statistická významnost p = 0.018 p = 0.904 p = 0.112 p = 0.027
na Ser 727
inducibilní 18 2 18 26
neinducibilní 24 3 14 44
Statistická významnost p = 0.449 p = 0.429 p = 0.805 p = 0.876
1 Sledované doby přeţití (v měsících) odhadované na základě Kaplan-Meierovy analýzy
(medián doby přeţití). Statistické srovnání dvou vrstev: log-rank test.
100
Tabulka 1: Fosforylace STAT1 v primárních buněčných kulturách odvozených
z maligního melanomu, ovlivněných a neovlivněných IFN-α/-γ.
Pacienti s maligním
melanomem (n=44)
Inducibilita
PS 727 STAT 1 PY 701 STAT 1
IFN α IFN γ Neovlivněné b. IFN α IFN γ Neovlivněné b.
1 I I + I I +
2 I I + I I +
3 I N + I I +
4 I N + I I +
5 I N - I I -
6 N N - N N +
7 N N + N N +
8 N N + N N +
9 N N + N N +
10 N N + N N +
11 N N + N N +
12 N N + N N +
13 N N + N N +
14 N N + I I +
15 N N + I I -
16 N N + I I -
17 N N + I I -
18 ND ND ND I I -
19 I I + N N +
20 I I + N N -
21 N N + N I -
22 N N + N I +
23 N N + N I +
24 N N + N I +
25 N N + N I -
26 N N + N I +
27 N N + N I +
28 N N + N I -
29 N N + N I -
30 N N + N I -
31 N N - N I -
32 N N - N I -
33 N N + N I -
34 N N + N I -
35 N N + N I -
36 ND ND ND N I -
37 I N + N I +
38 N I - N I +
39 N I + N I -
40 N I + I I +
41 N N + I N +
42 I I - N I +
43 I I - N I -
44 I N + N N +
Procento pacientů bez
odpovědi 73.80% 78.60% 72.70% 27.30%
I – inducibilní, N – neinducibilní, ND – nedetekovatelné.
Neovlivněné buňky: + pozitivní signál, - negativní signál.
101
Analýzy a statistické zhodnocení vztahu mezi inducibilitou aktivace STAT1
v melanomových buňkách některým z interferonů a vybranými fázemi vývoje onemocnění
odhalily nejdůleţitější a zřejmě dosud nerozpoznaný výsledek studie (Tabulka 5). Inducibilita
aktivace STAT1 na Tyr 701, ale ne na Ser 727, řízená IFN-γ, ale ne IFN-α, významně
ovlivnila raný vývoj onemocnění a také celkovou dobu přeţití. Skupina pacientů, jejichţ
maligní buňky postrádaly IFN-γ inducibilitu fosforylace STAT1 na Tyr 701, měla lepší
prognózu vzhledem k intervalům bez onemocnění a celkovým intervalům přeţití ve srovnání
se skupinou responderů.
Protoţe se inducibilita aktivace STAT1 na Tyr 701 řízená IFN-γ jevila být významným
prediktorem kratší doby přeţití, museli jsme ověřit její (ne)závislost na dalších známých
rizikových faktorech. Asociační analýzy (Tabulka 6) prokázaly, ţe IFNγ-indukovaná aktivace
STAT1 na Tyr 701 můţe být povaţována za nezávislou na téměř všech rizikových faktorech,
s výjimkou pohlaví a Clark kategorií. Vyšší podíl aktivačních responderů mezi pacientkami
však můţe stěţí vysvětlit prognostický potenciál aktivace STAT1, protoţe samo pohlaví má
velmi omezený vliv na vývoj onemocnění.
Potenciální příspěvek inducibility fosforylace STAT1 k predikci vývoje onemocnění byl
rovněţ potvrzen jednorozměrnými a mnohorozměrnými „time-to-event“ regresními modely,
které vyloučily potenciální ovlivnění výsledku v důsledku maskovacího vlivu jiných
rizikových faktorů. Všechny potenciální rizikové faktory nejprve vstoupily do
jednorozměrných Cox regresních modelů. Analýzy v Tabulce 7 potvrdily dříve rozpoznané
vzorce, jmenovitě významně zvýšené relativní riziko v případech inducibilního STAT1 na
Tyr 701 pomocí IFN-γ, a obdobné chování rizikových kategorií věku, Breslow skóre a
lokalizace primárního tumoru. Rizikové parametry popisující raný vývoj onemocnění
(vzdálené metastázy v čase první progrese a první progrese v intervalu max. jednoho roku)
velmi významně ovlivnily profil celkové doby přeţití.
102
Tabulka 6: Inducibilita fosforylace STAT1 na tyrozinu (Tyr 701) ve spojitosti s dalšími
rizikovými faktory
Rizikové faktory a jejich
kategorie
Inducibilita (v %
případů) Statistický test
1
Věk v době diagnózy
≥ 50 let 72.2 P = 0.996
< 50 let 73.1
Pohlaví
Muţi 43.8 P = 0.004
Ţeny 89.3
Primární nádor – lokalizace
Trup, hlava, krk 61.1 P = 0.183
Jiné 80.7
Clark
Clark ≤ III 70.0 P = 0.956
Clark > III 66.7
Breslow
Breslow ≥ 3.0 69.6 P = 0.740
Breslow < 3.0 76.2
1. progrese
Vzdálené metastázy v játrech,
mozku nebo v plicích 64.3 P = 0.261
Bez metastáz v játrech, mozku
nebo v plicích 87.5
1. progrese
ESF1 ≤ 12 měsíců 71.4 P = 0.998
ESF1 > 12 měsíců 76.9
1 Test asociace odpovědi na IFNγ a příslušného rizikového faktoru (Fisherův exaktní test)
103
Tabulka 7: Prediktivní hodnota potenciálních rizikových parametrů v Coxových jedno-
proměnných regresních modelech1.
Parametry2
Doby přeţití
Celková doba přeţití (OS) Interval bez událostí do 1. progrese
(EFS1)
Relativní risk (95% CI) p
hodnota
Relativní risk (95% CI) p hodnota
Základní charakteristika pacientů a onemocnění
Věk ≥ 50 let 2.39 (1.22; 4.71) 0.029 2.08 (1.08; 4.00) 0.027
Muţi 1.97 (0.81; 4.79) 0.118 1.82 (0.92; 3.51) 0.105
Breslow ≥ 3.0 1.34 (1.02; 1.79) 0.042 2.04 (1.02; 4.09) 0.039
Clark > III 0.88 (0.35; 2.22) 0.789 0.86 (0.43; 1.75) 0.698
Primární nádor – 2.27 (1.14; 4.51) 0.039 1.51 (1.02; 2.23) 0.048
trup, hlava, krk
Aktivace STAT 1 IFNα/γ na Tyr 701 nebo Ser 727: inducibilní případy
IFNα na Tyr 701 0.64 (0.28; 1.46) 0.299 0.69 (0.36; 1.36) 0.295
IFNα na Ser 727 0.89 (0.37; 2.15) 0.798 0.69 (0.33; 1.42) 0.294
IFNγ na Tyr 701 2.77 (1.15; 6.70) 0.029 2.38 (1.32; 4.92) 0.013
IFNγ na Ser 727 1.18 (0.44; 3.20) 0.742 1.52 (0.72; 3.24) 0.291
Průběh nemoci
1. progrese + vzdálené metastázy v játrech, mozku nebo v plících
2.83 (1.23; 6.52) 0.011
Doba do 1. progrese: ESF1 ≤ 12 měsíců
10.31 (3.51; 30.29) < 0.001
1OS a ESF1 byly vybrány jako doby doţití, které se jeví být významně asociovány
s několika rizikovými faktory. 2Všechny parametry byly kódovány jako binární faktory podle
specifických hodnot rizika. ESF1 - doba přeţití bez události, vypočtená od data diagnózy do
první progrese.
104
Všechny potenciální prediktory, které vstoupily do vícerozměrných Cox regresních
modelů, jsou spolu s výsledky shrnuty v Tabulce 8. Podle očekávání plynoucího z Tabulky 7
zaujímal EFS1 do 12 měsíců nejvýznamnější pozici mezi nezávislými prediktory rizika pro
OS. Jako významní přispivatelé k celkové prognóze rizika byly rovněţ zjištěny projev
vzdálených metastáz, věk nad 50 let a inducibilita IFN-γ na Tyr 701. Ačkoliv vzorek byl
velikostně omezen, objektivní mnohorozměrné analýzy naznačily potenciální roli IFN-γ
v inducibilitě Tyr 701 jako nezávislý prediktor dlouhodobého přeţití a raného rizikového
vývoje choroby měřených dobou přeţití „bez událostí“ do první progrese (EFS1) (Tabulka 8).
Tabulka 8: Výsledy Coxova více proměnného stepwise regresního modelování1.
Koeficient
(SE)
Model log-
likelihood
Log-likelihood
ratio test
Relativní
risk2
Model pro celkovou dobu přeţití (OS)
Null model -81.5
Krok 1. ESF1 (≤ 12 měsíců) 1.917 (0.434) -71.6 0.019 6.80
Krok 2. + meta 1.322 (0.312) -65.7 0.003 3.75
Krok 3. + věk (≥ 50 let) 0.912 (0.309) -63.8 0.001 2.49
Krok 4. + ind. IFNγ na Tyr 0.813 (0.337) -60.3 < 0.001 2.25
Model pro čas do 1. progrese (ESF1)
Null model -125.7
Krok 1. + věk (≥ 50 let) 0.751 (0.289) -120.1 0.036 2.12
Krok 2. + ind. IFNγ na Tyr 0.885 (0.277) -115.2 0.004 2.42
1Více proměnná stepwise procedura byla řízena pouze statistickými mírami
(funkce log-likelihood). 2Relativní rizika asociovaná s jednotlivými proměnnými vstupovala
do více proměnných modelů jako nezávislé prediktory. ESF1 - doba přeţití bez události,
vypočtená od data diagnózy do první progrese. Meta – vzdálené metastázy v játrech, plicích
nebo mozku v době 1. progrese. Ind. IFNγ na Tyr – IFNγ inducibilita fosforylace STAT1
na Tyr 701.
105
Tabulka 3: Sledované doby přeţití rozdělené podle potenciálně významných rizikových
faktorů
Parametry Sledované doby přeţití
EFS1 EFS2 Sp OS
Medián doby přeţití a statistické testy
Věk v době diagnózy
≥ 50 let 18 3.5 14 34
< 50 let 48 2.5 18 63
Statistická významnost p = 0.035 p = 0.572 p = 0.368 p = 0.029
Pohlaví
Muţi 20 3 15 38
Ţeny 28 4 16 55
Statistická významnost p = 0.146 p = 0.980 p = 0.948 p = 0.311
Primární nádor – lokalizace
Trup, hlava, krk 15 2 14 27
Jiné 30 4 16 48
Statistická významnost p = 0.046 p = 0.588 p = 0.239 p = 0.038
Clark
Clark ≤ III 25 7 15 41
Clark > III 27 3 18 53
Statistická významnost p = 0.918 p = 0.299 p = 0.685 p = 0.597
Breslow
Breslow ≥ 3.0 16 2 12 24
Breslow < 3.0 31 4 17 44
Statistická významnost p = 0.046 p = 0.592 p = 0.077 p = 0.039
1. progrese
Vzdálené metastázy v játrech,
mozku nebo v plících
20 1 13 32
Bez metastáz v játrech, mozku
nebo v plících
23 6 20 44
Statistická významnost p = 0.448 p = 0.029 p = 0.047 p = 0.033
1. progrese
ESF1 ≤ 12 měsíců - 2 11 14
ESF1 > 12 měsíců - 4 18 58
Statistická významnost - p = 0.337 p = 0.043 p = 0.019
1Sledované doby přeţití odhadované na základě Kaplan-Meierovy analýzy (medián doby
přeţití). Statistické srovnání dvou vrstev: log-rank test. ESF1 - doba přeţití bez události,
spočtená jako doba od primární diagnózy (a chirurgického vyjmutí nádoru) do první progrese
106
onemocnění; parametr vztaţen k primární terapii nádorů (všechny případy sledované ve studii
prošly prvním relapsem nebo progresí primární choroby).
ESF2 - doba přeţití bez události, spočtená jako doba od první progrese onemocnění do data
následné rizikové události (přeţivší bez rizikové události byli vyškrtnuti v době posledního
kontrolního sledování – follow-up). Sp - průměrná doba přeţití po první progresi onemocnění,
spočtená od data první progrese do data úmrtí (přeţivší byli vyškrtnuti v době posledního
kontrolního sledování). OS - celková doba přeţití, spočtená od data diagnózy do data úmrtí
(přeţivší byli vyškrtnuti v době posledního kontrolního sledování).
Obrázek 1 jasně demonstruje, ţe aktivační odpověď STAT1 na Tyr 701 po ovlivnění
IFN-γ významně sniţuje medián ESF1 a OS.
Obrázek 1: Kaplan-Meierova analýza sledovaných dob přeţití rozdělených podle IFN-γ
inducibility fosforylace STAT1 na Tyr 701 (Log-rank test).
107
DISKUZE
Léčba interferonem alfa můţe negativně ovlivnit progresi onemocnění
u pacientů s melanomem prostřednictvím hyperaktivace proteinu STAT3
Aktivovaný STAT3 je povaţován za onkogen, který vykazuje vlastnosti podporující růst
a anti-apoptotické vlastnosti (Darnell, 2005). V této studii jsme analyzovali expresi a aktivaci
STAT3 závislou na interferonech v krátkodobých melanomových buněčných kulturách, které
byly vytvořeny z metastáz lymfatických uzlin. Věříme, ţe tyto primární kultury lépe odráţejí
situaci in vivo ve srovnání se zavedenými buněčnými liniemi. Buněčné linie vskutku
pozoruhodně homogenně vykazovaly markery charakteristické pro melanomové linie.
Western blotové analýzy prokázaly konstitutivní expresi STAT3 proteinu ve všech vzorcích,
coţ je konzistentní s poţadavkem přítomnosti této molekuly pro přeţití nádorových buněk
v kultuře. Krátkodobá stimulace oběma typy interferonů vede k variabilnímu zvýšení úrovní
STAT3 fosfoforem. Všechny čtyři kultury (17 %), které vykazovaly silnou STAT3 indukci
pomocí IFN-α byly odvozeny z pacientů s krátkým intervalem bez nemoci a slabým přeţitím
(STAT3-pY705 inducibilní kohorta pacientů). Je moţné, ţe v těchto případech STAT3
protein transaktivuje geny podporující růst a/nebo anti-apoptotické geny, coţ vede
k agresivnějšímu nádorovému fenotypu. Toto je podpořeno prokázaným faktem, ţe onkogeny
c-myc a JunB obsahují ve svých promotorech STAT3-vazebná místa (Kiuchi et al., 1999).
Ačkoli IFN-α indukoval variabilní retardaci růstu (10-40%) ve všech buněčných kulturách,
nepozorovali jsme významnou korelaci mezi rezistencí k IFN-α a STAT3 fosforylací.
Například obě relativně citlivé linie (LM48/2 a KJ101) se lišily ve schopnosti aktivovat
STAT3-pY interferonem alfa (Tabulka S1). To můţe být důsledkem absence přídatných
agens podporujících růst v buněčném médiu, pokročilé buněčné senescence v dalších pasáţích
a snad i dalších neznámých faktorů. Inducibilita STAT3 pomocí IFN-γ byla častější ve
srovnání s IFN-α, a zdá se, ţe je tu trend směrem k lepší prognóze u inducibilních případů;
korelace s vývojem choroby ale nevykazovala statistickou významnost.
Několik studií popsalo poruchy STAT1 signalizace v melanomech, ačkoliv korelace
s citlivostí vůči interferonům byly často protichůdné (Pansky et al., 2000; Boudny et al., 2003;
Jackson et al., 2003; Kovarik et al., 2003; Kortylewski et al., 2004; Lesinski et al., 2005).
V našich experimentech docházelo ke zvýšení fosforylace STAT1 po nasazení IFN-α
s podobnou frekvencí (17 %) jako u STAT3. Frekvence aktivace STAT1 je o něco niţší
neţ frekvence dříve pozorované v imortalizovaných melanomových liniích (37 %)
108
(Kovarik et al., 2003), coţ můţe být vysvětleno selekcí klonů s „overresponzivním“
fenotypem. S výjimkou pacienta LM48/2 nebyl pozorován ţádný překryv inducibility STAT1
a STAT3 v kulturách, coţ naznačuje, ţe oba proteiny pouţívají odlišné regulační dráhy.
Bazální úrovně STAT3 byly inverzně korelovány s IFN-α-indukovaným STAT1-pY
v melanomových buněčných liniích (Lesinski et al., 2007). Na rozdíl od STAT3 nebyla
nalezena významná korelace mezi STAT1 respondery (k IFN-α) a klinickým stavem.
Regulační dráhy STAT3 v melanomových buňkách
Několik důkazů naznačuje, ţe u některých nádorů můţe aktivace STAT3 interferonem
alfa probíhat poněkud aberantně. Za prvé, interferony se, na rozdíl od interleukinu 10, nejeví
být silnými aktivátory STAT3 (Calo et al., 2003). Za druhé, vazba STAT3 na DNA
v melanomových liniích nebyla interferonem alfa stimulována (Carson, 1998). A konečně,
v myším modelovém systému byl STAT3 aktivován interferonem gama jen při absenci
funkčního STAT1 (Ramana et al., 2005). Selhání aktivace STAT3 můţe být vysvětleno
neefektivní expresí interferonového receptoru. Avšak všechny analyzované buněčné populace
vykazovaly expresi receptoru pro interferon alfa/beta na RNA i proteinové úrovni. Tyto
výsledky jsou částečně konzistentní s nedávnou imunohistochemickou studií, která prokázala
expresi receptoru v melanomových buňkách (Messina et al., 2008). Navíc se vyskytly
i případy alternativní indukce molekul STAT1 a STAT3 (LM58, RJ60, DM90
a VJ22). Dohromady se tedy zdá, ţe funkční defekty nebo variace v úrovních exprese IFNAR
se nedají úplně vyloučit, pravděpodobněji dochází k zapojení negativních regulačních drah
zahrnujících supresory cytokinové signalizace (SOCS) a proteinů, které inhibují aktivované
STATy (PIAS). V tomto kontextu většina melanomových buněčných linií, v kontrastu
k normálním melanocytům, nevykazovala aktivaci SOCS 3 po pouţití IFN-α, coţ naznačuje,
ţe SOCS 3 by mohl hrát roli (Kovarik et al., 2005). Na druhou stranu konstitutivně
exprimovaný SOCS 3 negativně koreluje s buněčnou senzitivitou k IFN-γ
(Fojtova et al., 2007; Komyod et al., 2007). Bude zajímavé v budoucnu zhodnotit integritu
negativních regulativních systémů JAK/STAT signalizace v nádorech a kulturách odvozených
z nádorů.
Moţné klinické implikace aktivace STAT3 pomocí interferonu alfa
Metastatické onemocnění se postupně vyvine u téměř 60 % pacientů s melanomy, kteří
obdrţí podpůrnou (adjuvantní) IFN-α terapii (Kirkwood et al., 1996). Navíc celková úroveň
odpovědi na IFN-α ve stadiu metastatického onemocnění činí jen 15-20%. Zdá se tedy, ţe
109
existuje jasná podskupina pacientů s melanomy, kteří na léčbu IFN-α odpoví příznivým
způsobem. Obdobná spekulace ohledně existence podskupin pacientů s melanomy, které
v klinické praxi reagují odlišně na IFN-α, byla jiţ vyslovena (Lens and Dawes, 2002). Naše
data naznačují, ţe taková podskupina můţe zahrnovat nádory, které nehyperaktivují STAT3
po léčbě IFN-α. A naopak metastatické onemocnění můţe být podpořeno u nádorů, které
vykazují silný STAT3 aktivační fenotyp. Významné je, ţe STAT3-inducibilní fenotyp byl
pozorován v primárních kulturách melanomových buněk získaných z jednotlivců, u nichţ
imunoterapie IFN-α selhala (Lesinski et al., 2007). Je rovněţ pozoruhodné, ţe aktivita STAT3
byla vyšší v metastatických melanomových buňkách v lidském mozku, ve srovnání
s primárními melanomovými vzorky (Xie et al., 2006). Zobecnění našich nálezů bude
vyţadovat budoucí potvrzení na větší sérii případů a dalších typech nádorů.
Vývoj rezistence k interferonu IFN-γ je v melanomových buňkách
asociován s atenuací indukce genů SOCS a konstitutivní expresí SOCS 3
Vývoj interferonové rezistence během pasáţí buněčných kultur
V této studii jsme izolovali a charakterizovali interferon-senzitivní a insenzitivní sub-linie
rodičovské melanomové linie. Vývoj cytokinové rezistence je známý komplexní fenomén
spojený s progresí z raných do pokročilých stadií maligních melanomů (Lu et al., 1993).
Můţe být výsledkem selekce jiţ existujících rezistentních buněk v primárním nádoru nebo
výsledkem změny drah přenosu signálu v důsledku genetických/epigenetických buněčných
změn. Naše data neumoţňují rozlišit tyto dvě moţnosti. Je zajímavé, ţe podobná změna
směrem k IFN-γ-rezistentnímu fenotypu byla jiţ dříve popsána u buněk cervikálního
karcinomu (Lee et al., 1999b), coţ naznačuje, ţe objevení se IFN-rezistentního fenotypu můţe
být obecný rys buněk, které podstoupily více dělení in vitro a snad i in vivo. Nicméně zatímco
v jejich pokusech byla změna senzitivity korelována se ztrátou exprese STAT1, v našem
systému byl STAT1 dále exprimován a fosforylován přinejmenším na tyrozinových zbytcích.
Je moţné, ţe existuje více alternativních drah ovlivňujících antiproliferativní potenciál IFN.
Expresní profily SOCS v melanomových buňkách
Je známo, ţe genové produkty SOCS jsou STAT-indukované negativní regulátory
fosforylace STATů. Vyuţili jsme dostupnosti senzitivních a insenzitivních derivátů linie WM
1158 ke studiu změn vzorců exprese SOCS. Tímto způsobem jsme sníţili variaci plynoucí
z odlišného rodičovského původu (stadium nádoru, histologický typ a individualita pacienta)
110
buněčných linií. Ze čtyř zkoumaných genů SOCS se SOCS 3 a SOCS 1 zdají být nejlepšími
respondery, zatímco SOCS 2 a SOCS 5 byly insenzitivní k působení IFN-γ. Absence indukce
SOCS 5 odpovídá současnému náhledu, ţe SOCS 5 není klasickým zpětnovazebným
regulátorem cytokinové signalizace (Fujimoto and Naka, 2003). Indukce transkriptů SOCS 3
se mezi sub-liniemi WM 1158 pozoruhodně lišila: zatímco senzitivní sub-linie vykazovala
v průměru 7,5násobnou indukci SOCS 3, u IFN-rezistentní varianty byl jen marginální nárůst
mnoţství transkriptu. U SOCS 1 byly rozdíly méně výrazné a indukce tohoto genu rovněţ
vykazovala vyšší úroveň variability. Kinetické experimenty ukázaly, ţe senzitivní sub-linie si
udrţovala zvýšené hladiny mRNA SOCS 1 a SOCS 3 po > 72 hodin po ovlivnění IFN-γ,
zatímco v rezistentní sub-linii WM 1158 byly oba transkripty rychle atenuovány (zeslabeny)
na bazální úroveň. Významné je, ţe trvání zvýšené exprese SOCS korelovalo s inhibicí růstu,
která byla nejvýraznější v intervalu 24 – 72 hodin. Tyto výsledky naznačily existenci rozdílů
v rozsahu a dynamice IFN-mediované aktivace SOCS 1 a SOCS 3 mezi senzitivní
a rezistentní sub-linií. Zajímavé je, ţe v dalších melanomových buněčných liniích byla
zjištěna dobrá korelace mezi konstitutivní expresí SOCS 3, chybějící inducibilitou SOCS 3
a rezistencí buněk k IFN. Silná upregulace SOCS 3 po ovlivnění IFN-γ by mohla být
specifickou vlastností melanomových linií, protoţe buňky epiteliální rakoviny prsu
vykazovaly jeho downregulaci (Evans et al., 2007) nebo variabilní expresi (Souckova,
nepublikovaná data). Nicméně v buňkách rakoviny prsu byl SOCS 1 silně aktivován, zatímco
v pouţitých melanomových liniích byla jeho indukce poměrně slabá. Je pravděpodobné, ţe
aktivační dráhy SOCS operují v různých buněčných a tkáňových typech odlišně.
Obecně byla buněčná senzitivita k interferonu lépe korelována s inducibilitou SOCS 3
neţ s inducibilitou SOCS 1. Vzniká tak otázka, jaká je moţná příčina odlišné aktivace těchto
genů. Byly dobře popsány epigenetické změny v průběhu prodlouţené kultivace buněk (Chow
a Rubin, 2000; Fojtova et al., 2003) a oba SOCS geny jsou inaktivovány metylací svých
promotorů (He et al., 2003). Nicméně tuto moţnost povaţujeme za nepravděpodobnou,
protoţe IFN-insenzitivní sub-linie WM 1158R exprimovala SOCS 3, coţ napovídá, ţe
promotor je transkripčně aktivní. Ačkoliv vysoce specifická metylace IFN-responzivního
elementu v promotoru nemůţe být úplně vyloučena, preferujeme hypotézu, ţe konstitutivní
exprese SOCS 3 můţe vyvaţovat trans aktivační signály doručované IFN-aktivovanými
STATy. Tuto hypotézu podporuje vysoká bazální exprese SOCS 3 ve třech
IFN-insenzitivních melanomových liniích WM 1158R, WM 9 a 1025 LU ve srovnání se
senzitivními buňkami. Dále pak i buňky rakoviny prsu (Evans et al., 2007) a leukemické
111
buňky (Sakai et al., 2002) vykazovaly zvýšenou konstitutivní expresi SOCS 1 a SOCS 3
a rezistenci k prozánětlivým cytokinům včetně IFN-γ. Je moţné, ţe IFN senzitivita promotoru
SOCS 3 sníţena v důsledku aberantní exprese aktivačních transkripčních faktorů. V tomto
kontextu byla pozorována aberantní aktivace tkáňově-specifických promotorů u rakoviny
(Kovarik et al., 1993).
Vztah mezi indukcí SOCS a fosforylací STAT1
Protoţe STAT1 je jedním z hlavních cílů fosforylace vyvolávané IFN-γ, zkoumali jsme
vztah mezi fosforylací STAT1 na zbytcích S727 a Y701 a indukcí SOCS. Naše
semikvantitativní RT-PCR nedokázala odhalit významné rozdíly v hladinách STAT1 (jak
konstitutivní tak indukované), coţ naznačuje, ţe mnoţství genových produktů nebylo
interferonem výrazně ovlivněno (Lesinski et al., 2005). Na úrovni modifikace proteinů
stimuloval IFN-γ fosforylaci zbytků Y701 v senzitivních i nesenzitivních buňkách, coţ je
konzistentní s předchozími studiemi, které vykazovaly nulovou nebo slabou korelaci mezi
fosforylací STAT1 na Y701 a senzitivitou buněk k cytokinovým stimulům
(Chawla-Sarkar et al., 2002; Kortylewski et al., 2004). Překvapivě se rozdíly v IFN senzitivitě
nejlépe odráţely na druhém nejčastěji fosforylovaném místě, tj. zbytku S727: zatímco
IFN-senzitivní buňky WM 1158S nevykazovaly výrazný nárůst fosforylace S727 po ovlivnění
IFN-γ, v insenzitivní sub-linii byla výrazná a prodlouţená fosforylace této aminokyseliny.
Zváţíme-li, ţe regulátor SOCS 3 byl silněji aktivován v IFN-senzitivní sub-linii, svádí to
ke spekulaci, ţe fosforylace zbytků S727 byla touto molekulou specificky blokována. V tomto
kontextu S727-fosforylovaný STAT1 poskytoval apoptotickou rezistenci pro buňky
Wilmsova tumoru (Timofeeva et al., 2006). Ačkoliv fosforylace na Y701 je dostačující pro
trans-aktivační schopnost molekuly STAT1 (Shuai et al., 1993), fosforylace na S727
se zdá být důleţitým modulátorem specifičnosti cílení v hemopoetických buňkách
(Kovarik et al., 2001). Je moţné, ţe vysoké hladiny fosforylace STAT1 na S727 aktivují
specifické geny účastnící se rezistence k IFN.
Srovnání normálních vs. maligních buněk
V normálních lidských melanocytech byl SOCS 3 silně indukován po ovlivnění IFN-γ,
zatímco jeho bazální hladiny byly nízké nebo zanedbatelné. Indukce byla dosti stabilní
a během 72-hodinového intervalu došlo jen k marginálnímu sníţení hladiny. V tomto aspektu
byly zjevné podobnosti mezi normálními buňkami a IFN-senzitivní melanomovou sub-linií
WM 1158. Nicméně melanocyty se od maligních buněk lišily tím, ţe neměly ţádnou nebo jen
112
nevýznamnou expresi SOCS 1. To je v souladu s jinou studií, která ukazovala nízké úrovně
SOCS 1 v melanocytech ve srovnání s melanomovými buněčnými liniemi (Li et al., 2004).
Nicméně v jejich studii se chybějící exprese SOCS 1 projevila na úrovni proteinů,
ale ne na úrovni RNA. Náš neúspěch při detekci SOCS 1 v melanocytech můţe být vysvětlen
odlišnostmi v citlivosti zkoušky RT-PCR (např. odlišným počtem cyklů) a snad i dalšími
faktory.
Závěry a další směry výzkumu
Lze shrnout, ţe prodlouţené udrţování melanomových buněk v buněčné kultuře můţe
vést ke sníţení jejich senzitivity k IFN-γ. Na molekulární úrovni je tento proces asociován se
zvýšenou konstitutivní expresí SOCS 3, jejíţ úrovně nejsou (nebo jsou jen marginálně)
ovlivňovány interferonovými signály. Naše data napovídají, ţe změny v expresi SOCS 3 jsou
svázány s progresí melanomových buněk z IFN-senzitivního na IFN-rezistentní fenotyp
a mohou způsobovat růstovou výhodu melanomu in vivo v jeho pokročilých stadiích.
V budoucnu bude zajímavé analyzovat expresi jednotlivých SOCS v klinických vzorcích
a korelovat jejich expresní profily s responzivitou pacientů k imunoterapii zaloţené na
interferonech, a průběhem onemocnění.
Interferon-γ na rozdíl od interferonu-α indukuje expresi SOCS 3
v buněčných liniích lidských melanomů
IFN-γ, ale ne IFN-α, stimuluje expresi SOCS 3
Vedle SOCS 1 se SOCS 3 zdá být jednou z nejlépe charakterizovaných molekul z rodiny
SOCS (Fujimoto a Naka, 2003). Funguje jako pleiotropní regulátor interleukinových signálů,
a tak hraje důleţitou roli v imunitních a zánětlivých procesech. Aktivace SOCS 3 v odpovědi
na interferony byla studována méně často (Cacalano et al., 2001; Federici et al., 2002; Sakai
et al., 2002). Získali jsme důkazy pro indukci SOCS 3 pomocí IFN-γ u většiny, ne-li všech,
analyzovaných melanomových a normálních buněk. Byla zjištěna dobrá korelace mezi expresí
na úrovni RNA a proteinů, coţ naznačuje, ţe stimulace SOCS 3 interferonem gama se
odehrává primárně na úrovni transkripce. Třicet minut působení IFN-γ se jeví být
dostatečným pro významnou akumulaci proteinu a RNA, coţ naznačuje bezprostřední
a rychlou odpověď buněk na působení cytokinu. Nedávno byl v promotoru SOCS 3
identifikován IFN-γ-responzivní element (Gatto et al., 2004). Společně tato pozorování
naznačují, ţe transkripce SOCS 3 je pravděpodobně pod kontrolou přenosové dráhy IFN-γ.
113
Na rozdíl od IFN-γ se IFN-α jevil značně neúčinný ve stimulaci SOCS 3
v melanomových buňkách. Na úrovni RNA odpovídaly normální melanocyty na působení
obou interferonů efektivněji neţ většina nádorových linií, coţ naznačuje, ţe melanomy mají
sníţenou schopnost reagovat na tyto cytokiny. To můţe mít několik vysvětlení. Za prvé,
receptor přenášející signál IFN-α můţe být v našem modelu nebo obecně v maligních
melanomech narušen; tuto moţnost však povaţujeme za nepravděpodobnou kvůli
IFN-α-stimulované fosforylaci na tyrozinových zbytcích u většiny buněčných linií.
Náš předpoklad potvrzují předchozí studie ukazující aktivaci tyrozinkináz Jak1 a Tyk2
v několika melanomových buněčných liniích (Pansky et al., 2000). Proto je moţné, ţe za
odlišné chování IFN-α a IFN-γ je zodpovědný faktor/faktory působící downstream od STAT1.
V tomto kontextu aktivace STAT1 pomocí IFN-γ má za výsledek homo dimerizaci
fosforylovaných molekul, které vstupují do jádra, kde se účastní procesu trans aktivace (Calo
et al., 2003; Levy a Darnell, 2002). V kontrastu k tomu trans aktivační signál IFN-α vyuţívá,
vedle homo dimerů STAT1-STAT1, také hetero komplexy fosfoforem STAT1-STAT2 a p48
(Calo et al., 2003). Zdá se být logické, ţe oba interferony zuţitkovávají společné a rozdílné
faktory, aby signál dopravily do jádra. Snad můţe být promotor SOCS 3 aktivován pouze
částí komplexů STAT1. Pozorovaná deficience STAT1, STAT2 a p48 v melanomových
buňkách je s touto hypotézou v souladu (Wong et al., 1997). Předběţné výsledky napovídají,
ţe STAT2 je ve studovaných liniích exprimován jen zanedbatelně (M. Fojtová, nepublikovaná
data).
Dalším rozdílem mezi oběma interferony je jejich schopnost inhibovat buněčnou
proliferaci. Ačkoliv většina linií vyţadovala pro inhibici růstu vysoké dávky IFN-α,
přesahující 1000 U/ml (30 %) nebo byla úplně rezistentní (50 %), bylo více neţ 70 % linií
citlivých na IFN-γ. Odlišné apoptotické efekty IFN-γ a IFN-α byly nedávno demonstrovány
v lidských endoteliálních buňkách (Porta et al., 2005). Ačkoliv se zdálo, ţe IFN-γ indukuje
apoptózu způsobem nezávislým na p53, defektní exprese p53 byla nezbytná pro apoptózu
zprostředkovanou IFN-α. Ačkoliv nemáme data o expresi p53 ve studovaných melanomových
buňkách, rozdíly v citlivosti jednotlivých linií k oběma interferonům by snad šlo vysvětlit
aberantní expresí p53.
Leukemické buňky po stimulaci IFN-α exprimovaly SOCS 3, a konstitutivní exprese
SOCS 3 korelovala s necitlivostí buněčné proliferace k léčbě IFN-α (Cacalano et al., 2001).
V našich pokusech byla konstitutivní exprese SOCS 3 RNA obecně nízká nebo zanedbatelná.
Zdá se tedy, ţe různé tkáně a jejich maligní varianty vykazují odlišnosti v IFN-mediované
114
transkripční schopnosti cílových genů, včetně SOCS 3. Na úrovni proteinů byla zjištěna slabá
exprese i v neovlivněných buňkách (jak citlivých tak rezistentních k IFN), coţ naznačuje, ţe
nemůţe být učiněn jasný závěr ohledně vztahu mezi citlivostí k IFN a expresí SOCS 3.
Zajímavé je, ţe v melanomových buňkách, které vykazovaly úplnou rezistenci k oběma
interferonům, byla pozorována mírná stimulace růstu s přírůstkem počtu buněk aţ 20 %,
coţ naznačuje, ţe v některých případech mohou interferony doručovat spíše mitogenní
neţ apoptotické signály.
Signalizace STAT1 a exprese SOCS 3
Vyvstává otázka, zda můţe fosforylovaný STAT1 fungovat jako trans-aktivátor genu
SOCS 3. V souladu s naší předchozí studií (Kovarik et al., 2003) byla fosforylace STAT1 na
tyrozinových zbytcích pozorována u většiny melanomových a normálních buněk, coţ
naznačuje, ţe signalizace STAT1 nemusí být v melanomových buňkách váţně poškozena.
IFN-γ stimuloval expresi SOCS 3 a tato aktivace byla často doprovázena zvýšenou fosforylací
molekul STAT1. Nicméně korelace mezi indukcí STAT1 a expresí SOCS 3 nebyla absolutní
a bylo zjištěno několik výjimek z tohoto obecného trendu. Například linie WM 852
vykazovala silnou indukci SOCS 3 po ovlivnění IFN-γ při absenci významné fosforylace
STAT1. Naopak WM 35 a WM 1617 po ovlivnění IFN-α a IFN-γ neexprimovaly SOCS 3, ale
vykazovaly normální fosforylaci STAT1. Společně tyto výsledky naznačují, ţe přetrvává
určitá nejistota ohledně toho, zda STAT1 funguje jako jediný regulátor exprese SOCS 3.
Mohou existovat alternativní signální dráhy IFN-γ, nezávislé na STAT1 (Ramana et al. 2001).
V tomto kontextu Ramana et al. (2005) nedávno ukázali IFN-zprostředkovanou indukci
SOCS 3 ve STAT1 -/- knokautovaných myších, a navrhli roli aktivovaného STAT3.
Naše předběţné výsledky naznačují, ţe STAT3 RNA je bohatě exprimována ve většině
melanomových linií. Navíc pak nemoţnost indukce SOCS 3 v buňkách WM 35 po ovlivnění
interferony můţe být rovněţ vysvětlena epigenetickou represí promotoru SOCS 3
(He et al., 2003).
Rodina genů SOCS je negativním regulátorem drah přenosu signálu JAK/STAT
(Fujimoto a Naka, 2003). Naše pozorování nedostatečné inducibility SOCS 3 po stimulaci
IFN-α naznačuje, ţe SOCS 3 nemůţe fungovat jako negativní regulátor fosforylace STAT
v signalizaci IFN-α v melanomových buňkách. Inhibiční role SOCS 3 v signalizaci IFN-γ je
pravděpodobnější, ačkoliv musí být zváţeny i další proteiny SOCS, např. SOCS 1 (Federici et
al., 2002). V nedávné studii Li et al. (2004) popsali upregulaci exprese SOCS 1 v mnoha
melanomových buněčných liniích (včetně WM 35 a WM 9 pouţitých v této studii)
115
a ve vzorcích nádorů. Zajímavé je, ţe v jejich studii mělo pouţití IFN za výsledek
pozoruhodnou indukci SOCS 1 ve WM 35 melanomových buňkách, a o něco niţší úroveň
indukce v buněčné linii WM 9. Naproti tomu naše výsledky ukázaly chybějící indukci SOCS
3 ve WM 35 melanomových buňkách, ale výraznou indukci v buněčné linii WM 9. Normální
melanocyty pak v našem systému vykazovaly nízkou úroveň exprese SOCS 1, ale vysokou
úroveň SOCS 3 (po stimulaci IFN-γ). To ukazuje zajímavou moţnost polarizace exprese
SOCS 1 a SOCS 3 v melanomech. Je zřejmé, ţe definování molekulárních faktorů
a interakcí účastnících se SOCS 3 inhibice JAK/STAT signálních drah můţe pomoci lépe
pochopit biologické účinky interferonů.
Chybějící či nedostatečná fosforylace STAT1 na tyrozinu 701 má souvislost
s průběhem onemocnění u pacientů s maligním melanomem
Ačkoliv jiţ mnoho zpráv popisovalo abnormální expresi a/nebo aktivaci proteinů STAT
v maligních buňkách, nebyla doposud uspokojivě zodpovězena důleţitá otázka, zda vůbec a
v jakém rozsahu deregulace STAT asociuje s nebo ovlivňuje vývoj choroby u pacientů.
V tomto kontextu Widschwendter et al. (2002) demonstroval na základě studia aktivace
STAT1 v archivních biopsiích pacientek s primární rakovinou prsu, ţe vysoká aktivace
STAT1 v primárním nádoru má přímou souvislost s příznivým průběhem nemoci a můţe být
povaţována za významný indikátor dobré prognózy. Tato data jsou v ostrém kontrastu
s našimi výsledky. Obě studie byly ovšem provedeny na různých typech rakoviny a je známo,
ţe různé STAT proteiny vykazují rozdílné aktivity v histologicky odlišných buněčných
systémech, s vyuţitím rozdílných aktivačních ligandů. Například bylo ukázáno, ţe výsledek
aktivace STAT1 a STAT3 můţe být pozitivní nebo negativní v závislosti na příslušném
stimulu a buněčném typu (Mui, 1999). Dále pak mohou být za rozdílné výsledky obou studií
zodpovědné odlišné metodologické přístupy, tj. výzkum hladin fosforylovaných forem
STAT1 v biopsiích vs. inducibilita fosforylace STAT1 exogenním IFN-γ.
Je pozoruhodné, ţe v naší studii postrádala převáţná většina pacientů aktivaci STAT1
pomocí IFN-γ, ale i přes tento aktivační defekt STAT1 měli stále lepší prognózu ve srovnání
s pacienty s odpovědí. Zjištění, ţe velký počet melanomových vzorků byl neresponzivní
k IFN-γ, by mohlo naznačovat, ţe v určitém stadiu onemocnění získávají melanomové buňky
růstovou výhodu, pokud je IFN-γ/STAT1 signalizace vypnuta. Taková fenotypová změna
je konzistentní s jevem nazývaným imunoeditace, tj. pozitivní selekce rakovinných buněk,
které získávají schopnost uniknout rozpoznání imunitním systémem (Dunn et al., 2002; Dunn
116
et al., 2004). Naše data nicméně ilustrují, ţe imunoeditace není zřejmě jediným mechanismem
ovlivňujícím chování nádoru a průběh onemocnění. Tato studie demonstruje, ţe nádorové
buňky, které postrádají responzivitu k IFN-γ, mají méně devastující efekt na zdraví
melanomových pacientů, coţ má za následek významně lepší prognózu onemocnění. Je dobře
známo, ţe prostředí nádoru, lokální imunitní reakce, zánětlivé procesy a epigenetické faktory
hrají důleţité role v růstu nádoru, invazivitě a metastatickém potenciálu. Je moţné, ţe tyto
faktory jsou příznivé pro prognózu melanomů, pokud tumorové buňky vykazují aberantní
odpověď na IFN-γ. Hypoteticky nelze vyloučit, ţe nedostatečnost v aktivaci STAT1 můţe
také negativně ovlivňovat některé další exogenní signály podporující růst, které vyuţívají
dráhy STAT1, coţ má za důsledek zpomalení růstu nádorových buněk.
Dohromady naše zjištění ukazují neočekávanou roli signalizace IFN-γ ve vývoji
a průběhu maligního melanomového onemocnění a ilustrují, ţe chybějící aktivace STAT1
pomocí IFN-γ inverzně koreluje s vývojem onemocnění u pacientů s maligním melanomem
a můţe tak představovat nový prognostický marker.
117
ZÁVĚR
Výsledky předkládané disertační práce lze shrnout do několika bodů:
Pacienti, kteří odpovídali na aktivaci interferonem alfa, tedy ti, jejichţ ex vivo
metastatické melanomové buňky vykazovaly IFN-α-indukovanou STAT3 fosforylaci na
Y705, vykazovali významně kratší dobu přeţití bez nemoci (DFS), přeţití bez progrese
(PFS) a celkové přeţití (OS) ve srovnání se skupinou bez odpovědi. Tyto analýzy
poskytují důkaz, ţe aktivace STAT3 na pY705 indukovaná IFN-α negativně koreluje
s výsledkem nemoci.
Protein STAT1 byl mnohem častěji indukován IFN-γ neţ STAT3. Nicméně bazální
úrovně STAT1-pY byly mnohem niţší neţ u STAT3-pY, coţ naznačuje konstitutivní
aktivaci STAT3 (ale ne STAT1) v nádorových buňkách.
Naše zjištění ukazují neočekávanou roli signalizace IFN-γ ve vývoji a průběhu maligního
melanomového onemocnění a ilustrují, ţe chybějící aktivace STAT1 pomocí IFN-γ
inverzně koreluje s vývojem onemocnění u pacientů s maligním melanomem a můţe tak
představovat nový prognostický marker.
Inducibilita aktivace STAT1 na Tyr 701, ale ne na Ser 727, řízená IFN-γ, ale ne IFN-α,
významně ovlivnila raný vývoj onemocnění a také celkovou dobu přeţití. Skupina
pacientů, jejichţ maligní buňky postrádaly IFN-γ inducibilitu fosforylace STAT1 na Tyr
701, měla lepší prognózu vzhledem k intervalům bez onemocnění a celkovým intervalům
přeţití ve srovnání se skupinou responderů.
Prodlouţené udrţování melanomových buněk v buněčné kultuře můţe vést ke sníţení
jejich senzitivity k IFN-γ. Naše data napovídají, ţe změny v expresi SOCS 3 jsou svázány
s progresí melanomových buněk z IFN-senzitivního na IFN-rezistentní fenotyp a mohou
způsobovat růstovou výhodu melanomu in vivo v jeho pokročilých stadiích.
118
Nebyly zjištěny ţádné (nebo jen marginální) rozdíly v intenzitách signálu na úrovni RNA
a proteinu mezi neovlivněnými buňkami a buňkami ovlivněnými IFN-α, coţ naznačuje
téměř úplnou absenci indukce SOCS 3 tímto cytokinem.
K indukci SOCS 3 pomocí IFN-γ docházelo u většiny analyzovaných melanomových
a normálních buněk jak na úrovni RNA, tak proteinů, coţ naznačuje, ţe stimulace SOCS 3
IFN-γ se odehrává primárně na úrovni transkripce. Zdá se tedy, ţe transkripce SOCS 3
je pravděpodobně pod kontrolou přenosové dráhy IFN-γ.
119
LITERATURA
Agaisse, H., Perrimon, N. (2004) The roles of JAK/STAT signaling in Drosophila immune
responses. Immunol. Rev. 198, 72-82.
Agarwal, S., Rao, A. (1998) Modulation of chromatin structure regulates cytokine gene
expression during T cell differentiation. Immunity 9, 765-775.
Agarwala, S.S., Kirkwood, J.M. (1995) Potential uses of interferon alpha 2 as adjuvant
therapy in cancer. Ann. Surg. Oncol. 2, 365-371. Review.
Aggarwal, B.B., Kunnumakkara, A.B., Harikumar, K.B., Gupta, S.R., Tharakan, S.T., Koca,
C., Dey, S., Sung, B. (2009) Signal transducer and activator of transcription-3,
inflammation, and cancer: how intimate is the relationship? Ann. N.Y. Acad. Sci. 1171, 59-
79.
Aittomaki, S., Pesu, M., Groner, B., Janne, O.A., Palvimo, J.J., Silvennoinen, O. (2000)
Cooperation among Stat1, glucocorticoid receptor, and PU.1 in transcriptional activation
of the high-affinity Fc gamma receptor I in monocytes. J. Immunol. 164, 5689-5697.
Akira, S., Nishio, Y., Inoue, M., Wang, X.J., Wei, S., Matsusaka, T., Yoshida, K., Sudo, T.,
Naruto, M., Kishimoto, T. (1994) Molecular cloning of APRF, a novel IFN-stimulated
gene factor 3 p91-related transcription factor involved in the gp130-mediated signaling
pathway. Cell 77, 63-71.
Akira, S. (1999) Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.
Stem Cells 17, 138-146.
Alexander, W.S., Starr, R., Fenner, J.E., Scott, C.L., Handman, E., Sprigg, N.S., Corbin, J.E.,
Cornish, A.L., Darwiche, R., Owczarek, C.M., Kay, T.W., Nicola, N.A., Hertzog, P.J.,
Metcalf, D., Hilton, D.J. (1999) SOCS1 is a critical inhibitor of interferon gamma
signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine. Cell 98, 597–
608.
Alonzi, T., Maritano, D., Gorgoni, B., Rizzuto, G., Libert, C., Poli, V. (2001) Essential role of
STAT3 in the control of the acute-phase response as revealed by inducible gene
inactivation [correction of activation] in the liver. Mol. Cell. Biol. 21, 1621-1632.
Alvarez, J.V., Greulich, H., Sellers, W.R., Meyerson, M., Frank, D.A. (2006) Signal
transducer and activator of transcription 3 is required for the oncogenic effects of non-
small-cell lung cancer-associated mutations of the epidermal growth factor receptor.
Cancer Res. 66, 3162-3168.
120
Anderson, P.O., Sundstedt, A., Yazici, Z., Minaee, S., O'Neill, E.J., Woolf, R., Nicolson, K.,
Whitley, N., Li, L., Li, S., Wraith, D.C., Wang, P. (2005) IL-2 overcomes the
unresponsiveness but fails to reverse the regulatory function of antigen-induced T
regulatory cells. J. Immunol. 174, 310-319.
Aoki, N., Matsuda, T. (2002) Anuclear protein tyrosine phosphatase TC-PTP is a potential
negative regulator of the PRL-mediated signaling pathway: dephosphorylation and
deactivation of signal transducer and activator of transcription 5a and 5b by TC-PTP in
nucleus. Mol. Endocrinol. 16, 58-69.
Ariyoshi, K., Nosaka, T., Yamada, K., Onishi, M., Oka, Y., Miyajima, A., Kitamura, T.
(2000) Constitutive activation of STAT5 by a point mutation in the SH2 domain. J. Biol.
Chem. 275, 24407-24413.
Arnould, C., Philippe, C., Bourdon, V., Gregoire, M.J., Berger, R., Jonveaux, P. (1999) The
signal transducer and activator of transcription STAT5b gene is a new partner of retinoic
acid receptor alpha in acute promyelocytic-like leukaemia. Hum. Mol. Genet. 8, 1741-
1749.
Asao, H., Okuyama, C., Kumaki, S., Ishii, N., Tsuchiya, S., Foster, D., Sugamura, K. (2001)
Cutting edge: the common gamma-chain is an indispensable subunit of the IL-21 receptor
complex. J. Immunol. 167, 1-5.
Aubry, L., Firtel, R. (1999) Integration of signaling networks that regulate Dictyostelium
differentiation. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 469-517.
Azam, M., Erdjument-Bromage, H., Kreider, B.L., Xia, M., Quelle, F., Basu, R., Saris, C.,
Tempst, P., Ihle, J.N., Schindler, C. (1995) Interleukin-3 signals through multiple isoforms
of Stat5. EMBO J. 14, 1402-1411.
Bach, E.A., Aguet, M., Schreiber, R.D. (1997) The IFN gamma receptor: a paradigm for
cytokine receptor signaling. Annu. Rev. Immunol. 15, 563-591.
Barahmand-Pour, F., Meinke, A., Groner, B., Decker, T. (1998) Jak2-Stat5 interactions
analyzed in yeast. J. Biol. Chem. 273, 12567-12575.
Barillas-Mury, C., Han, Y.S., Seeley, D., Kafatos, F.C. (1999) Anopheles gambiae Ag-
STAT, a new insect member of the STAT family, is activated in response to bacterial
infection. EMBO J. 18, 959-967.
Battle, T. E., Frank, D.A. (2002) The role of STATs in apoptosis. Curr. Mol. Med. 2, 381-
392.
121
Becker, S., Groner, B., Müller, C.W. (1998) Three-dimensional structure of the Stat3beta
homodimer bound to DNA. Nature 394, 145-151.
Begitt, A., Meyer, T., van Rossum, M., Vinkemeier, U. (2000) Nucleocytoplasmic
translocation of Stat1 is regulated by a leucine-rich export signal in the coiled-coil domain.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10418-10423.
Betz, A., Lampen, N., Martinek, S., Young, M.W., Darnell, J.E. Jr. (2001) A Drosophila
PIAS homologue negatively regulates stat92E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9563-9568.
Beuvink, I., Hess, D., Flotow, H., Hofsteenge, J., Groner, B., Hynes, N.E. (2000) Stat5a
serine phosphorylation. Serine 779 is constitutively phosphorylated in the mammary
gland, and serine 725 phosphorylation influences prolactin-stimulated in vitro DNA
binding activity. J. Biol. Chem. 275, 10247-10255.
Bhattacharya, S., Eckner, R., Grossman, S., Oldread, E., Arany, Z., D'Andrea, A.,
Livingston, D.M. (1996) Cooperation of Stat2 and p300/CBP in signalling induced by
interferon-alpha. Nature 383, 344-347.
Blumberg, H., Conklin, D., Xu, W.F., Grossmann, A., Brender, T., Carollo, S., Eagan, M.,
Foster, D., Haldeman, B.A., Hammond, A., Haugen, H., Jelinek, L., Kelly, J.D., Madden,
K., Maurer, M.F., Parrish-Novak, J., Prunkard, D., Sexson, S., Sprecher, C., Waggie, K.,
West, J., Whitmore, T.E., Yao, L., Kuechle, M.K., Dále, B.A., Chandrasekher, Y.A.
(2001) Interleukin 20: discovery, receptor identification, and role in epidermal function.
Cell 104, 9-19.
Bluyssen, H.A., Levy, D.E. (1997) Stat2 is a transcriptional activator that requires sequence-
specific contacts provided by stat1 and p48 for stable interaction with DNA. J. Biol.
Chem. 272, 4600-4605.
Boehm, A.L., Sen, M., Seethala, R., Gooding, W.E., Freilino, M., Wong, S.M., Wang, S.,
Johnson, D.E., Grandis, J.R. (2008) Combined targeting of epidermal growth factor
receptor, signal transducer and activator of transcription-3, and Bcl-X(L) enhances
antitumor effects in squamous cell carcinoma of the head and neck. Mol. Pharmacol. 73,
1632-1642.
Bogdan, C., Röllinghoff, M., Diefenbach, A. (2000) The role of nitric oxide in innate
immunity. Immunol. Rev. 173, 17-26.
Boudny, V., Kocak, I., Lauerova, L., Kovarik, J. (2003) Interferon inducibility of STAT 1
activation and its prognostic significance in melanoma patients. Folia Biol. (Praha) 49,
142-146.
122
Boudny, V., Dusek, L., Adamkova, L., Chumchalova, J., Kocak, I., Fait, V., Lauerova, L.,
Krejci, E., Kovarik, J. (2005) Lack of STAT 1 phosphorylation at TYR 701 by IFNγ
correlates with disease outcome in melanoma patients. Neoplasma 52, 330-337.
Bowman, T., Jove, R. (1999) STAT Proteins and Cancer. Cancer Control 6, 615-619.
Bowman, T., Garcia, R., Turkson, J., Jove, R. (2000) STATs in oncogenesis. Oncogene 19,
2474-2488.
Brierley, M.M., Fish, E.N. (2005) Stats: multifaceted regulators of transcription. J. Interferon
Cytokine Res. 25, 733–744.
Briscoe, J., Kohlhuber, F., Muller, M. (1996) JAKs and STATs branch out. Trends Cell Biol.
6, 336-340.
Bromberg, J. (2002) Stat proteins and oncogenesis. J. Clin. Invest. 109, 1139–1142.
Bromberg, J., Darnell, J.E. Jr. (2000) The role of STATs in transcriptional control and their
impact on cellular function. Oncogene 19, 2468-2473.
Bromberg, J.F. (2001) Activation of STAT proteins and growth control. BioEssays 23, 161-
169.
Bromberg, J.F., Horvath, C.M., Wen, Z., Schreiber, R.D., Darnell, J.E. Jr. (1996)
Transcriptionally active Stat1 is required for the antiproliferative effects of both
interferon α and interferon γ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7673-7678.
Bromberg, J.F., Fan, Z., Brown, C., Mendelsohn, J., Darnell, J.E. Jr. (1998) Epidermal
growth factor-induced growth inhibition requires Stat1 activation. Cell Growth Differ. 9,
505-512.
Bromberg J.F., Wrzeszczynska M.H., Devgan G., Zhao Y., Pestell R.G., Albanese C.,
Darnell J.E. Jr. (1999) STAT 3 as an oncogene. Cell 98, 295-303.
Buettner, R., Mora, L.B., Jove, R. (2002) Activated STAT signaling in human tumors
provides novel molecular targets for therapeutic intervention. Clin. Cancer Res. 8, 945-
954.
Cacalano, N.A., Sanden, D., Johnston, J.A. (2001) Tyrosine-phosphorylated SOCS-3 inhibits
STAT activation but binds to p120 RasGAP and activates Ras. Nat. Cell. Biol. 3, 460-465.
Cao, X., Shores, E.W., Hu-Li, J., Anver, M.R., Kelsall, B.L., Russell, S.M., Drago, J.,
Noguchi, M., Grinberg, A., Bloom, E.T., et al. (1995) Defective lymphoid development in
mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity 2, 223-
238.
123
Caldenhoven, E., van Dijk, T.B., Solari, R., Armstrong, J., Raaijmakers, J.A., Lammers,
J.W., Koenderman, L., de Groot, R.P. (1996) STAT3beta, a splice variant of transcription
factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J. Biol. Chem. 271,
13221-13227.
Callus, B.A., Mathey-Prevot, B. (2000) Hydrophobic residues Phe751 and Leu753 are
essential for STAT5 transcriptional activity. J. Biol. Chem. 275, 16954-16962.
Calo, V., Migliavacca, M., Bazan, V., Macaluso, M., Buscemi, M., Gebbia, N., Russo, A.
(2003) STAT proteins: from normal control of cellular events to tumorigenesis. J. Cell.
Physiol. 197, 157–168.
Cantwell, C.A., Sterneck, E., Johnson, P.F. (1998) Interleukin-6-specific activation of the
C/EBPdelta gene in hepatocytes is mediated by Stat3 and Sp1. Mol. Cell. Biol. 18, 2108-
2117.
Caraglia, M., Marra, M., Pelaia, G., Maselli, R., Caputi, M., Marsico, S.A., Abbruzzese, A.
(2005) Alpha-interferon and its effects on signal transduction pathways. J. Cell. Physiol.
202, 323–335.
Carson W.E. (1998) Interferon alpha-induced activation of signal transducer and activator of
transcription proteins in malignant melanoma. Clin. Cancer Res. 4, 2219-2228.
Carter-Su, C., Rui, L., Stofega, M.R. (2000) SH2-B and SIRP: JAK2 binding proteins that
modulate the actions of growth hormone. Recent Prog. Horm. Res. 55, 293-311.
Catlett-Falcone R., Landowski T.H., Oshiro M.M., Turkson J., Levitzki A., Savino R.,
Ciliberto G., Moscinski L., Fernandez-Luna J.L., Nunez G., Dalton W.S., Jove R. (1999)
Constitutive activation of STAT 3 signaling confers resistance to apoptosis in human
U266 myeloma cells. Immunity 10, 105-115.
Chang, T.L., Peng, X., Fu, X.Y. (2000) Interleukin-4 mediates cell growth inhibition through
activation of Stat1. J. Biol. Chem. 275, 10212-10217.
Chapman, R.S., Lourenco, P.C., Tonner, E., Flint, D.J., Selbert, S., Takeda, K., Akira, S.,
Clarke, A.R., Watson, C.J. (1999) Suppression of epithelial apoptosis and delayed
mammary gland involution in mice with a conditional knockout of Stat3. Genes. Dev. 13,
2604-2616.
Chatterjee-Kishore, M., Wright, K.L., Ting, J.P., Stark, G.R. (2000). How Stat1 mediates
constitutive gene expression: a complex of unphosphorylated Stat1 and IRF1 supports
transcription of the LMP2 gene. EMBO J. 19, 4111-4122.
124
Chawla-Sarkar, M., Leaman, D.W., Jacobs, B.S., Borden, E.C. (2002) IFN-beta
pretreatment sensitizes human melanoma cells to TRAIL/Apo2 ligandinduced apoptosis.
J. Immunol. 169, 847–855.
Chen, L.F., Cohen, E.E., Grandis, J.R. (2010) New strategies in head and neck cancer:
understanding resistance to epidermal growth factor receptor inhibitors. Clin. Cancer Res.
16, 2489-2495.
Chen, X., Vinkemeier, U., Zhao, Y., Jeruzalmi, D., Darnell, J.E. Jr., Kuriyan, J. (1998)
Crystal structure of a tyrosine phosphorylated STAT-1 dimer bound to DNA. Cell 93,
827-839.
Chin, Y.E., Kitagawa, M., Su, W.C., You, Z.H., Iwamoto, Y., Fu, X.Y. (1996) Cell growth
arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor p21 WAF1/CIP1 mediated by
STAT1. Science 272, 719-722.
Chow, M., Rubin, H. (2000) Clonal selection versus genetic instability as the driving force in
neoplastic transformation. Cancer Res. 60, 6510– 6518.
Chung C.D., Liao J., Liu B., Rao X., Jay P., Berta P., Shuai K. (1997) Specific inhibition of
STAT 3 signal transduction by PIAS 3. Science 278, 1803-1805.
Coffer, P.J., Koenderman, L., de Groot, R.P. (2000) The role of STATs in myeloid
differentiation and leukemia. Oncogene 19, 2511-2522.
Collum, R.G., Brutsaert, S., Lee, G., Schindler, C. (2000) A Stat3-interacting protein (StIP1)
regulates cytokine signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10120-10125.
Cooney, R.N. (2002) Suppressors of cytokine signaling (SOCS): inhibitors of the JAK/STAT
pathway. Shock 17, 83-90.
Copeland, N.G., Gilbert, D.J., Schindler, C., Zhong, Z., Wen, Z., Darnell, J.E. Jr, Mui, A.L.,
Miyajima, A., Quelle, F.W., Ihle, J.N., et al. (1995) Distribution of the mammalian Stat
gene family in mouse chromosomes. Genomics 29, 225-228.
Croker, B.A., Kiu, H., Nicholson, S.E. (2008) SOCS regulation of the JAK/STAT signalling
pathway. Semin. Cell. Dev. Biol. 19, 414-422.
Darnell J.E. Jr. (1997) STATs and gene regulation. Science 277, 1630-1635. Review.
Darnell, J.E. (2005) Validating Stat3 in cancer therapy. Nat. Med. 11, 595–596.
Darnell, J.E. Jr., Kerr, I.M., Stark, G.R. (1994) Jak-STAT pathways and transcriptional
activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science 264,
1415-1421.
125
Decker, T., Kovarik, P. (1999) Transcription factor activity of STAT proteins: structural
requirements and regulation by phosphorylation and interacting proteins. Cell. Mol. Life
Sci. 55, 1535-1546.
Decker, T., Kovarik, P. (2000) Serine phosphorylation of STATs. Oncogene 19, 2628-2637.
de Hooge, A. S., van de Loo, F.A., Koenders, M.I., Bennink, M.B., Arntz, O.J., Kolbe, T.,
van den Berg, W.B. (2004) Local activation of STAT-1 and STAT-3 in the inflamed
synovium during zymosan-induced arthritis: exacerbation of joint inflammation in STAT-
1 gene-knockout mice. Arthritis Rheum. 50, 2014-2023.
de la Chapelle, A., Traskelin, A.L., Juvonen, E. (1993) Truncated erythropoietin receptor
causes dominantly inherited benign human erythrocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
4495-4499.
Deiss, L.P., Feinstein E., Berissi H., Cohen O., Kimchi A. (1995) Identification of a novel
serine/threonine kinase and a novel 15kDa protein as potential mediators of the gamma
interferon-induced cell dech. Genes Dev. 9, 15-30.
DeMaeyer, E. and DeMaeyer-Giugnard J. (1988) Interferons and Other Regulatory
Cytokines. New York: John Wiley and Sons.
Dent, A.L., Shaffer, A.L., Yu, X., Allman, D., Staudt, L.M. (1997) Control of inflammation,
cytokine expression, and germinal center formation by BCL-6. Science 276, 589-592.
Diaz, M.O., Bohlander, S., Allen, G. (1993) Nomenclature of human interferon genes. J.
Interferon Res. 13, 243-244.
Dittrich, E., Haft, C.R., Muys, L., Heinrich, P.C., Graeve, L. (1996) A di-leucine motif and
an upstream serine in the interleukin-6 (IL-6) signal transducer gp130 mediate ligand-
induced endocytosis and down-regulation of the IL-6 receptor. J. Biol. Chem. 271, 5487-
5494.
Dumoutier, L., Van Roost, E., Colau, D., Renauld, J.C. (2000) Human interleukin-10-related
T cell-derived inducible factor: molecular cloning and functional characterization as an
hepatocyte-stimulating factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10144-10149.
Dunn, G.P., Bruce, A.T., Ikeda, H., Old, L.J., Schreiber, R.D. (2002) Cancer immunoediting:
from immunosurveillance to tumor escape. Nat. Immunol. 11, 991-998.
Dunn, G.P., Old, L.J., Schreiber, R.D. (2004) The immunobiology of cancer
immunosurveillance and immunoediting. Immunity 2, 137-148.
126
Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M.C., Levy, D.E. (1996) Targeted disruption of the
mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell 84, 443-
450.
Durbin, J.E., Fernandez-Sesma, A., Lee, C.K., Rao, T.D., Frey, A.B., Moran, T.M.,
Vukmanovic, S., Garcia-Sastre, A., Levy, D.E. (2000) Type I IFN modulates innate and
specific antiviral immunity. J. Immunol. 164, 4220-4228.
Egloff, A.M., Grandis, J.R. (2009) Improving Response Rates to EGFR-Targeted Therapies
for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma: Candidate Predictive Biomarkers and
Combination Treatment with Src Inhibitors. J. Oncol. 2009, 896407 Epub 2009 Jul 14.
Endo, T.A., Masuhara, M., Yokouchi M., Suzuki, R., Sakamoto, H., Mitsui, K., Matsumoto,
A., S., Ohtsubo, M., Misawa, H., Miyazaki, T., Leonor, N., Taniguchi, T., Fujita, T.,
Kanakura, Y., Komiya, S., Yoshimura, A. (1997) A new protein containing an SH2
domain that inhibits JAK kinases. Nature 387, 921-924.
Evans, M.K., Yu, C.R., Lohani, A., Mahdi, R.M., Liu, X., Trzeciak, A.R., Egwuagu, C.E.
(2007) Expression of SOCS1 and SOCS3 genes is differentially regulated in breast cancer
cells in response to proinflammatory cytokine and growth factor signals. Oncogene 26,
1941– 1948.
Fain, J.N., Ihle, J.H., Bahouth, S.W. (1999) Stimulation of lipolysis but not of leptin release
by growth hormone is abolished in adipose tissue from Stat5a and b knockout mice.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 263, 201-205.
Farrar, J.D., Smith, J.D., Murphy, T.L., Leung, S., Stark, G.R., Murphy, K.M. (2000)
Selective loss of type I interferon-induced STAT4 activation caused by a minisatellite
insertion in mouse Stat2. Nat. Immunol. 1, 65-69.
Farrar, M.A. and Schreiber, R.D. (1993) The molecular cell biology of interferon-gamma
and its receptor. Annu. Rev. Immunol. 11, 571-611. Review.
Federici, M., Giustizieri, M.L., Scarponi, C., Girolomoni, G., Albanesi, C. (2002) Impaired
IFN-gamma-dependent inflammatory responses in human keratinocytes overexpressing
the suppressor of cytokine signaling 1. J. Immunol. 169, 434-442.
Fletcher, S., Drewry, J.A., Shahani, V.M., Page, B.D., Gunning, P.T. (2009) Molecular
disruption of oncogenic signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) protein.
Biochem. Cell. Biol. 87, 825-833.
127
Fojtova, M., Van Houdt, H., Depicker, A., Kovarik, A. (2003) Epigenetic switch from
posttranscriptional to transcriptional silencing is correlated with promoter
hypermethylation. Plant Physiol. 133, 1240–1250.
Fojtova, M., Boudny, V., Kovarik, A., Lauerova, L., Adamkova, L., Souckova, K.,
Jarkovsky, J., Kovarik, J. (2007) Development of IFNgamma resistance is associated with
attenuation of SOCS genes induction and constitutive expression of SOCS 3 in melanoma
cells. Br. J. Cancer 97, 231–237.
Frank, D.A. (1999) STAT signaling in the pathogenesis and treatment of cancer. Mol. Med.5,
432-456. Review.
Frank, D.A. (2007) STAT3 as a central mediator of neoplastic cellular transformation.
Cancer Lett. 251, 199-210.
Frank, D.A., Mahajan, S., Yuan, H. (1999) The chemoprotectant butyrate down- regulates
IL-6-induced signaling events in colorectal carcinoma cells. Proc. Amer. Assoc.
CancerRes. 40, 318.
Fujimoto, M., Naka, T. (2003) Regulation of cytokine signaling by SOCS family molecules.
Trends Immunol.24, 659–666.
Galon, J., Sudarshan, C., Ito, S., Finbloom, D., O'Shea, J.J. (1999) IL-12 induces IFN
regulating factor-1 (IRF-1) gene expression in human NK and T cells. J. Immunol. 162,
7256-7262.
Garcia, R., Bowman, T.L., Niu, G., Yu, H., Minton, S., Muro-Cacho, C.A., Cox, C.E.,
Falcone, R., Fairclough, R., Parsons, S., Laudano, A., Gazit,A., Levitzki, A., Kraker, A.,
Jove, R. (2001) Constitutive activation of STAT 3 by Src and JAK tyrosinekinases
participaces in growth regulation of human breast carcinoma cells. Oncogene 20, 2499-
2513.
Gately, M.K., Renzetti, L.M., Magram, J., Stern, A.S., Adorini, L., Gubler, U., Presky, D.H.
(1998) The interleukin-12/interleukin-12-receptor system: role in normal and pathologic
immune responses. Annu. Rev. Immunol. 16, 495-521.
Gatto, L., Berlato, C., Poli, V., Tininini, S., Kinjyo, I., Yoshimura, A., Cassatella, M.A.,
Bazzoni, F. (2004) Analysis of SOCS-3 promoter responses to interferon gamma. J. Biol.
Chem. 279, 13746-13754.
Germain, D., Frank, D.A. (2007) Targeting the cytoplasmic and nuclear functions of signal
transducers and activators of transcription 3 for cancer therapy. Clin. Cancer Res. 13,
5665-5669.
128
Gonzalez, F.A., Raden, D.L., Davis, R.J. (1991) Identification of substrate recognition
determinants for human ERK1 and ERK2 protein kinases. J. Biol. Chem. 266, 22159-
22163.
Greenhalg, C.J., Hilton, D.J. (2001) Negative regulation of cytokine signaling. J. Leukoc.
Biol. 70, 348–356.
Greenlund, A.C., Farrar, M.A., Viviano, B.L., Schreiber, R.D. (1994) Ligand-induced IFN
gamma receptor tyrosine phosphorylation couples the receptor to its signal transduction
system (p91). EMBO J. 13, 1591-1600.
Gupta, S., Yan, H., Wong, L.H., Ralph, S., Krolewski, J., Schindler, C. (1996) The SH2
domains of Stat1 and Stat2 mediate multiple interactions in the transduction of IFN-alpha
signals. EMBO J. 15, 1075-1084.
Hague, S.J., Williams, B.R.G. (1998) Signal transduction in the Interferon System. Semin.
Oncol. 25, 14–22.
Harrison, D.A., McCoon, P.E., Binari, R., Gilman, M., Perrimon, N. (1998) Drosophila
unpaired encodes a secreted protein that activates the JAK signaling pathway. Genes Dev.
12, 3252-3263.
Hartman, S. E., Bertone, P., Nath, A. K., Royce, T. E., Gerstein, M., Weissman, S., Snyder,
M. (2005) Global changes in STAT target selection and transcription regulation upon
interferon treatments. Genes Dev. 19, 2953-2968.
Haspel, R.L., Darnell, J.E. Jr. (1996) A nuclear protein tyrosine phosphatase is required for
the inactivation of Stat1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 10188-10193.
He, B., You, L., Uematsu, K., Zang, K., Xu, Z., Lee, A.Y., Costello, J.F., McCormick, F.,
Jablons, D.M. (2003) SOCS-3 is frequently silenced by hypermethylation and suppresses
cell growth in human lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14133– 14138.
Heinrich, P.C., Behrmann, I., Müller-Newen, G., Schaper, F., Graeve, L. (1998) Interleukin-
6-type cytokine signalling through the gp130/Jak/STAT pathway. Biochem. J. 334, 297-
314.
Heinrich, P.C., Behrmann, I., Haan, S., Hermanns, H.M., Müller-Newen, G., Schaper, F.
(2003) Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation.
Biochem. J. 374, 1-20.
Herlyn, M., Thurin, J., Balaban, G., Bennicelli, J.L., Herlyn, D., Elder, D.E., Bondi, E.,
Guerry, D., Nowell, P., Clark, W.H., et al. (1985) Characteristics of cultured human
129
melanocytes isolated from different stages of tumor progression. Cancer Res. 45, 5670-
5676.
Hermann, A., Vogt, M., Monnigmann, M., Clahsen, T., Sommer, U., Haan, S., Poli, V.,
Heinrich, P.C., Muller-Newen, G. (2007) Nucleocytoplasmic shuttling of persistently
activated STAT. J. Cell. Sci. 120, 3249-3261.
Hilton, D.J., Richardson, R.T., Alexander, W.S., ViDey, E.M., Willson, T.A., Sprigg, N.S.,
Starr, R., Nicholson, S.E., Metcalf, D., Nicola, N.A. (1998) Twenty proteins containing a
C-terminal SOCS box form five structural classes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 114-
119.
Hilton, D.J. (1999) Negative regulators of cytokine signal transduction. Cell. Mol. Life Sci.
55, 1568-1577. Review.
Ho, A.S., Liu, Y., Khan, T.A., Hsu, D.H., Bazan, J.F., Moore, K.W. (1993) A receptor for
interleukin 10 is related to interferon receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11267-
11271.
Horvath, C.M. (2000) STAT proteins and transcriptional responses to extracellular signals.
Trends Biochem. Sci. 25, 496-502.
Horvath, C.M., Wen, Z., Darnell, J.E. Jr. (1995) A Stat protein domain that determines DNA
sequence recognition suggests a novel DNAbinding domain. Genes Dev. 9, 984–994.
Horvath, C.M., Stark, G.R., Kerr, I.M., Darnell, J.E. Jr. (1996) Interactions between STAT
and non-STAT proteins in the interferon-stimulated gene factor 3 transcription complex.
Mol. Cell. Biol. 16, 6957-6964.
Hou, J., Schindler, U., Henzel, W.J., Ho, T.C., Brasseur, M., McKnight, S.L. (1994) An
interleukin-4-induced transcription factor: IL-4 Stat. Science 265, 1701-1705.
Huang, S., Hendriks, W., Althage, A., Hemmi, S., Bluethmann, H., Kamijo, R., Vilcek, J.,
Zinkernagel, R.M., Aguet, M. (1993) Immune response in mice that lack the interferon-
gamma receptor. Science 259, 1742-1745.
Huang, Y.Q., Li, J.J., Karpatkin, S. (2000) Thrombin inhibic tumor cell growth in association
with up-regulation of p21(waf/cip1) and caspases via a p53-independent, STAT-
1-dependent pathway. J. Biol. Chem. 275, 6462-6468.
Ihle, J. N. (1996) STATs: signal transducers and activators of transcription. Cell 84, 331-334.
Review.
Ihle, J. N. (2001) The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 211-217.
130
Ihle, J.N., Kerr, I.M. (1995) Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptor superfamily.
Trends Genet. 11, 69-74.
Ihle, J.N., Witthuhn B., Tang B., Yi T., Quelle F.W. (1994) Cytokine receptors and signal
transduction. Baillieres Clin. Haematol. 7, 17-48. Review.
Ikeda, H., Old, L.J., Schreiber, R.D. (2002) The roles of IFN γ in protection against tumor
development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 95-109.
Irie-Sasaki, J., Sasaki, T., Matsumoto, W., Opavsky, A., Cheng, M., Welstead, G., Griffiths,
E., Krawczyk, C., Richardson, C.D., Aitken, K., Iscove, N., Koretzky, G., Johnson, P.,
Liu, P., Rothstein, D.M., Penninger, J.M. (2001) CD45 is a JAK phosphatase and
negatively regulates cytokine receptor signalling. Nature 409, 349-354.
Ito, S., Ansari P., Sakatsume M., Dickensheets H., Vazquez N., Donnelly R.P., Larner A.C.,
Finbloom D.S. (1999) Interleukin-l0 inhibits expression of both interferon alpha- and
interferon gamma-induced genes by suppressing tyrosine phosphorylation of STAT 1.
Blood 93, 1456-1463.
Ivashkiv, L.B., Hu, X. (2004) Signaling by STATs. Arthritis Res. Ther. 6, 159-168.
Janjua, S., Stephanou, A., Latchman, D.S. (2002) The C-terminal activation domain of the
STAT-1 transcription factor is necessary and sufficient for stress-induced apoptosis. Cell
Death Differ. 9, 1140-1146.
Jackson, D.P., Watling, D., Rogers, N.C., Banks, R.E., Kerr, I.M., Selby, P.J., Patel, P.M.
(2003) The JAK/STAT pathway is not sufficient to sustain the antiproliferative response
in an interferon-resistant human melanoma cell line. Melanoma Res. 13, 219–229.
Jiao, H., Yang, W., Berrada, K., Tabrizi, M., Shultz, L., Yi, T. (1997) Macrophages from
motheaten and viable motheaten mutant mice show increased proliferative responses to
GM-CSF: detection of potential HCP substrates in GM-CSF signal transduction. Exp.
Hematol. 25, 592-600.
Jing, N., Tweardy, D.J. (2005) Targeting Stat3 in cancer therapy. Anticancer Drugs 16, 601-
607.
Johnston, P.A., Grandis, J.R. (2011) STAT3 signaling: anticancer strategies and challenges.
Mol. Interv. 11, 18-26.
Kaplan, M.H., Schindler, U., Smiley, S.T., Grusby, M.J. (1996a) Stat6 is required for
mediating responses to IL-4 and for development of Th2 cells. Immunity 4, 313-319.
Kaplan, M.H., Sun, Y.L., Hoey, T., Grusby, M.J. (1996b) Impaired IL-12 responses and
enhanced development of Th2 cells in Stat4-deficient mice. Nature 382, 174-177.
131
Kaplan, D. H., Shankaran, V., Dighe, A.S., Stockert, E., Aguet, M., Old, L.J., Schreiber,
R.D. (1998a) Demonstration of an interferon γ-dependent tumor surveillance system in
immunocompetent mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7556-7561.
Kaplan, M.H., Wurster, A.L., Grusby, M.J. (1998b) A signal transducer and activator of
transcription (Stat)4-independent pathway for the development of T helper type 1 cells.
J. Exp. Med. 188, 1191-1196.
Karaghiosoff, M., Neubauer, H., Lassnig, C., Kovarik, P., Schindler, H., Pircher, H., McCoy,
B., Bogdan, C., Decker, T., Brem, G., Pfeffer, K., Müller, M. (2000) Partial impairment of
cytokine responses in Tyk2-deficient mice. Immunity 13, 549-560.
Karni R., Jove R., Levitzki A. (1999) Inhibition of pp60c-Src reduces Bcl-XL expression and
reverses the transformed phenotype of cells overexpressing EGF and HER-2 receptors.
Oncogene 18, 4654-4662.
Kawata, T., Shevchenko, A., Fukuzawa, M., Jermyn, K.A., Totty, N.F., Zhukovskaya, N.V.,
Sterling, A.E., Mann, M., Williams, J.G. (1997) SH2 signaling in a lower eukaryote: a
STAT protein that regulates stalk cell differentiation in dictyostelium. Cell 89, 909-916.
Kieslinger, M., Woldman, I., Moriggl, R., Hofmann, J., Marine, J.C., Ihle, J.N., Beug, H.,
Decker, T. (2000) Antiapoptotic activity of Stat5 required during terminal stages of
myeloid differentiation. Genes Dev. 14, 232-244.
Kim, T.K., Maniatis, T. (1996) Regulation of interferon-gamma-activated STAT1 by the
ubiquitin-proteasome pathway. Science 273, 1717-1719.
Kim, H., Kelly, J., Leonard, W.J. (2001) The basis for IL-2-induced IL-2 receptor alpha chain
gene regulation: importance of two widely separated IL-2 response elements. Immunity
15, 159-172.
Kirkwood, J.M. (1995) Biologic therapy with interferon alpha and beta: Clinical
applications: Melanoma. In: DeVita V.T., Hellman S. and Rosenberg S.A. (eds.): Biologic
therapy of cancer: Principles and Practice of Oncology, pp. 388-411. Philadelphia: J.B.
Lippincott.
Kirkwood, J.M., Strwaderman, M.H., Ernstoff, M.S., Smith, T.J., Borden, E.C., Blum, R.H.
(1996) Interferon alpha-2b adjuvant therapy of high-risk resected cutaneous melanoma:
The Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684. J. Clin. Oncol. 14, 7–17.
Kisseleva, T., Bhattacharya, S., Braunstein, J., Schindler, C.W. (2002) Signaling through the
JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 285, 1-24.
132
Kiuchi, N., Nakajima, K., Ichiba, M., Fukada, T., Narimatsu, M., Mizuno, K., Hibi, M.,
Hirano, T. (1999) STAT3 is required for the gp130-mediated full activation of the c-myc
gene. J. Exp. Med. 189, 63-73.
Klingmuller, U., Lorenz, U., Cantley, L.C., Neel, B.G., Lodish, H.F. (1995) Specific
recruitment of SH-PTP1 to the erythropoietin receptor causes inactivation of JAK2 and
termination of proliferative signals. Cell 80, 729-738.
Kolla, V., Lindner, D.J., Xiao, W., Borden, E.C., Kalvakolanu, D.V. (1996) Modulation of
interferon (IFN)-inducible gene expression by retinoic acid. Up-regulation of STAT 1
protein in IFN-unresponsive cells. J. Biol. Chem. 271, 10508-10514.
Komazaki, T., Nagai, H., Emi, M., Terada, Y., Yabe, A., Jin, E., Kawanami, O., Konishi, N.,
Moriyama, Y., Naka, T., Kishimoto, T. (2004) Hypermethylation-associated inactivation
of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor, in human pancreatic cancers. Jpn. J. Clin.
Oncol. 34, 191–194.
Komyod, W., Bohm, M., Metze, D., Heinrich, P.C., Behrmann, I. (2007) Constitutive
suppressor of cytokine signaling 3 expression confers a growth advantage to a human
melanoma cell line. Mol. Cancer Res. 5, 271–281.
Kortylewski, M., Komyod, W., Kauffmann, M.E., Bosserhoff, A., Heinrich, P.C., Behrmann,
I. (2004) Interferon-gamma-mediated growth regulation of melanoma cells: involvement
of STAT1-dependent and STAT1-independent signals. J. Invest. Dermatol. 122, 414–422.
Koshiji, M., Adachi, Y., Sogo, S., Taketani, S., Oyaizu, N., Than, S., Inaba, M., Phawa, S.,
Hioki, K., Ikehara, S. (1998) Apoptosis of colorectal adenocarcinoma (COLO 201) by
tumour necrosis factor-α (TNF-α) and/or interferon-γ (IFN-γ), resulting from down-
modulation of Bcl-2 expression. Clin. Exp. Immunol. 111, 211-218.
Kovarik, A., Peat, N., Wilson, D., Gendler, S.J., Taylor-Papadimitriou, J. (1993) Analysis of
the tissue-specific promoter of the MUC1 gene. J. Biol. Chem. 268, 9917–9926.
Kovarik, A., Fojtova, M., Boudny, V., Adamkova, L., Lauerova, L., Kovarik, J. (2005)
Interferon γ but not α induce SOCS 3 expression of human melanoma cell lines.
Melanoma Res. 15, 481-488.
Kovarik, J., Boudny, V., Kocak, I., Lauerova, L., Fait, V., Vagundova, M. (2003) Malignant
melanoma associates with deficient IFN-induced STAT 1 phosphorylation. Int. J. Mol.
Med. 12, 335-340.
Kovarik, P., Stoiber, D., Novy, M., Decker, T. (1998) Stat1 combines signals derived from
IFN-gamma and LPS receptors during macrophage activation. EMBO J. 17, 3660-3668.
133
Kovarik, P., Mangold, M., Ramsauer, K., Heidari, H., Steinborn, R., Zotter, A., Levy, D.E.,
Muller, M., Decker, T. (2001) Specificity of signaling by STAT1 depends on SH2 and C-
terminal domains that regulate Ser727 phosphorylation, differentially affecting specific
target gene expression. EMBO J. 20, 91-100.
Kube, D., Holtick U., Vockerodt, M., Ahmadi, T., Haier, B., Behrmann, I., Heinrich, P.C.,
Diehl, V., Tesch, H. (2001) STAT 3 is constitutively activated in Hodgkin cell lines.
Blood 98, 762-770.
Kumar, A., Commane, M., Flickinger, T. W., Horvath, C.M., Stark, G.R. (1997) Defective
TNF-α-induced apoptosis in STAT1-null cells due to low constitutive levels of caspases.
Science 278, 1630-1632.
Lee, C.K., Bluyssen, H.A., Levy, D.E. (1997) Regulation of interferon-alpha responsiveness
by the duration of Janus kinase activity. J. Biol. Chem. 272, 21872-21877.
Lee, C., Piazza, F., Brutsaert, S., Valens, J., Strehlow, I., Jarosinski, M., Saris, C., Schindler,
C. (1999a) Characterization of the Stat5 protease. J. Biol. Chem. 274, 26767-26775.
Lee, K.Y., Anderson, E., Madani, K., Rosen, G.D. (1999b) Loss of STAT1 expression
confers resistance to IFN-gamma-induced apoptosis in ME180 cells. FEBS Lett. 459, 323–
326.
Lee, C.K., Rao, D.T., Gertner, R., Gimeno, R., Frey, A.B., Levy, D.E. (2000a) Distinct
requirements for IFNs and STAT1 in NK cell function. J. Immunol. 165, 3571-3577.
Lee, C.K., Smith, E., Gimeno, R., Gertner, R., Levy, D.E. (2000b) STAT1 affects
lymphocyte survival and proliferation partially independent of its role downstream of IFN-
γ. J. Immunol. 164, 1286-1292.
Lee, S. J., Zhou, T., Choi, C., Wang, Z., Benveniste, E.N. (2000c) Differential regulation and
function of Fas expression on glial cells. J. Immunol. 164, 1277-1285.
Leeman, R.J., Lui, V.W., Grandis, J.R. (2006) STAT3 as a therapeutic target in head and
neck cancer. Expert.Opin. Biol. Ther. 6, 231-241.
Leeman, R.J., Cai, Q., Joyce, S.C., Thomas, S.M., Bhola, N.E., Neill, D.B., Arbiser, J.L.,
Grandis, J.R. (2010) Honokiol inhibits epidermal growth factor receptor signaling and
enhances the antitumor effects of epidermal growth factor receptor inhibitors. Clin.
Cancer Res. 16, 2571-2579.
Leeman-Neill, R.J., Wheeler, S.E., Singh, S.V., Thomas, S.M., Seethala, R.R., Neill, D.B.,
Panahandeh, M.C., Hahm, E.R., Joyce, S.C., Sen, M., Cai, Q., Freilino, M.L., Li, C.,
Johnson, D.E., Grandis, J.R. (2009) Guggulsterone enhances head and neck cancer
134
therapies via inhibition of signal transducer and activator of transcription-3.
Carcinogenesis 30, 1848-1856.
Lens, M. (2006) Cutaneous melanoma: interferon alpha adjuvant therapy for patients at high
risk for recurrent disease. Dermatol. Ther. 19, 9–18.
Lens, M.B., Dawes, M. (2002) Interferon alpha therapy for malignant melanoma: a
systematic review of randomized controlled trials. J. Clin. Oncol. 20, 1818–1825.
Leonard, W., O‟Shea, J.J. (1998) JAKS and STATS: Biological implications. Annu. Rev.
Immunol. 16, 293-322.
Lesinski, G.B., Valentino, D., Hade, E.M., Jones, S., Magro, C., Chaudhury, A.R., Walker,
M.J., Carson, W.E. 3rd. (2005) Expression of STAT1 and STAT2 in malignant melanoma
does not correlate with response to interferon-alpha adjuvant therapy. Cancer Immunol.
Immunother. 54, 815–825.
Lesinski, G.B., Treffry, J., Brasdovich, M., Kondadasula, S.V., Sackey, K., Zimmerer, J.M.,
Chaudhury, A.R., Yu, L., Zhang, X., Crespin, T.R., Walker, M.J., Carson, W.E. 3rd.
(2007) Melanoma cells exhibit variable signal transducer and activator of transcription 1
phosphorylation and a reduced response of IFN- compared with immune effector cells.
Clin. Cancer Res. 13, 5010–5019.
Leung, S., Li, X., Stark, G.R.(1996) STATs find that hanging together can be stimulating.
Science 273, 750-751.
Levy, D.E. (1999) Physiological significance of STAT proteins: investigations through gene
disruption in vivo. Cell. Mol. Life Sci. 55, 1559–1567.
Levy, D.E., Gilliland, D.G. (2000) Divergent roles of STAT1 and STAT5 in malignancy as
revealed by gene disruption in mice. Oncogene 19, 2505-2510.
Levy, D.E., Darnell, J.E. Jr. (2002) Stats: transcriptional control and biological impact. Nat.
Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 651-662.
Li, M., Sendtner, M., Smith, A. (1995) Essential function of LIF receptor in motor neurons.
Nature 378, 724-727.
Li, Z., Metze, D., Nashan, D., Muller-Tidow, C., Serve, H.L., Poremba, C., Luger, T.A.,
Bohm, M. (2004) Expression of SOCS-1, suppressor of cytokine signalling-1, in human
melanoma. J. Invest. Dermatol. 123, 737–745.
Liao, J., Fu, Y., Shuai, K. (2000) Distinct roles of the NH2- and COOH-terminal domains of
the protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1
135
(PIAS1) in cytokine-induced PIAS1-Stat1 interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,
5267-5272.
Lin, J.X., Migone, T.S., Tsang, M., Friedmann, M., Weatherbee, J.A., Zhou, L., Yamauchi,
A., Bloom, E.T., Mietz, J., John, S., et al. (1995) The role of shared receptor motifs and
common Stat proteins in the generation of cytokine pleiotropy and redundancy by IL-2,
IL-4, IL-7, IL-13, and IL-15. Immunity 2, 331-339.
Liu, X., Robinson, G.W., Wagner, K.U., Garrett, L., Wynshaw-Boris, A., Hennighausen, L.
(1997) Stat5a is mandatory for adult mammary gland development and lactogenesis.
Genes Dev. 11, 179-186.
Liu, C.J., Wang, H., Lengyel, P. (1999) The interferon-inducible nucleolar p204 protein
binds the ribosomal RNA-specific UBF1 transcription factor and inhibits ribosomal RNA
transcription. EMBO J. 18, 2845-2854.
Liu, L., McBride, K.M., Reich, N.C. (2005) STAT3 nuclear import is independent of tyrosine
phosphorylation and mediated by importin-alpha3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 8150-
8155.
Look, D.C., Pelletier, M.R., Tidwell, R.M., Roswit, W.T., Holtzman, M.J. (1995) Stat1
depends on transcriptional synergy with Sp1. J. Biol. Chem. 270, 30264-30267.
Lu, C., Rak, J.W., Kobyashi, H., Kerbel, R.S. (1993) Increased resistance to oncostatin M-
induced growth inhibition of human melanoma cell lines derived from advanced-staged
lesions. Cancer Res. 53, 2708– 2711.
Lu, B., Ebensperger, C., Dembic, Z., Wang, Y., Kvatyuk, M., Lu, T., Coffman, R.L., Pestka,
S., Rothman, P.B. (1998) Targeted disruption of the interferon-gamma receptor 2 gene
results in severe immune defects in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8233-8238.
Lui, V.W., Boehm, A.L., Koppikar, P., Leeman, R.J., Johnson, D., Ogagan, M., Childs, E.,
Freilino, M., Grandis, J.R. (2007) Antiproliferative mechanisms of a transcription factor
decoy targeting signal transducer and activator of transcription (STAT) 3: the role of
STAT1. Mol. Pharmacol. 71, 1435-1443.
Maniatis, T., Falvo, J.V., Kim, T.H., Kim, T.K., Lin, C.H., Parekh, B.S., Wathelet, M.G.
(1998) Structure and function of the interferon-beta enhanceosome. Cold. Spring. Harb.
Symp. Quant. Biol. 63, 609-620.
Martino, A., Holmes, J.H. 4th., Lord, J.D., Moon, J.J., Nelson, B.H. (2001) Stat5 and Sp1
regulate transcription of the cyclin D2 gene in response to IL-2. J. Immunol.166, 1723-
1729.
136
Martone, R., Euskirchen, G., Bertone, P., Hartman, S., Royce, T.E., Luscombe, N.M., Rinn,
J.L., Nelson, F.K., Miller, P., Gerstein, M., Weissman, S., Snyder, M. (2003) Distribution
of NF-κB-binding sites across human chromosome 22. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,
12247-12252.
Mascareno, E., El-Shafei, M., Maulik, N., Sato, M., Guo, Y., Das, D.K., Siddiqui, M.A.
(2001) JAK/STAT signaling is associated with cardiac dysfunction during ischemia and
reperfusion. Circulation 104, 325-329.
Masuhara, M., Sakamoto, H., Matsumoto, A., Suzuki, R., Yasukawa, H., Mitsui, K.,
Wakioka, T., Tanimura, S., Sasaki, A., Misawa, H., Yokouchi, M., Ohtsubo, M.,
Yoshimura, A. (1997) Cloning and characterization of novel CIS family genes. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 239, 439-446.
Matsumoto, A., Masuhara, M., Mitsui, K., Yokouchi, M., Ohtsubo, M., Misawa, H.,
Miyajima, A., Yoshimura, A. (1997) CIS, acytokine inducible SH2 protein, is a target of
the JAK-STAT 5 pathway and modulates STAT 5 activation. Blood 89, 3148-3154.
McBride, K.M., McDonald, C., Reich, N.C. (2000) Nuclear export signal located within
theDNA-binding domain of the STAT1transcription factor. EMBO J. 19, 6196-6206.
Meier, V., Groner, B. (1994) The nuclear factor YY1 participates in repression of the beta-
casein gene promoter in mammary epithelial cells and is counteracted by mammary gland
factor during lactogenic hormone induction. Mol. Cell. Biol. 14, 128-137.
Melen, K., Kinnunen, L., Julkunen, I. (2001) Arginine/lysine-rich structural element is
involved in interferon-induced nuclear import of STATs. J. Biol. Chem. 276, 16447-
16455.
Meraz, M.A., White, J.M., Sheehan, K.C., Bach, E.A., Rodig, S.J., Dighe, A.S., Kaplan,
D.H., Riley, J. K., Greenlund, A. C., Campbell, D., Carver-Moore, K., DuBois, R.N.,
Clark,R., Aguet, M., Schreiber, R.D. (1996) Targeted disruption of the Stat1 gene in mice
reveals unexpected physiologic specificity in the JAKSTAT signaling pathway. Cell 84,
431-442.
Messina, J.L., Hua, Y., Riker, A.I., Munster, P.N., Jove, R.L., Daud, A.I. (2008) Activated
STAT-3 in melanoma. Cancer Control 15, 196–201.
Meyer, J., Jucker, M., Ostertag, W., Stocking, C. (1998) Carboxyl-truncated STAT5beta is
generated by a nucleus-associated serine protease in early hematopoietic progenitors.
Blood 91, 1901-1908.
137
Mikita, T., Kurama, M., Schindler, U. (1998) Synergistic activation of the germline epsilon
promoter mediated by Stat6 and C/EBP beta. J. Immunol. 161, 1822-1828.
Miyoshi, K., Cui, Y., Riedlinger, G., Robinson, P., Lehoczky, J., Zon, L., Oka, T., Dewar, K.,
Hennighausen, L. (2001) Structure of the mouse Stat 3/5 locus: evolution from Drosophila
to zebrafish to mouse. Genomics 71, 150-155.
Moore, K.W., de Waal Malefyt, R., Coffman, R.L., O'Garra, A. (2001) Interleukin-10 and the
interleukin-10 receptor. Annu. Rev. Immunol. 19, 683-765.
Moriggl, R., Gouilleux-Gruart, V., Jahne, R., Berchtold, S., Gartmann, C., Liu, X.,
Hennighausen, L., Sotiropoulos, A., Groner, B., Gouilleux, F. (1996) Deletion of the
carboxyl-terminal transactivation domain of MGF-Stat5 results in sustained DNA binding
and a dominant negative phenotype. Mol. Cell. Biol. 16, 5691-5700.
Moriggl, R., Topham, D.J., Teglund, S., Sexl, V., McKay, C., Wang, D., Hoffmeyer, A., van
Deursen, J., Sangster, M.Y., Bunting, K.D., Grosveld, G.C., Ihle, J.N. (1999) Stat5 is
required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells. Immunity 10, 249-
259.
Mowen, K.A., Tang, J., Zhu, W., Schurter, B.T., Shuai, K., Herschman, H.R., David, M.
(2001) Arginine methylation of STAT1 modulates IFNalpha/beta-induced transcription.
Cell 104, 731-741.
Muhlethaler-Mottet, A., Di Berardino, W., Otten, L.A., Mach, B. (1998) Activation of the
MHC class II transactivator CIITA by interferon-gamma requires cooperative interaction
between Stat1 and USF-1. Immunity 8, 157-166.
Mui, A., Wakao, H., O'Farrell, A.M., Harada, N., Miyajima, A. (1995) Interleukin-3,
granulocyte-macrophage colony stimulating factor and interleukin-5 transduce signals
through two STAT5 homologs. EMBO J. 14, 1166-1175.
Mui, A.L. (1999) The role of STATs in proliferation, differentiation, and apoptosis. Cell.
Mol. Life Sci. 55, 1547-1558.
Muller, M., Laxton, C., Briscoe, J., Schindler, C., Improta, T.,Darnell, J.E. Jr, Stark, G.R.,
Kerr, I. M. (1993) Complementation of a mutant cell line: central role of the 91 kDa
polypeptide of ISGF3 in the interferon-α and –γ signal transduction pathways. EMBO J.
12, 4221-4228.
Murphy, K.M., Ouyang, W., Farrar, J.D., Yang, J., Ranganath, S., Asnagli, H., Afkarian, M.,
Murphy, T.L. (2000a) Signaling and transcription in T helper development. Annu. Rev.
Immunol. 18, 451-494.
138
Murphy, T.L., Geissal, E.D., Farrar, J.D., Murphy, K.M. (2000b) Role of the Stat4 N domain
in receptor proximal tyrosine phosphorylation. Mol. Cell. Biol. 20, 7121-7131.
Murray, P.J. (2007) The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration.
J. Immunol. 178, 2632-2629.
Naka, T., Narazaki, M., Hirata, M., Matsumoto, T., Minamoto, S., Aono, A., Nishimoto, N.,
Kajita, T., Taga, T., Yoshizaki, K., Akira, S., Kishimoto, T. (1997) Structure and fiction of
a new STAT-induced inhibitor. Nature 387, 924-929.
Naka, T., Fujimoto, M., Kishimoto, T. (1999) Negative regulation of cytokine signaling:
STAT-induced STAT inhibitor. Trends Biochem. Sci. 24, 394-398.
Neubauer, H., Cumano, A., Mueller, M., Wu, H., Huffstadt, U., Pfeffer, K. (1998) Jak2
deficiency defines an essential development checkpoint in definitive hematopoiesis. Cell
93, 397-409.
Nishibori, T., Tanabe, Y., Su, L., David, M. (2004) Impaired development of CD4+ CD25+
regulatory T cells in the absence of STAT1: increased susceptibility to autoimmune
disease. J. Exp. Med. 199, 25-34.
Nosaka, T., van Deursen, J.M., Tripp, R.A., Thierfelder, W.E., Witthuhn, B.A., McMickle,
A.P., Doherty, P.C., Grosveld, G.C., Ihle, J.N. (1995) Defective lymphoid development in
mice lacking Jak3. Science 270, 800-802.
Nosaka, T., Kawashima, T., Misawa, K., Ikuta, K., Mui, A.L., Kitamura, T. (1999) STAT5 as
a molecular regulator of proliferation, differentiation and apoptosis in hematopoietic cells.
EMBO J. 18, 4754-4765.
Oates, A.C., Wollberg, P., Pratt, S.J., Paw, B.H., Johnson, S.L., Ho, R.K., Postlethwait, J.H.,
Zon, L.I., Wilks, A.F. (1999) Zebrafish stat3 is expressed in restricted tissues during
embryogenesis and stat1 rescues cytokine signaling in a STAT1-deficient human cell line.
Dev. Dyn. 215, 352-370.
Ohmori, Y., Schreiber, R.D., Hamilton, T.A. (1997) Synergy between interferon-gamma and
tumor necrosis factor-alpha in transcriptional activation is mediated by cooperation
between signal transducer and activator of transcription 1 and nuclear factor kappaB.
J. Biol. Chem. 272, 14899-14907.
Ohtani, T., Ishihara, K., Atsumi, T., Nishida, K., Kaneko, Y., Miyata, T., Itoh, S., Narimatsu,
M., Maeda, H., Fukada, T., Itoh, M., Okano, H., Hibi, M., Hirano, T. (2000) Dissection of
signaling cascades through gp130 in vivo: reciprocal roles for STAT3- and SHP2-
mediated signals in immune responses. Immunity 12, 95-105.
139
Oritani, K., Medina, K.L., Tomiyama, Y., Ishikawa, J., Okajima, Y., Ogawa, M., Yokota, T.,
Aoyama, K., Takahashi, I., Kincade, P.W., Matsuzawa, Y. (2000) Limitin: An interferon-
like cytokine that preferentially influences B-lymphocyte precursors. Nat. Med. 6, 659-
666.
Ormandy, C.J., Camus, A., Barra, J., Damotte, D., Lucas, B., Buteau, H., Edery, M.,
Brousse, N., Babinet, C., Binart, N., Kelly, P.A. (1997) Null mutation of the prolactin
receptor gene produces multiple reproductive defects in the mouse. Genes Dev. 11, 167-
178.
O´Shea, J.J.O., Gadina, M., Schreiber, R.D. (2002) Cytokine signaling in 2002: New
suprises in the Jak/Stat Pathway. Cell 109, 121-131.
Ossina, N.K., Cannas, A., Powers, V.C., Fitzpatrick, P.A., Knight, J.D., Gilbert, J.R.,
Shekhtman, E.M., Tomei, L.D., Umansky, S.R., Kiefer, M.C. (1997) Interferon-γ
modulates a p53-independent apoptotic pathway and apoptosis-related gene expression.
J. Biol. Chem. 272, 16351-16357.
Ouchi, T., Lee, S.W., Ouchi, M., Aaronson, S.A., Horvath, C.M. (2000) Collaboration of
signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and BRCA1 in differential
regulation of IFN-gamma target genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5208-5213.
Ouyang, W., Ranganath, S.H., Weindel, K., Bhattacharya, D., Murphy, T.L., Sha, W.C.,
Murphy, K.M. (1998) Inhibition of Th1 development mediated by GATA-3 through an
IL-4-independent mechanism. Immunity 9, 745-755.
Pansky, A., Hildebrand, P., Fasler-Kan, E., Baselgia, L., Ketterer, S., Beglinger, C., Heim,
M. H. (2000) Defective Jak-STAT signal transduction pathway in melanoma cells
resistant to growth inhibition by interferon-α. Int. J. Cancer 85, 720-725.
Parganas, E., Wang, D., Stravopodis, D., Topham, D.J., Marine, J.C., Teglund, S., Vanin,
E.F., Bodner, S., Colamonici, O.R., van Deursen, J.M., Grosveld, G., Ihle, J.N. (1998)
Jak2 is essential for signaling through a variety of cytokine receptors. Cell 93, 385-395.
Park, C., Lecomte, M.J., Schindler, C. (1999) Murine Stat2 is uncharacteristically divergent.
Nucleic Acids Res. 27, 4191-4199.
Park, C., Li, S., Cha, E., Schindler, C. (2000) Immune response in Stat2 knockout mice.
Immunity 13, 795-804.
Park, S.Y., Saijo, K., Takahashi, T., Osawa, M., Arase, H., Hirayama, N., Miyake, K.,
Nakauchi, H., Shirasawa, T., Saito, T. (1995) Developmental defects of lymphoid cells in
Jak3 kinase-deficient mice. Immunity 3, 771-782.
140
Pascal, A., Riou, J.F., Carron, C., Boucaut, J.C., Umbhauer, M. (2001) Cloning and
developmental expression of STAT5 in Xenopus laevis. Mech. Dev. 106, 171-174.
Paul, W.E. (1997) Interleukin 4: signalling mechanisms and control of T cell differentiation.
Ciba Found. Symp. 204, 208-216.
Pestka, S. (1997) The human interferon-alpha species and hybrid proteins. Semin. Oncol, 24
(3 Suppl. 9) S9, 4-17. Review.
Piazza, F., Valens, J., Lagasse, E., Schindler, C. (2000) Myeloid differentiation of FdCP1
cells is dependent on Stat5 processing. Blood 96, 1358-1365.
Pilz, A., Ramsauer, K., Heidari, H., Leitges, M., Kovarik, P., Decker, T. (2003)
Phosphorylation of the Stat1 transactivating domain is required for the response to type I
interferons. EMBO Rep. 4, 368-373.
Porta, C., Hadj-Slimane, R., Nejmeddine, M., Pampin, M., Tovey, M.G., Espert, L., Alvarez,
S., Chelbi-Alix, M.K. (2005) Interferons alpha and gamma induce p53-dependent and
p53-independent apoptosis, respectively. Int. J. Cancer 85, 720-725.
Price, K.L., Herlyn, M., Dent, C.L., Gewert, D.R., Linge, C. (2005) The prevalence of
interferon-alpha transcription defects in malignant melanoma. Melanoma Res. 15, 91–98.
Pugh, B.F. (2000) Control of gene expression through regulation of the TATA-binding
protein. Gene 255, 1-14.
Quesnelle, K.M., Boehm, A.L., Grandis, J.R. (2007) STAT-mediated EGFR signaling in
cancer. J. Cell. Biochem. 102, 311-319.
Ram, P.T., Iyengar, R. (2001) G protein coupled receptor signaling through the Src and Stat3
pathway: role in proliferation and transformation. Oncogene 20, 1601-1606.
Ramana, C.V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G.R. (2000) Complex roles of
Stat1 in regulating gene expression. Oncogene 19, 2619-2627.
Ramana, C.V., Gil, M.P., Han, Y., Ransohoff, R.M., Schreiber, R.D., Stark, G.R. (2001)
Stat1-independent regulation of gene expression in response to IFN-gamma. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 98, 6674-6679.
Ramana, C.V., Kumar, A., Enelow, R. (2005) Stat1-independent induction of SOCS-3 by
interferon-gamma is mediated by sustained activation of Stat3 in mouse embryonic
fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 327, 727–733.
Ramsauer, K., Sadzak, I., Porras, A., Pilz, A., Nebreda, A.R., Decker, T., Kovarik, P. (2002)
p38 MAPK enhances STAT1-dependent transcription independently of Ser-727
phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12859-12864.
141
Ransohoff, R.M. (1998) Cellular responses to interferons and other cytokines: the JAK-
STAT paradigm. N. Engl. J. Med. 338, 616–618.
Rawlings, J.S., Rosler, K.M., Harrison, D.A. (2004) The JAK/STAT signaling pathway.
J. Cell. Sci. 117, 1281–1283.
Remy, I., Wilson, I. A., Michnick, S.W. (1999) Erythropoietin receptor activation by a
ligand-induced conformation change. Science 283, 990-993.
Rodig, S.J., Meraz, M.A., White, J.M., Lampe, P.A., Riley, J.K., Arthur, C.D., King, K.L.,
Sheehan, K.C., Yin, L., Pennica, D., Johnson Jr, E.M., Schreiber, R.D. (1998) Disruption
of the Jak1 gene demonstrates obligatory and nonredundant roles of the Jaks in cytokine-
induced biologic responses. Cell 93, 373-383.
Rogge, L., D'Ambrosio, D., Biffi, M., Penna, G., Minetti, L.J., Presky, D.H., Adorini, L.,
Sinigaglia, F. (1998) The role of Stat4 in species-specific regulation of Th cell
development by type I IFNs. J. Immunol. 161, 6567-6574.
Rosenberg S. A. (1997), In: DeVita D.T., Hellman S. and Rosenberg S.A. (eds.): Principles
of Cancer Management: Biologic Therapy, pp. 349-373. Philadelphia: J.B. Lippincott.
Ruvkun, G., Hobert, O. (1998) The taxonomy of developmental control in Caenorhabditis
elegans. Science 282, 2033-2041.
Ryan, J.J., McReynolds, L.J., Keegan, A., Wang, L.H., Garfein, E., Rothman, P., Nelms, K.,
Paul, W.E. (1996) Growth and gene expression are predominantly controlled by distinct
regions of the human IL-4 receptor. Immunity 4, 123-132.
Sahni, M., Raz, R., Coffin, J. D., Levy, D., Basilico, C. (2001) STAT1 mediates the increased
apoptosis and reduced chondrocyte proliferation in mice overexpressing FGF2.
Development 128, 2119-2129.
Saijo, K., Park, S.Y., Ishida, Y., Arase, H., Saito, T. (1997) Crucial role of Jak3 in negative
selection of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 185, 351-356.
Sakai, I., Takeuchi, K., Yamauchi, H., Narumi, H., Fujita, S. (2002) Constitutive expression
of SOCS3 confers resistance to IFN-alpha in chronic myelogenous leukemia cells. Blood
100, 2926–2931.
Sano, S., Itami, S., Takeda, K., Tarutani, M., Yamaguchi, Y., Miura, H., Yoshikawa, K.,
Akira, S., Takeda, J. (1999) Keratinocyte-specific ablation of Stat3 exhibits impaired skin
remodeling, but does not affect skin morphogenesis. EMBO J. 18, 4657-4668.
142
Sano, S., Kira, M., Takagi, S., Yoshikawa, K., Takeda, J., Itami, S. (2000) Two distinct
signaling pathways in hair cycle induction: Stat3-dependent and -independent pathways.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13824-13829.
Santos, F.P., Kantarjian, H.M., Jain, N., Manshouri, T., Thomas, D.A., Garcia-Manero, G.,
Kennedy, D., Estrov, Z., Cortes, J., Verstovsek, S. (2010) Phase 2 study of CEP-701, an
orally available JAK2 inhibitor, in patients with primary or post-polycythemia
vera/essential thrombocythemia myelofibrosis. Blood 115, 1131-1136.
Schaefer, T.S., Sanders, L.K., Park, O.K., Nathans, D. (1997) Functional differences between
Stat3alpha and Stat3beta. Mol. Cell. Biol. 17, 5307-5316.
Schindler, C., Fu, X.Y., Improta, T., Aebersold, R., Darnell, J.E. Jr. (1992a) Proteins of
transcription factor ISGF-3: one gene encodes the 91-and 84-kDa ISGF-3 proteins that are
activated by interferon α. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7836-7839.
Schindler, C., Shuai, K., Prezioso, V.R., Darnell, J.E. Jr. (1992b) Interferon-dependent
tyrosine phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factor. Science 257,
809-813.
Schindler, C., Darnell, J.E. Jr. (1995) Transcriptional responses to polypeptide ligands: the
JAK-STAT pathway. Annu Rev Biochem 64, 621-651. Review.
Schindler, C. (1999) Cytokines and JAK-STAT signaling. Exp. Cell. Res. 253, 7–14.
Schindler, C., Strehlow, I. (2000) Cytokines and STAT signaling. Adv. Pharmacol. 47,
113-174.
Schindler, U., Wu, P., Rothe, M., Brasseur, M., McKnight, S.L. (1995) Components of a Stat
recognition code: evidence for two layers of molecular selectivity. Immunity 2, 689-697.
Schwaller, J., Parganas, E., Wang, D., Cain, D., Aster, J.C., Williams, I.R., Lee, C.K.,
Gerthner, R., Kitamura, T., Frantsve, J., Anastasiadou, E., Loh, M.L., Levy, D.E., Ihle,
J.N., Gilliland, D.G. (2000) Stat5 is essential for the myelo- and lymphoproliferative
disease induced by TEL/JAK2. Mol. Cell 6, 693-704.
Seidel, H.M., Milocco, L.H., Lamb, P., Darnell, J.E. Jr., Stein, R.B., Rosen, J. (1995) Spacing
of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and
activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92, 3041-3045.
Sen, B., Saigal, B., Parikh, N., Gallick, G., Johnson, F.M. (2009a) Sustained Src inhibition
results in signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) activation and cancer
143
cell survival via altered Janus-activated kinase-STAT3 binding. Cancer Res. 69, 1958-
1965.
Sen, M., Tosca, P.J., Zwayer, C., Ryan, M.J., Johnson, J.D., Knostman, K.A., Giclas, P.C.,
Peggins, J.O., Tomaszewski, J.E., McMurray, T.P., Li, C., Leibowitz, M.S., Ferris, R.L.,
Gooding, W.E., Thomas, S.M., Johnson, D.E., Grandis, J.R. (2009b) Lack of toxicity of a
STAT3 decoy oligonucleotide. Cancer Chemother. Pharmacol. 63, 983-995.
Sexl, V., Piekorz, R., Moriggl, R., Rohrer, J., Brown, M.P., Bunting, K.D., Rothammer, K.,
Roussel, M.F., Ihle, J.N. (2000) Stat5a/b contribute to interleukin 7-induced B-cell
precursor expansion, but abl- and bcr/abl-induced transformation are independent of stat5.
Blood 96, 2277-2283.
Shankaran, V., Ikeda, H., Bruce, A.T., White, J.M., Swanson, P.E., Old, L.J., Schreiber,
R.D. (2001) IFNγ and lymphocytes prevent primary tumour development and shape
tumour immunogenicity. Nature 410, 1107-1111.
Shen, C.H., Stavnezer, J. (1998) Interaction of stat6 and NF-kappaB: direct association and
synergistic activation of interleukin-4-induced transcription. Mol. Cell. Biol. 18, 3395-
3404.
Shimoda, K., van Deursen, J., Sangster, M.Y., Sarawar, S.R., Carson, R.T., Tripp, R.A., Chu,
C., Quelle, F.W., Nosaka, T., Vignali, D.A., Doherty, P.C., Grosveld, G., Paul, W.E., Ihle,
J.N. (1996) Lack of IL-4-induced Th2 response and IgE class switching in mice with
disrupted Stat6 gene. Nature 380, 630-633.
Shimoda, K., Kato, K., Aoki, K., Matsuda, T., Miyamoto, A., Shibamori, M., Yamashita, M.,
Numata, A., Takase, K., Kobayashi, S., Shibata, S., Asano, Y., Gondo, H., Sekiguchi, K.,
Nakayama, K., Nakayama, T., Okamura, T., Okamura, S., Niho, Y. (2000) Tyk2 plays a
restricted role in IFN alpha signaling, although it is required for IL-12-mediated T cell
function. Immunity 13, 561-571.
Shin, E.C., Ahn, J.M., Kim, C. H., Choi, Y., Ahn, Y. S., Kim, H., Kim, S. J., Park, J. H.
(2001) IFN-γ induces cell death in human hepatoma cells through a TRAIL/death
receptormediated apoptotic pathway. Int. J. Cancer 93, 262-268.
Shuai, K. (1999) The STAT family of proteins in cytokine signaling. Prog. Biophys. Mol.
Biol. 71, 405-422.
Shuai, K. (2000) Modulation of STAT signaling by STAT interacting proteins. Oncogene 19,
2638-2644.
144
Shuai, K., Ziemiecki, A., Wilks, A. F., Harpur, A. G., Sadowski, H. B., Gilman, M. Z.,
Darnell, J. E. (1993) Polypeptide signalling to the nucleus through tyrosine
phosphorylation of Jak and Stat proteins. Nature 366, 580-583.
Shuai, K., Horvath, C.M., Huang, L.H., Qureshi, S.A., Cowburn, D., Darnell, J.E. Jr. (1994)
Interferon activation of the transcription factor Stat91 involves dimerization through SH2-
phosphotyrosyl peptide interactions. Cell 76, 821-828.
Silva, C.M. (2004) Role of STATs as downstream signal transducers in Src family kinase-
mediated tumorigenesis. Oncogene 23, 8017-8023.
Sinibaldi D., Wharton W., Turkson J., Bowman T., Pledger W.J., Jove R. (2000) Induction of
p21WAF1/CIP1 and cyclin D1 expression by the Src oncoprotein in mouse fibroblasts:
role of activated STAT 3 signaling. Oncogene 19, 5419-5427.
Socolovsky, M., Fallon, A.E., Wang, S., Brugnara, C., Lodish, H.F. (1999) Fetal anemia and
apoptosis of red cell progenitors in Stat5a-/-5b-/- mice: a direct role for Stat5 in Bcl-X(L)
induction. Cell 98, 181-191.
Spencer, S.D., Di Marco, F., Hooley, J., Pitts-Meek, S., Bauer, M., Ryan, A.M., Sordat, B.,
Gibbs, V.C., Aguet, M. (1998) The orphan receptor CRF2-4 is an essential subunit of the
interleukin 10 receptor. J. Exp. Med. 187, 571-578.
Stark, G. R., Kerr, I. M., Williams, B.R., Silverman, R.H., Schreiber, R.D. (1998) How cells
respond to interferons. Annu. Rev. Biochem. 67, 227-264.
Starr R., Willson T.A., Viney E.M., Murray L.J., Rayner J.R., Jenkins B.J., Gonda TJ.,
Alexander W.S., Metcalf D., Nicola N.A., Hilton D.J. (1997) A family of cytokine-
inducible inhibitors of signaling. Nature 387, 917-921.
Starr, R., Hilton, D. J. (1999) Negative regulation of the JAK/STAT pathway. BioEssays 21,
47-52.
Stephanou, A., Brar, B.K., Scarabelli, T.M., Jonassen, A.K., Yellon, D.M., Marber, M.S.,
Knight, R.A., Latchman, D.S. (2000) Ischemia-induced STAT-1 expression and activation
play a critical role in cardiomyocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 275, 10002-10008.
Stephanou, A., Latchman, D.S. (2005) Opposing actions of STAT-1 and STAT-3. Growth
Factors 23, 177-182.
Stocklin, E., Wissler, M., Gouilleux, F., Groner, B. (1996) Functional interactions between
Stat5 and the glucocorticoid receptor. Nature 383, 726-728.
145
Strehlow, I., Schindler, C. (1998) Amino-terminal signal transducer and activator of
transcription (STAT) domains regulate nuclear translocation and STAT deactivation.
J. Biol. Chem. 273, 28049-28056.
Strodicke, M., Karberg, S., Korge, G. (2000) Domina (Dom), a new Drosophila member of
the FKH/WH gene family, affects morphogenesis and is a suppressor of position-effect
variegation. Mech. Dev. 96, 67-78.
Su, W. C., Kitagawa, M., Xue, N., Xie, B., Garofalo, S., Cho, J., Deng, C., Horton, W.A., Fu,
X. Y. (1997) Activation of Stat1 by mutant fibroblast growth-factor receptor in
thanatophoric dysplasia type II dwarfism. Nature 386, 288-292.
Suk, K., Kim, S., Kim, Y.H., Kim, K. A., Chang, I., Yagita, H., Shong, M., Lee, M.S. (2001)
IFN-γ/TNF-α synergism as the final effector in autoimmune diabetes: a key role for
STAT1/IFN regulatory factor-1 pathway in pancreatic β cell death. J. Immunol. 166,
4481-4489.
Sutherland, K.D., Lindeman, G.J., Choong, D.Y.H., Wittlin, S., Brentzell, L., Phillips, W.,
Campbell, I.G., Visvader, J.E. (2004) Differential hypermethylation of SOCS genes in
ovarian and breast carcinomas. Oncogene 23, 7726– 7733.
Suzuki, H., Kundig, T.M., Furlonger, C., Wakeham, A., Timms, E., Matsuyama, T., Schmits,
R., Simard, J.J., Ohashi, P.S., Griesser, H., Tanaguchi, T., Paige, C.J., Mak, T.W. (1995)
Deregulated T cell activation and autoimmunity in mice lacking interleukin-2 receptor
beta. Science 268, 1472-1476.
Takayanagi, H., Kim, S., Matsuo, K., Suzuki, H., Suzuki, T., Sato, K., Yokochi, T., Oda, H.,
Nakamura, K., Ida, N., Wagner, E.F., Taniguchi, T. (2002) RANKL maintains bone
homeostasis through c-Fos-dependent induction of interferon-β. Nature 416, 744-749.
Takeda, K., Tanaka, T., Shi, W., Matsumoto, M., Minami, M., Kashiwamura, S., Nakanishi,
K., Yoshida, N., Kishimoto, T., Akira, S. (1996) Essential role of Stat6 in IL-4 signalling.
Nature 380, 627-630.
Takeda, K., Noguchi, K., Shi, W., Tanaka, T., Matsumoto, M., Yoshida, N., Kishimoto, T.,
Akira, S. (1997) Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic
lethality. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3801-3804.
Takeda, K., Kaisho, T., Yoshida, N., Takeda, J., Kishimoto, T., Akira, S. (1998) Stat3
activation is responsible for IL-6-dependent T cell proliferation through preventing
apoptosis: generation and characterization of T cell-specific Stat3-deficient mice.
J. Immunol. 161, 4652-4660.
146
Takeda, K., Clausen, B.E., Kaisho, T., Tsujimura, T., Terada, N., Forster, I., Akira, S. (1998)
Enhanced Th1 activity and development of chronic enterocolitis in mice devoid of Stat3 in
macrophages and neutrophils. Immunity 10, 39-49.
Takeda, K., Akira, S. (2000) STAT family of transcription factors in cytokine-mediated
biological responses. Cytokine Growth Factor Rev. 11, 199-207.
Takeshita, T., Arita, T., Higuchi, M., Asao, H., Endo, K., Kuroda, H., Tanaka, N., Murata,
K., Ishii, N., Sugamura, K. (1997) STAM, signal transducing adaptor molecule, is
associated with Janus kinases and involved in signaling for cell growth and c-myc
induction. Immunity 6, 449-457.
Teglund, S., McKay, C., Schuetz, E., van Deursen, J.M., Stravopodis, D., Wang, D., Brown,
M., Bodner, S., Grosveld, G., Ihle, J.N. (1998) Stat5a and Stat5b proteins have essential
and nonessential, or redundant, roles in cytokine responses. Cell 93, 841-850.
ten Hoeve, J., de Jesus Ibarra-Sanchez, M., Fu, Y., Zhu, W., Tremblay, M., David, M., Shuai,
K. (2002) Identification of a nuclear Stat1 protein tyrosine phosphatase. Mol. Cell. Biol.
22, 5662-5668.
Thierfelder, W.E., van Deursen, J.M., Yamamoto, K., Tripp, R.A., Sarawar, S.R., Carson,
R.T., Sangster, M.Y., Vignali, D.A., Doherty, P.C., Grosveld, G.C., Ihle, J.N. (1996)
Requirement for Stat4 in interleukin-12-mediated responses of natural killer and T cells.
Nature 382, 171-174.
Thomas, M., Finnegan, C.E., Rogers, K.M., Purcell, J.W., Trimble, A., Johnston, P.G.,
Boland, M.P. (2004) STAT1: a modulator of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer
Res. 64, 8357-8364.
Thomis, D.C., Gurniak, C.B., Tivol, E., Sharpe, A.H., Berg, L.J. (1995) Defects in B
lymphocyte maturation and T lymphocyte activation in mice lacking Jak3. Science 270,
794-797.
Timofeeva, O.A., Plisov, S., Evseev, A.A., Peng, S., Jose-Kampfner, M., Lovvorn, H.N.,
Dome, J.S., Perantoni, A.O. (2006) Serine-phosphorylated STAT1 is a prosurvival factor
in Wilms‟ tumor pathogenesis. Oncogene 25, 7555– 7564.
Townsend, P.A., Scarabelli, T.M., Davidson, S.M., Knight, R.A., Latchman, D.S.,
Stephanou, A. (2004) STAT-1 interacts with p53 to enhance DNA damage-induced
apoptosis. J. Biol. Chem. 279, 5811-5820.
Turkson, J., Jove, R. (2000) STAT proteins: novel molecular targets for cancer drug
discovery. Oncogene 19, 6613-6626.
147
Udy, G.B., Towers, R.P., Snell, R.G., Wilkins, R.J., Park, S.H., Ram, P.A., Waxman, D.J.,
Davey, H.W. (1997) Requirement of STAT5b for sexual dimorphism of body growth rates
and liver gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7239-7244.
Van Parijs, L., Refaeli, Y., Lord, J.D., Nelson, B.H., Abbas, A.K., Baltimore, D. (1999)
Uncoupling IL-2 signals that regulate T cell proliferation, survival, and Fas-mediated
activation-induced cell death. Immunity 11, 281-288.
Velazquez, L., Mogensen, K.E., Barbieri, G., Fellous, M., Uzé, G., Pellegrini, S. (1992)
Distinct domains of the protein tyrosine kinase tyk2 required for binding of interferon-
alpha/beta and for signal transduction. J. Biol. Chem. 270, 3327-3334.
Verstovsek, S., Kantarjian, H., Mesa, R.A., Pardanani, A.D., Cortes-Franco, J., Thomas,
D.A., Estrov, Z., Fridman, J.S., Bradley, E.C., Erickson-Viitanen, S., Vaddi, K., Levy, R.,
Tefferi, A. (2010) Safety and efficacy of INCB018424, a JAK1 and JAK2 inhibitor, in
myelofibrosis. N. Engl. J. Med. 363, 1117-1127.
Vinkemeier, U., Cohen, S.L., Moarefi, I., Chait, B.T., Kuriyan, J., Darnell, J.E. Jr. (1996)
DNA binding of in vitro activated Stat1 alpha, Stat1 beta and truncated Stat1: interaction
between NH2-terminal domains stabilizes binding of two dimers to tandem DNA sites.
EMBO J. 15, 5616-5626.
Vinkemeier, U., Moarefi, I., Darnell, J.E. Jr, Kuriyan, J. (1998) Structure of the amino-
terminal protein interaction domain of STAT-4. Science 279, 1048-1052.
Visconti, R., Gadina, M., Chiariello, M., Chen, E.H., Stancato, L.F., Gutkind, J.S., O'Shea,
J.J. (2000) Importance of the MKK6/p38 pathway for interleukin-12-induced STAT4
serine phosphorylation and transcriptional activity. Blood 96, 1844-1852.
von Freeden-Jeffry,U., Vieira, P., Lucian, L.A., McNeil, T., Burdach, S.E., Murray, R.
(1995) Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a
nonredundant cytokine. J. Exp. Med. 181, 1519-1526.
Von Stamm, U., Brocker, E.B., von Depka Prondzinski, M., Ruiter, D.J., Rumke, P.,
Broding, C., Carrel, S., Lejeune, F.J. (1993) Effects of systemic interferonalpha (IFN-
alpha) on the antigenic phenotype of melanoma metastases. EORTC melanoma group
cooperative study No. 18852. Melanoma Res. 3, 173-180.
Waldmann, T.A., Dubois, S., Tagaya, Y. (2001) Contrasting roles of IL-2 and IL-15 in the
life and death of lymphocytes: implications for immunotherapy. Immunity 14, 105-110.
Wang, D., Moriggl, R., Stravopodis, D., Carpino, N., Marine, J.C., Teglund, S., Feng, J., Ihle,
J.N. (2000) A small amphipathic alpha-helical region is required for transcriptional
148
activities and proteasome-dependent turnover of the tyrosine-phosphorylated Stat5. EMBO
J. 19, 392-399.
Wang, T., Niu, G., Kortylewski, M., Burdelya, L., Shain, K., Zhang, S., Bhattacharya, R.,
Gabrilovich, D., Heller, R., Coppola, D., Dalton, W., Jove, R., Pardoll, D., Yu, H. (2004)
Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor
cells. Nat. Med. 10, 48-54.
Ware, C.B., Horowitz, M.C., Renshaw, B.R., Hunt, J.S., Liggitt, D., Koblar, S.A., Gliniak,
B.C., McKenna, H.J., Papayannopoulou, T., Thoma, B., Cheng, L., Donovan, P.J.,
Peschon, J.J., Barlett, P.F., Willis, C.R., Wright, B.D., Carpenter, M.K., Davison, B.L.,
Gearing, D.P. (1995) Targeted disruption of the low-affinity leukemia inhibitory factor
receptor gene causes placental, skeletal, neural and metabolic defects and results in
perinatal death. Development 121, 1283-1299.
Waxman, D.J., Ram, P.A., Park, S.H., Choi, H.K. (1995) Intermittent plasma growth
hormone triggers tyrosine phosphorylation and nuclear translocation of a liver-expressed,
Stat 5-related DNA binding protein. Proposed role as an intracellular regulator of male-
specific liver gene transcription. J. Biol. Chem. 270, 13262-13270.
Weber, A., Hengge, U.R., Bardenheuer, W., Tischoff, I., Sommerer, F., Markwarth, A.,
Dietz, A., Wittekind, C., Tannapfel, A. (2005) SOCS-3 is frequently methylated in head
and neck squamous cell carcinoma and its precursor lesions and causes growth inhibition.
Oncogene 24, 6699– 6708.
Wellbrock, C., Weisser, C,. Hassel, J.C., Fischer, P., Becker, J., Vetter, C.S., Behrmann, I.,
Kortylewski, M., Heinrich, P.C., Schartl, M. (2005) STAT5 contributes to interferon
resistance of melanoma cells. Curr. Biol. 15, 1629– 1639.
Wells, J.A. (1996) Hormone mimicry. Science 273, 449-450.
Wen, Z., Zhong, Z., Darnell, J.E. Jr. (1995) Maximal activation of transcription by Stat1 and
Stat3 requires both tyrosine and serine phosphorylation. Cell 82, 241-250.
Widschwendter, A., Tonko-Geymayer, S., Welte, T., Daxenbichler, G., Marth, C., Doppler,
W. (2002) Prognostic significance of signal transducer and activator of transcription
1 activation in breast cancer. Clin. Cancer Res. 8, 3065-3074.
Wilks, A.F. (2008) The JAK kinases: not just another kinase drug discovery target. Sem. Cell.
Devel. Biol. 19, 319-328.
Wong, L.H., Krauer K.G., Hatzinisiriou I., Estcourt M.J., Hersey P., Tam N.D., Edmondson
S., Devenish R.J., Ralph S.J. (1997) Interferon-resistant human melanoma cells are
149
deficient in ISGF 3 components, STAT 1, STAT 2 and p48-ISGF 3gamma. J. Biol. Chem.
272, 28779-28785.
Wormald, S., Hilton, D.J. (2004) Inhibitors of cytokine signal transduction. J.Biol. Chem.
279, 821-824.
Wormald, S., Hilton, D.J., Smyth, G.K., Speed, T.P. (2006a) Proximal genomic localization
of STAT1 binding and regulated transcriptional activity. BMC Genomics 7, 254.
Wormald, S., Zhang, J.G., Krebs, D.L., Mielke, L.A., Silver, J., Alexander, W.S., Speed,
T.P., Nicola, N.A., Hilton, D.J. (2006b) The comparative roles of suppressor of cytokine
signaling-1 and -3 in the inhibition and desensitization of cytokine signaling. J. Biol.
Chem. 281, 11135-11143.
Wu, H., Liu, X., Jaenisch, R., Lodish, H.F. (1995) Generation of committed erythroid BFU-E
and CFU-E progenitors does not reguire erythropoietin or the erythropoietin receptor. Cell
83, 59-67.
Wurster, A.L., Tanaka, T., Grusby, M.J. (2000) The biology of Stat4 and Stat6. Oncogene
19, 2577-2584.
Wyszomierski, S.L., Rosen, J.M. (2001) Cooperative effects of STAT5 (signal transducer
and activator of transcription 5) and C/EBPbeta (CCAAT/enhancer-binding protein-beta)
on beta-casein gene transcription are mediated by the glucocorticoid receptor. Mol.
Endocrinol. 15, 228-240.
Xia, Z., Baer, M. R., Block, A. W., Baumann, H., Wetzler, M. (1998) Expression of signal
transducers and activators of transcription proteins in acute myeloid leukemia blasts.
Cancer Res. 58, 3173-3180.
Xie, M.H., Aggarwal, S., Ho, W.H., Foster, J., Zhang, Z., Stinson, J., Wood, W.I., Goddard,
A.D., Gurney, A.L. (2000) Interleukin (IL)-22, a novel human cytokine that signals
through the interferon receptor-related proteins CRF2-4 and IL-22R. J. Biol. Chem. 275,
31335-31339.
Xie, T.X., Huang, F.J., Aldape, K.D., Kang, S.H., Liu, M., Gershenwald, J.E., Xie, K.,
Sawaya, R., Huang, S. (2006) Activation of stat3 in human melanoma promotes brain
metastasis. Cancer Res. 15, 3188–3196.
Xu, X., Sun, Y.L., Hoey, T. (1996) Cooperative DNA binding and sequence-selective
recognition conferred by the STAT amino-terminal domain. Science 273, 794-797.
150
Xu, X., Fu, X. Y., Plate, J., Chong, A. S. (1998) IFN-gamma induces cell growth inhibition
by Fas-mediated apoptosis: requirement of STAT1 protein for up-regulation of Fas and
FasL expression. Cancer Res. 58, 2832-2837.
Yaffe, M.B. and Cantley, L.C. (1999) Signal transduction. Grabbing phosphoproteins. Nature
402, 30-31.
Yamashita, H., Xu, J., Erwin, R.A., Farrar, W.L., Kirken, R.A., Rui, H. (1998) Differential
control of the phosphorylation state of proline-juxtaposed serine residues Ser725 of Stat5a
and Ser730 of Stat5b in prolactin-sensitive cells. J. Biol. Chem. 273, 30218-30224.
Yang, C.H., Murti, A., Pfeffer, L.M. (1998): STAT 3 complements defects in an interferon-
resistant cell line: evidence for an essential role for STAT 3 in interferon signaling and
biological activities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5568-5572.
Yang, E., Wen, Z., Haspel, R.L., Zhang, J.J., Darnell, J.E. Jr. (1999) The linker domain of
Stat1 is required for gamma interferon-driven transcription. Mol. Cell. Biol. 19,
5106-5112.
Ye, B.H., Cattoretti, G., Shen, Q., Zhang, J., Hawe, N., de Waard, R., Leung, C., Nouri-
Shirazi, M., Orazi, A., Chaganti, R.S., Rothman, P., Stall, A.M., Pandolfi, P.P., Dalla-
Favera, R. (1997) The BCL-6 proto-oncogene controls germinal-centre formation and
Th2-type inflammation. Nat. Genet. 16, 161-170.
Yeh, T.C., Pellegrini, S. (1999) The Janus kinase family of protein tyrosine kinases and their
role in signaling. Cell. Mol. Life Sci. 55, 1523-1534.
Yeh, T.C., Dondi, E., Uze, G., Pellegrini, S. (2000) A dual role for the kinase-like domain of
the tyrosine kinase Tyk2 in interferon-alpha signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,
8991-8996.
Yi, T., Mui, A.L., Krystal, G., Ihle, J.N. (1993) Hematopoietic cell phosphatase associates
with the interleukin-3 (IL-3) receptor beta chain and down-regulates IL-3-induced tyrosine
phosphorylation and mitogenesis. Mol. Cell. Biol. 13, 7577-7586.
Yoshikawa, H., Matsubara, K., Qian, G.S., Jackson, P., Groopman, J.D., Manning, J.E.,
Harris, C.C., Herman, J.G. (2001) SOCS-1, a negative regulator of the JAK/STAT
pathway, is silenced by methylation in human hepatocellular carcinoma and shows
growth-suppression activity. Nat. Genet. 28, 29–35.
Yoshimura A., Ohkubo T., Kignchi T., Jenkins N.A., Gilbert D.J., Copeland N.G., Hara T.,
Miyajima A. (1995) A novel cytokine-inducible gene CIS encodes an SH2- containing
151
protein that binds to tyrosine phosphorylated interleukin 3 and erythropoietin receptors.
EMBO J. 14, 2816-2826.
You, M., Yu, D.H., Feng, G.S. (1999) Shp-2 tyrosine phosphatase functions as a negative
regulator of the interferon stimulated Jak/STAT pathway. Mol. Cell. Biol. 19, 2416-2424.
Yu, C.L., Meyer, D.J., Campbell, G.S., Larner, A.C., Carter-Su, C., Schwartz, J., Jove, R.
(1995) Enhanced DNA-binding activity of a Stat3-related protein in cells transformed by
the Src oncoprotein. Science 269, 81-83.
Yu, C.L., Burakoff, S.J. (1997) Involvement of proteasomes in regulating Jak-STAT
pathways upon interleukin-2 stimulation. J. Biol. Chem. 272, 14017-14020.
Yu, C.L., Jin, Y.J., Burakoff, S.J. (2000) Cytosolic tyrosine dephosphorylation of STAT5.
Potential role of SHP-2 in STAT5 regulation. J. Biol. Chem. 275, 599-604.
Zeidler, M.P., Bach, E.A., Perrimon, N. (2000) The roles of the Drosophila JAK/STAT
pathway. Oncogne 19, 2598-2606.
Zhang, X., Blenis, J., Li, H.C., Schindler, C., Chen-Kiang, S. (1995) Requirement of serine
phosphorylation for formation of STAT-promoter complexes. Science 267, 1990-1994.
Zhang, J.J., Zhao, Y., Chait, B.T., Lathem, W.W., Ritzi, M., Knippers, R., Darnell, J.E. Jr.
(1998) Ser727-dependent recruitment of MCM5 by Stat1alpha in IFN-gamma-induced
transcriptional activation. EMBO J. 17, 6963-6971.
Zhang, J.G., Farley, A., Nicholson, S.E., Willson, T.A., Zugaro, L.M., Simpson, R.J., Moritz,
R.L., Cary, D., Richardson, R., Hausmann, G., Kile, B.J., Kent, S.B., Alexander, W.S.,
Metcalf, D., Hilton, D.J., Nicola, N.A., Baca, M. (1999a) The conserved SOCS box motif
in suppressors of cytokine signaling binds to elongins B and C and may couple bound
proteins to proteasomal degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2071-2076.
Zhang, X., Wrzeszczynska, M.H., Horvath, C.M., Darnell, J.E. Jr. (1999b) Interacting
regions in Stat3 and c-Jun that participate in cooperative transcriptional activation. Mol.
Cell. Biol. 19, 7138-7146.
Zhang, T., Kee, W.H., Seow, K.T., Fung, W., Cao, X. (2000) The coiled-coil domain of Stat3
is essential for its SH2 domain-mediated receptor binding and subsequent activation
induced by epidermal growth factor and interleukin-6. Mol. Cell. Biol. 20, 7132-7139.
Zhang, X., Zhang, J., Wang, L., Wei, H., Tian, Z. (2007) Therapeutic effects of STAT3
decoy oligodeoxynucleotide on human lung cancer in xenograft mice. BMC Cancer 7,
149-160.
152
Zhu, M., John, S., Berg, M., Leonard, W.J. (1999) Functional association of Nmi with Stat5
and Stat1 in IL-2- and IFNgamma-mediated signaling. Cell 96, 121-130.
Zhang, C., Li, B., Zhang, X., Hazarika, P., Aggarwal, B.B., Duvic, M. (2010) Curcumin
selectively induces apoptosis in cutaneous T-cell lymphoma cell lines and patients'
PBMCs: potential role for STAT-3 and NF-kappaB signaling. J. Invest. Dermatol. 130,
2110-2119.
153
SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK
STAT Proteiny transdukce signálů a aktivátory transkripce
(signal transducers and activators of transcription)
JAK Janusovy tyrozin kinázy (Janus tyrozin kinases)
SOCS proteinové supresory cytokinové signalizace
(suppressors of cytokine signalling)
PIAS proteinové inhibitory aktivovaných STAT proteinů
(protein inhibitors of activated STATs)
SH2 doména Src homologická doména (Src homology 2 domain)
Ser 727, S727 serin 727
Tyr 701, Y701 tyrozin 701
IFN-α interferon alfa
IFN-β interferon beta
IFN-γ interferon gama
IL interleukiny
TNF nádorový nekrotický faktor (tumor necrosis factor)
GF růstový faktor (growth factor)
EGF-R receptor pro epidermální růstový faktor
(receptor for epidermal growth factor)
CSF-1R receptor pro kolonie stimulující faktor-1
(receptor for colony stimulating factor 1)
PDGF-R receptor pro růstový faktor odvozený z destiček
(receptor for platelet-derived growth factor)
Epo erytropoetin
Tpo tyroid peroxidáza (thyroid peroxidase)
γC řetězec gama (gamma chain)
IFNAR receptory pro interferony (receptor for interferons)
PTK proteintyrozinkinázy
ISRE IFN Stimulation Response Element
GAS IFN-Gamma Activation Site
MEF myší embryonální fibroblasty
154
SEZNAM VŠECH PUBLIKACÍ DOKTORANDKY
1. Humpoliková-Adámkova L, Kovařík J, Dušek L, Lauerová L, Boudný V, Fait V, Fojtová
M, Krejčí E, Kovařík A. (2009) Interferon-alpha treatment may negatively influence disease
progression in melanoma patients by hyperactivation of STAT3 protein. Eur. J. Cancer 45,
1315-1323.
2. Souckova K, Kovarik A, Dusek L, Humpolikova-Adamkova L, Lauerova L, Krejci E,
Matouskova E, Bursikova E, Fojtova M, Kovarik J. (2009) Reduced inducibility of SOCS3 by
interferon gamma associates with higher resistance of human breast cancer lines as compared
to normal mammary epithelial cells. Neoplasma 56, 379-386.
3. Boudny V, Adamkova L, Souckova K, Lauerova L, Krejci E, Fait V. (2008) Defective
IFNα/γ-induced STAT3 protein activation in human malignant melanoma cells.
Mol. Med. Report 1, 909-915.
4. Fojtova M, Boudny V, Kovarik A, Lauerova L, Adamkova L, Souckova K, Jarkovsky J,
Kovarik J. (2007) Development of IFN-gamma resistance is associated with attenuation
of SOCS genes induction and constitutive expression of SOCS 3 in melanoma cells. Br. J.
Cancer 97, 231-237.
5. Adamkova L, Soucková K, Kovarík J. (2007) Transcription protein STAT1: biology and
relation to cancer. Folia Biol. (Praha) 53, 1-6.
6. Kovarik A, Fojtova M, Boudny V, Adamkova L, Lauerova L, Kovarik J. (2005)
Interferon-gamma, but not interferon-alpha, induces SOCS 3 expression in human melanoma
cell lines. Melanoma Res. 15, 481-488.
7. Boudný V, Dušek L, Adamková L, Chumchalová J, Kocák I, Fait V, Lauerová L, Krejči
E, Kovarik J. (2005) Lack of STAT 1 phosphorylation at TYR 701 by IFNgamma correlates
with disease outcome in melanoma patients. Neoplasma 52, 330-337.
155
PŘÍLOHY
E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3
. sc iencedi rec t . com
ava i lab le a t wwwjournal homepage: www.ejconl ine.com
Interferon-alpha treatment may negatively influence diseaseprogression in melanoma patients by hyperactivationof STAT3 protein
L. Humpolikova-Adamkovaa, J. Kovarıka, L. Dusekb, L. Lauerovaa, V. Boudnya, V. Faita,M. Fojtovac, E. Krejcıa, A. Kovarıkc,*
aDepartment of Experimental Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7, 656 53 Brno, Czech RepublicbInstitute of Biostatistics and Analyses, Masaryk University, Kamenice 3, 625 00 Brno, Czech RepubliccInstitute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Kralovopolska 135, 612 65 Brno, Czech Republic
A R T I C L E I N F O
Article history:
Received 18 September 2008
Accepted 13 January 2009
Available online 14 February 2009
Keywords:
Malignant melanoma
Interferons
STAT3 activation
Disease outcome
0959-8049/$ - see front matter � 2009 Elsevidoi:10.1016/j.ejca.2009.01.009
* Corresponding author: Tel.: +42 541 517 178E-mail address: [email protected] (A. Kovarı
A B S T R A C T
Interferon-alpha (IFN-alpha) is an important drug used in anti-melanoma therapy. How-
ever, metastases eventually reappear in almost 60% of melanoma patients, who have
received adjuvant cytokine therapy suggesting that IFN-alpha can paradoxically promote
disease progression in some cases, at least. In this study, we have investigated the possibil-
ity that a growth-promoting STAT3 protein might be activated by interferon-alpha in mel-
anoma cells. We examined 24 primary cultures established from node metastases of
melanoma patients who were monitored in a 5-year clinical follow-up. The patients dif-
fered in the course of disease and survival end-points. Using Western blot analyses, we
show that interferon-alpha stimulated STAT3 phosphorylation at tyrosine (Y705) residue
in 17% of cases. These over-reactive cell populations originated from patients who had
the shortest disease-free intervals. A significant correlation was obtained between the
length of survival end-points and a lack of STAT3 activation by IFN-alpha. No STAT3 induc-
tion was observed in normal melanocytes. The STAT1 activation at tyrosine (Y701) occurred
at a similar frequency as that of STAT3 (17%) albeit in different patients, no clear correlation
with the clinical status could be made. The interferon-alpha/beta receptors (IRFARs) were
expressed irrespective to the signal transducers and activators of transcription (STATs)
inducibility suggesting that signalling defects occur downstream from IRFAR. We propose
that in some cases the application of IFN-alpha could increase the probability of disease
progression via overactive STAT3. The tests for STAT3 inducibility prior to cytokine immu-
notherapy in the clinic are therefore warranted.
� 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Normal growth and differentiation of cells depend on a con-
tinuous flow of signals from their environment. One impor-
tant set of signals is provided by cytokine family comprising
er Ltd. All rights reserved
; fax: +42 541 211 293.k).
over 40 glycoproteins, including interleukins (ILs), interferons
(IFNs), tumour necrosis factors (TNFs) or growth factors (GFs).
They have been defined well both by their structure and by
target receptors they bind to. Of these cytokines, IFN-alpha
has been used in the clinic as an anti-cancer agent in
.
Table 1 – Basic characteristics of the patients.
Parameter Value
Sample N = 24
General characteristicsa
Age (years) 56 (36; 71)
Breslow score 2.9 (1.5; 5.5)
Risk localisation in upper body parts 70.8%
Clark score P 4 87.5%
Median of survival end-points
Disease-free survival (DFS) 19.6 months
Progression-free survival (PFS) 44.6 months
Overall survival (OS) 54.3 months
a Quantitative variables summarised as median and 5–95% per-
centiles (in parentheses).
1316 E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3
leukaemias and solid tumours, including malignant mela-
noma. The rationality of using IFN-alpha for the management
of melanoma stands on its well-known resistance to chemo-
therapy and/or radiotherapy. It may exert a direct antiprolifer-
ative and proapoptotic activity, and may inhibit tumour-
induced neoangiogenesis.1,2 Interferon-alpha of its own could
also have a role in the aetiology of melanoma since its pro-
moter appears to be frequently inactive in melanoma cell
lines.3 However, it is believed that the antitumour activity of
IFN-alpha is mainly accomplished via stimulation of host im-
mune system including up-regulation of the expression of
adhesion molecules and MHC class I antigens.4–6 Despite its
undisputed anti-cancer properties, various clinical trials have
demonstrated that the response rate of melanoma patients
treated with IFN-alpha was less than expected to be, and
the reason has been a topic of frequent debates. The validity
of adjuvant IFN-alpha administration for melanoma treat-
ment has also been questioned in a recent study.7 One expla-
nation is that the IFNs could exert differential effects on
immune system and tumour itself.
Recent molecular studies of events that follow IFN recep-
tor binding and operate downstream from receptor to target
genes defined number of proteins involved in the intracellular
signalling cascade. Of those, receptor-associated Janus tyro-
sine kinases (JAKs), signal transducers and activators of tran-
scription (STATs), suppressors of cytokine signalling (SOCSs)
and protein inhibitors of activated STATs (PIASs) represent
key proteins that ensure execution of biological effects of
most, if not all cytokines.8–10 Since STAT proteins besides
transducing signals from many ligands act as transcription
factors modulating the expression of genes that control cell
growth, differentiation, apoptosis and tumour angiogenesis,
it is not surprising to note that various perturbances in these
proteins are frequently found in human cancer cells and tis-
sues. Of seven members of STAT family recognised so far
the particularly noticeable cancer-associated changes such
as constitutive expression, down-regulation and aberrant
phosphorylation were mainly detected in STAT1 and STAT3
proteins.8,11 Both proteins show similar DNA-binding specific-
ities; however, they also exert distinct patterns of binding to
natural enhancer elements, which may explain differences
in their cellular functions..12,13 STAT1 behaves as a tumour
suppressor, acting as an apoptosis inducer and negative regu-
lator of cell growth and angiogenesis.14,15 We have recently
shown that malignant melanoma associates with deficient
IFN-induced STAT1 phosphorylation, and that the absence
of STAT1 phosphorylation at tyrosine 701 (Y701) in response
to IFN-gamma in ex vivo melanoma cells positively correlates
with disease outcome in melanoma patients.16,17 STAT3 has
opposing biological effects and its constitutively active (DNA
binding) variant induces malignant transformation and onco-
genesis, i.e. it functions as oncogene.18,19
A considerable amount of data on the pathophysiology of
STAT1/STAT3 transcription factors including cancer-associ-
ated alterations has been accumulated. However, little is
known about the association of their abnormal expression
and activation with the clinical parameters, i.e. disease out-
come, metastatic potential and treatment response. In the
current study, we investigated the activation response of
STAT3 to IFN-alpha and gamma in melanoma cells derived
from node metastases of 24 melanoma patients and evalu-
ated the possible association of phosphorylation responses
with the course of disease. We have obtained a positive corre-
lation between the absence of STAT3 activation by IFN-alpha
and a better prognosis in melanoma patients.
2. Materials and methods
2.1. Patients
Twenty four melanoma patients of clinical stages II and III
(UICC TNM classification, the fifth edition) were included in
this study. After regional lymph node dissection for meta-
static disease, patients underwent postsurgical adjuvant
immunotherapy with IFN-a2b (Schering-Plough, Kenilworth,
NJ) according to the following regimen: an initial induction
phase of 10 MU subcutaneously (s.c.) daily for 5 days during
4 weeks followed by a maintenance dosage of 10 MU s.c. three
times a week for 48 weeks. The basic characteristics of the
sample are shown in Table 1. The median follow-up was 54
months. The course of the disease as from the first diagnosis
is illustrated in Fig. 1. For the comparisons of laboratory data
with the disease evolution of each patient, the following
intervals were employed: 1. disease-free survival (DFS), i.e.
months elapsing from the initial diagnosis until the first re-
lapse (metastases in the regional lymph nodes); 2. progres-
sion-free survival (PFS), i.e. interval from the first relapse till
the subsequent progression; 3. overall survival (OS), i.e.
months from the first diagnosis until the exitus and/or termi-
nation of the study. At the stage of lymph node metastases
the regional lymph node exenteration was performed, and
all nodes were examined by histology. The melanoma cells
separated from nodes with massive tumourous infiltration
were used for in vitro STAT3 activation studies.
2.2. Melanoma cell culture
The infiltrated lymph node was cut into small pieces, gently
minced and the monocellular suspension was obtained by re-
peated pipetting. The cells were seeded into Petri dishes and
grown in DMEM with glutamine (PAN Biotech GmbH, Aiden-
bach, Germany) supplemented with 15% fetal bovine serum
(FBS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Germany), insulin
Fig. 1 – Classification of patient samples according to the
course of the disease.
E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3 1317
(5 ng/ml) and antibiotics. To verify the nature of growing cells
prior to the activation experiments, the cells grown on slides
were fixed and immunostained using monoclonal antibodies
(Melan-A and Tyrosinase, Novocastra; S-100 and HMB-45,
BioGenex), which are considered as melanoma phenotypic
markers. Only those cultures showing positivity to at least
one immunoreagent in more than 90% of cells were used for
the study (see Fig. 2). The activation experiments were per-
formed with cultures that were maintained in vitro for a max-
imum of four weeks. Subconfluent cells were serum starved
overnight in DMEM before exposure to IFNs. Activation dos-
ages of either IFN were selected from dose–response curves.
IFN-alpha and IFN-gamma were used at concentrations of
5000 IU/ml and 10 ng/ml, respectively. Cells were incubated
with IFNs for 30 min at 37 �C, and control samples were incu-
bated in parallel without IFN treatment.
Fig. 2 – A typical culture of melanoma cells established from lym
Melan-A antibody (original magnification: 200·). Note, a highly
immunoreaction and malignant morphology.
2.3. Growth inhibition assay
The antiproliferative effect of IFN-alpha was assessed in four
primary cell cultures. Cells were seeded in duplicates into 96-
well plates at a cell density of 2,000 cells per well. One day
after seeding, the medium was replaced by medium contain-
ing IFN-alpha at concentrations: 1000, 5000 and 20,000 U/ml.
After 3 days of culture, WST-1 colorimetric assay (Roche;
Mannheim, Germany) was performed according to the manu-
facturers’ protocol. The percentage of growth inhibition was
calculated in relation to the growth of untreated control cells.
Each experiment was repeated three times.
2.4. Reagents and antibodies
Recombinant human IFN-alpha and IFN-gamma were pur-
chased from Sigma (St. Louis, United States of America
(USA)). For the detection of STAT3 protein, rabbit polyclonal
antibody against C-terminal domain of STAT3 (C-20) as well
as mouse monoclonal antibody recognising STAT3 protein
(F-2) was employed (Santa Cruz Biotechnology, California,
USA). For the detection of STAT3-phosphorylated forms,
anti-pY705 rabbit polyclonal antibody (Cell Signalling Tech-
nology, Beverly, USA) and anti-pS727 rabbit polyclonal anti-
body (AbCam, Cambridge, United Kingdom (UK)) were used.
STAT1-phosphorylated forms were detected with anti-pY701
rabbit polyclonal antibody (Cell Signalling Technology, Dan-
vers, MA, USA) and anti-pS727 monoclonal antibody
(PSM116). Mouse monoclonal antibody against the R1 chain
of the IFN-alpha/beta receptor (R&D systems, USA) was used.
2.5. Western blot analyses
The protein content in whole-cell extracts (WCEs) was
determined by means of Bradford assay (Bio-Rad, Munich,
ph node metastasis. Immunoperoxidase staining with
homogeneous population of cells showing positive
1318 E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3
Germany). Supernatants were incubated overnight at 4 �Cwith polyclonal antibody C-20 (dilution 1:100) and protein A
– Sepharose CL-4B beads (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden). Immunoprecipitates were washed four
times with ice-cold Frackleton buffer. The beads were eluted
by boiling in Laemmli sample buffer for 5 min. Equal
amounts of proteins were resolved by 10% SDS–PAGE and
transferred to nitrocellulose (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Membranes were blocked with 5% bovine serum albumin
(BSA) in TBS buffer containing 0.1% Tween-20 (TBST) and
incubated with the predetermined concentrations of specific
antibodies. For the dilution of anti-STAT3 antibodies, TBST
supplemented with 5% BSA (Sigma, St. Louis, USA) and
0.05% NaN3 was employed. After washing, the blots were
incubated with either anti-rabbit or anti-mouse horseradish
peroxidase-conjugated secondary antibody (Amersham, UK)
and were developed using the enhanced chemiluminescence
(ECL) detection system (Amersham, UK) according to manu-
facturers’ instructions. Signals were quantified by densitom-
etry using ImageQuant software (GE Healthcare, USA).
Phosphorylated STAT levels were normalised to total STAT
signals.
2.6. RNA analysis
Total RNAs were isolated using RNeasy kit (Qiagen, Hinden,
Germany) followed by the DNase I treatment (TURBO DNA-
free, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX, USA). The
cDNAs were prepared by reverse transcription of RNAs with
Superscript II Reverse Trancriptase (Invitrogen, Carlsbad,
CA, USA) and amplified using the PCR Arrays master mix
and IFNAR2, STAT3 and GAPDH primers, respectively (SABio-
sciences, Frederick, MD, USA) according to the manufactur-
ers’ recommendation. The primers amplified a 153 bp
fragment of the IFNAR2 gene encoding a R2 chain of the inter-
feron-alpha/beta receptor. The 10-ll aliquots were loaded on
1.5% agarose gels, stained by ethidium bromide and visual-
ised using a CCD camera (Ultralum, Claremont, CA, USA).
2.7. Statistical analysis
All statistical tests were performed based on intention-to-
treat principle, and all failure or death events were binary re-
corded as fully equivalent. A value p < 0.05 was taken as a uni-
versal limit for statistical significance. Standard descriptive
statistics were used to describe primary data (median, 5–
95% percentiles, frequency tables). Stratified Kaplan–Meier
product-limit method was applied to discriminate survival
rates between two or more subgroups. Peto-Prentice general-
ised log-rank test was applied as comparative statistical test.
3. Results
3.1. Immunohistochemical characterisation of primarymelanoma cell cultures and cytotoxic effect of interferons
Primary cell cultures were established from 24 regional node
melanoma metastasis after the surgery. After one month of
in vitro growth, the cells were phenotyped using antibodies
against antigens, which were known to be expressed in skin
neuroectodermal cells. It is evident that immunostaining of
cells with an antibody against Melan-A resulted in uniform
staining patterns indicating homogeneity of cell populations
(Fig. 2). All cultures had mostly single cell phenotype.
Cytotoxic effect of interferon-alpha was assessed in sev-
eral cell populations by counting of viable cells at 24, 48 and
72 h intervals. There was about 10–40% growth inhibition
depending on the experiment and the line. Examples of
growth curves are shown in Fig. S1.
3.2. Western blot analysis of STAT3 phosphorylation
Antibodies against STAT3 phosphoforms (pY705 and pS727)
were used for the detection of activated STAT3 known to be
associated with cancer phenotype. Information on the drug
dosage effect was obtained by analysis of STAT3 phosphoryla-
tion levels in two selected primary cultures (Fig. 3A). It is evi-
dent that the LM48/2 line in the left panel showed the absence
of STAT3 induction at low (1 · 103 U/mL), while there was a
significant induction at both higher (5 · 103 and 20 · 103 U/
mL) concentrations of IFN-alpha. In contrast, the VJ22 line
in the right panel showed a relatively strong basal STAT3-pY
signal, which was little (IFN-gamma) or not (IFN-alpha) in-
creased after the cytokine treatment.
The concentration of IFN-alpha of 5 · 103 U/mL was se-
lected for further experiments involving Western blot analy-
ses of 24 primary cultures. Immunostaining of protein blots
with an antibody against an amino acid determinant (Fig. 3B
and C, STAT3 – total), indicated the expression of STAT3 pro-
tein in all samples with little differences in signal intensities.
In contrast to non-phosphorylated STAT3, there were differ-
ences in the basal levels of phosphorylated STAT3 isoforms
between the samples. For example, the HM68 and LM58 pa-
tients had low STAT3-pY levels, while both PT56 and SJ97 pa-
tients showed strong pY-STAT3 signals (Fig. 3B) consistent
with the reported variation in basal phosphorylation levels
of STAT3 in melanoma patients.20,21 Based on the STAT3-pY/
STAT3-total ratio we can assess that the basal STAT3-pY lev-
els were relatively low in melanocytes compared to most mel-
anoma samples.
The interferon treatments resulted in enhanced STAT3-pY
and STAT3-pS signals in some, but not in all samples (Fig. 3B
and C and summarised in Table S1). Based on the inducibility
of phosphorylated Y705-STAT3 isoforms, the 24 melanoma
samples could be divided into three groups (Table 2). In the
first group (13 cases/54%), no activation with either interferon
was observed. The second group comprises samples with
STAT3 induction after IFN-gamma but not alpha (7 cases/
29%). Normal melanocytes fell into this group. The third
group (4 cases/17%) comprises samples showing induction
of STAT3 phosphorylation with both IFNs. There were no
cases of STAT3 induction with IFN-alpha without concomi-
tant activation with IFN-gamma. It is necessary to stress that
the experiments were carried out using cells within the 1
month following surgical excision for cell culture (the first
passage). Further passages and prolonged cultivation of cells
resulted in altered STAT3-pY responses in some cases (Lud-
mila Lauerova – unpublished).
The relation between STAT3 activation response at pY705
induced by IFNs and disease outcome is demonstrated in
Fig. 3 – STAT3 expression and activation in melanoma cell populations. (A) Dosage effect of IFN-alpha on stimulation of
STAT3 phosphorylation at Y705. (B) Example of immunoblotting analysis of STAT3-pY705. (C) Example of immunoblotting
analysis of STAT3-pS727. C, control; G, interferon-gamma; A, interferon-alpha. STAT3-pY, staining with anti phosphotyro-
sine (pY705) antibody. STAT3-pS, staining with anti phosphoserine (pS727) antibody. STAT – total, staining with an antibody
to the primary amino acid determinant. Exposure of chemiluminescent bands to the film was 1–5 min. Signals were
evaluated by densitometry and expressed as a STAT3-p/STAT3-total ratio (numbers below each lane). For control samples,
the ratios were arbitrarily chosen as 1.0.
Table 2 – STAT3 activation in response to IFN-alpha/-gamma in melanoma patients.
IFN-alpha IFN-gamma
Not induciblea
Cases/percentageInducibleCases/percentage
Not inducibleCases/percentage
InducibleCases/percentage
pY705 20/83 4/17 13/54 11/46
pS727 22/92 2/8 22/92 2/8
a The data were taken from Western blot analyses (Fig. 3 and Table S1). Samples showing >20% increase of pY705 and pS727 signal intensities
over non-treated controls were considered as ‘inducible’.
E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3 1319
Table 3. Patients disclosed as activation responders to IFN-al-
pha, i.e. whose ex vivo metastatic melanoma cells showed
IFN-alpha-induced STAT3 phosphorylation at Y705 exhibited
a significantly shorter disease-free survival (DFS), progres-
sion-free survival (PFS) and overall survival (OS) as compared
to the non-responder group. These analyses provide evidence
that the activation of STAT3 at pY705 induced by IFN-alpha
negatively correlates with the disease outcome.
In contrast to phosphorylation at tyrosine, only two sam-
ples showed an increased phosphorylation at serine 727 resi-
due (pS727) after IFN-alpha or IFN-gamma stimulation (Fig. 3C
and Table 2). However, the activation response at pS727 in
these patients did not uniformly reflect disease evolution
since one case was lost after 51 months due to dissemination,
whereas the other was surviving 62 months without
progression.
Table 3 – Survival end-points in relation to different measures of STAT3 activation.
Parametera DFSb PFSb OSb
Induction by IFN-alpha: Not inducible (N) activity versus inducible (I) activity
STAT3 at Y705 p = 0.049 p = 0.041 p = 0.039
N: 34.9 month N: 62.3 month N: 78.4 month
I: 5.0 months I: 26.1 months I: 26.5 months
Induction by IFN-gamma: Not inducible (N) activity versus inducible (I) activity
STAT3 at Y705 p = 0.693 p = 0.496 p = 0.726
N: 18.0 months N: 39.2 months N: 40.2 months
I: 23.8 months I: 43.9 months I: 55.4 months
a Activation of STAT3 at Ser 727 is not analysed due to a very low frequency of inducible cases (N = 2).
b Significance level of log-rank test comparing the two variants (p) and median values of survival in months.
1320 E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3
3.3. Western blot analysis of STAT1 phosphorylation
The STAT1 phosphorylation status at Y701 residues was as-
sessed in the same sets of patient cell populations as in the
STAT3 analysis. Examples of immunodetections with anti-
bodies against total and phosphorylated STAT1 are shown in
Fig. 4, and summarised in Tables 4 and S1. In the first group
(4 cases/17%), no activation with either interferon was ob-
served. The second group comprises samples with STAT1
induction after IFN-gamma but not alpha (16 cases/66%).
The third group (4 cases/17%) comprises samples showing
induction of STAT1 phosphorylation with both IFNs. In gen-
eral, STAT1 was more frequently induced with interferon-
gamma (88%) than STAT3 (46%). However, the basal levels of
STAT1-pY were much lower than those of STAT3-pY suggest-
ing constitutive activation of STAT3 (but not STAT1) in tumour
cells.
3.4. RNA and protein analysis of interferon-alpha/betareceptor (IFNAR) in melanoma cells
Of the 24 patient samples, 18 samples (75%) did not show
induction at either STAT3 or STAT1 after IFN-alpha. We
thought that this might be due to deficiencies in the IFNAR
expression. We therefore analysed expression of IFNAR genes
in the selected samples that show (VJ 22, LM48/2) or do not (SJ
97, KJ 101) show STATs activation. At the RNA level, we stud-
ied the expression of the R2 chain of the IFNAR using RT PCR
assay. A �150 bp product was amplified with the IFNAR2-spe-
cific primers in all cDNA samples analysed including those of
normal melanocytes (Fig. 5A). The signal intensities were
comparable in cell populations with both inducible and
Fig. 4 – Example of immunoblotting analysis of STAT1 in melan
staining with anti-phosphotyrosine (pY701) antibody. The sym
weak basal levels of STAT1-pY.
non-inducible phenotypes indicating that the IFNAR2 genes
were equally transcribed in melanoma cells. Similarly, at
the protein level, an antibody recognising a R1 chain of the IF-
NAR showed immunoreactivity with all protein extracts
(Fig. 5B). Thus, it appears that there were probably no defects
in the expression of interferon-alpha/beta receptor among
the melanoma cells.
4. Discussion
Activated STAT3 is considered as an oncogene displaying
growth-promoting and anti-apoptotic properties.22 In this
study, we have analysed interferon-dependent STAT3 expres-
sion and activation in short-term melanoma cell cultures that
are established from lymph node metastases. We believe that
these primary cultures, in contrast to the established cell
lines, probably better reflect the situation in vivo. Indeed, the
cell populations were remarkably homogeneous expressing
markers characteristic for melanoma lineages. Western blot
analyses showed a constitutive expression of STAT3 protein
in all the samples, which is consistent with the requirement
of this molecule for survival of tumour cells in culture. The
short-term stimulation with both types of interferons leads
to a variable elevation of the levels of STAT3 phosphoforms.
Significantly, all four cultures (17%) that showed a strong
STAT3 induction after IFN-alpha treatment were derived from
patients with short disease-free interval and poor survival
(STAT3-pY705 inducible cohort of patients, Table 3). Perhaps,
in these cases STAT3 protein might transactivate growth-pro-
moting and/or anti-apoptotic genes leading to a more aggres-
sive tumour phenotype. In support, c-myc and JunB oncogenes
have been shown to contain STAT3-binding sites in their
oma cell populations and normal melanocytes. STAT1-pY,
bols are the same as those shown in Fig. 3. Note relatively
Fig. 5 – The RNA (A) and protein (B) analysis of IFNAR expression. (A) Ethidium bromide-stained gels with PCR products
obtained after amplification of cDNA samples using IFNAR2, STAT3 and GAPDH – specific primers. Amplification of the
GAPDH gene was used as a positive control. No products were obtained without a reverse transcription step (lane ‘-’). (B)
Example of Western blot analysis of protein extracts using antibody against interferon-alpha/beta receptor (R1 chain).
Table 4 – STAT1 activation in response to IFN-alpha/-gamma in melanoma patients.
IFN-alpha IFN-gamma
Not inducibleCases/percentage
InducibleCases/percentage
Not inducibleCases/percentage
InducibleCases/percentage
pY701 20/83 4/17 4/17 20/83
pS727 20/83 4/17 19/79 5/21
The data were taken from Western blot analyses (Fig. 4 and Table S1).
E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3 1321
promoters.23 Although IFN-alpha induced a variable growth
retardation (10–40%) in all the cell cultures, we were unable
to observe a significant correlation between IFN-alpha resis-
tance and STAT3 phosphorylation status. For example, both
relatively sensitive LM48/2 and KJ101 lines (Fig. S1) differed
in the ability to activate STAT3-pY after IFN-alpha (Table S1).
This may be due to the absence of additional growth-promot-
ing agents in cell culture medium, ongoing cell senescence in
advanced passages and perhaps other unknown factors. The
STAT3 inducibility with IFN-gamma was more frequent com-
pared to that of IFN-alpha, and there seems to be a trend
towards better prognosis in inducible cases; however, correla-
tion with disease evolution showed no statistical significance
(Table 3).
Impaired STAT1 signalling has also been noted in mela-
noma by several studies although the correlations with sensi-
tivity towards interferons were often contradictory.16,24–28 In
our experiments, increased STAT1 phosphorylation after
IFN-alpha occurred at a frequency (17%) similar to that of
STAT3. The frequency of STAT1 activation is slightly lower
than that previously observed in immortalised melanoma
lines (37%)16, which can be explained by selection of clones
with ‘overresponsive’ phenotype. With the exception of the
LM 48/2 patient there was no overlap between inducibilities
of STAT1 and STAT3 between the cultures suggesting that
both proteins are using different regulatory pathways. Basal
levels of STAT3 have been inversely correlated with IFN-
alpha-induced STAT1-pY in melanoma cell lines.20 In contrast
to STAT3, there was no significant correlation between STAT1
responders (to IFN-alpha) and clinical state (Table S2).
4.1. STAT3 regulatory pathways in melanoma cells
Several lines of evidence indicate that activation of STAT3 by
IFN-alpha may occur somewhat aberrantly in a subset of tu-
mours. Firstly, interferons in contrast to interleukin 10 do
not seem to be strong activators of STAT3.29 Secondly, binding
of STAT3 to DNA was not stimulated by interferon-alpha in
melanoma cell lines.30 Finally, in a mouse model system,
STAT3 was activated by IFN-gamma only in the absence of
functional STAT1.31 Failure of STAT3 activation could be ex-
plained by an inefficient expression of interferon receptor.
However, all cell populations analysed showed the expression
of interferon-alpha/beta receptor at both RNA and protein lev-
els. These results are partially consistent with the recent
immunohistochemical study showing the expression of the
receptor in melanoma cells.21 In addition, there were cases
of alternative induction of STAT1 and STAT3 molecules (LM
58, RJ 61, DM 90 and VJ22). Together, it seems that though
the functional defects or variation in IFNAR expression levels
(Fig. 4) cannot be entirely excluded, it is more likely that neg-
ative regulatory pathways involving suppressors of cytokine
signalling (SOCS) and proteins that inhibit activated STATs
(PIAS) might be involved. In this context, most melanoma cell
1322 E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3
lines, in contrast to normal melanocytes, failed to activate
SOCS3 following IFN-alpha suggesting that SOCS3 could play
a role.32 On the other hand, constitutively expressed SOCS3
has been negatively correlated with cell sensitivity to IFN-
gamma.33,34 It will be interesting to determine the integrity
of negative regulatory systems of JAK/STAT signalling in tu-
mours and tumour-derived cultures.
4.2. Possible clinical implication of STAT3 activation byinterferon-alpha
Metastatic disease will eventually develop in almost 60% of
the melanoma patients, who have received adjuvant IFN-al-
pha therapy.35 In addition, the overall response rate to IFN-al-
pha in the stage of metastatic disease is just 15–20%. Thus,
there appears to be a distinct subset of melanoma patients,
who will respond favourably to IFN-alpha. A similar specula-
tion on the existence of subgroups of melanoma patients
responding differently to IFN-alpha in the clinic was reported
by Lens.36 Our data suggest that this subset may comprise tu-
mours that do not hyperactivate STAT3 after the IFN-alpha
treatment. Conversely, metastatic disease could be promoted
in tumours that do show a strong STAT3 activation pheno-
type. Significantly, the STAT3-inducible phenotype was ob-
served in primary cultures of melanoma cells obtained from
individuals who failed IFN-alpha immunotherapy.20 It is also
noteworthy that STAT3 activity was increased in human brain
metastatic melanoma cells when compared with primary
melanoma specimens.37 The generality of our findings will re-
quire confirmation on a larger series of cases and other types
of tumours.
Conflict of interest statement
None declared.
Acknowledgements
The study was supported in part by Project MZOMOU2005 and
by grants from the Internal Grant Agency of the Czech Minis-
try of Health (NS/9813-4), Grant Agency of the Czech Republic
(301/06/0912) and Academy of Sciences of the Czech Republic
(AVOZ50040507 and AVOZ50040702). Authors also acknowl-
edge Mrs. Sekaninova and Mrs. Hoskova for their excellent
technical assistance.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found,
in the online version, at doi:10.1016/j.ejca.2009.01.009.
R E F E R E N C E S
1. Agarwala SS, Kirkwood JM. Potential uses of interferon alpha2 as adjuvant therapy in cancer. Ann Surg Oncol 1995;2:365–71.
2. Kirkwood JM. Biologic therapy with interferon alpha and beta.Clinical applications: melanoma. In De Vita VT, Hellman S,Rosenberg SA, editors. Biologic therapy of cancer. Principles andPractice of oncology. Philadelphia: J.B. Lippincott; 1995. p. 388–411.
3. Price KL, Herlyn M, Dent CL, Gewert DR, Linge C. Theprevalence of interferon-alpha transcription defects inmalignant melanoma. Melanoma Res 2005;15:91–8.
4. Hague SJ, Williams BRG. Signal transduction in the InterferonSystem. Semin Oncol 1998;25:14–22.
5. Schindler Ch. Cytokines and JAK-STAT signaling. Exp Cell Res1999;253:7–14.
6. Caraglia M, Marra M, Pelaia G, et al. Alpha-interferon and itseffects on signal transduction pathways. J Cell Physiol2005;202:323–35.
7. Lens M. Cutaneous melanoma: interferon alpha adjuvanttherapy for patients at high risk for recurrent disease.Dermatol Ther 2006;19:9–18.
8. Darnell Jr JE. STATs and gene regulation. Science1997;277:1630–5.
9. Greenhalg CJ, Hilton DJ. Negative regulation of cytokinesignaling. J Leukoc Biol 2001;70:348–56.
10. Fujimoto M, Naka T. Regulation of cytokine signaling by SOCSfamily molecules. Trends Immunol 2003;24:659–66.
11. Rawlings JS, Rosler KM, Harrison DA. The JAK/STAT signalingpathway. J Cell Sci 2004;117:1281–3.
12. Horvath CM, Wen Z, Darnell Jr JE. A Stat protein domain thatdetermines DNA sequence recognition suggests a novel DNA-binding domain. Genes Dev 1995;9:984–94.
13. Seidel HM, Milocco LH, Lamb P, Darnell Jr JE, Stein RB, Rosen J.Spacing of palindromic half sites as a determinant ofselective STAT DNA binding and transcriptional activity. ProcNatl Acad Sci USA 1995;92:3041–5.
14. Meraz MA, White JM, Sheehan KC, et al. Targeted disruptionof the Stat1 gene in mice reveals unexpected physiologicspecificity in the JAK-STAT signaling pathways. Cell1996;84:431–42.
15. Levy DE. Physiological significance of STAT proteins:investigations through gene disruption in vivo. Cell Mol Life Sci1999;55:1559–67.
16. Kovarik J, Boudny V, Kocak I, Lauerova L, Fait V, Vagundova M.Malignant melanoma associates with deficient IFN-inducedSTAT 1 phosphorylation. Int J Mol Med 2003;12:335–40.
17. Boudny V, Dusek L, Adamkova L, et al. Lack of STAT 1phosphorylation at TYR 701 by IFNgamma correlates withdisease outcome in melanoma patients. Neoplasma2005;52:330–7.
18. Bromberg JF, Wrzeszczynska MH, Devgan G, et al. Stat3 as anoncogene. Cell 1999;98:295–303.
19. Bromberg J. Stat proteins and oncogenesis. J Clin Invest2002;109:1139–42.
20. Lesinski GB, Treffry J, Brasdovich M, et al. Melanoma cellsexhibit variable signal transducer and activator oftranscription 1 phosphorylation and a reduced response ofIFN- compared with immune effector cells. Clin Cancer Res2007;13:5010–9.
21. Messina JL, Hua Y, Riker AI, Munster PN, Jove RL, Daud AI.Activated STAT-3 in melanoma. Cancer Control2008;15:196–201.
22. Darnell JE. Validating Stat3 in cancer therapy. Nat Med2005;11:595–6.
23. Kiuchi N, Nakajima K, Ichiba M, et al. STAT3 is required forthe gp130-mediated full activation of the c-myc gene. J Exp Med1999;189:63–73.
24. Pansky A, Hildebrand P, Fasler-Kan E, et al. Defective Jak-STAT signal transduction pathway in melanoma cellsresistant to growth inhibition by interferon-alpha. Int J Cancer2000;85:720–5.
E U R O P E A N J O U R N A L O F C A N C E R 4 5 ( 2 0 0 9 ) 1 3 1 5 – 1 3 2 3 1323
25. Boudny V, Kocak I, Lauerova L, Kovarik J. Interferoninducibility of STAT 1 activation and its prognosticsignificance in melanoma patients. Folia Biol (Praha)2003;49:142–6.
26. Jackson DP, Watling D, Rogers NC, et al. The JAK/STATpathway is not sufficient to sustain the antiproliferativeresponse in an interferon-resistant human melanoma cellline. Melanoma Res 2003;13:219–29.
27. Lesinski GB, Valentino D, Hade EM, et al. Expression of STAT1and STAT2 in malignant melanoma does not correlate withresponse to interferon-alpha adjuvant therapy. CancerImmunol Immunother 2005;54:815–25.
28. Kortylewski M, Komyod W, Kauffmann ME, Bosserhoff A,Heinrich PC, Behrmann I. Interferon-gamma-mediatedgrowth regulation of melanoma cells: involvement of STAT1-dependent and STAT1-independent signals. J Invest Dermatol2004;122:414–22.
29. Calo V, Migliavacca M, Bazan V, et al. STAT proteins: fromnormal control of cellular events to tumorigenesis. J CellPhysiol 2003;197:157–68.
30. Carson WE. Interferon-alpha-induced activation of signaltransducer and activator of transcription proteins inmalignant melanoma. Clin Cancer Res 1998;4:2219–28.
31. Ramana CV, Kumar A, Enelow R. Stat1-independent inductionof SOCS-3 by interferon-gamma is mediated by sustained
activation of Stat3 in mouse embryonic fibroblasts. BiochemBiophys Res Commun 2005;327:727–33.
32. Kovarik A, Fojtova M, Boudny V, Adamkova L, Lauerova L,Kovarik J. Interferon-gamma, but not interferon-alpha,induces SOCS 3 expression in human melanoma cell lines.Melanoma Res 2005;15:481–8.
33. Fojtova M, Boudny V, Kovarik A, et al. Development of IFN-gamma resistance is associated with attenuation of SOCSgenes induction and constitutive expression of SOCS 3 inmelanoma cells. Br J Cancer 2007;97:231–7.
34. Komyod W, Bohm M, Metze D, Heinrich PC, Behrmann I.Constitutive suppressor of cytokine signaling 3 expressionconfers a growth advantage to a human melanoma cell line.Mol Cancer Res 2007;5:271–81.
35. Kirkwood JM, Strwaderman MH, Ernstoff MS, Smith TJ,Borden EC, Blum RH. Interferon alpha-2b adjuvant therapy ofhigh-risk resected cutaneous melanoma: The EasternCooperative Oncology Group Trial EST 1684. J Clin Oncol1996;14:7–17.
36. Lens MB, Dawes M. Interferon alpha therapy for malignantmelanoma: a systematic review of randomized controlledtrials. J Clin Oncol 2002;20:1818–25.
37. Xie TX, Huang FJ, Aldape KD, et al. Activation of stat3 inhuman melanoma promotes brain metastasis. Cancer Res2006;15:3188–96.
Development of IFN-g resistance is associated with attenuation ofSOCS genes induction and constitutive expression of SOCS 3 inmelanoma cells
M Fojtova1, V Boudny*,2, A Kovarik1, L Lauerova2, L Adamkova2, K Souckova2, J Jarkovsky3 and J Kovarik2
1Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic v.v.i., Kralovopolska 135, 612 65 Brno, Czech Republic; 2Department of ExperimentalOncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7, 656 53 Brno, Czech Republic; 3Faculty of Medicine and Science, Institute of Biostatisticsand Analyses, Masaryk University, Kamenice 126/3, 625 00 Brno, Czech Republic
The resistance to interferons (IFNs) limits their anticancer therapeutic efficacy. Here we studied the evolution of an IFN-resistantstate in vitro using melanoma cell lines. We found that the cells became less sensitive to antiproliferative effect of IFN-g afterprolonged cultivation enabling us to isolate sensitive and resistant subclones of the parental line. We investigated transcriptionof signal transducer and activator of transcription (STAT) 1–6 and suppressor of cytokine signalling (SOCS) 1–3 genes, andphosphorylation of STAT 1 protein. The resistant subline (termed WM 1158R) differed from the sensitive subline (WM 1158S) by aconstitutive expression of SOCS 3, lack or weak SOCS 1–3 activation following IFN-g, and short duration of cytokine activatorysignal. Similar correlations were observed in additional melanoma lines differing in IFN sensitivities. At the protein level, IFN-g inducedstrong and prolonged STAT 1 activation at serine 727 (S727) in WM 1158R while in WM 1158S cells phosphorylation of this aminoacid was much less pronounced. On the other hand, phosphorylation of tyrosine 701 (Y701) was stimulated regardless of thesensitivity phenotype. In conclusion, constitutive expression of SOCS 3 is correlated with attenuation of its induction following IFNtreatment. These results suggest that progression of melanoma cells from IFN sensitivity to IFN insensitivity associates with changes inSOCS expression.British Journal of Cancer (2007) 97, 231–237. doi:10.1038/sj.bjc.6603849 www.bjcancer.comPublished online 19 June 2007& 2007 Cancer Research UK
Keywords: SOCS proteins; interferon resistance; STAT phosphorylation; malignant melanoma
��������������������������������������������������
It has been well established that interferons (IFNs) can inhibit thegrowth and proliferation of a wide variety of tumour cells. Theiraction is generally cytostatic rather than cytotoxic, and inhibitionof progression through cell cycle phases has been shown.Therapeutic utility of IFN administration has been primarilydemonstrated in some leukaemia and from solid type ofmalignancies in renal cell carcinoma, Kaposi’s sarcoma andmalignant melanoma –(for review see Lens and Dawes, 2002).However, the effectiveness of the treatment is often unsatisfactoryprobably due to per se resistance of some tumour cell subclonesand/or acquired resistance to IFN biological effects.
Biologic activities of IFNs are mediated upon interaction withspecific cell surface receptors and activation of intracellularsignalling cascades (Ransohoff, 1998). Janus kinase (JAK)/signaltransducer and activator of transcription (STAT) proteins play akey role in IFN-induced signalling that consequently modulateessential cellular functions such as growth, differentiation andapoptosis (Brierley and Fish, 2005). STAT 1 is certainly needed fortransmission of IFN-g signals (Durbin et al, 1996), but the role forother STATs including STAT 3 (Ramana et al, 2005) is emerging as
well. Recent recognition of JAK/STAT signalling pathways asinevitable molecular mechanism of various cellular effects ofIFNs has elicited a considerable effort to elucidate the role oftheir components in cancer (Calo et al, 2003). In malignantmelanoma, some studies demonstrated reduced STAT 1 activity inIFN-resistant cell lines pointing to defects in the JAK/STATpathways (Wong et al, 1997; Pansky et al, 2000). Alterationsoccurred at both protein and RNA levels and at post-translationalphosphorylation modifications. While most melanoma cell linesdisplayed normal Y701 phosphorylation response to IFN-gtreatment, phosphorylation block at S727 appeared to be morefrequent (Kovarik et al, 2003). On the other hand, variable STAT 1levels without apparent correlation with cell sensitivity towardsIFNs were also reported (Chawla-Sarkar et al, 2002; Jackson et al,2003), and in a clinical study, upregulated STAT 1 phosphorylationwas found at high frequency in patients with poor prognosis(Boudny et al, 2003). In addition to STAT 1, defects in STAT 5regulation have recently been shown to contribute to IFNresistance in melanoma cells (Wellbrock et al, 2005). It seemsthat involvement of STAT molecules in oncogenesis may be arather complex phenomenon.
The duration of STAT function is tightly controlled by severalfamilies of negative regulators including a family of classicalfeedback loop regulators – suppressors of cytokine signalling(SOCSs). Up to now, eight members of these cytokine-induced
Received 17 November 2006; revised 22 May 2007; accepted 22 May2007; published online 19 June 2007
*Correspondence: Dr V Boudny; E-mail: [email protected]
British Journal of Cancer (2007) 97, 231 – 237
& 2007 Cancer Research UK All rights reserved 0007 – 0920/07 $30.00
www.bjcancer.com
Mo
lecu
lar
Dia
gn
ost
ics
family have been identified that attenuate or inhibit cytokinegrowth factor signal –(for review see Hilton, 1999; Fujimoto andNaka, 2003). Out of these, SOCS 1 (Alexander et al, 1999) andSOCS 3 (Ramana et al, 2005) appear to be critical inhibitors ofIFN-g signalling. In tumours, dysfunction of SOCS molecules cancause hyper-responsiveness to cytokines and growth factors andcould contribute to the development and/or progression ofmalignant tumours. For example, silencing of SOCS 1 and/orSOCS 3 genes by methylation of promoter has been correlatedwith the loss of growth control inhibition in lung (Yoshikawaet al, 2001), pancreatic (Komazaki et al, 2004), breast and ovarian(Sutherland et al, 2004) carcinomas. Similar epigenetic blockapparently affected SOCS 3 gene expression in lung (He et al, 2003)and head and neck carcinomas (Weber et al, 2005). These studiesindicated that aberrant silencing could be a cause for constitutiveactivation of JAK/STAT pathway in cancer cells. However, otherstudies also indicated that malignant cells compared to theirnormal counterparts express SOCS genes constitutively (Sakaiet al, 2002; Li et al, 2004; Evans et al, 2007) and forced expressionof SOCS transgene often conferred resistance to IFN. Constitutiveexpression can potentially hamper immunotherapy by inactivatingcytokine signals. Clearly, many uncertainties remain on thefunction of SOCS in tumourigenesis.
Our previous screening of melanoma cell lines showed thatconstitutive expression of SOCS 3 was generally low (Kovarik et al,2005). Nevertheless, few lines showed relatively high level of SOCS 3expression at both RNA and protein levels. No attempts were madeto correlate expression levels with IFN sensitivity. We now aimed toinvestigate the relationship between IFN sensitivity and expressionof STAT and SOCS genes. To reduce the variability caused byvariation in genetic and cell type background, we have used twosublines derived from the parental human malignant melanomaWM 1158 line, differing in the sensitivity towards IFN-g.
MATERIALS AND METHODS
Cell cultures
Melanoma WM 1158, WM 9, WM 39, WM 1552C, 1205 Lu cell lines(Wistar Institute, Philadelphia, PA, USA) were grown in Dulbec-co’s modified Eagle’s medium (GIBCO, USA) supplemented with2 g l�1 of sodium bicarbonate, L-glutamine, insulin, antibiotics and10% of fetal bovine serum. Cells were cultured in the incubatorwith 5% CO2 in humidified atmosphere. Human epidermalmelanocytes (manufacture code C-002-5C) isolated from lightlypigmented neonatal foreskin were purchased from CascadeBiologics, USA. The cells were grown in the medium 254supplemented with human melanocyte growth supplement (bothCascade Biologics, USA). The cells were obtained at the end of thesecondary culture stage and have passed three to six passages untilused for experiments.
Growth inhibition assay and statistical analyses
Cells were seeded into 96-well microplates at a density of 2000 cellsper well. One day after seeding, the medium was replaced bymedium containing IFN-g (Sigma, Saint Louis, MO, USA) atconcentrations of 50, 100, and 200 ng ml�1. After 24, 48 and 72 hintervals of treatment, WST-1 colourimetric assay (Roche,Mannheim, Germany) was performed according to the manufac-turer’s protocol. The absorbance was measured in threeparallel wells. The growth inhibition (cytotoxicity) was evaluatedin at least three independent experiments and expressed as theamount of viable cells in treated and untreated samples (Figure 1Aand B) or as the cell viability normalised to untreated controls(Figure 1C). The data were statistically analyzed employing aparametric t-test.
Western blot analyses
The cells were harvested and lysed according to standardprocedures (Boudny et al, 2003). The protein content in whole-cell extracts was determined by Bradford assay (Bio-Rad, Munich,Germany). Approximately, 20 mg of total proteins were separatedby sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis(10% gels) and the proteins were transferred to nitrocellulosemembrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Phosphorylated STATproteins were visualised after immunoprecipitation as describedin Kovarik et al (2003). After the primary antibody bindingreaction, the blots were incubated with either anti-mouse or anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody(Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)and developed using the enhanced chemiluminiscence detectionsystem (Amersham) according to manufacturer’s instructions.
For the detection of STAT 1 phosphoforms, commercial STAT 1anti-pY701 rabbit polyclonal antibody (Cell Signaling Technology,Danvers, MA, USA) and home-developed anti-pS727 mousemonoclonal antibody (pSM1, Kovarik et al, 2003) were used. Total
3.50IFN
Control
IFNControl
Subline: WM 1158S
Subline: WM 1158R
Time
Time
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
3.504.00
3.002.502.001.501.000.500.00
120
100
80
60
40
20
0
0 h 24 h
Abs
orba
nce
Abs
orba
nce
48 h 72 h
0 h 24 h 48 h 72 h
Subline: WM 1158RSubline: WM 1158S
0 h 24 h
Per
cent
age
of v
iabl
e ce
lls
MeanBox: standard errorWhisker: 95% confidence interval
48 h
Time72 h
Figure 1 Antiproliferative effect of IFN-g in WM 1158S and WM 1158Rsublines measured by WST-1 colourimetric test. (A and B) The growth isexpressed as the amount of viable cells in treated and untreated samples.Each value represents a mean from three independent experiments. Errorbars indicate s.d. (C) The cell viability normalised to untreated controls.The differences between WM 1158S and WM 1158R sublines werestatistically significant (Po0.01) for all time intervals (24, 48 and 72 h).
SOCS expression in IFN-c- sensitive and -resistant melanoma cells
M Fojtova et al
232
British Journal of Cancer (2007) 97(2), 231 – 237 & 2007 Cancer Research UK
Mo
lecu
lar
Dia
gn
ostic
s
STAT 1 protein levels were assayed by rabbit polyclonal antiserumagainst C-terminal domain of STAT 1 raised in author’s lab (S1C).
RNA analyses
Total RNAs were isolated from cells treated with 50 ng ml�1 ofIFN-g for various intervals using RNAeasy kit (Qiagen, Hilden,Germany). Each sample was extensively treated with DNaseI. Thecorresponding cDNAs were prepared by reverse transcriptionusing Superscript II polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).The cDNAs were amplified using a multigene 12-well format strip(SuperArray, Biosci Co., Frederick, MD, USA) containing sets ofprimers for seven STATs, four SOCSs and GAPDH genes. The PCRwas carried out in a MJ Research thermocycler according to themanufacturer’s recommendation using 30 cycles at a maximum tokeep the reaction in a linear phase. The 5–10 ml aliquots wereloaded on a 2% agarose gel. The sizes of bands were estimatedfrom size markers and found to fit with expected sizes ofamplicons. The ethidium bromide fluorescent signals werescanned by a CCD camera (Ultralum) and quantified (Ultraquant).
In some cases, the reverse transcriptase (RT)– PCR results wereverified by Northern blot using SOCS 1 (Hebenstreit et al, 2005)and SOCS 3 (Masuhara et al, 1997) probes as described in Kovariket al (2005).
RESULTS
Differential sensitivity of WM 1158 sublines to interferon-c
Upon continuous cultivation of WM 1158 melanoma cells, weobserved gradual decrease of sensitivity towards IFN-g. Repeatedcloning resulted in the isolation of resistant (WM 1158R) andsensitive (WM 1158S) sublines. While IFN-g retarded the growthof WM 1158S by 80–90%, the growth of WM 1158R cells wassignificantly less inhibited (Figure 1 and Table 1). The growthproperties of both sublines in the absence of IFN-g were similar(Figure 1A and B) as well as cell morphology (data not shown). Theantiproliferative effect of IFN was further studied in severaladditional melanoma lines (Table 1). These cells can be roughlycategorised into high (WM 1158S, WM 39, WM 1552C), medium(WM 1158R) and low (WM 9, 1205 Lu) sensitive ones. The lowsensitivity of WM 9 line towards IFN-g was in a good agreementwith that previously published (Kortylewski et al, 2004).
Expression profiles before interferon-c treatment
Reverse transcriptase –PCRs were carried out in 12-well stripsallowing simultaneous expression analysis of STAT 1 –6, SOCS1–3 and SOCS 5 genes (Figures 2A– 4A, upper panels). As areference, each strip contained primers amplifying a constitutivelyexpressed GAPDH gene. Isolated RNAs were reverse transcribedand corresponding cDNAs amplified using specific primers. The
first seven lanes in each strip show amplification productsobtained with primers specific for various STATs. Most STATswere amplified generating strong bands in all cell lines suggestingtheir constitutive expression. However, there were differences inthe intensities of individual bands. For example, STAT 4 signal wasweak and even missing (in melanocytes) compared to otherSTATs. The STAT 5B band was consistently stronger than that ofSTAT 5A.
The SOCS primers were designed to allow detection of SOCS 1,2, 3, and 5 transcripts. The bands corresponding to SOCS 1, 2, and3 transcripts were hardly visible in WM 1158S (Figure 2A),indicating that expression of most SOCSs was low or negligiblebefore IFN treatment. In contrast, WM 1158R showed relativelystrong SOCS 3 signals (Figure 3A) arguing for a constitutive
Table 1 Relation between cell sensitivity to IFN-g, SOCS 3 mRNA levels andSOCS 3 inducibility
Line IFN-g resistancea SOCS 3 constitutive expressionb SOCS 3 induction (fold increase)c
1205 Lu 90–100 0.7 1.0WM 9 86–98 0.5 1.3WM 1158R 68–80 0.4 2.4WM 39 28–38 0.03 9.5WM 1552C 39–43 0.03 12.7WM 1158S 10–20 0.05 7.5
Abbreviations: IFN¼ interferon; SOCS¼ suppressors of cytokine signalling. aExpressed as a percentage of viable cells after the 72 h time interval of IFN-g treatment as related tountreated controls. Range of cytotoxicity values from at least three parallel experiments. bAssayed by RT–PCR as described in Figures 2 and 3. Fluorescent signals werenormalized to GAPDH. Means of at least two independent experiments are shown. cFold increase over the non-treated control after 30 min of IFN-g treatment.
CTR
STA
T1
STA
T2
STA
T3
STA
T4
STA
T5A
STA
T5B
WM 1158S
STA
T6
SO
CS
1
SO
CS
2
SO
CS
3
SO
CS
5
GA
PD
H
IFN-�30 min
IFN-�24 h
IFN-�72 h
0.60.50.40.30.20.1
0
16
11
6
1
SOCS1 SOCS3
SOCS1 SOCS3
CTRIFN-� 30 minIFN-� 24 hIFN-� 72 h
IFN-� 30 minIFN-� 24 hIFN-� 72 h
Figure 2 Analysis of STAT and SOCS transcripts in the sensitive WM1158S subline. (A) Total RNAs were prepared from cells treated withIFN-g for 30 min, 24 and 72 h and from non-treated controls. TheDNA products of RT–PCRs were separated on 2% agarose gels. (B)Transcription is expressed as a SOCS/GAPDH ratio or (C) fold increaseover basal level. Means of three independent experiments are shown.
SOCS expression in IFN-c- sensitive and -resistant melanoma cells
M Fojtova et al
233
British Journal of Cancer (2007) 97(2), 231 – 237& 2007 Cancer Research UK
Mo
lecu
lar
Dia
gn
ost
ics
expression of SOCS 3 in these cells. To quantify transcript levels,we measured fluorescence intensities of individual bands andexpressed data as the SOCS 3/GAPDH ratio (Figures 2B– 3B andTable 1). RT–PCR analysis of SOCSs RNA was further carriedout in additional melanoma cell lines (Table 1) and in humanmelanocytes (Figure 4). Relatively strong SOCS 3 signals wereobserved in both IFN-resistant WM 9 and 1205 Lu lines while lowconstitutive expression displayed relatively sensitive WM 39 andWM 1552C (Table 1) and the melanocytes (Figure 4A). Comparedto SOCS 3, the SOCS 1 signals were barely detectable except of 1205Lu (data not shown). Abundant SOCS 5 transcripts were detectedin all cell lines (exemplified in Figures 2A–4A).
Expression profiles after IFN-c treatment
After the IFN-g treatment, there were no material changesin the STAT transcripts profiles. In melanocytes, there was amoderate (1.5-fold) increase of STAT 1 (Figure 4) while noincrease was observed in melanoma lines (Figures 2 –3). However,IFN-g slightly elevated STAT 5 and STAT 6 signals in melanomacells.
Significant qualitative changes occurred in a spectrum of SOCS-specific bands after the IFN treatment (Figures 2–4). The mostprominent changes involved SOCS 3 and SOCS 1 transcripts. SOCS3 expression was significantly induced in WM 1158S subline(Figure 2), WM 1552C and WM 39 cells (Table 1) as well as innormal melanocytes (Figure 4). However, no or weak SOCS 3signals were detected in WM 9 and 1205 Lu cells (Table 1) and WM1158R subline (Figure 3). The induction levels were expressed as aratio of normalised signals in IFN-treated and -non-treated cells(Figures 2C–4C, Table 1). Detailed kinetic analysis (Figures 2 –4)revealed that in both WM 1158S and melanocytes the SOCS 3
signal peaked within 24 h following IFN-g treatment while in WM1158R the faint induction was time-limited and reached itsmaximum in a 30 min interval. After 72 h, there was no apparentdifference between non-treated and treated WM 1158R cells,whereas WM 1158S still retained elevated SOCS 3 expression.
Intensities of the SOCS 1 bands were generally much lower thanthose of SOCS 3. Nevertheless, it is evident that SOCS 1 bands werevisible after IFN-g in both WM 1158S and WM 1158R andmelanocytes. Compared to SOCS 3, the induction was shifted to alonger exposure time. IFN treatment had no apparent effect onSOCS 2 RNA levels.
STAT 1 phosphorylation
Several studies indicated the importance of activated (phosphory-lated) STAT 1 molecules in IFN resistance. We explored STAT 1phosphorylation status in cell extracts of sensitive and resistantsublines derived from WM 1158 melanoma cells isolated fromdifferent time intervals of IFN treatment (Figure 5). In the resistantWM 1158R subline, the signal corresponding to phosphorylatedS727 isoform sharply increased within 30 min after the inductionwith IFN-g and remained stable thereafter. In contrast, thesensitive WM 1158S cells showed relatively uniform pS727 bands,not significantly influenced by IFN treatment. Both sublinesexhibited increased and stable pY701 signals in the presence ofIFN-g. STAT 1 levels were not significantly influenced by IFNtreatment as revealed by staining of blots with an antibodyrecognising a primary determinant (Figure 5, bottom panels).Similar STAT 1 phosphorylation results were also observed inadditional WM 9 and WM 39 melanoma cell lines as well as inmelanocytes (data not shown).
CTR
STA
T1
STA
T2
STA
T3
STA
T4
STA
T5A
STA
T5B
WM 1158R
STA
T6
SO
CS
1
SO
CS
2
SO
CS
3
SO
CS
5
GA
PD
H
IFN-�30 min
IFN-�24 h
IFN-�72 h
CTR1.2
10.80.60.40.2
SOCS1 SOCS3
SOCS1 SOCS3
0
9
7
5
3
1
IFN-� 30 min
IFN-� 24 hIFN-� 72 h
IFN-� 30 min
IFN-� 24 h
IFN-� 72 h
Figure 3 Analysis of STAT and SOCS transcripts in the resistant WM1158R subline. The conditions and experimental set-up were as in Figure 2.
CTR
STA
T1
STA
T2
STA
T3
STA
T4
STA
T5A
STA
T5B
Melanocytes
STA
T6
SO
CS
1
SO
CS
2
SO
CS
3
SO
CS
5
GA
PD
H
IFN-�30 min
IFN-�24 h
IFN-�72 h
Control0.8
0.6
0.4
0.2
0
21161161
SOCS1 SOCS3
SOCS1 SOCS3
IFN-� 30 min
IFN-� 24 h
IFN-� 72 h
IFN-� 30 min
IFN-� 24 h
IFN-� 72 h
Figure 4 Analysis of STAT and SOCS transcripts in normal humanmelanocytes. Description of lanes and panels is as in Figure 2. Results of asingle experiment are shown.
SOCS expression in IFN-c- sensitive and -resistant melanoma cells
M Fojtova et al
234
British Journal of Cancer (2007) 97(2), 231 – 237 & 2007 Cancer Research UK
Mo
lecu
lar
Dia
gn
ostic
s
DISCUSSION
Development of interferon resistance over cell culturepassages
In the present study, we have isolated and characterisedinterferon-sensitive and -insensitive sublines of a parentalmelanoma line. Development of cytokine resistance is a knowncomplex phenomenon linked to progression from early toadvanced stages of malignant melanoma (Lu et al, 1993). It couldbe a result of selection of pre-existing resistant cells in parentaltumour or alteration of signal transduction pathways as a resultof genetic/epigenetic cellular changes. Our data do not allow todistinguish between both possibilities. Interestingly, similar switchtowards IFN-g-resistant phenotype was previously reported incervical carcinoma cells (Lee et al, 1999), suggesting thatemergence of IFN-resistant phenotype might be a general featureof cells that have passed multiple divisions in vitro and possibly invivo as well. However, while in their experiments the sensitivitychange was correlated with the loss of STAT 1 expression, in oursystem STAT 1 continued to be expressed and faithfullyphosphorylated at tyrosine residues at least. Perhaps there mightbe multiple alternative pathways influencing antiproliferativepotential of IFNs.
Expression profiles of SOCSs in melanoma cells
The SOCS gene products are known STAT-induced negativeregulators of STATs phosphorylation. We took advantage of theavailability of sensitive and insensitive derivatives of WM 1158line to study changes in SOCS expression patterns. In this way, wereduced variation originating from different parental origin(tumour stage, histological type and patient individuality) of celllines. Out of four SOCS genes investigated, SOCS 3 and SOCS 1appeared to be the best responders while SOCS 2 and SOCS 5 wereinsensitive to IFN-g challenge (Figures 2 –4). The absence of SOCS5 induction fits with the current view that SOCS 5 is not a classicalfeedback regulator of cytokine signalling (Fujimoto and Naka,2003). The induction of SOCS 3 transcripts remarkably differedbetween the WM 1158 sublines: while the sensitive subline showedin average 7.5-fold induction of SOCS 3, there was only marginaltranscript increase in its IFN-resistant variant (Table 1). Thedifferences were less pronounced for SOCS 1, and the induction ofthis gene also showed higher level of variation (Figures 2– 3). Thekinetic experiments showed that the sensitive subline maintainedelevated SOCS 1 and SOCS 3 mRNA levels for 472 h followingIFN-g challenge while both transcripts were attenuated rapidly tobasal levels in the resistant WM 1158R. Significantly, duration ofelevated SOCSs expression correlated with the growth inhibitionthat was most pronounced within the 24–72 h interval (Figure 1).These results indicated differences in the extent and dynamics ofSOCS 1 and SOCS 3 IFN-mediated activation between sensitive and
resistant sublines. Interestingly, a good correlation betweenconstitutive SOCS 3 expression, lack of its inducibility and IFNcell resistance was obtained in additional melanoma cell lines(Table 1). The strong upregulation of SOCS 3 following IFN-gcould be a specific feature of melanoma lineages because epithelialbreast cancer cells showed its downregulation (Evans et al, 2007)or variable expression (Souckova, unpublished data). However, inbreast cancer cells SOCS 1 was strongly activated while itsinduction was rather weak in melanoma lines used. It is likelythat SOCS activation pathways operate differently in diverse celland tissue types.
In general, the cell sensitivity to interferon was better correlatedwith inducibility of SOCS 3 than that of SOCS 1. The questionarises as to the possible cause of differential activation of thesegenes. Epigenetic changes in the course of prolonged cultivation ofcells have been well described (Chow and Rubin, 2000; Fojtovaet al, 2003) and both SOCS genes were shown to be inactivatedby methylation of their promoters (He et al, 2003). However, weconsider this possibility unlikely since the IFN-insensitive WM1158R subline expressed SOCS 3, suggesting that the promoter istranscriptionally active. Although highly specific methylation of anIFN–responsive element in the promoter cannot be entirelyexcluded, we favour the hypothesis that constitutive SOCS 3expression could counteract the transactivatory signals deliveredby IFN-activated STATs. In support, three IFN-insensitive WM1158R, WM 9 and 1205 Lu melanoma lines had high basalexpression of SOCS 3 compared to sensitive cells. Furthermore,breast cancer (Evans et al, 2007) and leukaemia cells (Sakai et al,2002) showed elevated constitutive expression of SOCS 1 and SOCS3 and the resistance to proinflammatory cytokines includingIFN-g. Perhaps IFN sensitivity of a SOCS 3 promoter is reduceddue to aberrant expression of an activatory transcription factor(s).In this context, aberrant activation of tissue-specific promoters hasbeen observed in cancers (Kovarik et al, 1993).
Relation between SOCSs induction and STAT 1phosphorylation
Since STAT 1 is one of the major targets of phosphorylationelicited by IFN-g, we have investigated relationship between STAT1 phosphorylation at S727 and Y701 residues and SOCS induction.Our semi-quantitative RT–PCR failed to reveal significantdifferences in STAT 1 levels (both constitutive and induced),suggesting that amounts of gene products were not markedlyinfluenced by IFN (Lesinski et al, 2005). At the proteinmodification level, IFN-g stimulated phosphorylation of Y701residues in both sensitive and insensitive cells consistent withprevious studies that demonstrated lack or weak correlationbetween Y701 STAT 1 phosphorylation and cell sensitivity tocytokine stimuli (Chawla-Sarkar et al, 2002; Kortylewski et al,2004). Surprisingly, the differences in IFN sensitivity were bestreflected by the second most commonly phosphorylated site, theS727 residue: while the IFN-sensitive WM 1158S cells did not showmarked increase of S727 phosphorylation following IFN-g treat-ment, there was extensive and prolonged phosphorylation of thisamino acid in the insensitive subline. Considering that SOCS 3regulator was more strongly activated in the IFN-sensitive subline,it is tempting to speculate that phosphorylation of S727 residueswas specifically blocked by this molecule. In this context, S727-phosphorylated STAT 1 provided apoptotic resistance for Wilmstumour cells (Timofeeva et al, 2006). Although phosphorylation atY701 was shown to be sufficient for transactivatory capacity ofSTAT 1 molecule (Shuai et al, 1993), S727 phosphorylation seemsto be an important modulator of target specificity in haemopoeticcells (Kovarik et al, 2001). Perhaps high levels of STAT 1phosphorylation at S727 might activate specific genes involved inIFN resistance.
WM 1158R
C 0.5 h 24 h 48 h 72 h C 0.5 h 24 h 48 h 72 h
pS727 STAT1
pY701 STAT1
S1C STAT1
WM 1158S
Figure 5 STAT 1 phosphorylation levels in both IFN-resistant and IFN-sensitive WM 1158 sublines. The proteins were extracted from the samecellular pool as used for RNA analysis and analysed by Western blot. Allexperiments were performed in triplicates.
SOCS expression in IFN-c- sensitive and -resistant melanoma cells
M Fojtova et al
235
British Journal of Cancer (2007) 97(2), 231 – 237& 2007 Cancer Research UK
Mo
lecu
lar
Dia
gn
ost
ics
Comparison of normal versus malignant cells
In normal human melanocytes, SOCS 3 appeared to be stronglyinduced following IFN-g while its basal levels were low ornegligible. The induction was quite stable and only marginaldecrease occurred within the 72 h treatment interval. In this aspect,there were apparent similarities between normal cells and theIFN-sensitive WM 1158S melanoma subline. However, melano-cytes differed from malignant cells in no or marginal SOCS 1expression. This is congruent with another study showing lowlevels of SOCS 1 in melanocytes compared to melanoma cell lines(Li et al, 2004). However, in their study the lack of SOCS 1expression occurred at the protein but not at the RNA level. Ourfailure to detect SOCS 1 in melanocytes might be explained bydifferences in the sensitivity of the RT–PCR assay (e.g., variablenumber of cycles), and perhaps by other factors.
Conclusions and further directions
In conclusion, prolonged maintenance of melanoma cells in cellculture may lead to reduction of their sensitivity to IFN-g. At the
molecular level, this process is associated with increasedconstitutive expression of SOCS 3 whose levels are no longer ormarginally influenced by IFN signals. Our data suggest thatchanges in the SOCS 3 expression are tightly bound with theprogression of melanoma cells from IFN-sensitive to IFN-resistantphenotype and may account for a growth advantage of melanomain vivo at its advanced stages. In the future, it will be interestingto analyse the expression of various SOCSs in clinical samples tocorrelate their expression profiles with patients’ responsiveness toIFN-based immunotherapy and disease outcome.
ACKNOWLEDGEMENTS
The study was supported by the Internal Grant Agency of theCzech Ministry of Health (NR/8341-3), the Grant Agency of theCzech Republic (301/06/0912), Academy of Sciences of the CzechRepublic (A50040507, KJB502070601) and by Project MZO00209805. We thank Professor Dr M Herlyn (Wistar Institute,USA) for a kind gift of melanoma cell lines.
REFERENCES
Alexander WS, Starr R, Fenner JE, Scott CL, Handman E, Sprigg NS, CorbinJE, Cornish AL, Darwiche R, Owczarek CM, Kay TW, Nicola NA, HertzogPJ, Metcalf D, Hilton DJ (1999) SOCS1 is a critical inhibitor of interferongamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions ofthis cytokine. Cell 98: 597 – 608
Boudny V, Kocak I, Lauerova L, Kovarik J (2003) Interferon inducibility ofSTAT 1 activation and its prognostic significance in melanoma patients.Folia Biol (Praha) 49: 142 – 146
Brierley MM, Fish EN (2005) Stats: multifaceted regulators of transcription.J Interferon Cytokine Res 25: 733 – 744
Calo V, Migliavacca M, Bazan V, Macaluso M, Buscemi M, Gebbia N, RussoA (2003) STAT proteins: from normal control of cellular events totumorigenesis. J Cell Physiol 197: 157 – 168
Chawla-Sarkar M, Leaman DW, Jacobs BS, Borden EC (2002) IFN-betapretreatment sensitizes human melanoma cells to TRAIL/Apo2 ligand-induced apoptosis. J Immunol 169: 847 – 855
Chow M, Rubin H (2000) Clonal selection versus genetic instability as thedriving force in neoplastic transformation. Cancer Res 60: 6510 – 6518
Durbin JE, Hackenmiller R, Simon MC, Levy DE (1996) Targeted disruptionof the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viraldisease. Cell 84: 443 – 450
Evans MK, Yu CR, Lohani A, Mahdi RM, Liu X, Trzeciak AR, Egwuagu CE(2007) Expression of SOCS1 and SOCS3 genes is differentially regulatedin breast cancer cells in response to proinflammatory cytokine andgrowth factor signals. Oncogene 26: 1941 – 1948
Fojtova M, Van Houdt H, Depicker A, Kovarik A (2003) Epigenetic switchfrom posttranscriptional to transcriptional silencing is correlated withpromoter hypermethylation. Plant Physiol 133: 1240 – 1250
Fujimoto M, Naka T (2003) Regulation of cytokine signaling by SOCSfamily molecules. Trends Immunol 24: 659 – 666
He B, You L, Uematsu K, Zang K, Xu Z, Lee AY, Costello JF, McCormick F,Jablons DM (2003) SOCS-3 is frequently silenced by hypermethylationand suppresses cell growth in human lung cancer. Proc Natl Acad SciUSA 100: 14133 – 14138
Hebenstreit D, Luft P, Schmiedlechner A, Duschl A, Horejs-Hoeck J (2005)SOCS-1 and SOCS-3 inhibit IL-4 and IL-13 induced activation of Eotaxin-3/CCL26 gene expression in HEK293 cells. Mol Immunol 42: 295 – 303
Hilton DJ (1999) Negative regulators of cytokine signal transduction. CellMol Life Sci 55: 1568 – 1577
Jackson DP, Watling D, Rogers NC, Banks RE, Kerr IM, Selby PJ, Patel PM(2003) The JAK/STAT pathway is not sufficient to sustain theantiproliferative response in an interferon-resistant human melanomacell line. Melanoma Res 13: 219 – 229
Komazaki T, Nagai H, Emi M, Terada Y, Yabe A, Jin E, Kawanami O,Konishi N, Moriyama Y, Naka T, Kishimoto T (2004) Hypermethylation-associated inactivation of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor, inhuman pancreatic cancers. Jpn J Clin Oncol 34: 191 – 194
Kortylewski M, Komyod W, Kauffmann ME, Bosserhoff A, Heinrich PC,Behrmann I (2004) Interferon-gamma-mediated growth regulation ofmelanoma cells: involvement of STAT1-dependent and STAT1-indepen-dent signals. J Invest Dermatol 122: 414 – 422
Kovarik A, Fojtova M, Boudny V, Adamkova L, Lauerova L, Kovarik J(2005) Interferon-gamma, but not interferon-alpha, induces SOCS 3expression in human melanoma cell lines. Melanoma Res 15: 481 – 488
Kovarik A, Peat N, Wilson D, Gendler SJ, Taylor-Papadimitriou J (1993)Analysis of the tissue-specific promoter of the MUC1 gene. J Biol Chem268: 9917 – 9926
Kovarik J, Boudny V, Kocak I, Lauerova L, Fait V, Vagundova M (2003)Malignant melanoma associates with deficient IFN-induced STAT 1phosphorylation. Int J Mol Med 12: 335 – 340
Kovarik P, Mangold M, Ramsauer K, Heidari H, Steinborn R, Zotter A, LevyDE, Muller M, Decker T (2001) Specificity of signaling by STAT1depends on SH2 and C-terminal domains that regulate Ser727phosphorylation, differentially affecting specific target gene expression.EMBO J 20: 91 – 100
Lee KY, Anderson E, Madani K, Rosen GD (1999) Loss of STAT1 expressionconfers resistance to IFN-gamma-induced apoptosis in ME180 cells.FEBS Lett 459: 323 – 326
Lens MB, Dawes M (2002) Interferon alpha therapy for malignantmelanoma: a systematic review of randomized controlled trials. J ClinOncol 20: 1818 – 1825
Lesinski GB, Valentino D, Hade EM, Jones S, Magro C, Chaudhury AR,Walker MJ, Carson III WE (2005) Expression of STAT1 and STAT2 inmalignant melanoma does not correlate with response to interferon-alpha adjuvant therapy. Cancer Immunol Immunother 54: 815 – 825
Li Z, Metze D, Nashan D, Muller-Tidow C, Serve HL, Poremba C, Luger TA,Bohm M (2004) Expression of SOCS-1, suppressor of cytokine signalling-1, in human melanoma. J Invest Dermatol 123: 737 – 745
Lu C, Rak JW, Kobyashi H, Kerbel RS (1993) Increased resistance tooncostatin M-induced growth inhibition of human melanomacell lines derived from advanced-staged lesions. Cancer Res 53:2708 – 2711
Masuhara M, Sakamoto H, Matsumoto A, Suzuki R, Yasukawa H, Mitsui K,Wakioka T, Tanimura S, Sasaki A, Misawa H, Yokouchi M, Ohtsubo M,Yoshimura A (1997) Cloning and characterization of novel CIS familygenes. Biochem Biophys Res Commun 239: 439 – 446
Pansky A, Hildebrand P, Fasler-Kan E, Baselgia L, Ketterer S, Beglinger C,Heim MH (2000) Defective Jak-STAT signal transduction pathway inmelanoma cells resistant to growth inhibition by interferon-alpha. Int JCancer 85: 720 – 725
Ramana CV, Kumar A, Enelow R (2005) Stat1-independent induction ofSOCS-3 by interferon-gamma is mediated by sustained activation ofStat3 in mouse embryonic fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun327: 727 – 733
SOCS expression in IFN-c- sensitive and -resistant melanoma cells
M Fojtova et al
236
British Journal of Cancer (2007) 97(2), 231 – 237 & 2007 Cancer Research UK
Mo
lecu
lar
Dia
gn
ostic
s
Ransohoff RM (1998) Cellular responses to interferons and other cytokines:the JAK-STAT paradigm. N Engl J Med 338: 616 – 618
Sakai I, Takeuchi K, Yamauchi H, Narumi H, Fujita S (2002) Constitutiveexpression of SOCS3 confers resistance to IFN-alpha in chronicmyelogenous leukemia cells. Blood 100: 2926 – 2931
Shuai K, Ziemiecki A, Wilks AF, Harpur AG, Sadowski HB, Gilman MZ,Darnell JE (1993) Polypeptide signaling to the nucleus through tyrosinephosphorylation of Jak and Stat proteins. Nature 366: 580 – 583
Sutherland KD, Lindeman GJ, Choong DYH, Wittlin S, Brentzell L,Phillips W, Campbell IG, Visvader JE (2004) Differential hypermethyla-tion of SOCS genes in ovarian and breast carcinomas. Oncogene 23:7726 – 7733
Timofeeva OA, Plisov S, Evseev AA, Peng S, Jose-Kampfner M, LovvornHN, Dome JS, Perantoni AO (2006) Serine-phosphorylated STAT1is a prosurvival factor in Wilms’ tumor pathogenesis. Oncogene 25:7555 – 7564
Weber A, Hengge UR, Bardenheuer W, Tischoff I, Sommerer F, MarkwarthA, Dietz A, Wittekind C, Tannapfel A (2005) SOCS-3 is frequentlymethylated in head and neck squamous cell carcinoma and its precursorlesions and causes growth inhibition. Oncogene 24: 6699 – 6708
Wellbrock C, Weisser C, Hassel JC, Fischer P, Becker J, Vetter CS,Behrmann I, Kortylewski M, Heinrich PC, Schartl M (2005) STAT5contributes to interferon resistance of melanoma cells. Curr Biol 15:1629 – 1639
Wong LH, Krauer KG, Hatzinisiriou I, Estcourt MJ, Hersey P, Tam ND,Edmondson S, Devenish RJ, Ralph SJ (1997) Interferon-resistant humanmelanoma cells are deficient in ISGF3 components, STAT1, STAT2, andp48-ISGF3gamma. J Biol Chem 272: 28779 – 28885
Yoshikawa H, Matsubara K, Qian GS, Jackson P, Groopman JD, ManningJE, Harris CC, Herman JG (2001) SOCS-1, a negative regulator of theJAK/STAT pathway, is silenced by methylation in human hepatocellularcarcinoma and shows growth-suppression activity. Nat Genet 28: 29 – 35
SOCS expression in IFN-c- sensitive and -resistant melanoma cells
M Fojtova et al
237
British Journal of Cancer (2007) 97(2), 231 – 237& 2007 Cancer Research UK
Mo
lecu
lar
Dia
gn
ost
ics
lnterfeÍofl.y, but not interfeřOfl.C[, induces SOCS 3 expressionin.human melanoma cel l l ines .Ales Kovarik", Miloslava Fojtova", Vladimir Boudnyb, Lenka Adamkovab,Ludmila Lauerovab and Jan Kovarikb
The signal transducers and transcription activators (STATs)and their endogenous inhibitors of the suppressors ofcytokine signa||íng (socs) fami|y are major proteinsharmonizing the transmission of external signals from thesurface membrane to target genes in the nucleus. Tocorrelate the induction of SOCS 3 by interferons (lFNs) onmessenger RNA and protein levels with STAT 1 phos-phorylation in human malignant melanoma cell lines, weused a unique co||eďion of 18 estab|ished malignant .melanoma cell l ines and six human non-malignant normalce||s (two melanocytes, two skin keratinocýes and twofibroblasts). IFN-y induced SOCS 3 in 830/o of melanomacell lines, whereas IFN-a stimulated SOCS 3 expression inonly 110/o of cases. Similarly, melanocytes showed stronginduction of SOCS 3 by IFN-y and, to a lesser extent, byIFN-cr. In most cases, SOCS 3 expression was paralleled bySTAT 1 phosphory|ation at tyrosine residues ť701). lnsevera| lines, howeveř' socs 3 was not induced despiteSTAT 1 phosphorylation and, in a few lines, SOCS 3induction occurred without detectable STAT 1 phosphor-ylation, indicating that STAT 1 might not be an exclusiveinducer of SOCS 3. Similarly, non-malignant cells displayedSTAT 1 aďivation and high |eve|s of socs 3 expression
lntroductionA vital role in cytokine-induced signalling cascades and,consequently, in gene transcription has been ascribed toJanus tyrosine kinase/signal transducer and transcriptionactivator (JAIVSTAT) transduction pathways. Threemajor groups of proteins that harmonize the transmissionof external signals from the surface membrane to rargetgenes in the nucleus have been reported. These includereceptor-associated JAKs, STATš and their negativeregulators [suppressors of cytokine signall iňg (SoCSs)][1,2), and prorein inhibitors of activared STAB (PIASs)[3] operating at the receptor{AK complex or in thenucleus.
STATs belong to a multigene family of latent cytoplasmicproteins localized in an inactive form in the cytoplasmand comprising seven members identified so far (STATsl-4, 5a,5b and 6). Activared STATs rranslocate to thenucleus where they bind to specific DNA sequences inthe promoters of responsive genes and subsequentlymodulate their expression [4-6j. Phosphorylation of theryrosine and serine residues of various STATs, including
0960-8931 O 2005 Lippincott Williams & Witkins
Original article 48 1
after IFN-y (but not IFN-o) treatment. ln conclusion, incontrast to IFN-o, IFN-y appeared to induce SOCS 3apparently at the transcription level and exhibited highercytotoxic effeďs regardless of the cel| origin. MelanomaRes 15:48'l -488 @ 2005 Lippincott Williams & Wilkins.
Melanoma Research 2005, 15:481 -488
Keywords: interferons, malignant melanoma, signal transduction, SOCS 3,STAT 1
'lnstitute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic and"Department oÍ Experimental onco|ogy, Masaryk Memoria| cancer Institute,Brno, Czech Republic
Correspondence and requests Íor reprints to Jan Kovarik DrSci, MasarykMemoria| cancer |nstituté, Z|uty kopec Z 656 53 Brno, Czech RepublicTel: (+42o)-g 491g gB00; fax: (+420)-b 431g 3313;e-mail: [email protected]
Sponsorship: The study was supported in part by gÍants NR/8341.3 írom theInternal Grant Agency ofthe Czech Ministry of Health,30l/03/0370 from theGrant Agency of ihe Czech Repub|ic, s500401 0 írom the Academy oí Sciencesoí the Czech Repub|ic, Projects MZo 00209805 and MSM 6-l 9895921 6.
Received 12 January 2005 Accepted 1O August 2005
STAT 1 [7,8], is important for interferon (IFN) signaltransduction and transactivation. In oioo, STATš mediatea wide range of actions induced by IFNs, interleukins andgrowth factors. Via target gene rransactivation and incooperation with other rranscriptional activators, STATsmodulate developmental processes, cell growth, differ-entiation, senescence and apoptosis in various cell types.Of particular importance, STAT proteins play a sub-stantial role in coordinated signalling within multiplecomponents of the immune system, whose development,maturation, differentiation and function are induced andorchestrated by IFNs and interleukins, that is ligandsthat utilize STAT signalling pathways [9]. Moreover,recent reports have shown that STAT proteins functionin a broad range of immune compartments, includingdendritic cells and T:regulatory subsers [10,11].
The SOCS proteins represenr the largest and apparentlythe most important factors in a classic negarive feedbackloop that regulates JAIÝSTAT transduction pathwaysinitiated by various exogenous stimuli [2,12]. In manycases, the transcriptional upregulation of SOCS genes is
482 Melanoma Research 2005, Vol 15 No 6
mediated by activated STATs. In contrast, suppression ofthe JAIýSTAT pathways leads to a decrease in theexpression of SOCS proteins, thus contributing rothe process of restoring cell responsiveness. Althoughthe exact molecular mechanism by which SOCS mole-cules block the JAIÝSTAT pathways remains mostlyunclear, it is likely that SOCS proteins control theinitiation, magnitude and duration of cytokine signals andmay determine the threshold level of cytokine to which acell will meaningfully respond.
The gradual underscanding of STAT/SOCS signalling mayhave significant practical consequences in oncology. Theabnormal signal transduction and induction of genetranscription mediated via STAT/SOCS pathways arethought to be involved in the biology of cancer and in itsresponse to cytokine-based therapy t131. Several sug-gested cancer-related alterations in these systems includethe down-regulated expression or constitutive release ofSTATs and their inappropriate activation. Moreover,abnormal proteasome SOCS degradation and/or silencingof the SOCS gene locus by methylation has also beensuggested as a cause of continued signalling in cancer[14,15]. To date, only a few reports have analysed the roleof STATsignalling in cancer patients in relation to IFN-o-induced direct antiproliferative activiry and the sensitiv-iry of melanoma cells to exogenous IFN-cr [16]. Thesedata support the notion that an abnormaliry in STAT Ilevel, or in its activation, may coincide with a diminishedresponsiveness of tumour cells to IFN-o growrh inhibi-tory activity. Data opposing the association of abnormal-ities in STAT status and patients' response to IFN-o
treatment have also been reported. For example, Lesinskiet al. Il7), in their clinical studies, showed that levels ofSTAT 1 and STAT 2 within a tumour do not significantlyinfluence a patient's response to adjuvant IFN-cx therapy.Thus, the relationship between abnormalities in STATstatus and a patient's response to IFN-a treatmentremains elusive. To our knowledge, no convincing repoÍtshave investigated the possible tumour-associated defectsin SOCS proteins and their consequences.
In this study, we investigated SOCS 3 gene expression inresponse to IFN treatment in several well-defined humanmalignant melanoma cell lines, melanocytes, normal skinkeratinocytes and fibroblasts. The expression was exam-ined at both RNA (Northern blot) and protein flV'esternblot) levels and correlated with the phosphorylationstatus of the STAT l prorein.
Materials and methodsCells, IFN treatments and growth inhibition assayCellular modelsfu a model, a unique collection of 18 human malignantmelanoma cell l ines [18], kindly provided by Professor M.Herlyn (Wstar Institute, Philadelphia, Pennsylvania,USA), was used. All cell line characteristics are shownin Table 1. The cells were grown in Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM; PAN Biotech GmbH, Aiden-bach, Germany) with l-glutamine (PAN Biotech GmbH)supplemented with I0% fetal bovine serum (FBS; PANBiotech GmbH)' insulin (5 nďml) and antibiotics.Melanocytes were purchased from TCS CellWorks(Botolph Claydon, Buckinghamshire, UK) and grown in
Tab|e 1 Charaďeristics of human ma|ignant me|anoma ce|| |ines. Resistance to interferons (lFNs)
Cell l ine Origin Stage Histopathological characteristics IFN- 'y"(ng/ml) IFN-o'(U/ml)
Growth phase Clark Breslow (mm)
500ó growth inhibitionwM 1158wM 1552CwM 1617WM 164WM 35WM 9834wM 3211WM 852300/o growth inhibitionWM 9O2BWM 2394451 LuWM9WM 1341DWM 852WM 1I5WM 373wM 3211Resistant1 205LuWM 39WM 278WM 793
MPMMPPPM
PMMMPMPMP
n.a.n.a.n.a.n,a.n.a.3
n.a.n,a.1
31
I
Ú
RGP/VGPRGP/VGP
VGP onlyRGP/VGPRGP/VGPRGP/VGPVGP only
\/aD
n.a.RGP/VGPVGP onlyRGPAr'GP
RGP/VGP
VGP onlyRGP/VGP
2.52.51010
10050
ResistantResistant
2.52.5105050100100200200
ResistantResistantResistantResistant
10000500
ResistantResistantResistantResistant'10 000
>10000
Resistant>10000>10000Resistant>10ooo>10000>10000>1000010000
ResistantResistantResistantResistant
l l lIV
n.a,illl lIV
n.a.ill
n,a.n.a.n,a.
IVillIV
n.a.
n,a.
IVt l
2.755.92n.a.2.7
0.6925n.a.2.7
n.a.n.a.
n.a.25
2.24
n.a.
n.a.3.70.55
MPPP
2'l
M, meiastatic cells; n.a., inÍormation not avai|ab|e; P' primary me|anoma; RGP, radial growth phase; VGP, vertica| growth phase."Me|anoma ce||s were treated with different doses oÍ |FN for 4 days. The va|ue of IFN (ng/m|, U/ml) represents the minimal concentÍation required for growth inhibitioncomoared with an untreated control.
Malignant me|anoma and |FN.induced STAT 1 activation ánd SoCS 3 expression Kovarik eť ai. 483
the recommended commercial medium (M-254) withhuman melanocyte growth supplements (HMGS). Cellswepe expanded at minimum passages, preserving their "good growth characteristics and yielding a sufficientamount of material. Ear skin of healthy donors and humandermal fibroblasts were emp|oyed tá establish primarycultures of keratinocytes and fibroblasts, respectively, andgrown in DMEM as described above.
IFN treatmentsSubconfluent crlls were serum-starved overnight beforeexposure to IFNs. Activation dosages of both IFNs wereselected from the dose-response curves. IFN-1 was usedat a concentration of 10 nýml and IFN-d at concentra-tions of 1000 and 5000IU/ml. Cells were incubated withIFNs for 30min at 37"C in a humidified 5% CO2atmosphere. Control samples were incubated in parallelwithout IFN treatment. Cells were harvesred and lysedaccording to standard procedures suitable for Western andNorthern analyses.
Growth inhibition assayThe antiproliferative effect of recombinant human IFN-uand IFN-y (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) wasassessed in 18 melanoma cell lines. Cells were seededin duplicate into 96-well plates at a cell density of 2000cells per well. One day after seeding, the medium wasreplaced by medium containing IFNs at concenrrarions of2.5, 5, t0,50, 100, 200 and 400 nýml for IFN-1 and 200,500, 1000,2000,5000, 10000 and 20000U/mlfor IFN-or.After 4 days of cukure, WST:1 colorimetric assay (Roche,Mannheim, Germany) was performed according ro rhemanufacturer's protocol. The percentage of growthinhibition was calculared in relation ro rhe srowrh ofuntreated control cells.
Western blots and antibodiesWestern blotThe protein contenr in whole-cell extracts was deter-mined by means of the Bradford assay (Bio-Rad, Munich,Germany). Between Z0 and 50pg of total protein wasseparated by sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE). For the STAT 1 and SOCS3 analyses, t0% and lSVo gels were used, respecrively, andthe proteins were transferred ro nitrocellulose (Bio-Rad,Hercules, California, USA) and probed with relevantantibodies. SOCS 3 prorein was direcrly detected onblots; phosphorylated STAT I was visualized afrerimmunoprecipitation as described in Kovarik et al. L191.For normalization of rhe signals, Western blots werereprobed with an antibody (pan-ERK) against extracel-lular signal-regulated protein kinases I and 2 (ERK I at44kDa and ERK Z at 42kDa), known nor to beinfluenced bv IFNs [8,20-ZZ).After the primary antibodybinding reaction, blots were incubated wíth either anti-mouse or anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugatedsecondary antibody (Amersham Biosciences, Little Chal-
font, Buckinghamshire, UK) and developed using theenhanced chemiluminescence (ECL) detection sysrem(Amersham Biosciences) according to the manufacturer'sinstructions. Signals were quantified by densitometryusing ImageQuanr software (Molecular Dynamics, Sunny-vale, California. USA).
AntibodiesFor the detection of SOCS 3 protein, anti-SOCS 3 rabbitpolyclonal antibody was purchased from AbCam(Cambridge, Cambridgeshire, UK). As a loading controlfor SOCS 3 Western blots, commercial mouse monoclonalantibody to pan-ERK \Mas employed (BD TřansductionLaboratories, San Diego, California, USA). For thedetection of phosphorylated STAT 1 isoforms, anti-pY-701 polyclonal antibody (Cell Signaling Technology,Beverly, Massachusetts, USA) and anti-pS-727 monoclo-nal antibody (pSM I, developed in the authors'laboratory[19]) were used.
Northern blotsRNA isolation and Northern blot hybridizationTotal RNA was isolated from frozen cell pellets (cellnumber, 8 x t07) using the RNeasy Mini Kit (Qiagen,Hilden, Germany) according to the manufacturer'sinstructions. The RNA qualiry was checked by elecrro-phoresis on a l% agarose gel. RNA was subjected toelectrophoresis in t.Z% formaldehyde-agarose gels andblotted onto a nylon membrane (Hybond-Xl, AmershamBiosciences) according to a Qiagen-recommended proto-col. The probe was radioactively labelled wirh u-[32P]-deoxycytidine triphosphate (dCTP) (ICN, Irvine,California, USA) in a random priming reaction using aDecaprime kit (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Hybridi-zation with labelled probes was carried out in 0.25 M Na-phosphate buffer, pH 7.0, supplemented with 7Vo SDS at65'C for at least 16h, followed by washing with 2 x SSCand 0.1% SDS (1 x SSC : 150 mM NaCl, 15 mM Na3-citrate, pH 7.0) (65'C, twice for 5min), 0.2 x SSC and0.1% SDS (65'C, twice for 15min). The hybridizationbands were visualized using a phosphorimager (STORM;Molecular Dynamics). The radioactivity in the bands wasquantified by a rectangle integration method usingImageQuant softwaÍe (Molecular Dynamics)' Each blotcontained a standard RNA sample allowing comparison ofsignal intensities between individual blots. The data wereassembled from three independent experiments.
DNA probesThe following probes and plasmids were used in thehybridization experiments: the SOCS 3 probe \Mas aninsert of the pcDNA 3 plasmid carrying -Í.?kb of thehuman SOCS 3 cDNA lZ3l; the GAPDH probe was aninsert of the pV2 (GAPDH) plasmid carrying -350bp ofthe mouse glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenasecDNA (collections of the Cancer Research Campaign,London. UK).
{íl
i
484 Melanoma Research 2005, Vot 1b No 6
ResultsGrowth inhibition assay
.Individual cell lines showed considerable differences insensitivity to IFNs, fluctuating from apparently sensirivecells responding by more than 50% growth inhibition(eight lines) to partially sensitive cells with growthinhibition up to 30vo (nine lines) to íour entirely resistantlines (Table 1). At clinically relevant doses (< 250 U/ml),the responsiveness of most cell lines was poor to IFN-o.There was no correlation between rhe hiitoparhologicalfeatures of the original rumours and sensitiviry to IFNs.
Stimu|ation of SoCS 3 expression by |FN tÍeatmentThe expression of the SOCS 3 gene ar the RNA andprotein levels was determined by Northern and Westernblot hybridizarion, respectively (Table 2, Ftg. 1). TheRNfu were exrracred from 18 melanoma cell lines, twoprimary melanocytes, two normal keratinocytes and twofibroblasts, and then hybridized on to blors with theradioactively labelled SOCS 3 cDNA probes. The SOCS 3hybridization signal (1.3kb) was almosr undetectable innon-stimulared cells (Fig. la), excepr for a few cell lines(e.g. line 1205Lu) that showed a weak hybridizationsignal. After IFN-y rrearmenr, most lines showed an
increased SOCS 3 hybridization signal, but rhere weredifferences in levels between individual cell lines (Fig. 1a,Thble 2). The SOCS 3 bands were weak (e.g. M2melanocytes) or negligible in all samples after IFN-u.The RNA levels remained negligible even after prolongedexposuÍe (4h) of cells to IFN-cr (l ines WM 1341D and45ll-u), suggesting a lack of induction of SOCS 3transcripts by this cytokine. To quantifi' the hybridizationsignals, we carried out phosphorimaging of SOCS 3 andGAPDH signals, and expressed the induction as a foldincrease over the non-treated cetls (Table 2 and numbersbelow each lane in HS. 1).
To determine the protein levels, we employed Westernblotting using a polyclonal antibody against the primaryamino acid determinant of SOCS 3 protein recognizing a28kDa polypeptide. The intensiry of the specific bandwas significantly increased after IFN-1 rreatment in themajority of lines, consistenr with the RNA analysis in thesame samples. There \Mere no (or marginal) differences insignal intensities between non-treated and IFN-u-treatedcells, indicating the near absence of SOCS 3 inductionby IFN-c. To quantifii the protein signals, we carried outphosphorimaging of SOCS 3 and ERK signals, and
Tab|e 2 Summarized resu|ts showing interferon (lFN).indrťced STAT 1 phosphorylation and SoCS 3 expression in me|anoma and norma|non-malignant cells
IFN-y
SOCS 3 mRNA SOCS 3 protein STAT 1 phosphorylationpS-727!pY-7O1b
SOCS 3 mRNA SOCS 3 protein STAT l phosphorylationpS-727lpY-7o1"
Melanoma cel l l ine (n:18)WM9WM 7938WM 278wM 161 7'l205Lua
WM 164WM 983AWM 373wM tS4lDWM 39451 LuWM 35wM 1lEB'WM 852WM 9O2BwM 1.15WM 239AwM 1552C'Induction (o7e)Normal non-malignant cells (n:6)Keratinocytes K1Keratinocytes K2Fibroblasts F1Fibroblasts F2Melanocytes MlMelanocytes M2lnduction (o/o)
o
+/-
25.0"
+l-
*;__
+
r i ,"
+-l -8.3"
- l+-t+-l+- l+
- l+
+/+-l++l+-l+-/+
11 .1t77.8
+/++l+
33.3/33.3
++++++
+++Ť+++
l+
:
---+
83.3"
ŤŤ++
+++
+++
++++
:
---Ť
+++
83.3
+/+-l++l+
-/++/-- l+- l+
- l+
-/+-l++l++l++l++/++t+
44.4lAA.9
- l+-/+-l+
o/83.3
+++++
ŤŤ++100
++++
Ť+
100ERK, extrace|lu|ar signa|+egu|ated protein kinase; GAPDH, g|yceraldehyde S.phosphate dehydrogenase; SoCS, suppřessor oŤ cytokine signal1ing; STAT, slgna|transducer and transcription activator.SOCS 3 mRNA and protein levels were evaluated by phosphorimaging and expressei as the ratios sOcS g/GApDH and SoCS3/ERK,respect ively 'ForcontroIsamples,the.rat ioswerearbitrar i|ychosenas1.o(Fig.1): i . i - r .+,negt ig ibt(+); >3.0, strongly inducible, strongly positive signal (+ +)."Cell lines with constitutive expression of SOCS O RNA.bSTAT 1 activation data are taken from a prevjous paper [1 5] and are shown on|y íor comparison."SOCS 3 */- cell lines were considered as half positive.
Ma|ignant me|anoma and lFN-induced STAT 1 activation and SOCS 3 expression Kovarik eÍ a/- 485
expressed the induction as a fold increase over the non-treated cells (numbers below each lane in Fig. 1b). Ingeneral, a somewhat higher frequency of SOCS 3-positivelines was observed at the protein level than at the RNAlevel (Table 2), which can be explained by rhe highersensitivity of immunoblotting.
The activation of STAT I transcription power is believedto be mediated by the phosphorylation of tyrosine andserine amino acid residues. In order to study the possibleinduction of SOCS 3 by the STAT 1 transcription factor,we determined the levels of phosphorylation in untreated
Fig, 1
and lFN-treated cells. The proteins were immunoblottedwith antibodies recognizing phosphorylated ryrosine 701
"and serine 727, and the results are summarized in Thble2. The data for melanoma cell lines are taken from ourprevious paper [19]; primary melanocytes, keratinocytesand fibroblasts were newly assayed in this study. Ingeneral, constitutive STAT 1 phosphorylation was ob-served at serine but not at tyrosine residues. It isnote'ň/orthy that, in relevant control cells (i.e. melano-cytes), IFN-a induced STAT 1 phosphorylarion arboth amino acid residues, whereas a response at serine727 was lacking after IFN-y. Stimulation of tyrosine 701
WM9
Melanoma cel l l ines
WM 7938 WM 278 WM 1617 12o5Lu
1 2.o 1.0 1 2.5 1.0 1.0 12.o 1.1 í 1.6 1,0 1.0
Normal cells
WM 164 WM 983A
666(Ú(U(Ú(Ú
E p E p E p EE F E E p F p
E B B E ts i. E E, * ; B i. E B + E B i. E B i.ózz óz z ózzózz ózz ózz ózzotru- o E E oEtrotrE o E tr oc E Ó|!tL
WM 373 WM 1341 D WM 39 451Lu WM 35 WM 1 l bB(Ú@(!(g(Ú(d
xE*;E+*==E* =EE{s= E* EeE 8' _ř .! s-. €.E .! s -ř E E, aoao-e E s =o E s ao'é ? z é7zz1ó z z ózzz1ó z z ózzo l ! |J- (J Eg|!Ňo lJ- u- oE EtrŇo tt E o tr tr
M2oEc6-É
zz
E_o-o
F2(!
i=E*E i óEz ózzLOr!U-
tr l
6EE
Kí K266
oRqoRo_Ě;*_-Ě:._=řF-""="'ózzózzóOLEO*LO
socs 3
GAPDH
1 2.4 1.1 1 3,3 I.0 1 >5 1.1 | 1.5 1.0 1 3,3 1.0 . l 1.5 . t .0 1 1.5 1.0
socs 3
GAPDH
M1óE
Fb
socs 3
GAPDH
1 1.8 1.0 1 3.5 1.0 1 >5 1.O 1 2.21.0 1 3.5 1.4 1 >5 1.6
Suppressor oÍ cytokine signa||ins (socs) 3 gene expression at RNA (a) and protein (b) |evels. (a) Example of RNA ana|vsis in me|anoma and normatnon-malignant cells. The RNAs were hybridized with the SOCS 3 cDNA and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene probes.Subconf|uent ce||s were serum-starved overnight in Du|becco's modiÍied Eag|ďš mediumioHl|rttl|) bófore expoóureio interferons (lrŇš). trŇ-v wasused at 1o ng/m|' IFN-o at 5000 |U/ml. Ce||s were incubated with IFNs for 3Ó min' Contro| samples were incrjbated in para||e| without |FN treatment'Norma| cel|s: M1' M2' me|anocytes; Kí, K2, keratino.cytes; F.l , F2, fibrob|asts. (b) Examp|e oi immunob|otting analysis oí SoCS 3 protein inme|anoma cel| |ines and norma| non-ma|Qnant ce||s. For the detection oÍ SOCS 3 proteiň, commercial antřsÓcs íj rabbit po|yc|onai antibody wasused (AbCam, Cambridge, Cambridgeshire'.!4..4: a |oading control for socs 3 Wesiern b|ots, commercia| mouse monoó|onal antíbody toextracellular signal-regulated protein kinase (ERK) (BD Transduction Laboratories, San Diego, Caliiornia, USA) was employed.
486 Melanoma Research 2005, Vol I5 No 6
Fig. l (Continued)
(b)
WM 9 WM 7938
Mdanoma cell lines
12051u WM 9834
o
9d-g
ózzoLt!
&
6
yo-9.
6zzOLL
ffi,ř{ř
6tr*
sr6:o6ózz.) L L
,**t#
ooEoEo
ĚĎ.6ió.6ózzózz
oLLOLL
&{}. ****'**.
wM 278 WM 161 7
66
Fs E qq*š*
ř s- ř E $_řózzózzouEOLrL
.*trrt
o
!óEózz
OLL
l&* socsg
6Eo
o6zzu-L
**".Č.
** .. x'*..x *mt * e ERKí 1.9 0.6 1 4.5 1.4 1 3.8 o.5 . l 0.5 0.6 1 3.0 1.8 1 5.0 1.2
WM 1341D WM 39 451Lu WM 35 WM 1 í 58( i6666
EcEoEoEoEo=!_=E:E=:E-=ES_=.
96_op6_o9(ť_u96_rEo(sEo(sr:oó.=06Eodazzazzózzázzázz
oqLOLLOLLOELOLLq
*_ -J- ' ,_ t---_ #
ffiffi1 4.0 1.2 1 3.6 1.0 1 2.5 1.3 1 0.9 1.0
Normal cells
Čn ERK1 3.s 1.8
M16Eo
oŘo-o
tzzEOL+O
*,gffi *,
F1K1
c
ir1
o6
E c EsP.-:Yg-=
'e=zzózzELOTLL
hr 5{* *1 4.5 1.0 1 3.0 1.1
*. ,.'::l' ..iř'&{ii.xgp , qie*,3.8 1.3 1 2.8 t .0
l}rf *nqxryp ERK
1 1.7 0.5 1 2.5 1.3
socs 3
phosphorylation in normal keratinocytes and fibroblastswas observed by IFN-y only. These data demonstratedifferences between individual cell types in their capacityto activate STAT 1 in response to different stimuli.
DiscussionIFN-y, but not IFN-o, stimulates the expression of SOCS 3SOCS 3 (besides SOCS 1) appears to be one of the bestcharacterized molecules of the SOCS family lZl. kfunctions as a pleiotropic regulator of interleukin signals,hence playing an important role in immune andinflammatory processes. The activation of SOCS 3 inresponse to IFNs has been studied less frequentlyU5,?4,251. We have obtained evidence for SOCS 3induction by IFN-1 in most, if not all, melanoma andnormal cells analysed. There \Mas a good correlationbetween expression at the RNA and protein levels,suggesting that SOCS 3 stimulation by IFN-y occursprimarily ai the transcriptional level. Thirty minutes ofexposure to IFN-y seemed to be sufficienr for thesignificant accumulation of protein and RNA, indicatingan immediate and fast resoonse of cells to cvtokine
treatment. Recently, the IFN-y responsive element hasbeen identified in the SOCS 3 promorer [26]. Together,these obsewations indicate that it is l ikely that SOCS 3transcription is unde r the control of the IFN-y transduc-tion pathway.
In contrast to IFN-y, IFN-cr appeared to be largelyinefficient in SOCS 3 stimulation in melanoma cells. Arthe RNA level, normal melanocytes responded moreefficiently to both IFNs than did most tumour lines(Fig. 1), suggesting that melanomas have a reducedcapacity to respond to these cytokines. There may beseverál explanations. Firstly, a receptor transducing IFN-*signal could be impaired in our model or in malignantmelanoma in general; however, we consider this possibi-lity to be unlikely as IFN-cr stimulared STAT 1phosphorylation at ryrosine residues in most cell lines(Table 2). In addition, previous studies showing theactivation of JAK 1 and TYK 2 ryrosine kinases inseveral melanoma cell lines support our presump-tion [16]. Thus, it is possible thaÍ. a factor(s) actingdownstream from STAT 1 is resoonsible for the
differential behaviour of IFN-u and IFN-y. Inthis context, STAT I activation by IFN-y results inhomodime rization of phosphorylared molecules rharenter the nucleus to participare in rhe transactivationprocess 113,271. In contrasr, the IFN-cr rransacrivarionsignal utilizes, in addition to STAT 1-STAT t homo-dimers, heterocomplexes of STAT 1-STAT 2 phospho-forms and pa8 [13]. It seems logical that both IFNsuttlize common and distinct factors to deliver transcrip-tion signals to the nucleus. Perhaps the SOCS 3 promotermight be activated by a subset of STAT 1 complexes only.The observed STAT 1, STAT 2 and p48 deficiency inmelanoma cells is in accordance with this hypothesis[28]. Preliminary results suggesr that STAT 2 is negligiblyexpressed in the melanoma lines studied (M. Fojtova,unpublished results).
Another distinction between the rwo IFNs was theircapacity to inhibit cell proliferation. Although most linesrequired high doses of IFN-u exceeding 1000Ulml (30%)for growth inhibition, or were completely resisrant (50Vo),more than 70% of lines were sensirive to IFN-y (Table 1 ) .Divergent apoptotic effects of IFN-1 and IFN-cx haverecently been demonstrated in human endothelial cells[29]. Although IFN-y appeared to induce apoprosis in apS3-independent manner, defective p53 expression wasrequired for lFN-cr-mediared apoptosis. Although we donot have data on the expression of p53 in the melanomalines studied, the differences in the se nsitivity ofindividual lines towards rhe r\Mo IFNs could perhaps beexplained by aberrant p53 expression.
Leukaemia cells appeared to express SOCS 3 afterstimulation with IFN-o, and constitutive expression ofSOCS 3 was correlared with cell proliferation insensiriviryto IFN-u treatmenr [15]. In our experiments, consriru-tive expression of SOCS 3 RNA was generally low ornegligible. Thus, it seems rhat distinct rissues and theirmalignant varianrs manifest dissimilarities in the IFN-mediated transcriptional power of target genes, includingSOCS 3. At the protein level, weak expression was foundeven in non-treated cells (both sensitive and resistant roIFN), suggesting that no firm conclusion on rhe relation-ship between IFN sensitivity and SOCS 3 expression canbe made. Interestingly, in melanoma cells thát exhibitedcomplete resistance to both IFNs, moderate growrhstimulation with up to a20% increase in cell numbers wasobserved, suggesting that IFN may deliver mirogenicrather.than apoptoric signals in some instances.
STAT 1 signalling and SOCS 3 expressionThe question arises as to whether phosphorylatedSTAT I can operare as a SOCS 3 gene rransacrivaror.Corresponding to our previous report [19], STAT 1phosphorylation ar tyrosine residues was observed in rhemajority of melanoma and normal cells, suggesting thatST{T 1 signalling may nor be severely impaired in
Ma|ignant me|anoma and IFN.induced STAT 1 activation and SoGS 3 expression Kovarik eť a/' 48?
melanoma cells. IFN-1 stimulated the expression ofSOCS 3 and this activation was often accompanied by'enhanced phosphorylation of STAT 1 molecules. Never-theless, the correlation between STAT 1 induction andSOCS 3 expression was nor absolute and seve ralexceptions from this general trend were noted. Forexample, the WM 852 line showed srrong SOCS 3induction after IFN-y in the absence of significant STATI phosphorylation. Conversely, the WM 35 and WM 1617lines did not express SOCS 3, but showed normal STAT 1phosphorylation after IFN-u and IFN-y rrearmenrs.Together, these results indicate that some uncerraintyremains about whether STAT 1 acts as a sole regulator ofSOCS 3 expression. There may be alternative STATl-independent IFN-y signall ing parhways [30]. In thiscontext, Ramana a al. [3t] have recenrly shown IFN-mediated SOCS 3 induction in STAT 1 -l- knockoutmice and have proposed a role for activated STAT 3.Our preliminary results suggesr that STAT 3 RNA isabundantly expressed in most melanoma lines (data notshown). In addition, the failure of SOCS 3 induction inWM 35 cells after IFN trearmenr can also be explained byepigenetic repression of the SOCS 3 promoter [14] .
The SOCS gene family is a negative regulator of JAIVSTATsignal transduction pathways [2]. Our observation of a lackof SOCS 3 inducibiliry following IFN-or stimulationindicates that SOCS 3 cannot function as a negariveregulator of STAT phosphorylation in IFN-u signalling inmelanoma cells. The inhibitory role of SOCS 3 in IFN-ysignalling is more likely, although other SOCS proteins, forexample SOCS 1 [24), also need ro be considered. In arecent study, Li et a/. [32] reported the upregulation ofSOCS I expression in many melanoma cell lines (includingWM 35 and WM 9 used in this study) and in rumoursamples. Interestingly, in rheir study, IFN trearmenrresulted in a remarkable induction of SOCS 1 in WM 35melanoma cells and in a somewhat lower level in the WM 9cell line. In contrast, our resuks showed a lack of SOCS 3induction in WM 35 melanoma cells, but marked inductionin the WM 9 cell line (Fig. 1 and Table 2). Moreover, normalmelanocytes appeared ro express a low level of SOCS 1 buta high level of SOCS 3 (after stimulation with IFN-y) in oursystem. This raises an interesting possibiliry of the polarizedexpression of SOCS 1 and SOCS 3 in melanoma. It isconceivable that dehning the molecular factors andinteractions involved in the SoCS 3 inhibition of the JAIÝSTAT signalling pathways might promote a berter under-standing of the biological effects of IFNs.
References'I Darnell JE Jr. STATs and gene regulation keviewl. Sclence 1 997;
277:1 630-1 635.2 Fu]ímoto M, Naka T. Regu|ation oí cytokine signaling by SoCS family
molecules. Trends lmmunol 2003; 24:659-666.3 Greenhalgh CJ, Hilton DJ. Negative regulation of cytokine signaling. J Leuk
Biol 2OO1', 70:348-356.4 Schindler C, Darnell JE Jr. Transcriptional responses to polypeptide ligands:
the JAK-STAT pathway [review]. Annu Rev Biochem 1995; 64:621-651.
20
22
23
2410
488 Melanoma Research 2005, Vol 15 No 6
t1
Frank DA. STAT signa|ing in the pathogenesis and treatment oí cancerlreview]. Mol Med 1999; 5:432-456.o'Shea JJ' Gadina M' Schreiber RD. Cýokine signa|ing in 2002: new surprisesin the JAI(STAT pathway lreviewl. Cel I 2OO2; I 09 (Suppl):S1 21 -S1 3 1.'Decker T, Kovarik P. Serine phosphorylation of STATs. Oncogene 2OOO;19:2624-2637.Kovarik P'.Mango|d M, Ramsauer K, Heidari H, Steinborn R, zotteÍ A' eťal'Specificity of signaling by STAT 1 depends on SH2 and C-terminal domainsthat řegu|ate Ser 727 phosphory|ation, differentialIy affecting speciíic targetgene expression. EMBO J 2001 ; 20:9.1-100,Agaisse H, Perrimon N. The ro|es of JAIíSTAT signaling in Drosophi|aimmune responses. lmmunol Rev 2OO4; 198172-82.Wang T' Niu G, Koňy|ewski M, Burdelya L' Shain K, Zhang S, et al'ReguIation bf Íhe innate and adaptive immune responses by Stat-3 signa|ingin tumor cells. Nat Med 2OO4i 1Oi48-54.Anderson Po' Sundstedt A'Yazici Z, Mínaee S' Woo|Í R, Nico|son K,et al. lL-2 overcomos tho unresponsiveness but fails to reverse the regulatoryfunction of antigen-inducod T regulatory cells. J Immunol 2005; 174:31 0-31 9.Cooney RN, Suppressors oí cytokine signa||ing (SoCS): inhibitors of theJAK/STAT pathway. Shock 2OO2i 1 7:83-90,Calo V, Migliavacca M, Bazan V, Macaluso M, Buscemi M, Gebbia N,Russo A. STAT proteins: from norma| contro| oÍ ce||u|ar events totumorigenesis, J Cell Physiol 2OO3; 197 :1 57 -1 68.He B, You L, Uematsu K,ZangK, Xu Z' Lee AY, eťal, SoCS 3 is írequent|ysilenced by hypermethylation and suppresses cell growth in human lungcancer. Proc Natl Acad Scl USÁ 20031 1 00:1 4 1 33-1 4 1 38.Cacalano NA, Sanden D, Johnston JA. Tyrosine-phosphorylated SOCS 3inhibits STAT activation but binds to p1 20 RasGAP and activates Ras.Nat Cell Biol 2001; 3:460-465.Pansky A, Hildebrand E Fasler-Kan E, Baselgia L, Ketterer S, Beglinger C,Heim MH' DeÍective JAK-STAT signa| lransduction pathway in melanomacelfs resistant to groMh inhibition by inierferon-alpha. lnt J Cancer 2OOO|85..72O-725.Lesinski GB, Valentino D, Hade EM, Jones S, Chaudhury AR, Walker MJ,Carson WE 3rd' Expression oí STAT 1 and STAT 2 in ma|ignant me|anomadoes not corelate with response to interferon-alpha adjuvant lherapy.Cancer lmmunol Immunother 2OO5;54:81 5-825.Her|yn M,Thurin J, Ba|aban G, Bennice||i JL, Her|yn D, E|der DE, eť a/.Characteristics oÍ cu|tured human me|anocytes iso|aled from differentstages oí tumor progression. Cancer Res 1 985i 45:5670-5676.Kovarik J, Boudny V, Kocak l, Lauerova L, Fait V Vagundova M. Malignantmelanoma associates with deficient IFN-induced STAT 1 phosphorylation.lnt J Mol Med 2003; 1 2:335-340.
Kovarik R Stoiber D, Novy M, Decker T Statl combines signals derivedfrom |FN-gamma and LPS receptors during macrophage activation.EMBO J 1998; 17:3660-3668.Ramsauer K, Sadzak l, Porras A, Pilz A, Nebreda AR, Decker T, Kovarik Pp38 MAPK enhances STAT 1-dependent transcr;ption independentlyoÍ Ser.727 phosphoryla1ion. Proc Natl Acad Sci US,4 2Qo2i 99:'12 859-12 864.Pilz A, Ramsauer K, Heidari H, Leitges M, Kovarik R Decker T.Phosphory|ation of the stat1 transactivatíng domain is required for theresponse to type I interferons. EMBO Rep 2OO3i 4:368-373.Masuhara M, Sakamoto H, Maisumoto A, Suzuki R, Yasukawa H, Mitsui K,eÍ a/' C|oning and characterization of noveI C|S fami|y genes. BiochemBiophys Res Commun 1997i 239:439-446.Federici M, Giustizieri ML, Scarponi C, Girolomoni G, Albanesi C. lmpairedIFN-gamma-dependent iní|ammatory responses in human keratinocytesoverexpressing the suppÍessor oí clokine signa|ing 1 ' J lmmunol 2oo2;'169:434-442.Sakai I,Takeuchi K,Yamauchi H, Narumi H, Fujita S. Constitutive expressionof SOCS 3 confers resistance to IFN alpha in chronic myelogenousleukemia cells. Blood 2OO2;'l 00:2926-2931.Gatio L, Ber|ato C' Poli V, Tininini S' Kinjyo |, Yoshimura A, eÍ a/. Analysis ofsocs 3 pÍomoter responses to interferon gamma. J Biol Chem 2004;279:'13746-13754.Levy DE, Darnell JE Jr. STATs: transcriptional control and biological impact.Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3:651-662.Wong LH' Krauer KG' Hatzinisiriou |, Estcourt MJ, Hersey R Tam ND' eť al|nterféron.resistant human melanoma cel|s are deficient in |SGF3components, STAT 1, STAT 2, and p48-lSGFSgamma. J Biol Chem'1997;272228779-2A785.Porta C, Hadj-Slimane R, Nejmeddine M, Pampin M, Tovey MG, Espert L,et al Interferons alpha and gamma induce ps3-dependent andp53-independenl apoptosis, respectively. Oncogene 2OO5i 24:605-61 5.Ramana CV, Gil MR Han Y, Ransohoff RM, Schreiber RD, Stark GR. Statf -independent regulation of gene expression in response to lFN-gamma.Proc Natl Acad Sci USÁ 2001 i 98:6674-6679.Ramana CV Kumar A. Ene|ow R. statl -indeoendent induction oÍ SoCS 3by interferon-gamma is mediated by sustained activation of Stat 3 inmouse embryonic Íibrob|asts. Biochem Biophys Res Commun 2oo5;327:727-733.Li Z, Metze D, Nashan D, Mu|Ier-Tidow C, Serye HL, Poremba C' eÍ a/'Expression oí SoCS 1' suppressor oí cytokine signa||ing 1, in humanmelanoma. J lnvest Dermatol 2OO4i 123i737-745.
25
26
28
29
t2
13
14
't5
' t6
17
1831
NEOPLASMA, 52, 4,2005
Lack of STAT 1 phosphorylation at TYR 701 by IFNy correlates with diseaseoutcome in melanoma patients.
v. BoUDN.f', r. ouŠBtř, r.. eoÁurovÁ', J. CHuuCHAtovÁ,, I. rocÁr4, v. relť, t. tauBRovÁ', B. rrtlČÍ6, r. rovaŘÍr'--
lDepartment of Experimental Oncologt, e-mail: kovarik@mou-cz, Masaryk Memorial Cancer Institute, 656 53 Brno, Czech Republic;2Center of Biostatistics andAnalyses, Faculty of Medícine and Science, Masaryk IJniversiý, Brno;3Center of Molecular Biologl and GeneTherapy IHOK, Faculty Hospital Brno; oclinic of Complex Oncological Care, sDepartment of Surgery, and 6Department of Pathologlt,Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, Czech Republic
Received December 16. 2004
STAT I, a member of signal transducer and transcription activator family has been implicated as key downstream media-tor of interferon (IFN) signaling. Its functional activation requires phosphorylation at Tyr 701 and Ser 727 residues. VariousSTAT abnormalities have been found in cancer cells but their relation to oncogenesis, tumor behavior and disease outcomeremains mostly unknown. We have examined the inducibility of STAT I phosphorylation by IFN o /yin primary culturesestablished from melanoma lymph node metastases at first progression and correlated our results with disease outcome andoverall survival. Forfy-four patients at clinical stage I_I[ at initial ďagnosis entered the study. STAT l inducibility ofphosphorylation by IFNs was assessed in melanoma cell lysates by means of standard immunoprecipitation and Westernblotting using polyclonal and monoclonal antibodies. Lack of STAT 1 phosphorylati on at Ser 727 after either IFN was re-corded in 75% of patients, however, no correlations with disease evolution could be proved. In contrast, STAT Iphosphorylation response at Tyr 701 after IENo occurred in 13 (29.5%) and after IFN1 in32 (73%)patients. Inducibility ofSTAT 1 activation at Tyr 70l but not at Ser 727 driven by lFNybutnotby IFNa significantý and favorably influenced dis-ease-free interval and overall survival. In conclusion, these results show that the absence of IFN1 inducibility of STAT Iphosphorylation at Tyr 701 positively correlates with disease outcome in malignant melanoma patients and may representnew independent prognostic marker.
Key words: STAT I activation, intederons, malignant melanoma, disease prognosis
Signal transducers and activators of transcription (STAIs)are multigene family of latent cýoplasmic proteins that func-tion as important downstream mediators of a number ofextracellular signaling molecules including cýokines,growth factors, hormones and oncoproteins [2, l1]. It hasbeen well established that various members of STATs are crit-ical in maintaining cellular homeostasis. Seyen members ofSTAI proteins so far recognized have been structurally char-acterized and the function of various domains and regionsthat take part in the processes of signal-induced activation,transduction and DNAbinding was determined [7, 15]. The
*The study was supported in part by grants NC/7139-3 from the IntemalGrant Agency of the Czech Ministry of Health, 301103/0370 from the GrantAgency of the Czech Republic and by Projects MZO 00209805 and MSM61989s92r6.
"Corresponding author
essential molecular events that follow ligand-receptorinteractions comprise ýrosine phosphoýation of receptorby receptor-associated Janus řyrosine kinases (JAKs), there-by creating receptor docking sites for recruitment of cýo-plasmic STAT proteins. Upon association with phospho-rylated receptor, STAIs are activated by phosphorylation onconserved tyrosine residues and homodimeize or hetero-dimerize through SH2 domain-phosphotyrosine interactions.Activated STATs translocate into nuclei, bind to recognitionsequences in the promoters of specific cellular genes andmodulate their transcription [6, 15,21]. Recent investigationon the mechanisms regulating STAT-mediated transcriptionalpower revealed that phosphorylation of STATs at conservedserine residues also actively operates in signaling pathwaysenhancing transcriptional potential mediated by activatedSTATs andprobably acting as a dephosphorylation signal [7,l 1, l 3, l 5]. Molecular state and the activiý of STATs are con-
LÁCK oF STAT 1 PHoSPHoRYLATIoN IN MELANoMA 331
trolled through their interactions with a number of cýoplas-mic and nuclear proteins includiňg variety of transcriptionfuctsrs as well as by STATs mutual crosstalking [7, 15]. Al-though there is a close homology among the individual STAImembers, they differ in their response to the particular domi-nant ligand and consequently in the downstream target geneclusters that are transcribed. In general, STATs 1 and 2 princi-pally mediate in viyo response to inteďerons (IFNs), STAI 3represents main target for IL-6, STAI 4 and STAT 6 as domi-nant mediators of IL-12 and IL-4 control Th cell differentia-tion, whereas STIII 5 in a form of its two isoforms is indis-pensable for growth hormones and prolactin [14]. However,there are frequent overlaps within STAI responses to domi-nant ligands as well as responses to additional ligands outsidedominant ones. As mediators of a broad range of externalstimuli and modulators of gene expression, STATs play im-portant role in regulating cell cycle, proliferation, differentia-tion, senescence and apoptosis. Perturbances in STAT pro-teins have been described in several human pathologicalconditions including immune or developmental disordersand cancer.
Down-regulated expression or constitutive release ofSTATs and their ihappropriate activation are the most fre-quent alterations observed in many human malignancies [2,3,10, l7l. Reports on the oncogenic activity of persistentlyactivated STAT 3 [4] together with abnormalities in STAI ac-tivation observed in some malignant cells [2, 17, 20] sup-port a notion that STAT dysregulation is involved in the biol-ogy of cancer and its responsiveness to cýokine-basedtherapy [5]. To our knowledge, little is known whether can-cer-associated STI(T deregulations described in in vitromodel systems operate a|so in vÍvo situations, and whethersome of them might have a link with the biological behaviorof the tumor and disease outcome.
We have examined the inducibility of STAI I phospho-rylation in primary cultures of melanoma cells derived fromregional lymph node metastases and exposed in vitro toIFj,{aand IFNy, respectively, and correlated the abnormalities withdisease outcome and overall survival in 44 melanoma pa-tients. Our results revealed significant positive correlationbetween lack of inducibility of STAT I phosphorylation atTyr 701 by IFNy and disease outcome. Since the possible biasdue to the influence ofknown risk factors has been excluded,we recognized that the absence of IFNyinducibility of STAT1 phosphorylation at Tyr 701 in melanoma cells may repre-sent new independent positive prognostic marker in mela-noma patients. This prognostic influence was proved inmultivariate Cox regression models taking both overall sur-vival and early development of the disease as principal end-poinis.
Material and methods
Patients. Forty:four patients with malignant melanoma atclinical stage I-I[ (UICC TNM classification, the 5th eďtion,
1997) without node metastases at the time of initial diagnoses(median age 56 years) entered the study. The basic character-
^ istics of the sample are in Table 2. The median follow-up was6l months. At first ďsease progression mostly to regionallymph nodes, the metastases were surgically dissected andpatients were further treated according to standaÍd protocols.Primary cultures from metastatic lymph node of each patientwere established and examined for the inducibility of STAT Iphosphorylation at tyrosine (Y 701) and serine (S 727) resi-dues, respectively, after exposing the melanoma cells to ei-ther interferon gaÍnma (IFNy) or interferon alpha (IFNcr).The phosphorylation response of STAT I was correlated withthe following variables: time interval from initial diagnosis tofirst progression (EFS,), disease-free survival from date offirst progression to date of subsequent relapse (EFS2), sur-vival from the first progression to date ofdeath (So), overallsurvival from the initial diagnosis to the time oi last fol-low-up control or date of death, respectively (OS).
Melanoma cell cultures. Melanoma cells were derivedfrom a biopsy of lymph node massively infiltrated by meta-static melanoma cells. The biopsy was cut into small pieces,gently minced and the monocellular suspension obtained byrepeated pipetting. The cells of forty-four samples weregrown in medium DMEM with L-glutamine (PAN BiotechGmbH, Germany) supplemented with l0% FBS (pANBiotech GmbH, Germany), insulin (5 nglm) and antibiotics.To veri$r the nature of growing cells prior to activation ex-periments, the cells grown on slides were ťrxed and immuno-stained using monoclonal antibodies (NCL-L-MelanA,Novocastra; NCl-L-Tyrosinase, Novocastra; HMB 45,BioGenex) which are considered as melanoma phenotypicmarkers. Only those cultures showing positivity to at leastone immunoreagent in more than 80% of cells were used forthe study. Primary cultures were maintained in yitro for amaximum of four weeks.
Reagents and antibodies. Recombinant human IFNcr andIFN1 were purchased from Sigma (USA). For the detectionof STAT 1 protein and its phosphorylated forms, we devel-oped polyclonal antiserum against C-terminal domain ofSTltI l (SlC) as well as monoclonal antiboďes recognizingSTAI 1 protein (SMl) and its S 727 phosphorylated form(rSMl). Polyclonal antibody anti-PY 701 STAI I (Sigma,USA) was used for analysis of IFN-induced STAT I activa-tion.
SIAT I phosphorylation analysis. The method was de-scribed previously Il, lZl. Briefly, IFNy was used at a con-centration of l0 nýml and IFNcr at concentrations of 1000IU/ ml and 5000 IU/ml, respectively. Cells were incubatedwith IFNs for 30 min at37 "C. Control samples were withoutIFN treatment. Induction of STAT I phosphorylation at Y'707 and S'127 was assessed in cellular lysates by means ofWestern blots.
Cellular lysates, immunoprecipitation and Western blot.Cell lysis, immunoprecipitation and Western blotting werecarried out by standard methods as described elsewhere [1,
tBot'DlŤÝ, DUŠEK ADÁ}'ÍKovÁ cHtJMcHALovÁ KoCÁret al.
l2]. Cells were lysed for 5 min on ice in Frackleton buffer.Protein concentration was determined by Bradford assay(Bio-Rad, Germany). For immunoprecipitation, polyclonalanti.body SIC and protein A-Sepharose beads were usedíAňersham Pharmacia Biotech. Sweden). For Western blotanalyses, antibodies SMl, pSMl and anti-PY 701were employed.
Statistical analyses. All statistical tests were per-formed on intention-to-treat principle, no case wasexcluded prior to the analyses and all failure eventsor death events were recorded as fully equivalent.A value c[<0.05 was taken as a universal limit forstatistical significance in all univariate and multi-variate analyses. Although the study investigatedmaximum of attainable cases in common conse-quential clinical recruitment, it might be limited insample size. Therefore, namely outcomes ofmultivariate analyses are presented as pilot esti-mates that need further confirmation in independ-ent studies. Standard descriptive statistics was usedto express ďfferences among subgroups of casgs(mean supplied with 95% confidence limits or rela-tive frequencies). Standard univariate statisticaltechniques were used to test differences betweenchosen subgroups ofpatients: Fisher's exacttest inbinary outcomes, ML chisquare test for ordinalcategorical variables, unpaired Student's t-test fornormally distributed continuous variables andMann-Whitney test for non-normally disÍibutedcontinuous variables. Stratified Kaplan-Meierproduct-limit method was applied to discriminatesurvival rates between two or more subgtoups.Standard Peto-Prentice generalized log-rank testwas used as comparďive statistical test. Bothunivariate and multivariate analýic strategies wereapplied to quantiff predictive power of examinedvariables to predeťrned study endpoints: overallsurvival and event-free survival to the lst progres-sion. All potential predictors were coded as binaryfactors according to their risk values and then pro-cessed in univariate and multivariate Cox regÍes-sion models. A stepwise multivariate Cox propor-tiona| hazarď analysis was used as final modelidentifying significant predictors of event-free oroverall survival. Hazard ratio was estimated withappropriate 95%o cortfidence limits and supportedby significance level. The final set of independentprognostic factors was identified by backwardstepwise selection algorithm.
Results and discussion
Table I summarizesresultsof STAI I activationin lFN-keated and untreated 44 melanoma pa-tients. Intensity of signals was compared with ref-
erence signals of controls present at the identical membrane.Basic statistical description of the investigated sample in-cluding common follow-up characteristics of disease devel-opment illustrates Table 2. Follow-up period (median 6lmonths) was sufficiently long for stratified survival analysis
Table 1. STAT 1 phosphorylation in IFN ď1treated and untreated primary cell cul-tures derived from melanoma patients
Malignantmelanoma
patient(n:44)
InducibilityPS 727 STAT I
IFN cr IFNT untÍeated IFN d
PY 701 STAT 1IFNT untreated
I2J
+
)6'78ol0l112IJ
t4
15t6T7l819202122z i
aÁ
25262728293031)z
JJ
)+
Jf
36)t
385v
404142{J
44
NNNNNNNNNNNN
NDIINNNNNNNNNNNNNNN
NDINNNNII
NIIN
+ŤŤ+
+++++++++++
ND++++++++++++
+++
ND+
+++
+
IINNNNNNNNN
,-N
NNNNN
NDIINNNNNNNNNNNNNNN
NDN
NNNNNNNN
NNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNIINNN
NIIN
Percentage of .t7. eo/-non-responders
I - inducible, N - not inducible, ND - not detected.Untreated: +: positive signal, -: negative signal.
72;7% 273%
LACK O}' STAT I PHOSPHORYLATION IN MEI-A}.IOMA
PatienJsNGender (male)Age at diagnosis (years)rFollow-up time (months)'
Table 2. Basic characteristics of the sample and disease development
Parameters Values
months from diagnosis) significantly contributed to the riskload and negatively influenced overall survival.
To assess IFN inducibility of STAT I phosphorylation at. Tyr 701 and Ser 727 as the potential predictors of diseaseevolution, the activation response was determined in patientsamples and related to the disease outcome of individual pa-tients (Tab. 4 and 5). The frequency of STAT I phospho-
rylation atSer 727 was more or less the same for IFNo andIFN1 (11 vs. 9 inducible cases) and both STI(I 1 activatingsignals led to dominant proportion ofnon-responders (33 vs.35 cases). on the other hand, there were signiÍicant differ.ences between IFNo and IFNy induction of STAT Iphosphorylation at Tyr 701 (13 vs. 32 inducible cases - seeTab. 4). Thus, IFNyprovided significantly increased propor-tion of inducible responders (73%), what corresponds withthe reports describing IFNy as the principal activator ofsTAr I [18].
Analyses and statistical evaluation of the relationship be-tween inducibility of STAT I activation in melanoma cells byeither IFN and selected phases ofdisease evolution revealedthe most important and apparently so far not recognized re-sult of the study (Tab. 5). Inducibility of STAT I activation atTyr 701 but not at Ser 727 driven by IFNy but not by IFNcxsignificantly influenced early event-free development of thedisease and overall survival as well. The group of patientswhose malignant cells were lacking IFNy inducibility ofSTlfl I phosphorylation at Tyr 701 had better prognosis withrespect to event-free and overall survival intervals as com-pared to the group ofresponders.
Figure I clearly demonstrates that activation response ofSTAI 1 atTyr 101after IFNy significantly decreases medianofEFSl and OS.
As the inducibility of STAT I phosphorylation by IFNy atTyr 701 appeared to be a meaningful prediclor of shorter sur-vival, we had to verifu its dependence/independence on theother known risk factors. Association analyses aS suÍlma-izedinTable 6 proved that lFNy-induced STAT 1 activationat Tyr 701 can be regarded as independent on nearly all riskfactors, except for sex and Clark categories. However, higherproportion of activation responders in female patients canhardly explain the prognostic potential of STAI I activationsince sex categories themselves have very limited influenceon disease development.
The potential contribution of inducibility of STIII 1phosphorylation to the prediction of disease developmentwas also confirmed in univariate and multivariatetime-to-event regression models that excluded potential biasdue to masking influence of other risk factors. All potentialrisk factors ťtrst entered univariate Cox regression models.The analyses in Table 7 confrmed previously recognizedpatterns, namely significantly increased relative risk in caseshaving inducible STAT I at'Iyr 'l01by IFNy and similar be-havior ofrisk categories ofage, Breslow score and ločationof primary tumor. Risk parameters describing early diseasedevelopment (distant metastases at time of lst progression
4463.6%s6 (36;76)6I Q4:114\
Primary tumor - localizationTrunk, head, neckOther
59.r %40.9 %
Primary tumor BreslowSummary statistics I
Category: Breslow < 1.02.4 (1.0;9.4)|I..7 oÁ
35.3 %Catesorv: Breslow > 3.0
Primary tumor - ClarkCategory: Clark š IIICatesorv: Clark > III
3s.7 %64.3 %
First disease progressionEvent-free survival (EFS1 in months)2Distant metastases in liver. brain or lungs
2I (4;44)N:ZI (4 '7.7 %)
Survival after fnst ďs.ease progressionEvent-&ee survival (EFS2 in months)2 3 (1; 7)Survival after first progression (Sp in months)2 18 (8; 35)
Overall survival (OS in months)" 5s (20;' I2s)
'Summary statistics: estimate of meďan supplied with 10% and 90% percen.tiles (in parentheses). 2Median survival time estimated on the basis ofKaplan-Meier analysis supplied with 25% and 7 5Yo percentiles (in parenthe-ses). For détailed description of survival parameters see legend in Tabte 2.
and all examined survival endpoints reached median level.Four principal survival criteria were defined in order to mapdifferent phases of disease evolution, i.e. time from primarydiagnosis to ťtrst progression and subsequent phases ofevent-free survival or survival. Overall survival (OS) cov-ered all these episodes and could be considered as dominantintegrating endpoint ofthe study.
Stratified survival analyses as performed by standardKaplan-Meier method are displayed in Table 3. We havefound that EFSI as an indicator of early risk development aswell as OS significantly coincide with the most risk factors,what is in accordance with data reported elsewhere. In con-trast, detailed analyses focused on disease development afterlst progression showed no significant associations.Event-free intervals and survival after lst progression ap-peared to be unpredictable on the basis offactors examinedand listed in Table 3. Age, risk location of primary tumor andBreslbw score weie recognized as potential risk factors bothfor EFSt and OS, what is in agreement with known data andcomplying with known melanoma prognostic indices. Fur-thermore, early risk development of disease (distantmetastases into the vital organs, first progtession up to 12
BoUD}cý' DUŠEK, ADÁMKoVÁ, CHUMcHALovÁ, rocÁr et al
Tablg 3. Survival endpoints stratified accorďng to potentially important rjsk factors
Stratiffing parametersSurvival endpointsr
EFS2EFSl OSSp
Median survival time and statistical tests
Age at diagnosis
Age > 50 years
Age < 50 years
Statistical significance
Sex
Men
Women
Statistical significance
Primary tumor: locality
Trunk-neck-head
Other
Statistical significance
Clark
Clark < III
Clark > III
Statistical signifi cance
Breslow
Breslow ) 3
Breslow < 3
Statistical si gniťrcance
ls progression
Distant metastases: lung, liver, brain
No metastases in lung, liver, brain
Statistical signifi cance
1$ progression
EFSI < 12 months
EFSI > 12 months
Statistical significance
18
48p = 0.035
2028
p = 0.146
1530
p = 0.046
25
27p:0.918
lóJI
p:0.046
20L)
P:0-448
3.5
2.5p: 0.572
J
p:0.980
2
4p = 0.s88
7
)p:0.299
2Á
p - 0.592
1
6p:0.029
2
4p = 0.337
I4
18p:0.3ó8
l5I6
p:0.948
t4
16p: 0.239
1518
p :0.685
12LI
p: 0.077
IJ
20p: 0.047
1l
18p:0.043
34
63p:0.029
38
55p : 0.311
2748
p:0.038
4I]J
p = 0.597
2444
p = 0.039
)z
44p:0.033
T4
58p:0.019
lSurvivalendpointsestimatedonthebasisofKaplan-Meieranalysis(medianofsurvivaltime).Statisticalcomparisonoftwostrata: log-ranktest. EFSI-event-free survival calculated fiom date ofprimary diagnosis (and surgically dissected tumor) to the Íirst progression ofthe disease; parameteÍ related to theprimary therapy oftumors (all cases recruited to the study passed tbrough fust relapse or progression ofprimary disease).EFS2= event-free survival calculated from date offirst progression ofthe disease to date ofsubsequent risk event (suwivors without risk event were censoredattime oflast follow-up control). Sn- survival reached after first progression oftle disease calculated from date offirstprogression to date ofdeath (survivors
were censoted at time of last follow-up conhol). oS _ overall súrvival calculated from date of diamosis to date of death (survivors were censored at time oflast follow-up control).
Table 4. IFN inducibility of STAT I phosphorytation at tyr ZOr and Ser 727
STAT 1 phosphorylation Responders (inducible) Non-responders (not-inducible) Overall difference in inducibilityby IFNcr or IFNý
Tyr 701
IFNoIFN1
Ser'72'7
IFNtrIFNT
29.5 % (n: 13)
72.7 %(n:32)
25'0%(n= Í|\
20.s % (n:9)
71.5 % (n= 3l)2'7.3 %.(n: L2)
7s.0% (n= 33)
79.s % (n:35)
p = 0.013 .(IFN a< IFN g)
p = 0.819(IFNa=IFNg)
lBinomialtest comparing inducibility (responsiveness) to IFNo and IFN1as quantitative test of ďfference bet\ťeen these two variants.
LACK OF STAT 1 PHOSPHORYLATION IN MELANOMA
Table 5. Survival endpoints stratiÍied according to IFN inducibility ofSTAT lphosphbrylation
Shati$ring ParametersEFSl
Survival endpoints'
FSz Sp
- Meďan surviva] time and statistical tests -ACTTVATION BY IFNU
IFNo activation atTyt 701
and lst progression up to I year) influenced very sig-nificantly proťrle of overall survival.
A1l potential predictoÍs entered multivariate Coxregression models with outcomes suÍnmarizesTable 8. As expected from Table 7, EFSr up to 12months occupied most signiťrcant position among in.dependent risk predictors of OS. In addition, occur-rence ofdistant metastases, age higher than 50 yearsand inducibility by IFNy at Tyr 701 were applied assignificant contributors to the ťrnal riskprognosis. Al-though limited in sample size, the objective multi-variate analyses suggested potential role of IFNy atTyr 701 inducibility as independent predictor oflong-term survival and early risk development of thedisease as measured by event-free survival to the firstprogression (EFSI) (Tab. 8).
In spite of numerous reports describing abnormalexpression and/or activation of STATproteins in vari-ous malignant cells, the important question, whetherat all and to what extent STAT deregulation associateswith or affects disease evolution in patients, has notbeen satisfactory elucidated. In this context,WIDSCHWENDTER et al [19] on the basis of examina-tion of STAI I activation in archival biopsies of pri-mary breast cancer patients demonstrated that highSTAI I activation in primary tumor has direct linkwith favorable outcome of disease and can be consid-ered as a significant indicator of good prognosis.These data are in sharp contrast with our results.However, both shrdies were carried out on differenttypes of cancer and it is known that various STATs ex-ert distinct activity in histologically different cell sys-tems utilizing diverse activating ligands. For exam-ple, it has been shown that the outcome of STAI 1 andSTII 3 activation can be positive or negative depend-ing on the stimulus and cell type involved [16]. More-oveq the different methodological approach, i.e. ex-amination of STAI 1 phosphorylated form levels inbiopsies versus . inducibility of STAT I phospho-
rylation by exogenous IFNy, might also account fordivergent results in both studies.
It is noteworthy that in our study prevailing numberofmelanomapatients were lacking STAI I activationby IFNybut in spite of this STAI I activation defectthey still had better prognosis comparing to the re-sponders. The finďng that high numbers of mela-noma samples were unresponsive to IFNycould indi-cate that melanoma cells acquire, at certain stage ofdisease, growth advantage ifthe IFN1/STAT I signal-ing is tumed off Such a phenotypical change is -con-sistent with a phenomenon called immunoeďting, i.e.a positive selection of cancer cells that acquire theability to escape recognition by immune system [8, 9].Our data, however, illustrates that immunoediting isnot apparently the only mechanism affecting the be-
InducibleNon-inducible
2125
= 0.487
b
3= 0.157
L4l )
= 0.669
)z
44:0.446Statistical si ficance
lFNoc activation at Set'727lnducibleNon-inducible
3144631639
2Í22
Statistical significance p:0.456 p: 0.959 p : 0.ó63 p:0.696
ACTTVATION BY IFNy
IFNy activation at Tyr 701Inducible 16Non-inducible 45
StatisticalsisniÍicance o:0.018 o:0.904 o:0.112 o: 0.027
3t
2580
12z7
IFNT activation at SeÍ 727lnducibleNon-inducible
218314
o:0.429 o = 0.805
l8z4
2644
o:0.876Statisticď sisnificance o= 0.449
lSurvival endpoints estimated on the basis of Kaplan-Meier analysis (meďan of sur-vival time). Statistical comparison oftwo strata: log-rank test. For detailed descriptionofsurvival endpoints see Table 2.
Table 6. Intlucibility of STAT 1 phosphorylation at Tyr 701 in relation to theother risk factors
fusk factors and their catesories Inducibilitvrii.ýJl.r"ijiĚ.r statistical testl
Age at diagnosisAge ž 50 yearsAse < 50 veaÍs
72.2 P:0.996I5- l
Sex
Clark
MenWomen
43.889.3
P = 0.004
Primary tumor: localiýTrunk-neck-headOther
61.180.7
P:0.183
Clark Š IIIClark > III
70.066.7.
P:0.956
BreslowBreslow > 3Breslow < 3
69.6'76.2
P :0.740
l" progressionDistant metastases: lung, liver, brainNo metastases in lung, liver, brain
64.387.5
P:0-261
l"progressionEFSI < 12 monthsEFS' > l2 months
71.476.9
P: 0.998
rTest for association between response to IFNy and particular risk factor (Fisher'sexact test).
336 BoUDNf. DUŠE}.. ADÁMKoVÁ' CHUMCHALoVÁ, KoCÁK et al'
Table 7. Predictive value of potential risk parameters in univariate Cox regression modelsr
Parameter 2 Predefined endpoint
Event-free survival to 1"'progression (EFS1)
p value Relative risk (95% CI) p valueOverall survival (OS)
Relative risk (95% CI)
Basic characteristics ofpatients and disease
Age > 50 years
Male sex
Breslow > 3
Clark > III
Primary tumor locality: trunk-neck-head
2.39 (1.22; a.71)|.97 (0.8Í; 4.79)r.34 (1.02;1.19)0.88 (0.3s;2-22)2.27 (1.r4;4.5r)
0.0290.1 180.0420.7890.039
2.08 (1.08; 4.00)1.82 (0.92;3.s1)2.04 (1.02;4.09)0.86 (0.43; 1.75)r.s\ (1,.02;2.23)
0.02'70.1 050.0390.ó980.048
STAT 1 activation by IFN aJy atTyr 107 or Set 727
IFN tlt activation at Tyr 701
IFN cr activation at Set '727
IFN y activation at Tyr 701
IFN yactivation atSer 727
inducible cases0.64 (0.28;1.46)0.89 (0.37;2.15)2.77 (1.15; 6.70)1.18 (0.44;3.20)
0.2990.7980.0290.742
0.69 (0.36; 1.3ó)0.69 (0.33;1.42)2.38 (1.32;4.92)1.52 (0.72;3.24)
0.29s0.2940.0130.291
Disease development
l't progression with distant metastases (lung,liver. brain)
Time to l't progression: EFS1 < 12 months
2.83 (1.23;6.52)
10.31 (3.51;30.29)
0.011
<0.001
lOS and EFSr were selected as endpoints that appeared to be significantly associated with several risk factors (see also Tab. 2). 2Al1 parameters were coded as
binary factors according to specified risk values. EFS1 - event-free survival calculated from date of diagnosis to the first progression (see also Tab. 2).
Table L Results of the multivariate stepwise Cox regression modetingr
End-point parameters included Coefficient (SE) Model log-likelihood LoeJikelihood ratio test RelatiÝe risk2
Model for overall survival (OS)
Null model
Step 1. EFS1 (Š 12 months)
Step 2. + Meta
Step 3. + Age (ž 50 years)
Step 4. + Ind IFN T at Tyr 701
r.917 (0.434)r.322 (0.312)0.e12 (0.30e)0.813 (0.337)
-81.5-'71.6-65;7-63.8.ó0.3
0.0190.0030.001
< 0.001
6.p03.752.492.25
Model for time to the first progression (EFS1)
Null model
Step 1. Age (> 50 years)
Step 2. + Ind IFN yat Tyr 701
0;7510.885
-125;7-120.1-t15.2
0.0360.004
2.122.42
(0.28e)(0.277)
alMultivariate stepwise procedure was driven only by statistical measures (LogJikelihood function). 2Relative risk associated with variables entered in
multivariate models as independent predictors. EFSI - event-free survival calculated from date of diagrosis to the first progression (see also Tab.2).Meta -
ďstant metastases in liver, lung or brain at time of lst progression. Ind IFN1at Tyr 70l _ IFNT inducibility of STAT 1 phosphorylation at Tyr 701.
havior of the tumor and disease outcome. This study demon-strates that tumor cells, which lack responsiveness to IFN%have less devastating effects on melanomapatients'health re-sulting in a signiťrcantly better disease prognosis. It is wellknown that tumor environment, local immune reactions, in-flammatory processes and epigenetic factoÍs play importantrole in tumor growth, invasiveness and metastátic potential.It is entirely possible that these factors aÍe favorable for mela.noma prognoses if the tumor cells display aberrant responsesto IFNy. Hypothetically, it can not be ruled out that STIťI 1
activation insuffrciency might also negatively affect someother growth promoting exogenous signals utilizing STAI 1pathways with consequence in the diminishing tumor cellgÍowth.
Altogether, our findings show an unexpected-to-edgedrole of lFNysignaling in development and outcome ofmalig-nant melanoma and illustrate that the lack of STAI I activa-tion by IFNy inversely correlates with disease evolution inmalignant melanoma patients and may represent new prog-nostic markeÍ.
LACK OF STAT I PHOSPHORYLATION IN MELANOMA 33'7
o IFN lactivation at Tyr 701: inducible cases a IFN Tactivation at Tyr 701: non-inducible cases * Censored points
Figure 1. Kaplan-Meier analysis of survival endpoints stratified according to IFN gamma inducibility of STAT 1 phosphorylation at Tyr 701(Log-rank test. The figure demonstrates that response of STAT 1 at Tyr 701 after IFM gammr signiÍicantly decreases median of Etr'S1 and oS.
References
t l l
121
t3l
t4l
t6l
17l
t1t
BoUDNY Y KoCAK I, LAUERoVA L, KoVARIK J. Inteďeroninducibility ofSTAT I activation and its prognostic signifi-cance in melanoma patients. Folia Biologica @rague) 2003;49: 14-146.BOWMAN T, GARCIA R, TIJRKSON J, JOVE R. STATS iNoncogenesis. Oncogene 2000; 19: 247 4-2488.BOWMAN J. JOVE R. STAI oroteins and cancer. Cancer Con-trol 1999; 6:615-619.BROMBERG JF, WRZESZCZYNSKA MH, DEVGAN G, ZHAO Y,PESTELL Rc et al. Stat 3 as an oncosene. Cell 1999; 98:295-i03.CALO V MIGLIAVACCAM, BAZAN V MACALUSO M, BUSCEMIM et al. STAT proteins: from normal control of cellularevents to tumorigenesis. J Cell Physiol 2003;197:157-168.DARNELLJE Jn. STAIs and gene regulation. Science 1997;277:1630-1635.DECKER T, KOVARIK P. Transcription factor activity of STATproteins: structural requirements and regulation by phospho-
rylation and interactingproteins. Cell MolLife Sci 1999; 55:1535-r s46.DUNNGB BRUCEAT,IKEDAH, OLD LJ, SCHREIBERRD. CanceTimmunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.Nat Immunol 2002; ll:991-998DUNN GP. QLD LJ, SCHREIBER RD. The immunobiology ofcancer immunosurveillance and immunoedítine. Immunity2004;2:137-148FRANK DA. STAI signaling in the pathogenesis and treat-ment of cancer. Mol Med 1999:'5:432456.HORVATTI cM. STAT proteins and transcriptional responses toextracellular signals. Trends Biochem Sci 2000; 25 : 496-502.KOVARIK J. BOUDNY V. KOCAK I. LAUEROVA L. FA]T V Et AI.
Malignant melanoma associates with deficient IFN-inducedSTAT I phosphorylation. Int J Mol Med 20 03 ; 12: 33 5-3 40.
tI3] KOVARIK B MANGoLD M, RAMSAT]ER K IIEIDARI H,STEINBoRN n et al. Specificity of signaling by STAI I de-pends on SH2 and C-terminal domains that regulate Ser727 ,phosphorylation, differentially affecting specific target geneexpression. EMBO J 2001; 20: 91-100.
[14] LEvY DE. Physiological signiťrcance of STAI proteins: in-vestigatións through gene disruption in vivo. Cell Mol LifeSci 1999; 55: 1559-1567.
[15] LEVYDE, DARNELLJE JR. STATs: transcriptional control andbiological impact. Nat Rev Mol Cell Biol 20 021' 3 : 65 1462.
[16] MUI ALF. The role of STATs in proliferation, differentiationand apoptosis. Cell Mol Life Sci 19991'55:.1547-1558.
I17l PANSKY A, HILDEBRAND R FASLER.KÁN E, BASELGIA L,KETTERER s et al. Defective JAK-STAr signal hansductionpathway in melanoma cells resistant to growth inhibition byinteďeron-alpha. Int J Cancer 2000; 85: .72o-,l25.
[18] RAMANA cV crrArrERJEE-KrsHoRE M, NcrrrEN H, srARKGR. Complex roles of Statl in regulating gene expression.Oncogene 2000; 1.9 : 2619-2627 .
[l9] wIDscHwENDTER A, ToNKo.GE\M,Á.YER s, WELIE T,DAXENBICHLER G, MARTI{ CH, DOPPLER W. Prognostic sig-nificance ofsignal transducer and activator oftranscription Iactivation in breast cancer. Clin Cancer Res 2002: 8:3065-3074.
I20l woNG LH, KRAIIER KG, HArzIMsINou r, EsrcouRT MJ,I{ERSEY P et ď. Inteďeron-resistant human melanoma cellsare defllcient in ISGF3 components, STAT 1, STAT 2, andp48-ISGF 3 gaÍnma. J Biol Chem 1997;222:28779_28.185.
[21] YEH Tc, PELLEGRINI s. The Janus kinase family ofprotein ty-rosine kinaseš and their role in signaling. Cell Mol Life Sci1999:55: 1.523-1534.
t8l
tel
t10l
Í|2]
NEOPLASMA, 52, 6,2005 523
Book review
Curiel D.T., Douglas J.T.:Cancer Gene Therapy. Methods and ReviewsTotowa, New Jersey 07512, USA, Ilumana Press 2004.pages XII + 489
The book represents comprehensive review of the anticancergenes and gene delivery methods currently available for cancergene therapy. These include the transfer of genetic material into thecancer cells, stimulation of the immune system to recognize cancercells to be eliminated, and the targeting of the nonmalignant stromalcells that support tumor cells growth. An authoritative panel of re-searchers and clinical oncologists provide in the book..Cancer GeneTherapy" a complete introduction and guide to the latest develop-ments in gene therapy for cancer from laboratory bench to clinicalpraxes. Importantly, in the book it is possible to find the lessons
leamed from clinical gene therapy trials and strategies to overcomeobstacles to clinical implementation of cancer gene therapy. Forthose who plan cancer gene therapy trials in the future, regulatoryguidelines are presented.
There are no doubts that, a new generation of targeted cancertherapeutics being specifically dřected toward molecular pathwaysof malignant tumor cell phenotype and gene therapy offers tremen-dous promise for the future of cancer therapy. The book with 29 dis-tinct chapters represents an outstanding work, which should not bemissed in all laboratories dealing with cancer gene therapy. Thebook will be ofinterest to clinicians interested in new cancer treat-ment modalities based on our uňderstanding of the molecular basisof cancer as well.
C. Altaner
Eruata:
NEOPLASMA, 2005 ; 52(4 : 3 30-T
II Boudny et al.: ,,Lack of STAT I phospňorylation at TYR 701 by IFNy correlates with disease outcome in melanoma patients',
The correct version of the last two sentences in the Abstract should be::.. . Jnducibility of STAI I activation at Tyr 701 driven by IFNy significantly and unfavorably influenced disease-free intervaland werall survival. In conclusion, these results show that the absence of IFNy inducibiliý of STAI 1 phosphorylation atTyr 701 positively corelates...
