11
Gene Knock-down in Rainbow Trout Embryos Using Antisense Morpholino Phosphorodiamidate Oligonucleotides Surintorn Boonanuntanasarn, Goro Yoshizaki,* Yutaka Takeuchi, Tetsuro Morita, and Toshio Takeuchi Laboratory of Fish Culture, Tokyo University of Fisheries, Konan, Minato, Tokyo 108-8477, Japan Abstract: Gene knock-down technology using antisense molecules has many applications for studying gene function, disrupting undesirable genetic traits, as well as providing effective therapy for a number of viral diseases. Encouraged by these applications, we developed a gene knock-down technique to interfere with gene expression using transgenic rainbow trout expressing the green ¯uorescent protein GFP) gene as a model. One of the antisense morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides AMOs) used in this study AtGFP-1) was 25 nucleotides in length and localized against codons 2 to 8 of GFP messenger RNA. Microinjection of AtGFP-1 into the blastodisc of fertilized eggs decreased the level of GFP gene expression in a dose-dependent manner, A comparison of the effects of various doses of AtGFP-1 suggested that 10 ng of AtGFP-1 was the optimal concentration in that it interfered with speci®c gene expression without being strongly toxic to trout embryos. Conversely, morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides with the inverted AtGFP-1 sequence, which cannot bind to the target mRNA, did not inhibit GFP gene expression. AtGFP-1 did not affect the expression of nontargeted genes such as the skeletal muscle actin and foreign lacZ genes. These results also indicate that AtGFP-1 interfered with the expression of only the targeted gene. Western blot and reverse transcriptase polymerase chain reaction analyses revealed that the amount of GFP protein drastically decreased whereas the mRNA level was not affected by AtGFP-1, suggesting that AtGFP-1 blocked speci®c gene function at the translational level. Further, this gene inhibition persisted until the hatching stage. Another AMO, which was localized against the junction region between the 5¢ untranslated region and the starting codon of GFP mRNA AtGFP-2), also caused inhibition effects. Thus AMOs can have potent and speci®c gene knock-down effects in trout embryos. This technology may be useful for examining the roles of selected genes and disrupting their expression during embryonic development of salmonid ®sh. Key words: gene knock-down, transgenic ®sh, GFP, morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides, antisense, rainbow trout. INTRODUCTION Antisense technology has been used as a powerful tool to reduce the expression level of target genes for functional analysis of gene products. In general, antisense molecules Received August 31, 2001; accepted January 10, 2002 *Corresponding author. telephone/fax +81-3-5463-0558; e-mail goro@tokyo-u-®sh.ac.jp Mar. Biotechnol. 4, 256 ± 266, 2002 DOI: 10.1007/s10126-002-0017-x

Gene Knock-down in Rainbow Trout Embryos Using Antisense Morpholino Phosphorodiamidate Oligonucleotides

Embed Size (px)

Citation preview

���� �������� �� � ���� ����� ������� �������������� ���������� ���������� �� �����������������

��������� ������������ ���� �������� ��� �������� ������ �������� ����� �������

���������� �� �� ������� ����� �������� �� ������� ������ ������ ����� ��������� �� ��

��������� ���� ���������� ���������� ���� ������ �������� � ��� ��������� ��� ������� ����

��������� ��������� ��������� ������� ����� ���� ��� ����� ������� � ������ ��� ������ �� ���

����! "�������� �� ���� ���������� �� �� ������ ���� ���������� ������#�� �� ��������� ���� ����

�$������ ���� �������� ������ ����� �$������ ��� ����� %�������� ������� &�'() ���� �����! *��

�� ��� ������ ���������� ��������������� ��������������� &+�*) ��� �� ��� ���� &+��'(�,) �

-. ���������� �� ������ �� �������� ���� ����� - �� / �� �'( ������� 01+! �������2������ ��

+��'(�, ���� ��� ������� �� ���������� ��� ������� ��� �� �� �� �'( ���� �$������ �� �������������

������ + �������� �� ��� ������ �� ���� ��� �� +��'(�, ������� ��� ,3 �� �� +��'(�, � ���

������ ������������ �� ��� �� ���������� ���� ����4� ���� �$������ ������� ����� ������� ��$�� �� �����

������! 5�� ������ ���������� ��������������� ��������������� ���� ��� �� ����� +��'(�, �#������

����� ����� ���� �� ��� ����� �01+� ��� ��� ������� �'( ���� �$������! +��'(�, ��� ��� ����� ���

�$������ �� ���������� ���� ��� ��� ������ ����� ���� �� ������� ��!" ����! ���� ����� ��

������� ��� +��'(�, ���������� ���� ��� �$������ �� ���� ��� ������� ����! 6����� ���� �� �� ���

��������� �������� ���� ������� ���� �� ���� ��� ��� ����� �� �'( ������� �������� �������

����� ��� �01+ �� �� � ��� ������� �� +��'(�,� �������� ��� +��'(�, ������� ����4� ���� ��������

� ��� ��������� �� ��! '������� ��� ���� ���������� ������� ����� ��� ������� ���! +������ +�*� �����

� �������� ���� ��� 2������� ������ ������� ��� .� ��������� ������ �� ��� ������ ����� �� �'(

�01+ &+��'(�-)� �� ���� ���������� ������! ��� +�* �� � � ������ �� ����4� ���� ����������

������ �� ����� ������! ��� ���������� �� �� ����� ��� �$������ ��� ���� �� ������� ���� �� ���������

����� �$������ ������ ��������� �� �������� �� ������ 4�!

� � ���� ���� ����������� �������� 4�� �'(� ���������� ��������������� ����������������

������� ������ �����!

�����������

+������ ���������� � ���� ��� �������� ���� ��

������ ��� �$������ �� �� �� ����� ���� ��� ���������

���� �� ���� �������! 7� ������� ������ ��������0���� �� +���� 8,� -33,9 ������� :���� ,3� -33-

� ����� ��#�$ ������% ���� ����&��' (���)�*�+)��**�, ��-�� $���.��������/��%�!%0

��! ����������! ;� -.< = -<<� -33->*7? ,3!,33@A,3,-<�33-�33,@�$

������ ��� ��������� �� ����� ������� 01+ �� ���

�#������ ������ ��������� �� ��� �01+ ���� 01� B

�� ���� ��������� ��������� �� ��� ������ ���

������� �� ������� &��� �� ���� �� ������� �� �!� ,CCC)!

+ ������ ��� ������ �������� ������������ �$����

��� �� ��� ����� ����! ��� ������#�� � ����� DD����

����������!EE 5�������� ����4�� ��������������� ����

������� �� ��������� �� ��������� ������ �� ��

��$����� �� ��� ���� � � ������ �����! *�� ��� ����

�� ���������������� ����� ���������� �������������

��� ��������������� &�*)� ����� �� �������������

���������� ���������� �� ����� ������������������

���������� ������� �� ��������� ��� ��� ������� ����

����! �* � � ���� ���� �� ��������� ����4� ����

���������� ������� ������4���� ������� �� ����� �01+�

�� ��������� ������� �� �� ��� ����! 7� ������ �� �����

��� ������ ����������� �* ���� �� ��������

������� �������� �������� ��� ������� 01� B=���

��������� �� �01+ &��� �� ���� �� ���������� ,CCC9

"���� �� F���� -33,)!

0�������� ������ �� ���� ���� #�������� �����

� � ���� ������ �� ���������� �����������! 7� ���

������� ������� ���� �� �������� ��� �$�����

�#����� �� &"��)� � � ���� ������� ��� ��

��� ����� ����� ��������� ���������� �� ������ &G���

�� �!� -3339 > �� �� �!� -33,)! ����� ��� �������� ��

��� �� ���� ���� ����� �� ������� ���� ����� ��

#������ ����� ������#�� ��� ������� ���� �������� ��

������! (��������� �� �������� 4� ����� �����

��� �� ������� ���� �������� ����� �� ���� ��� ���

������� �� ��������� ��� � � ���� ������ �� ��� ��

��������! B��� ��� ��� �������� ������ � ���� ��

������� ���� ����� �� � ����� ������������� �����

�� ������ ���� �������� ���� ��� �� ������ ������

&������� ���� �� ��������� ���� ��� ��� ��������� ��

���� ������� �� ��� ����)! ����� ��� �� � ���4���� ��

��������� ��� ���� �� ��� ������� �� �� ��� � ���$�����

������� ���� ��� ��� ����� ��� ��������� �� ��� ��� 4�

���������! +� ������� � ������#��� ����� ���� ������

���� �� �� ��� �� ������ ��������� ����! +�������

����� � � ���� ��� ���� ��������� ����� �� ����� ���

������#�� � ��� ��� ���� ���������� �� ���� �� 4�!

���������� ���� ���������� ����� �� �� �� ���� �� ��

��� �$������ ��� �������� �� ���� ���� �#����� �

�����! ���� ���������� ���������� � ��� �� �� �*

� ���� ���������� ����� ������#�� ��� ������

������ ���� �������� ������ ��������� �� �������� ��

����4� &1� ���� �� "����� -3339 �������� �� �!�

-33,9 �� �� �!� -33,)! B��� ��� �� � ��� ��� ���� ���

��� ����� 4� ������ 7� ��������� ��������� ������ ���

�������! ����� ���� ���� ������ ���� �� ������

���� �� �������� ��� ����4�� �� ��� ��������� ���

���� �� �$������ ������ ��������!

��� ������ ������������ �� ����� ������ ���

���� ��� ��� 4� ������� ��� �� ��� #�������� ������

����! '�� �$����� ������ �������� �� ���� �� ��� ���

��� ����! 7� ���� ������ ��������������� � � ����

���� �� � � ���������� ������ �� ��� ���������� �� ����

�$������ &��� �� ���� �� ������� �� �!� ,CCC)! '�������

����� ��� ������ ������ � ���� ���� �� ���� ��� ���

����� ���� �� 4�! �������� ������ ����� �������

������ ���� ������������������� �������

&��0B) ���� ���� �������� �� ������� ���������! +�������

��� �� �� �� ������ 01+� ��� ������ �� �������� ��� ���

4�� ��� 4� ����� ����4��� ������ �� ��0B �� ���

���� �� �������� &H����� �� �!� -333)! ���� �������

��������� �� ������ ���������� ��������� � �� ��

����� �� ������ ������� � ������ ��� #�������� �����!

+ 4�� ��� �� �� ���� ������� ���� ����������

������#�� �� ������ ������ �� �$����� ��� ������ ��

������ �* &+�*) �� ��� �������� �� ���������

�� ��� ����� ����! 7� ��� ���� ������� ���� ��� �����

%�������� ������� &�'() � ��� ��� ����� ���� ��

����������� �� ������ ��������� �� ��������� ���� ���

�'( ���� �$������ ���� ��������!

������ �� �� ���

��������� ����

0����� ����� &1�!�����!��� -����) ���� ����� � ,3�5� ��� *����� 0����� �� ������� ������� ����� H���

����� �� '������ & ����� :��)! ��� ������� ���

�� ��� ���� �������� �'( �>1+ ��� �� �� ��� ���� ��

���� �������� &�+�) &B�� �� �!� ,CC/)! ��������

����� ������� �+� ���� �������� �� ��� �������2������

������ �������� �� ������ �� �! &,CC,)! ��� '-�������� ������ ���� �������� �� ����� ���������

����� �� ', �������� ��� ������ ���#����� �'(

���� �$������ & ������� -33,)!

� ��� ��� �� ��� � �������� ���� ���� ����

+�� �* ���� ������� ���� ���� ����� FF5 &(�����

���� *��!)! ��� -.���� ������ ���������� ��������

���� G��������� �� 0����� ����� -.@

�������� &+��'(�, �� +��'(�-) ���� ���! +��'(�, &.����++5+�5�55�5�555���5�5+5�8�) � ������� ��� ��

����� - �� / �� �'( �� +��'(�- &.��5+�������+55�

�++��5��+�5���8�) � ������� ���� ��� .������������ ������ �� ������ ����� &���������� �#����� ��

������������ �� ������ �����)! ����� ������� �� �+�

�� ���� �� '����� ,! 7� ����� �� �$���� ��� ����4���� ��

��� +��'(�,� � �* ���� ��� �� ����� +��'(�, �#�����

&7 �'(� .��5+5�5���555�5�55�5�+5++���8�) � ���

�������! '�� �������2������� ��� �� ��� 8 �* � ���

�� �� �� ,3 �� ����B5� &�B /!3) �� 3!, �� ">�+ ��

����� � �-3�5 ����� ��!

���� � ����� � ��� ���� ������ �

���� ��������� ���� ��� ����������� �������� ', 4� �

��� �� �������� ��������� ��� �� ������� ��� '- ����

������! +���� ����������� ��� ���� ��� ��� �� ���

������ ���� �� ������� �� , �� ���������� &�������

����) �2���� �� �B /!3 �� ��� ��� �������� �� ���

������� & ������ �� �!� ,C/C)! ������� - �� @ ����

���������������� - �� �� ��� �* ������� � ��������

2����� ���� ��� ������� �� ,��������� ������ ����

����� �������� �� ��� ������ �� ������ ��� ���������� ��

�������� ����� & ������ �� �!� ,CC,)! +� 4��� ���������

��� &�� �� ;3 �� ��� ������) �� +��'(�, ���� ������

�����! ����� ,3 �� �� +��'(�, � ��4����� �� �������

�'( ���� �$������ �� ��� ��������� �$��������� �� ���

���� ��� ��� ��� ���#���� �$��������! +���� ��������

2������� �� ������ ���� ���� � ,3�5!�� ��������� ��� ������ �� ��� �* �� ��������� ����

���� �$������ � � ������ ��� &8 �� ���������������

I���J� �����)� ������ ��� ��������� �$����� ��� �'(

���� ���� �������� �� �������2������ �� .3 �� �� �+�!

��� ������ �� +��'(�,� +��'(�-� �� 7 �'( � ���

��2����� ���� �+� ���� ���������� ��� �� ��������� �����!

��� ������� ����� ����� �� ���� �+�! +�� �������2������

��������� ���� ��������� � ,3�5!

��� ��� ����� �������� �

�� � ���� ��� ������ �� �* �� '- �������� ������

�$������ �'(� ��� ����� %��������� �� ��� ��2�����

������ � ���� �� � ,.� -3� �� 83 ��� �������� ��

������ �������� �� ������� �� �! &,CCC)! ����� ����

�� ��� ����� ���%���������� ��� ��������� �����

���� �������� ���� ��� ���� � �� ���� �� ������� ��

������� &15� C!3; �� G5� 3!-; �� �� 55�-�-B-* 3!8;

�AF)! +��'(�, ������� ��� �$������ �� ��� ����� �'(

����! + ������ ��� �������� �� ����� %��������� �

���4�� ������ ���� �� ���� �� %�������� ������

����� ���� ���� &�� '����� -� +� ������ ���� ��

���� �������� ������� ���)!

������� �'( ���� �$������ � ���� �� ���� 8

��� ������ �������� �� ��� ������ �� ������� �� �!

&,CCC)! �������� ���� ������ �������� ���� ���

���� ���� ��� �� ��������E ������! ��� ������

�������� ���� ����� �� ���� �� ������� �� �������

�������� � ,3�5! ��� ������ �� �'( ���� �$������

� ���4�� ���� 8 �� �� &������ ���� �� �� �$����

���) ��������� �� ��� ������� �� ����� %��������� &��

'����� -� 5)!

�� ��� !������ � ��� "���� #� � ��������

�� ���4�� ��� ������ �� ��� �* �� ��� ������� �� ���

6����� ���� ���� � ������ ��� ���� ��������

���� �'( �� ������ ����� ���� �������! '�� �������

�$�������� . ������ &,. ���) ���� ������� �����������

�� �������� ������������� ������ &.3 �� ����B5�� �B

<!/� ,3K ��������)� �� ������������ . ����! ��� ����

� ��� ������� � ,/����� ������ � ��� ���� ��

����������� � ,-�333 ��� ��� . ������ � ;�5! ��� ��

������� � ��� ��� ���#���� �������������! '�� 8

��� ������� ,3 �������� ���� ������ �� ���� �� ����

���� ������������� ������ �� ��������� � ��� ����! ���

���� ���� �$����� ���� ����� ������������ �����

�������� ��� ������������� ���� ,.K ������������

���! ��� ����� �� ���� ����� ���� ��� ��� �

�#�� ���� �� ��� 8 ��� �� ��� ����� �� ,. ��� ������!

'�������� �������������� ��� ��� ���� �������������� ����

B������"5F &+����� (����� �������� ��������

����� $% F������ �� +�* �� �+�! ����� ��$ �������� ���

���� ������ ���� ��������� ������� ��������� .��%����� ���������� 4�� �$��� �� ��� 4�� ������! 6���� �� ���� ��$� ��������

��� .����������� ������ �� ��� ������ ���� �� ���� ��� ������

������ �� �'( �>1+� ������� ���! ��� ������� �� ��� ��� ����� �

����! +��'(�, � ������� �� ���� �� ����� - �� / �� �'(

�01+! +��'(�- � ������� �� ���� �� ��� ������ ������� ��� .����������� ������ �� ��� ��� ����� �� �'( �01+!

-./ ��������� ����������� �� �!

����� &% 7��������� ������ �� +��'(�, ��2������ �� ���� �'( ����

�$������ �� ������� �$������! �� '��������� ��� ������� �+�

���� �������2����� ���� ,3 �� �� �* �� ����� %��������� �

���� �� � ,@ ���9 �A� ������� �������� ������ ��� ��� ���

����� � +��'(�,9 7� �������� ������ �������2����� ���� 7 �'(!

����� %��������� ������ �� ��� 7 �'(���2����� ������ ����

����� �� ���� �� ��� ������� ������ &�A�)! �, �� �- �������

�������� ������ ��� ����� �� +��"(�,! �, ��� ��� ��� ��

����� %��������� ����� �- ����� ��� ����� %���������! 6����

������� ������� ����� �'( �$������9 ���� ��������

��� �'( �$������9 ���� �������� �� �'( �$������! #� ���

�� 4��� ����� �� ������ �����! �� '��������� ��� ���� ����2�����

���� ,3 �� �� �* �� .3 �� �� �+� �� �'( �$������ �

���� �� � 8 ���9 ( ������� �+����2����� ������9 �� ��������

������ ��� ����� �� +��'(�,9 7� �������� ������ ��� ����� ��

7 �'(! '� ��� �� 4��� �� 5 ����� �� ������ �����!

���� G��������� �� 0����� ����� -.C

������� H!G!) �������� �� �� ����������E ��������!

��� ���� ���� ������� ���� .K ����� ��� ���� �� (���

&/3 �� 1B(*;� -3 �� 1B-(*;� ,33 �� 15�� 3!,K

����� -3) �� �������� �� (��� ��������� ����

��������� �������� ���� �'( &0���� ��������

����������� ���� ����������) �� ���� ������ ����

&751 ���������� 7��!� 5�� ��� 5���!)! ��� �����

�������� ���� ������� ���� ��� "5F (�� 6�����

�������� >�������� ����� �� B����4���"5F &+�����

(����� �������)!

���� �� � ������ � !������

�� ��� ������� +��'(�, ����� ������� �� ���� �$����

���� �� �$����� ��� �$������ �� ������� ��!" ����

����2����� ���� +��'(�,! 6�������� ���������� ��� ����

����2����� ���� ,3 �� �� +��'(�, �� .3 �� �� �����

��������� ��!" ���� ��� �� �� ��� ���� ������ ����

����� &�+L) &���� �� �!� ,CC;)! + ����� � ��������

������ ���� �������2����� ���� ���� .3 �� �� �+L! 7�

�������� ������ ���� ��2����� ���� .3 �� �� �+L� .3 ��

�� �+�� �� ,3 �� �� +��'(�, �� ����� �� ���4�� ���

�#����������4���� �� ���� ����������! ����������

��� ��� �� �������� �� 8 ��� ������ � ������� ��

�� ��� ������ �������� �� 7���� �� �! &,CC,)!

()� *� ���� � ��� (�+��(

�� ��������� ������� +��'(�, ���������� ���� ��������

���� �� ��� ����� ����� ��� �01+ �� �� �� ��� ����� ����

� �� �������! 01+ � ������ ���� ���� ����

�������� � 8 ��� ���� �07L*F 0����� &�7�5* �0F�

0��� ����� ���) �������� �� ��� ����������E ��������!

'�������� ������������ >1+ � ��������� ���� -

�� �� ���� 01+ ���� 0��������� ���(���� '����

����� ��� &+����� (����� �������) ���� � �����

&��) ������! ��� �� ��� ��������� �������� ����

������� &0��(50) � ������ ��� ���� �'( �>1+����

��4� ������! ��� ��� ������ � ������ �� ��� �#�����

�������� ���� ��� -- �� -/ &.���+5��+++5��55+5++���

8�)� �� ��� ������ ������ � ������ �� ��� �#�����

�������� ���� ��� -,@ �� -,8 &.���55+�5+��+55+����

�+��8�)! ��� �$������ ��� �� ��� ����4�� ������� �

���� 3!< ��! ��� (50 ������� � ������ ��� �� ����

����� �� ,3 �� �������� �� , �� �� �>1+ �������� -33

�� �� ��� �1�(� , ���� �� ��� ������� , � 2' ��3

������� �� 3!-. H �� 24 ��$ &��� ������ ����� :��)!

��� (50 ������� � ��������� � C;�5 ��� - �������

���� 83 ������� ����� ���� ��� ���� ��� ����� ��������

�� -3 ����� � C;�5� -3 ����� � ./�5� �� ;. �����

� @-�5� �� ��� 4�� ��������� ��� � ��������� �

@-�5 ��� 8 ������! *�� 4��� �� ��� ����� �� ��� (50

������� � ������ �� ������������� ���� -K ����

��� ��������� �������� �������!

������

����� �$������ �� ��� �'( ���� ���� � ,- ��� �� �+��

���������� �������� �����! + �$������� ����$������

.3K �� ��� �$����� '- ������ ����� ����� %�����

�����! 6��� ��� ������ ����� �� +��'(�,� ����� �$����

��� �� �� �� �'( ���� �������! ��� �������� �� �����

%��������� ���� ��������� �� ��� ���� ���� �� ���

��������! 6��� ����� �$������ &'����� -� +� ����� ��

������)� ����� %��������� � �������������� ����

��� �� ��� ������� ��������! "$���� �� ��� �$������

�� ����$������ �� ���� �� ������ �� ���� �����

���� ������� ���� �� '����� -� +!

'���� ��� ������ ��� �� +��'(�, ��� ���� �����

��������� �� ��� ����� %��������� �� ��� ��$����� �� ���

������ � ����������! ��� ��������� �� ��� ������

��� ����� ����� %��������� �������� ���� ��� ������

������� �� +��'(�, �� ������������� �����

&'����� 8)! 7� '����� 8� ��� ������ �� ����� ��� �� ���

�� ������� ��� ��������� �� ������ ������ �����

����� ,% >�� ������ ���������� �� �'( ���� �$������ ��

+��'(�,! B����� �� ����� �� ��������� ��� ��������� �� ,.

��� ������ ������ ����� �� ��� ����� %���������� ������

�� ���9 �� �� � � ��� �� ,. ��� ������ ����� ��� ��� ��������

��� �� +��'(�,! '�� ��� ���� +��'(�, � ��2����� ���� � ���

,33 ������ �������� �� ����� ��������� ����� �� � ',

�������� ��� &.3K �� '- ������ ���� �$������ �� �� ��������

������ �'()!

-<3 ��������� ����������� �� �!

�� ��� %���������� ������� ���! ��� � � ��� �� ���

2����� ������ ���� ��������� �� ��� ��� ��� ����

������� �������� � ��� � �� ,3 �� ��� ������! +� 3!@.

�� �� ����� ������ ��� ��������� �� ��� ������

������ ����� %��������� ������ ��� �� �� �������

������� ���� ��� �� ��� ����2����� ������� ����� &3 ��

�� +��'(�,)9 ���� ��� ���� ��� ��� ������� ���

������� �� ����� %��������� �� ��� ������! + ����

��������� �� ����� ���� �$������ � ���� �� �� ���

������ ��� ����� �� ���� ��� , �� �� +��'(�,!

6��� ,3 �� �� +��'(�,� ���� ��� ������ �����

����� ����� %��������� �� ��� �� � � ��� &���� .3K)

� ���� ��������! ����� ������ �������� �� �����

%��������� � ��� ���� �� �� �������� ��� ��2�����

����� �� +��'(�, �� -3 �� ����� ��� �� � � ��� �

���� �������� �� ���� ,3 �� �� +��'(�, ��� ��� ���

�#���� �����! +� ��� ��� �� +��'(�,� ���� ,,K ��

���� ������ �$����� &--K �� ��� ������ ��� ����

������� �� �� ��������) ����� ��� ����� %����������

�� ���� @!,K �� ������ &,;!-K �� ��������� ��������

������) ����� ����� ����� %��������� &���� ,)! 7�

������� ���� ,3 �� �� 7 �'( ��2������� ��� �� ��� ���

���� ����� ����� %��������� ��� � ����� ���

�� ��� ����2����� ������� &'����� -� +� 7)! 7� ���� ��� ����

������ �� ����� %�������� ������ ��2����� ���� 7 �'(

&.8!;K) � ��� ����4����� ��������� ���� ��� �� ���

����2����� ������� &���� ,)! >��������� ������ �� ����

+��'(�,� �� 7 �'(���2����� ������� ��� �����

��������� �� ��������� ���� ���� �� �� ��� ������

&�� ��� ����)!

+ 6����� ���� ���� � ������ ��� �� #������

��� ����� �� �'( ������� ���� �������� ������ ����

�� ������� �* ��2������ &'����� ;� +)! (���� �� ���

6����� ���� ����� +��'(�,���2����� ������ ��� ���

��� ��� ����� %��������� ���� �$����� �� (50 ��

��������� ������� ���� ������ �+� &�� ��� ����)�

�� ���� �������� ������ ������� �+� ���� ��� ���

������� ������ ���� ����! ���� ������� ���� ����

�������� ������� ����� �� �'( ������� ���� &'���

��� ;� +� �,)! 7� �������� +��'(�,���2����� ������

������ ��� ����� %��������� �������� ���� ���

����� �� �'( ������� &'����� ;� +� �-)! B��� ��� ���

�'( ������� ���� �� 7 �'(���2����� ������ � �����

�� �������� �� ��� �� ��� �������� ������ ��� ��� ���

����� � �* &'����� ;� +� 7)! + 6����� ���� ���� �

�� ������ ��� ���� � ������� ���� ������ �����

���� ������� �� ��������� ������� +��'(�, ����������

���� ��� �$������ �� ������� �� ����! ��� �� ����

���� ���� ��� ���� ��� �� ��� �� ����������� �$�

�������� ���� ���! ����� � �� ��������� ���������� ��

��� ����� �� ���� ������� ���� �� ���� ��� ���������

����� &'����� ;� �)!

+ ������� �$������ �$�������� � ��������� ��

��� ��� ����������� ������ � ��� ���� �� ��������� ���

�� ������ ����� ������! +��'(�, ������ �����������

������� �$������ �� �+� �� 8 ��� ������ ����� 7 �'(

��� ��� &'����� -� 5� �� ���� -)! "$���� �� ������

���� �� �� �$������ �� ���� �� '����� -� 5! + ����

�� ��� ���� ��������� �� ��� ������ ��� ���� ��2�����

���� ���� �+� ����� ����� �$������ �� �'(! ���

��������� �� +��'(�,�����2����� ������ ������ �'(

�$������ � ���� �����! '������� ������ �� ���

���� ������ ����� �'( �$������ �������� ��������

�� +��'(�, ����2������ &���� -)! B��� ��� 7 �'( ��� ���

��� �� ����4��� ������ �� �'( �$������! ��� �����

���� � ���4���� �� 6����� ���� ���� ���

����� ��� ��� �'( ������� ���� �� +��'(�,���2�����

������ � �������� ����� ��� �� 7 �'(���2����� ���

���� � ��� ������� &'����� ;� 5)! +���� ��� �� �� ��

���� ������� ���� �� ������ ������ ��� �� �� ��%��

����� �� �* ��2������ &'����� ;� >)! �� ���4�� ��� ��

#��������������� ���������� ������ �� +�*� �� �� ���

���� $% 7��������� �� ����� �'( "$������ �� +��'(�, �� �������� "����� � ,. ���!

"����� ������ �'( �$������ &K)�

�*� ���� ������ 6��

1��� .3!< M -!C .3!< M -!C 3!3 M 3!3

+��'(�, &,3 ��A������) ,/!8 M 8!3� @!, M ,!@� ,,!- M -!@�

7 �'( &,3 ��A������) .8!; M <!@ .,!, M @!8 -!; M -!;��

���� ����� �� ���� ��� M �" �� @ ��������! '������ �� </ ������ ���� ��� ��� ��� ��������! >�������� ��������� ������ ������ ������

������� ��������� ����4��� ���������� &5 N 3!3,)!�1��� ��� ��� �������� � ����� �� ���� ��� ������ ��2����� ���� 7 �'(!

���� G��������� �� 0����� ����� -<,

+��'(�-� ����� � ������� ���� ��� �� ��� .������������ ������ �� ��������� ����� &'����� ,)! +��'(�-

� ������� +��'(�, � ����������� ���� �'( ����

�$������ &�� ��� ����)!

�� ��������� ��� ������� � ������ �� +�*� �� �$��

���� ��� ������ �� +��'(�, �� ���� �'( ���� �$������

������ ��� 4�� 83 �� �� ����������� &'����� .)! ���

���������� ������ �� +��'(�, � ����� �� ,. ��� ������

&@3������ ���)! ��� ��������� �� ������ ������

����� ����� %��������� ���� ����4����� ������� � �� �

-3 �� 83 ���! B��� ��� � -3 ��� &���� ���) �� 83 ���

&������� ���)� ��� ���� ��������� �� ������ ������

����� %��������� ���� ���� ������� ����� ��� ��� ���

�� ��� �������� �� ���� ���������� ���� ��� ���������

����4���!

�� ���4�� ��� ����4���� �� +��'(�,� �� ����2����� ��

���� �+L� ����� ������ ��� ��!" ���� ��� �� �� ���

���� ������ ��������! ��� �+L���2����� ������ ��

������ ����2����� ���� +��'(�, �� �+L ����� �����

������ �� ��!" ���� �$������ &'����� <)! ����� ��� ��

������ ����2����� ���� �+�� �+L� �� +��'(�,� �'(

���� �$������ � �������� ����� ��!" ���� �$������

��� ��� ���� �� �� ������� &�� ��� ����)!

6� �� � ����� ��� ����� �� ����� �01+ �� ��

������� +��'(�, ����� ��� ����������� �� �� �� ��� �����

����! 01+ � �$������ ���� 8 ��� ������ ����� ��� �+�

&.3 ��)� �+� �� +��'(�,� �� �+� �� 7 �'(! 1��� ��

��� +��'(�,���2����� ������ ��� �� ��� �$��������

����� ����� ����� %���������! +� 0��(50 ����

����� ��� ��� �01+ �� �� �� +��'(�,� �� 7 �'(�

��2����� ������ ���� ����� �� ��� �� �� �� ��������

������ ��� ���� ��� ��2����� ���� �* &'����� @)!

!���������

7� ��� ���� �� �� ������ � ������� � ���� ����������

������#�� ���� +�* �� ������ ����� ������! �����

4����� �� ��� ������� �������� �� ������ ��������

�������� � ������ �� ����� &,) �$��� ����� ����

������������ ���� ��� ����� �01+� &-) ������� �������

�� ������� �� &8) ��� ��$����� �� ��� ����! �� ���

����4�� ������ ��������������� � � ���� �� ������

���� ���������� ����! +���� ����� ��������������

��������������� &�������) � � ���� ��������� ��� ��

������ ��� &��� �� ���� �� O�� �� �!� ,CCC)! + �������

���� ���� �������� � ��� ���� ���� �� ��� �������

������� ����� ����������� ����� ������ ����� ����4����

����� -% 6����� ���� ���� �� �'( ������� &�. �) �� ������

����� ���� ������� &#. ')! �. #? 7 ������� �������� ������ &,.

���)� ��2����� ���� 7 �'(9 1� ����������� ������9 �, �� �-�

�������� ������ ��2����� ���� +��'(�, � ,3 �� ������ �� ��

��� ����� %���������� ������� ���9 �A�� �������� ������

������� +��'(�, ��2������! (������ ���� �#�� ���� �� ��� �����

�� ,. ��� ������ ���� ����� �� ��� ���! �. '� ����� ���� 8

��� ������ ��2����� ���� .3 �� �� �+� �� 7 �'( � ,3 �� &7)�

����2����� ����������� ������ &1)� ���� ����2����� ���� .3 ��

�� �+� �� +��'(�, � ,3 �� &�)� �� ���� ��2����� ���� .3 �� ��

�+� &()! (������ ���� �#�� ���� �� ��� 8 ��� ������ � �����

�� ��� ���! �'( ������� ���� ���� ���� �� ������� ��������

������ � �������� ������� �� +��'(�, ��2������� ��� �� � ���

������� �� 7 �'( ��2������! 1��� ��� ��� ����� �� ������ �����

���� ������� ���� ��� ������� �� �� �� ��� ����� �$�����!

-<- ��������� ����������� �� �!

�� ������ ����� ��$�����! B��� �� �! &-333) ����

������ ��� ��$����� �� ������� �� 4��� �� ������! �����

����� �� ����� ��� ������� &� ��� �� ��� �� +��'(�,

��� �� ��� ����) ���� ��� ��$�� �� ������ ����� ���

���� &�! ����������� �� �!� ���������� ��)!

'������ ����� ��� �� ������� ��� ��� ��� ������ ���

���� �� � � ��� ���� ����� ���������� ���� �'( ����

�$������! ��� ������ ���� ������ ��������� ���

+�* �� ������� � � �������� ���� ���� �$������ ��

������ ����� ������! +�* � � �� ���� ���� ��

��������� ���� ����4� ����� ���� �� 4��� ��% &B���

�� �!� -333) �� ����4� &1� ���� �� "����� -333)!

��� +�* �� �� �� ��� ��� ������� � ������ �����

���� ��� �� �� ���� ���������� �$��������� � ��� ��

����� ��������!

+��������� ��� ��� ������������ ������� ��� ������

���������� �� ��� ����� �01+ ���� �� �� ������� ��

�$����� ��� ������������ �� ���� �$������! +��'(�, �

������� ��� �� ����� - �� / �� �'( �� +��'(�- �

������� ��� �� ��� ������ �������� ��� .����������������� �� ������ ����� &'����� ,)! ���� �#����� ������

����� ���� ���� �$������! 7��������� �� +��'(�, � ���

������������ �� �� � ������4�� �� ������� ��� �����

�� �01+ ���� 0��(50� �� ���������� �� +��'(�, � ���

��������� �� �� � ������4�� �� ������� ��� �����

�� �'( ������� ���� 6����� ��������! +������� ���

�01+ �� �� ����� ��� �� �������� #����4�� �� 0��(50�

�� ��������� ��� ����� �� ��� ��� ��� �'( �01+ �� ��

��� ��� ����� ����� �'( ������� � �������� ��������

�� +��'(�,! �� ����� ���� ���� ������������ ������� +��

�'(�, ��� �� ��������� ���� ���� �$������ �� ����

������ �������� �� ��� ����� �01+� ��� �� ��������

��! ���������� �� � ������ ��� ��� � +�* ��� � ����

��������� �� ��� �#����� ����� ��� ��� ����� �� ���

����� ���� ����� ����� ��� ������� �� ������� �� ���

�������� ��������� ��� �� �� �01+ �� ������ �����

������! ������ ��������� ������������ �� +�* � �

���� �������� �� 4��� �� &B��� �� �!� -333) �� �����

4� &1� ���� �� "����� -333)� �� �� ���� �� ����

&��� �� ���� �� ���������� ,CCC)!

*�� ����� ��������� ��� ��2������ �� +��'(�, � ,

�� ,3 �� ��� ������ ������� ��� ������� ��� ������ �� �'(

���� �$������ �� ������������� �����! + ��� �� ,3

�� ����� ��� ��������� �� �������� �� ���� ,3K �� ���

������� ����� � ��������� �� �� ��������! B�����

��� �� +��'(�, �� 7 �'( &-3 �� �� ����) ������� ��

�$������� ��� �� � � ���� ��� ,3 �� �� +�* ���� ��

���� &% 7��������� �� ������� �'( "$������ �� +��'(�, �� �������� "����� � 8 ���!

"����� ������ �'( �$������ &K)�

7�2����� ������� ���� ������ 6��

�+� C;!3 M <!3 /8!3 M .!@ ,,!3 M .!.

�+� P +��'(�, &,3 ��A������) 88!, M ,3!.� @!. M .!/� -.!. M ,-!C�

�+� P 7 �'( &,3 ��A������) C;!. M -!8 @<!- M ,8!; ,/!8 M ,8!3

�'���� ������� �� �+� � �������2����� ���� ���������� ��� ���� �� ������� �*!���� ����� �� ���� ��� M �" �� . ��������! ��� �� -3 ������ ���� ��� ��� ��� ��������! >�������� ��������� ������ ������ �� ������

������� ��������� ����4��� ���������� &5 N 3!3,)!

����� /% 7��������� �� �'( �$������ �� +��'(�, ������

�����������! '- ������ ���� �������� �� ����� ���������

����� �� ', �������� ��� �� ��� ��� ��� ������ &.3K ��

'- ���� �$������ �� �� �������� ������ �'()! ��� ������ ��

+��'(�, � �������2����� ���� ���������� ���! B����� �� �����

�� �������� ��� ��������� �� ������ ������ ����� �� ���

����� %���������� ������� ���! ���� ����� ������� ��� ��� ��

�� ��� ��� �� ����� �$������ � ����4����� ��������� ����

��� �� ��� ����2����� ������� &�A�) &( N 3!3,)! 6���� �����

��������� ��� ��� ��������� �� ������ ������ ����� �����

%��������� ���� ����4����� ��������� ���� ���� �� �A� &( N 3!3,)!

"�� ��� �������� ��� ��� ��������� �� ������ ������ �'(

�$������ M �" ��� � ��� 8 ��������! ����� ������ &�) � ,.!

���� G��������� �� 0����� ����� -<8

�� ��� ������ ���9 �!�!� �� �� ��� ����4� ���� ���������

���� �� ������ ����� ������ ���� ������ ��$�����! F����

��� &, �� . ��) ���� ����� �� �� ������� � �� ����4�

&1� ���� �� "����� -3339 �������� �� �!� -3339 ��

�� �!� -33,)� ������� ����� �� ����� ����� ��� &��� ���

����� �� ��� ������� ������ ��� 4�� ��� �� � ���� .33

�� �� ����4�� ����� �� � ����� C33 �� �� ������ �����)!

��� ��� �$��� ������� � ������������ �� � +�*

������� ������ �� ��� ����� �� ��� ��� ������!

�� �$���� ��� ����4���� �� +��'(�,� �� 4�� �$��

���� ��� ������ �� 7 �'( ����� � �������! ����� ����

���� 6����� �������� �� �� ��� ������������ �������

�� ���������� ��� �$������ �� �� �� - �������� ����

&��������� ������ ����� ���� ���� �� ������� ��!"

����� 0% "����� �� +��'(�, ��2������ ��

������� ��!" ���� �$������ ���� �� ��

��� ������ �� �������� ������� ����

8������� ������ &�����)! H �������

����� ��� ��� ��� ����� � �+L9 �+L�

����� ��2����� ���� �+L &.3 ��) ����9

�+LP+��'(�,� ����� ��2����� ���� �+L

&.3 ��) �� +��'(�, � ,3 ��! 1��� ���

+��'(�, ��� ��� ����� ��� ������ �� ��!"

���� �$������!

����� 1% 0��(50 ���� �� �'( ���� ����������� ���� �01+

�$������ �����*���2����� ������! ���� 01+ � �$������ ����

�������� �� 8������� ������! (50 ������� ������� ���� �'(

�>1+�����4� ������ �� ����! F�� �� �������� ������

�����9 ��� �+�� ������ ��2����� ���� .3 �� �� �+�9 ���

�+�P+��'(�,� ������ ����2����� ���� .3 �� �� �+� �� ,3 �� ��

+��'(�,9 ��� �+�P7 �'(� ������ ����2����� ���� .3 �� �� �+�

�� ,3 �� �� 7 �'(9 H ���� ����2����� ����������� ������9

��� 1� ����� � ������� ���� �������� ���� ����� �� �������

�>1+!

-<; ��������� ����������� �� �!

����) �� ������ ��� �� ���� ��2����� ���� +�* ���

������ ���� ��� �'( ����! ��� ����� �� ���� �$�����

���� ����� ��� 7 �'( ��� ��� ����4����� ���������

���� �'( ���� �$������ �� ��� ��� +�* ��������

���� ��� �'( ���� ��� ��� ��������� ����� ��� �$����

��� �� �������� ����! ��� +��'(�, ����4���� ������

���� �$������ �� ��� ����� ����!

��� ��� �� �� �������� � ����� +��'(�, � �������

� � ����� ���� 8 �� 83 ���! 7� ������ ����� ������� ���

��������� �������� &���) ����� � 8 ��� &������� ��

�!� ,CCC)! ���������� ��� ������ ���������� ���� +��'(�

, ����� �� ������ �� ��������� ���� ���� ���� �$�������

����� ��� ����� ���� ���! ��� +��'(�, ��������� ��

��������� ���� �$������ �� ��� ����� ���� ����� 83 ����

������� ��� ������ ���� ����� ��� ���� ���� �� � ,.

���! 0����� ����� ������ ��#���� ���� 8- �� �� ����

� ,3�5� ����� � ���� ������ ��� ��� ���� ��� �����

�$��������� 4� ��� ����4� �� ���� ��#����!

1� ���� �� "���� &-333) ����� ��� +�* �� �

������ �� ����4� ������ � ,3 ���� ��� �� ������ � �����

��� � ��� ����������! 7� 4��� ��� +�* ���� ��

����� ������ �� ����� ��� ������ ��� &B��� �� �!�

-333)! 7� ��� ���� ������ ����� ������ ���� ����� �

,3�5! ��� ��� ���������� ������ �� ������� ��� +�* ��

�������� ������ ��� ���� �� ��� ����! '������� ���

� ���� �������� ��� �� �� ����� �� ������ ����� ���

�� ��� ���� 4� ����� ��� ����4�! *�� ������

�������� ���� ���� �� ��� ��� ������� ����� ��� ���

������ ���� � +�* � ������� � �� ������ ��������� ��

��� ��� ����� �� ��� ������ ����������!

*�� ����� ��� ��� +�* � � ������ �� ����4�

���� ���������� ������� �������� ��� ���� �� �� ���

�� �$���� ���� �������� �� ������ ����� ������! *����

+�* ������#�� ��� �� � � ��������� �� 4� �������

�� #�������� ���� �� �� � �����! '�� �$����� ���

���� ���������� �� ���� ��� ��� ����� ���� �� �� ���

�� ���� ��� ���������� �� ���������! 7� �������� �� �����

�� ������ �� �� ���� ������ ��� ���� ����� � +�* ��

������� ���� �� ����� �� �� �� ����� ���� �� �����

���� ��� ���� ���������� ��� ������ 01+� �������

������ 01+� �� ��������!

�������������

6� ��������� ���������� >�! ��� G������� G����

H�� ������ ��� ��� ���� �� ��� �+� ��������!

������

> ��� �!5!� 5������ 1!5!� ������ �!+!� �� (������ 0! &-33,)! +

�� �� �� ���� �� ��� +������ ���� &6��-� �����) ������4��

�� �$����� �#����� ��! 7��� -<8?,-,=,83!

"����� �!5!� �� F���� :!>! &-33,)! ������� ���������� ��

����� �� ��������� ����! 7����� 83?/C=C8!

�������� H!� 5����� +!� �� �������� +! &,CCC)! +������

��������������� ���������� ����! � ��� 5����� ,/,?-.,=-.@!

B��� G!� ����� G!� ���� �!� 6��� !� G��� �!�

6����� � *���� G!� G������� �!� G����� 0!� ����� �!�

�� G����� �! &,CC/)! H������ �� ��� ���� ������

�������� �� ������� ���� ����� �'( �������� ���� ��

�������� ���� &1��8�� ��� ��)! ��� ��� 9�� 9���!����

@?,@8=;/3!

B���� :!� G������ �!� �� 6����� 5! &-333)! ��5����� ���

����� ��� ��� ������� �� ��� ���� 4��� �� ������? �� ��

������ ������! :�� 9�� ---?,-;=,8;!

7����� G!� ����� �!� +���� 1!� ��������� �!� 1���� "!�

����� �!� �� '�2��� �! &,CC,)! B���������� ��������� �� ����

���� ���� �$������ �� ������ �����! ; �� 6���� 7������

.@?,.,,=,.,@!

G���� �!� ���� �!� �� F(��� �"! &-333)! "$����� �#�����

�� ���� �� ������ �� ���� ���� ���� ������ ����� &1��

!�����!��� -����) �������� ���� ��������� ������������ ������

���! ��� 9���!���� -?;C8=;C/!

1� ����� +!� �� "����� �!5! &-333)! "������ � ������� ����

D���������E �� ����4�! ;�� 7���� -<?-,<=--3!

��������� F!�!� ������� 5!"!� �� 0����� >!6! &-33,)! '��������

���� �� ����4� �>1'! :�� 9�� -8,?;-3=;8.!

���������� :! &,CCC)! ���������� ������ ��������? ��� ��

��� � 01� B������������ �������� ����! 9�!�- 9� ��� <!��

,;/C?,;,=,./!

�������� �!� ������� �!� �� �������� �! &,CCC)! �����

%�������� ������� ������������� ���� �� �������� ��

���� �$������ �� �������� ������ �����! ��� 9���!����

,?;;/=;.@!

����� �!� ���� �!� ����� �!� *���� G!� 6����� !�

������� +!� G����� �! &,CC;)! +� ��4����� �$������ �����

��� �������� ���� �����������! ��� ��� 9�� 9���!����

8?,C-=,CC!

H����� � �!� 5���� :!� 0�������� 0� �������� �!� (������ (!�

+������� (!� �� ������� �! &-333)! �������� ������ �����

�$����� ��0B������� 01+ ����� ��� ������� �� ��0B

�������� �� +������ ����! � ��� 2�#�!���� -.?88@=8.3!

���� G��������� �� 0����� ����� -<.

O��� F!O!� ����� �!� 1� �� F!� �� '��� +! &,CCC)! +������

�������? �������� �� ��������� �� ����������! =--����

���� <C?-,@=--;!

��� �!� F��� 1!� �� F��� �! &-33,)! + ����4� �������������4�

���� 4���� ���� �� ������ ������� #�'> �� #�'+ �$������! :��

9�� -8,?,8/=,;/!

������� �! &-33,)! ���� ������ �� ��������? ��������� ��

#��������! 6����8������ ;C?,8@=,;-!

������� �!� *����� �!� �� ������ '! &,C/C)! (�� ������

�� �������� �� ������� �� ������������� ��� ������

��2������ ���� 4� ���! ; �� 6���� 7������ ..?8<C &�� :��

���)!

������� �!� *����� �!� �� ������ 0! &,CC,)! 7�����������

�� ��� �������� ���� ���� ������ �����! ; �� 6���� 7������

.@?/,C=/-;!

-<< ��������� ����������� �� �!