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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA

Thaysa Buss Carvalho

“Avaliação de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas”

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais

Orientador: Prof. Dr. Paulo Câmara Marques Pereira

Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Mattos dos Santos

Botucatu

2018

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Thaysa Buss Carvalho

“AVALIAÇÃO DE SNPS (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS) NAS DIFERENTES

FORMAS CLÍNICAS DA DOENÇA DE CHAGAS”

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais

Orientador: Prof. Dr. Paulo Câmara Marques Pereira

Coorientador:Prof. Dr. Rodrigo Mattos dos Santos

Botucatu

2018

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4

5

“Dedico esse trabalho à minha vó

Diva, a pessoa mais bondosa e incrível

que já passou por esse mundo. Sempre

será meu exemplo e minha maior

saudade.”

6

7

Agradeço à Deus por essa oportunidade, por me dar forças nos momentos em

que eu mais precisei, pelas conquistas, livramentos e por sempre me

direcionar nessa jornada. Obrigada Senhor por ser meu refúgio, por me trazer

paz e sempre ouvir minhas preces.

Aos meus pais Edson e Mila que sempre me apoiaram, me ensinaram a correr

atrás dos meus sonhos e que sempre me amaram incondicionalmente. Não há

palavras no mundo que consigam expressar o quanto sou grata por tudo que

fazem por mim, toda preocupação e amparo. Obrigada por todos os conselhos,

pelos puxões de orelha, por sempre me estenderem a mão sem pensar duas

vezes. Vocês são meu alicerce e meu ponto de partida. Amo muito vocês.

À minha vó Diva que partiu desse mundo mas deixou inúmeras lembranças. A

senhora sempre cuidou de mim, me protegeu, me deu broncas, conselhos, e

me deu o carinho e amor mais puro que eu poderia sentir. A senhora sempre

foi acima de tudo de maravilhoso que possa existir nesse mundo. Acima da

bondade, acima da transparência, acima da força de vontade, acima da fé,

acima de tudo que é mais sagrado. Sempre me incentivou a correr atrás dos

meus sonhos e sempre me ajudou para que isso fosse possível. Sempre será

minha inspiração de vida, sempre vai ser lembrada por mim e cada dia que

passar eu farei de tudo para que a senhora se orgulhe de mim aí de cima. Te

amo muito minha “vó de ouro”.

À minha irmã Gisele e meu irmão Júlio, por todo carinho, amor e momentos

compartilhados. Obrigada por todas as conversas, conselhos e risadas. Amo

muito vocês e sinto muito orgulho em ter vocês na minha vida.

Aos meus queridos sobrinhos Lucas e Luisa, que são a razão da minha vida e

o motivo da minha felicidade, sem ao menos terem noção do bem que me

fazem. É impossível descrever a imensidão do amor que sinto por vocês. A

vida é muito mais linda, colorida e cheia de luz com vocês por perto. Sou muito

sortuda por Deus ter me dado os presentinhos mais lindos desse mundo.

8

À minha tia Lucy e tia Iracema por todos os conselhos, ajuda e por sempre

estarem presente em todos os momentos da minha vida.

Ao meu namorado Felipe, por me apoiar nessa jornada, ser meu confidente,

companheiro e melhor amigo. Obrigada por sempre me dar forças para

continuar, por sempre escutar minhas angústias e por todo empenho para me

ajudar. Tenho muito orgulho de ter uma pessoa tão linda como você na minha

vida. Eu te amo muito!

À D. Ana Maria e Stefânia que são minha segunda família. Obrigada por todas

as conversas, desabafos e por vocês sempre estarem ao meu lado me

ajudando e me apoiando. Sou muito grata a Deus por Ele ter colocado vocês

em minha vida.

À irmã de coração Maria Julia, por ser minha amiga desde que me conheço por

gente (rs). Você é a pessoa com quem compartilhei minha vida, é quem me

conhece mais que eu mesma. Obrigada por saber ouvir, ser paciente, dar

conselhos e broncas, ser irmã, mãe e melhor amiga. Você é uma das pessoas

mais incríveis que já conheci. Você faz parte da minha família, da minha vida e

ocupa um espaço enorme no meu coração. Amo muito você “Zu”.

Aos meus entes queridos, que de alguma forma participaram dessa jornada

direta, ou indiretamente. Muito obrigada por tudo!

Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Câmara Marques Pereira por me receber tão

bem, desde o dia que fui à sua procura por estágio até o presente momento.

Obrigada por toda ajuda, paciência e momentos compartilhados nessa

jornada.

Ao meu coorientador Dr. Rodrigo Mattos dos Santos, por sempre se prontificar

em me ajudar, pela paciência e por sempre ter uma palavra amiga nos

momentos de desespero. Obrigada por acreditar em mim e pelos

ensinamentos que levarei para a vida toda.

9

À Profa. Dra. Sueli Aparecida Calvi, por toda atenção, ajuda, e por se mostrar

tão solicita desde o meu primeiro dia de estágio. A senhora deixou saudades.

À Profa. Dra. Cilmery Suemi Kurokawa, por todos os ensinamentos. Obrigada

pelos “puxões de orelha”, pelas palavras de apoio e pelas enormes

contribuições nesse trabalho.

À Profa. Dra. Ana Carla por se prontificar tanto a me ajudar nesse projeto,

desde o primeiro momento que nos conhecemos na seleção do mestrado.

Obrigada por todo apoio e todas as sugestões que contribuíram muito para o

crescimento desse trabalho.

À Profa. Dra. Izolete Aparecida Thomazini Santos que foi uma das grandes

responsáveis por me direcionar nessa área e por sempre dispor de seus

melhores conselhos nos momentos em que eu mais precisei. Obrigada por

todo o suporte, atenção e por se mostrar uma pessoa tão doce nesse mundo

tão turbulento.

À Dra Erika Pellison por toda ajuda, principalmente no Ambulatório e por ter

contribuído para o andamento desse projeto.

Às enfermeiras do Ambulatório de Doenças Tropicais, principalmente Angela

Zumba por toda ajuda nos momentos das coletas de sangue.

Ao Prof. Carlos Padovani pela disponibilidade, empenho e colaboração para

análise dos dados deste trabalho.

Às minhas queridas amigas Luciana, Luli e Taliane, pela linda amizade que

construímos ao longo desses 13 anos. Eu amo vocês de todo o meu coração e

sou muito grata por entender de fato o verdadeiro significado de amizade

convivendo com vocês. Obrigada por sempre terem me apoiado.

10

Ao meu querido amigo Pinguim por sempre caminharmos juntos nessa

jornada, pelas risadas, conversas, choros e acima de tudo, pelo

companheirismo. Obrigada por toda ajuda no desenvolvimento desse projeto e

por todos os momentos que vivenciamos.

À minha amiga Patricia Borim por sempre estar ao meu lado, ser uma pessoa

incrível e grandiosa. Obrigada por todos os momentos, por sempre me ouvir,

me dar conselhos e se preocupar comigo. Você é uma amiga maravilhosa que

faz muita falta no meu dia-a-dia. Amo muito você!

À minha amiga Francilene Capel, por ser essa menina tão doce e amiga.

Obrigada por sempre se prontificar em me ajudar, por me entender mais que

eu mesma e por ser tão bondosa e companheira. Não há como te descrever,

amiga! Compartilhamos muitos momentos, temos várias histórias e são

lembranças lindas que ficarão guardadas eternamente. Amo você minha

amiga, sinto muita saudade sua e da nossa convivência.

À minha querida Beatriz Pereira, pelas incontáveis risadas que

compartilhamos, pelas conversas e por fazer do mundo um lugar mais

divertido. Obrigada por sempre me mostrar o lado bom de viver. Tenho um

carinho muito grande por você.

À menina de ouro que eu tive o privilégio de conhecer: Lariza Maza. A

admiração que sinto por você é imensurável. Pessoa de bem, batalhadora e

que inspira a todos. Obrigada por toda ajuda e por simplesmente ser essa

pessoa tão incrível sempre.

À minha querida Mariana Gatto por sempre me ajudar e encontrar soluções

mesmo para os problemas mais complicados. Obrigada por sempre se dispor,

pelas palavras amigas, pelas conversas, risadas, atenção e carinho. Obrigada

por ser tão especial e companheira nessa jornada.

11

À querida Karen Ingrid Tasca por sempre compartilhar seus conhecimentos e

ser essa pessoa linda com o coração do tamanho do mundo. Sou grata a Deus

por ter conhecido uma pessoa como você, com uma energia tão boa. Obrigada

por todos os conselhos, ajuda e carinho.

Aos amigos de laboratório: Laura, Andréia, Vanessa, Jéssica, Nayore,

Guilherme, Mateus, Carol, Camila, Drica e Thaty pelas inúmeras conversas

entre um cafézinho e outro, pelas risadas, choros, desesperos e tantos

momentos compartilhados que ficarão guardados na memória.

Aos queridos amigos do curso de férias com quem tive o privilégio de

compartilhar momentos tão maravilhosos.

Aos funcionários da Unipex pela convivência e pelo carinho.

Meus agradecimentos a

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Faculdade

de Medicina de Botucatu

Seção de Pós-Graduação da FMB.

Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem

À Capes pela concessão de bolsa durante todo o período de realização do

mestrado

Aos pacientes chagásicos envolvidos nesse projeto que aceitaram, tão

humildemente, em participar desse trabalho.Foi incrível poder conhecer um

pouco de cada um e ouvir suas histórias nos intervalos da coleta. Sem vocês,

não seria possível chegar até aqui.

12

À banca do Exame Geral de qualificação, Profa Cilmery Suemi Kurokawa e

Profa Simone Baldini Lucheis pela disponibilidade e pelas valiosas

considerações.

Aos membros da banca, Profa Simone Baldini Lucheis e Profa Adriana Sierra

Assencio Almeida Barbosa pela disponibilidade e comprometimento em avaliar

esse trabalho

13

14

“Seja quem você for, seja qual posição social você tenha na vida, a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre como meta muita força, muita determinação e sempre faça tudo com muito amor e muita fé em Deus, que um dia você chega lá. De alguma maneira você chega lá.”

(Ayrton Senna)

15

16

A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi),

ainda é considerada como um problema de saúde pública em muitos países da

América Latina. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que entre

seis a sete milhões de pessoas no mundo estejam infectadas. Indivíduos na fase

crônica da doença podem ser classificados como assintomáticos ou sintomáticos

(estes, desenvolvendo as formas clínicas cardíaca, digestiva ou mista). Os

assintomáticos correspondem a 70% dos indivíduos nessa fase e, embora

apresentem sorologia positiva para anticorpos anti T-cruzi, não desenvolvem

manifestações clínicas da doença. O motivo pelo qual alguns pacientes permanecem

assintomáticos, e outros desenvolvem sintomas severos, ainda é desconhecido.

Fatores genéticos do hospedeiro são bastante relevantes e podem explicar a

heterogeneidade encontrada em pacientes que vivem com a doença em áreas

endêmicas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar SNPs (Single

Nucleotide Polymorphisms) no gene TNF-α (rs1800629) e ACAT-1 (rs1044925) em

indivíduos com DC crônica e verificar se os mesmos estão relacionados com a

susceptibilidade para manifestação de formas clínicas sintomáticas com uso da

técnica PCR-RFLP. Foram genotipadas 124 amostras para o gene TNF-α e 135 para

o gene ACAT-1. Foi observada associação significativa da presença do alelo A do

gene TNF- α em indivíduos sintomáticos em relação aos assintomáticos (p = 0,045).

Também houve associação significativa entre o alelo G (p = 0,008) e o genótipo GG

(p = 0,001) do gene TNF-α e os genótipos AA (p = 0,047) e AC (p = 0,016) do gene

ACAT-1 nos indivíduos assintomáticos em relação aos sintomáticos. Nossos

resultados sugerem que a presença do alelo A do gene TNF-α possa estar relacionada

com a presença de manifestações clínicas sintomáticas na fase crônica da doença e

o alelo G, bem como, genótipo GG possam estar associados com ausência de

sintomas clínicos em indivíduos nessa fase. A respeito do SNP do gene ACAT-1,

nossos dados sugerem efeito protetor dos genótipos AA e AC segundo apresentação

de sintomas da doença na fase crônica, o que representa dado inédito em chagásicos.

Palavras-chave: doença de Chagas, genotipagem, marcadores genéticos,

Trypanosoma cruzi

* SNPs: Single nucleotide polymorphisms (Polimorfismos de nucleotídeo único)

17

18

Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is still

considered a public health problem in many Latin America countries. According to the

World Health Organization, it is estimated that between six and seven million people

worldwide are infected. Disease’s chronic phase individuals may be classified as

asymptomatic or symptomatic (these, developing as clinical cardiac, digestive or mixed

forms). Asymptomatic individuals account for 70% of the patients at this stage and,

although they have positive serology for anti-T-cruzi antibodies, they do not develop

it’s clinical manifestations. The reason why some patients remain asymptomatic, and

others develop severe symptoms, is still unknown. Host’s genetic factors are quite

relevant and may explain the heterogeneity found in patients living with the disease in

endemic areas. The objective of this study was to evaluate SNPs in the TNF-α

(rs1800629) and ACAT-1 (rs1044925) genes in individuals with chronic CD and to

verify if the polymorphisms are related to the susceptibility to manifestation of

symptomatic clinical forms using the PCR-RFLP technique. Were genotyped 124

samples for the TNF-α gene and 135 for the ACAT-1 gene. Significant association for

the presence of the A allele of the TNF-α gene was observed for symptomatic

individuals in relation to the asymptomatic ones (p = 0.045). There was also a

significant association between the G allele (p = 0.008) and the GG genotype (p =

0.001) of the TNF-α gene and the AA (p = 0.047) and AC (p = 0.016) genotypes of the

ACAT-1 gene for asymptomatic patients. Our results suggests that the presence of the

TNF-α gene A allele may be related to the presence of symptomatic clinical

manifestations in the chronic phase of the disease and the G allele as well as the GG

genotype may be associated with absence of clinical symptoms in individuals at this

stage. Regarding the ACAT-1 gene SNP, our data suggests a protective effect of AA

and AC genotypes according to the to the presentation of chronic disease symptoms,

which is an unprecedented finding in chagasic patients.

Key words: Chagas disease, genotyping, genetic markers, Trypanosoma cruzi

* SNPs: Single nucleotide polymorphisms

19

Lista de abreviaturas

20

TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa

SNPs – Polimorfismos de Nucleotídeo Único

ACAT-1 – Acil-CoA-Colesterol aciltransferase 1

MHC – Complexo de histocompatibilidade

HLA-B – Complexo de histocompatibilidade classe I

HLA-DR – Complexo de histocompatibilidade classe II

LDL – Lipoproteína de baixa densidade

HDL – Lipoproteína de alta densidade

RCLB – Tampão de lise de células vermelhas

dNTPs – Desoxirribonucleotídeos Fosfatados

pb – Pares de bases

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

RFLP – Polimorfismos de Tamanhos de Fragmentos de Restrição

NcoI – Nocardia corallina

RsaI – Rhodopseudomonas sphaeroides

21

22

CAPÍTULO I .............................................................................................................. 24

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 25

OBJETIVOS ......................................................................................................... 36

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 38

CAPÍTULO II ............................................................................................................. 49

ARTIGO (enviado para publicação) ..................................................................... 50

ARTIGO (a ser submetido) ................................................................................... 77

CONCLUSÃO ......................................................................................................... 106

ANEXOS ................................................................................................................. 108

23

I

24

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Doença de Chagas

A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi

(T. cruzi) foi primeiramente descrita em 1909 pelo médico Carlos Chagas (1). Após

mais de 100 anos de sua descoberta, a doença ainda é considerada como um

problema de saúde pública em muitos países da América Latina (2-3). De acordo com

a Organização Mundial da Saúde, estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas no mundo

estejam infectadas (4), sendo que, apenas nos Estados Unidos, a doença atinge cerca

de 300.000 pessoas (5). No Brasil, estima-se que ocorram 6.000 mortes por ano (6,7)

e que 2 a 3 milhões de pessoas estejam infectadas (8,9).

O principal mecanismo de transmissão em áreas endêmicas é por meio do

vetor, o inseto triatomíneo, também chamado de barbeiro (10,11). No entanto, há

diversas formas de transmissão como: transfusão de sangue, transmissão vertical (da

mãe para o bebê), transplante de órgãos ou tecidos, acidentes laboratoriais e

transmissão oral, principalmente através do consumo de suco de cana-de-açúcar ou

açaí produzido artesanalmente(1).

Mais de 130 espécies do inseto são capazes de transmitir T. cruzi (12),

sendo que, 61 são encontradas no Brasil (13). No entanto, quanto a transmissão em

áreas endêmicas, poucas espécies dos gêneros Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus

destacam-se (12), principalmente as espécies Triatoma sordida, Rhodnius neglectus

e Panstrongylus megistus no Estado de São Paulo (14).

Após a inoculação do parasita, o período de incubação geralmente é de

uma a duas semanas e o indivíduo entra na fase aguda da doença (15). Nessa fase,

os indivíduos apresentam alta parasitemia (16) e sintomas pouco específicos como:

linfocitose atípica, mal-estar, febre, hepatoesplenomegalia (17) e, em casos mais

25

graves, geralmente relacionados com surtos de transmissão oral, pode-se manifestar

miocardite aguda e até levar o indivíduo a óbito (18,19). Embora sejam raras, algumas

manifestações da doença nessa fase são primordiais no auxílio do diagnóstico pois

apontam o local da inoculação. São eles o chagoma de inoculação que refere-se a um

nódulo e inchaço de pele, e edema exibido na pálpebra chamado sinal de Romaña

(1,17).

A fase aguda dura aproximadamente dois a quatro meses e dificilmente os

indivíduos são diagnosticados devido aos sintomas inespecíficos. Se não tratados,

evoluem para a fase crônica da doença que persiste por toda a vida (16,20-21). Devido

a resposta imune desencadeada na fase aguda, os níveis de parasitas circulantes são

reduzidos a níveis quase indetectáveis na fase crônica (22) da qual fazem parte os

assintomáticos (indeterminados) e àqueles com manifestações graves da doença

(16). Cerca de 70% dos indivíduos apresentam forma indeterminada (15), ou seja, não

apresentam sintomas da doença, nem anormalidades em exames físicos e

radiológicos de tórax, cólon e esôfago, embora apresentem sorologia positiva para

anticorpos anti-T. cruzi (23).

Indivíduos podem apresentar a forma clínica indeterminada por toda a vida

ou desenvolver formas mais severas da doença com acometimento de órgãos

específicos (24). Até o momento não é possível prever a evolução ou não desses

indivíduos indeterminados para formas clínicas da doença (25). No entanto, estima-

se que, por ano, de 2-5% dos indeterminados possam evoluir para formas

sintomáticas da doença (26,27) e que esses sintomas levam em torno de 10 a 30 anos

para se manifestarem a partir da fase aguda (28).

A forma digestiva da doença é desencadeada pela destruição de fibras

musculares e neurais do sistema digestivo e afeta aproximadamente 10% dos

26

indivíduos chagásicos (16,1,29) e que geralmente ocorre em países do cone sul da

América do Sul (30-32). As manifestações mais comuns são: perda de peso,

constipação, disfagia, refluxo esofágico, tosse, regurgitação, odinofagia, e dor

abdominal (28,30). Geralmente os órgãos mais acometidos em indivíduos com essa

forma da doença são o esôfago, cólon ou ambos (32,33).

A destruição do plexo mioentérico é responsável pela manifestação do

megaesôfago e megacólon que são ocasionadas por disfunções de motilidade e

dilatação de órgãos do trato gastrointestinal (34,24). Outras manifestações menos

comuns, mas características dessa forma clínica, são: megaíleo, megaduodeno e

megajejuno (35).

A forma mais grave da doença de Chagas crônica é a cardíaca (36) que

afeta em torno de 20% dos indivíduos (37). O desenvolvimento dessa forma clínica

abrange vários mecanismos relacionados com o dano tecidual pela persistência do

parasita, como: fibrose, autoimunidade e inflamação (38-40). Além disso, a forma

cardíaca da doença é uma das principais causas de miocardite infecciosa no mundo

(38) e é responsável pela manifestação de cardiomegalia ou aumento do tamanho do

coração, que pode ser ocasionado devido a distúrbios da inervação intrínseca (41).

Cerca de 30% dos infectados desenvolvem cardiomiopatia chagásica crônica (42), um

processo inflamatório resultante de miocardite difusa, fibrose e danos nas fibras

cardíacas (43) que pode elevar o risco de infarto nesses indivíduos (44).

Normalmente, os primeiros indicativos de alterações cardiovasculares são

devido a alterações do sistema de condução, principalmente bloqueio fascicular

anterior esquerdo e bloqueio do ramo direito, que são constatados em exames de

eletrocardiograma (45). A forma cardíaca é responsável por cerca de 21.000 mortes

27

a cada ano (12), sendo que, as causas mais frequentes são: morte súbita (60%),

insuficiência cardíaca refratária (25-30%) e tromboembolismo (10-15%) (46).

Estudos têm demonstrado que a taxa de desenvolvimento para cardiopatia

em chagásicos crônicos é de 1,4 a 5% por ano (47-49) e, nesse sentido, a busca por

marcadores moleculares indicativos de evolução clínica seria importante para a fase

crônica da doença.

Embora menos frequente, indivíduos também podem apresentar

manifestações das formas cardíaca e digestiva concomitantemente. São

denominados com forma mista, presente em 2-5% dos casos (34,1).

Com relação ao tratamento da doença, são utilizados o nifurtimox ou

benzonidazol sendo o último, considerado droga de escolha por ser mais eficaz e

apresentar menos efeitos colaterais (17), embora os dois medicamentos possam

ocasionar sintomas como: vômitos, neuropatia periférica, anorexia, entre outros (50).

Na fase aguda e congênita, o tratamento é eficaz em 80-90% dos casos. No entanto,

ao longo da doença, essa efetividade diminui para 8-37% em adultos (51-55,48). Os

pacientes com manifestações clínicas da doença de Chagas crônica geralmente

realizam acompanhamento médico para tratamento dos sintomas que apresentam,

pois, além da eficácia do medicamento não ser comprovada nessa fase da doença

(56), os efeitos colaterais são mais recorrentes em indivíduos de idade avançada (57).

Apesar do grande numero de estudos sobre a doença, o motivo pelo qual

alguns pacientes permanecem assintomáticos, e outros desenvolvem sintomas

severos ainda é desconhecido. Dutra et al (2009) reforçam a importância do ambiente,

parasita e genética para entender os diversos mecanismos que levam os indivíduos

chagásicos a responderem de maneiras diferentes frente a infecção (16). Nesse

sentido, os estudos são baseados em três fases: a importância do parasita no dano

28

tecidual; estudos que tem como alvo o sistema imune e foco genômico da interação

entre os dois genomas (do parasita e do genoma humano) (58). De acordo com este

último item, o tropismo tecidual poderia constituir processo influenciado por fatores

genéticos do parasita e do hospedeiro (59-61).

SNP’s (Single Nucleotide Polymorphisms)

Um aspecto importante a ser investigado na doença de Chagas são os

fatores genéticos do hospedeiro que são bastante informativos e podem explicar a

heterogeneidade encontrada em pacientes que vivem com a doença em áreas

endêmicas (62). Com a criação do Projeto Genoma Humano, em 1990, o objetivo foi

reunir informações sobre a sequência da maior porção do genoma humano, para obter

melhor entendimento da fisiologia e evolução humana (63). A partir de muitas

pesquisas e muito investimento acerca deste projeto, descobriu-se que cerca de

25.000 a 30.000 genes do genoma humano são codificadores de proteínas (64). Se

dois genomas humanos forem aleatoriamente comparados, será possível chegar à

conclusão que cerca de 99,9% de sua composição genética é idêntica (65). A

diferença de, aproximadamente 0,1% distribuídas pelo genoma, permite a diversidade

genética que distingue uma pessoa da outra (66).

Quase 90% da variação genética do genoma humano constituem os

denominados SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) (67). Estes compreendem a

uma mudança em um único nucleotídeo por outro em uma sequência de DNA (68) e

tem frequência de mais de 1% na população humana (69). Diferentemente das

mutações que são raras, os SNPs atualmente se tornaram marcadores de escolha em

análises genéticas populacionais por serem bastante comuns (70,71).

29

O genoma humano engloba mais de 3 milhões de SNPs que, quando

comparados entre dois cromossomos, apresentam uma ocorrência a cada 1000 –

2000 pares de bases (72,73). As substituições de nucleotídeos podem ser do tipo

transições, resultado da troca entre purinas (A/G) e pirimidinas (C/T) ou transversões

que são mais frequentes e ocasionam troca entre purinas e pirimidinas (A/C; A/T; G/C

e G/T) (74).

A maioria dos SNPs (~ 96%) se localizam em regiões não codificadoras de

proteínas. O restante são encontrados em regiões codificadoras (75,76), como os

éxons, e podem levar a troca da sequência do aminoácido (chamados de não-

sinônimos ou nsSNPs) ou não alterar essa sequência (chamados de sinônimos ou

sSNPs) (77).

Os nsSNPs podem não afetar diretamente a produção da proteína pois os

códons são capazes de especificar mais de um aminoácido (78,79). No entanto, em

alguns casos, podem promover alterações fenotípicas devido a mudanças na proteína

(80,81) e originar proteínas não-funcionais responsáveis pela manifestação de

algumas doenças (78). Já os SNPs do tipo sinônimo, apesar de serem denominados

“silenciosos”, podem levar ao desenvolvimento de algumas doenças por meio de

alguns mecanismos, como redução dos níveis de expressão de proteínas devido a

alterações na estrutura secundária do RNA mensageiro (RNAm) (81). Há também

SNPs que se localizam em regiões promotoras e podem influenciar na expressão do

gene (82).

Acredita-se que esses marcadores possam contribuir para a manifestação

de características particulares de cada indivíduo como cor dos olhos, estrutura do

cabelo e altura ou para a susceptibilidade a algumas doenças (83). Pesquisas que

30

envolvem SNPs são utilizadas no campo da farmacogenética, evolução, no

mapeamento de genes e em estudos de associação (71,84).

Os estudos genéticos que têm como objetivo analisar a predisposição de

indivíduos a doenças infecciosas e suas consequências patológicas (85-87), são

recentes e já foram investigados em doenças como: lepra (88), malária (89), dengue

(90) e HIV-1 (91-93). Esses estudos também têm se aplicado em pacientes com

doença de Chagas. Williams-Blangero et al (2011), em um estudo realizado no Estado

de Goiás, verificaram que fatores genéticos podem contribuir com mais da metade da

variação na suscetibilidade a infecção em indivíduos soropositivos para T. cruzi (94).

Um dos métodos descritos para a detecção aleatória de SNPs é o RFLP

(Restriction Fragment Leght Polymorphisms – Polimorfismos de Tamanho de

Fragmento de Restrição) que consiste no uso de enzimas de restrições que clivam

sítios específicos na sequência de DNA, permitindo identificação do genótipo. As

diferenças de tamanhos de fragmentos geradas, que podem ser verificadas por

eletroforese em gel de agarose, permite distinguir ou caracterizar a população de

estudo (95).

A busca por SNPs em genes que participem da resposta imune e

inflamatória, particularmente do gene TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) e de

desordens que possam representar risco para desenvolvimento de doenças

cardiovasculares, como o gene ACAT-1 (Acil-CoA colesterol aciltransferase 1) são

importantes e devem ser aplicados em estudos na doença de Chagas.

Gene TNF-α

TNF-α é uma citocina pró-inflamatória produzida principalmente por

macrófagos, monócitos e células T e B (96) que está envolvida em processos

31

moduladores de diversas doenças (97). Dentre suas inúmeras funções, destaca-se a

ativação e recrutamento de células do sistema imune para os locais da inflamação

(97,98), indução do reparo tecidual e defesa contra patógenos (99).

Com relação à doença de Chagas, estudos destacam a importância desta

citocina durante a fase aguda da doença para que haja controle da parasitemia (100-

102) e embora não se saiba exatamente seu papel na sua fase crônica, o TNF-α já foi

encontrado em cardiomiócitos de camundongos infectados por T. cruzi (103) e em

células de infiltrados inflamatórios de humanos com miocardite, sugerindo relação

entre essa citocina e o desenvolvimento da cardiopatia chagásica (104-106).

Em relação a forma digestiva da doença, Mendes et al (2017) não

encontraram níveis significativos de TNF-α no plasma de indivíduos com essa forma

clínica (107) e Crema et al (2006) encontraram baixos níveis da produção dessa

citocina em indivíduos com esofagopatia chagásica avançada (108).

O locus do gene codificador de TNF- α está no cromossomo 6p21.3

(109,110) dentro do complexo de histocompatibilidade (MHC) classe III (111) entre os

genes HLA-B e HLA-DR (112). Polimorfismos na região promotora deste gene são

apontados como determinantes no controle da produção de TNF-α (113,114) e na

progressão de algumas doenças inflamatórias e infecciosas (115-117). Um SNP

desse gene, localizado na região promotora, está na posição -308, no qual a adenina

é o alelo incomum (TNF2) e a guanina o alelo comum (TNF1) (118).

Alguns estudos têm investigado o papel desse polimorfismo em doenças

infecciosas. Homozigotos de TNF2 foram associados ao desenvolvimento de malária

cerebral em crianças, principalmente nos casos em que houve progressão para

sequelas neurológicas ou óbito (119). Na infecção causada pelo Mycobacterium

leprae, Sapkota et al (2010) observaram efeito protetor do polimorfismo TNF2 (120) e

32

Roy et al (1997) encontraram associação entre os genótipos GA e AA e o

desenvolvimento para a forma clínica mais severa da infecção (121). O TNF2 também

foi associado com a susceptibilidade para a forma clínica mucocutânea da

leishmaniose (122) e com o desenvolvimento da dengue hemorrágica (123).

Com relação à doença de Chagas, os trabalhos mostram dados

controversos. Em um estudo foi encontrado maior frequência do alelo TNF2 em

pacientes com a forma cardíaca, comparado àqueles com a forma indeterminada da

doença (124) e Drigo et al (2006) mostraram associação desse alelo com a redução

de sobrevida nos pacientes com cardiomiopatia chagásica crônica (125). Criado et al

(2012), observaram risco de desenvolvimento da cardiopatia chagásica em

colombianos carreadores do alelo A do gene TNF-α (126). No entanto, em outros dois

estudos conduzidos em populações diferentes, os autores não encontraram

associação entre TNF2 e susceptibilidade para forma cardíaca da doença (127,128).

Gene ACAT-1

O colesterol é uma importante molécula constituinte de membranas

celulares que está envolvida em diversos processos fisiológicos, tais como

manutenção da fluidez da membrana, metabolismo de ácidos biliares e hormônios

esteroides (129,130). Em humanos, o colesterol pode ser proveniente de vias

exógenas (dietas) ou endógenas (130), e o equilíbrio entre elas é fundamental para a

manutenção da homeostase (131). O excesso de colesterol livre pode ser prejudicial

para as células, portanto se faz necessário sua conversão em ésteres de colesterol

que se organizam em gotas de lipídios citoplasmáticos (132,133).

Uma enzima responsável pela esterificação intracelular do colesterol é a

Acetil-CoA – colesterol acetiltransferase (ACAT) encontrada no retículo

33

endoplasmático (132,134). Os genes que codificam essa proteína em mamíferos

apresentam duas isoformas: ACAT1 e ACAT2 (135) que possuem diferentes padrões

de expressão nos tecidos (136). O ACAT1 é expresso pela maioria dos tecidos (137)

e o ACAT2 é expresso principalmente em hepatócitos e intestinos (138). Acredita-se

que o ACAT1 desenvolva suas atividades catalíticas principalmente no fígado (137) e

que ACAT2 atue no fígado e intestino apenas de fetos (134).

O ACAT1 foi identificado e clonado em 1993 em células do ovário de

hamster chinês mutante (132). Embora tenha papel na regulação da homeostase do

colesterol, o ACAT1 pode contribuir com o desenvolvimento de aterosclerose (139).

Monócitos penetram na camada íntima da artéria e se transformam em macrófagos

residentes. Dentro das células, os macrófagos internalizam grande parte do colesterol

que é esterificado pela ACAT1 e adquirem a forma de macrófagos espumosos,

característica dos primeiros estágios de lesões ateroscleróticas (136,140).

Estudos têm demonstrado que polimorfismos genéticos podem ser

responsáveis por até 60% da variação de fenótipos lipídicos entre indivíduos (141-

143). Nesse sentido, tem sido investigado o papel de SNP na região rs1044925 (A/C)

do gene ACAT1 (1q25.2) em algumas desordens. Wu et al (2010) verificaram que em

uma população da China, os genótipos AC e CC de rs1044925 estiveram associados

com baixos níveis de colesterol total e LDL em mulheres, quando comparados com o

genótipo AA (144). Em outro estudo, os genótipos AC e CC foram associados com

aumento da pressão sistólica em fumantes (145). Os genótipos AC e CC do SNP

rs1044925 também foram associados com maiores níveis de colesterol total e HDL no

soro de homens com hipercolesterolemia (146).

Esses estudos demonstram o papel do SNP rs1044925 do gene ACAT-1 e

sua relação em algumas desordens envolvidas com o metabolismo lipídico e que

34

representam risco para doenças cardiovasculares. No entanto, nenhum estudo ainda

foi realizado com indivíduos com doença de Chagas com propósito de avaliar a

relação desse SNP com o desenvolvimento de manifestações clínicas da doença.

Grandes progressos foram alcançados na compreensão da doença de

Chagas desde sua descoberta em 1909. No entanto, ainda não se sabe o motivo pelo

qual, indivíduos na fase crônica podem apresentar acometimento de órgãos e outros

não.

Nesse sentido, o maior conhecimento sobre a composição genética do

hospedeiro pode contribuir para melhor entendimento da patogênese da doença.

Sendo assim, o presente estudo visa buscar marcadores moleculares no sentido de

contribuir para melhor acompanhamento clínico dos pacientes com doença de

Chagas.

35

36

Objetivo geral

Avaliar a associação de SNPs dos genes TNF-α (rs1800629) e ACAT-1

(rs1044925) em indivíduos com doença de Chagas crônica e verificar se os

marcadores estão relacionados com as manifestações clínicas sintomáticas da

doença.

Objetivos específicos

Avaliar dados clínicos, como: sexo, idade, naturalidade, procedência,

índice de massa corpórea (IMC) e presença de comorbidades dos pacientes

portadores da doença de Chagas.

37

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48

49

Avaliação do SNP rs1044925 do gene ACAT-1 e sua relação com as diferentes

formas clínicas da doença de Chagas crônica

Thaysa Buss Carvalho1, Carlos Roberto Padovani2, Luiz Roberto de Oliveira Júnior¹, Ana Carla Pereira Latini 1,3, Cilmery Suemi Korokawa 1,4, Rodrigo Mattos dos Santos1, Paulo Câmara Marques Pereira1

1 Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp

2 Departamento de Bioestatística do Instituto de Biociências de Botucatu, Unesp

3 Departamento de Biologia Molecular do Instituto Lauro de Souza Lima

4 Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp

Autor correspondente: Thaysa Buss Carvalho

Endereço: Laboratório de MI – UNIPEX – FMB UNESP; Rua Dr. Walter Mauricio Correa s/n

E-mail: thata_carv@hotmail.com

Periódico submetido: Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

50

Resumo

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, foi descoberta há

mais de um século. Indivíduos na fase crônica da doença podem apresentar forma

clínica assintomática ou sintomatologias relacionadas ao sistema cardíaco, digestivo

ou ambos (forma clínica mista). SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) têm sido

apontados como importantes marcadores em análises genéticas. Um deles, se

localiza no gene ACAT-1 (acetil-CoA – colesterol acetiltransferase 1) (rs1044925) e

têm sido relacionado com desordens lipídicas e risco para desenvolvimento da

aterosclerose. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a associação

entre o SNP rs1044925 do gene ACAT-1 em relação a presença de manifestações

clínicas sintomáticas em pacientes com doença de Chagas crônica.

Participaram do estudo 135 indivíduos com doença de Chagas crônica, sendo 86

(63,7%) indivíduos assintomáticos e 49 (36,3%) sintomáticos (22 com forma clínica

cardíaca, 18 com forma digestiva e 9 com forma mista). Para avaliação do

polimorfismo, foi empregada a técnica PCR-RFLP e visualização em gel de agarose.

Os resultados sugerem caráter protetor dos genótipos AA e AC do SNP rs1044925 (p

= 0,047 e p = 0,016, respectivamente) em relação à presença de manifestações

clínicas sintomáticas da doença nos indivíduos chagásicos crônicos.

Palavras-chave: Doença de Chagas – Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) –

ACAT-1 -

51

Introdução

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi ainda é endêmica

em muitos países (1). De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se

que oito milhões de pessoas no mundo estejam infectadas e que a infecção tenha se

expandido para regiões não-endêmicas (2) Nos Estados Unidos, por exemplo, cerca

de 300.000 pessoas estão infectadas (3). No Brasil, estima-se que entre duas e três

milhões de pessoas tenham adquirido a doença e 600.000 apresentem sintomas

referentes a fase crônica (4).

A doença possui duas fases clínicas: fase aguda e crônica. Na fase aguda, os

indivíduos apresentam alta parasitemia e sintomas inespecíficos como: mal-estar,

febre, hepatoesplenomegalia e linfocitose atípica (5). Após dois a quatro meses,

indivíduos entram na fase crônica da doença e podem apresentar forma clínica

assintomática ou sintomatologias relacionadas ao sistema cardíaco, digestivo ou

ambos (forma clínica mista) (6).

Cerca de 70% dos infectados apresentam forma clínica indeterminada (7) e não

possuem anormalidades em exames físicos e radiológicos nem apresentam sintomas

da doença (8).

A forma clínica cardíaca, que atinge aproximadamente 20% dos infectados,

corresponde à manifestação mais séria da doença e pode ocasionar nos indivíduos

arritmias, tromboembolismo e insuficiência cardíaca (9).

Já a forma clínica digestiva, envolve, principalmente, acometimento de esôfago e

cólon com consequente aparecimento de megaesôfago e megacólon. As

manifestações mais comuns dessa forma clínica são: acalasia leve, distúrbios de

motilidade, disfagia e regurgitação (5).

52

Uma pequena parcela de chagásicos crônicos (2-5%), apresentam manifestações

clínicas digestivas e cardíacas da doença e são denominados com forma mista ou

cardiodigestiva (10). Uma das questões mais intrigantes da fase crônica da doença é

o fato que leva indivíduos a apresentarem distintas manifestações clínicas. Até o

momento não se sabe o principal fator responsável por alguns indivíduos

desenvolverem sintomas da doença e outros não. Informações a respeito da

predisposição genética humana têm progredido muito nos últimos anos e a busca de

marcadores moleculares do hospedeiro constituem potenciais alvos para explicar a

susceptibilidade em algumas infecções (11).

Um tipo de marcador bastante utilizado em estudos genéticos compreende os SNPs

(Single Nucleotide Polymorphisms) ou Polimorfismos de nucleotídeo único, que

resultam em uma troca de um nucleotídeo por outro em uma sequência de DNA (12).

Estes representam cerca de 90% da variação do genoma humano (13) e possuem

frequência de mais de 1% na população humana (14).

Por serem bastante comuns, esses polimorfismos têm sido bastante investigados.

Alguns estudos já evidenciaram papel desses polimorfismos na susceptibilidade a

algumas doenças comuns como diabetes e câncer (15-17) e na progressão para

formas graves de doenças infecciosas como malária (18) e lepra (19).

O SNP rs1044925 (A/C) se localiza no gene ACAT-1 (colesterol aciltransferase 1) tem

sido bastante investigado em desordens lipídicas. Esse gene codifica uma enzima

ACAT-1 que é responsável pela esterificação do colesterol intracelular (20) e têm sido

relacionada com a formação de células espumosas em macrófagos, característica dos

primeiros estágios de lesões ateroscleróticas (21).

Com relação a esse polimorfismo, Wu et al (2010) verificaram que em uma população

da China, os genótipos AC e CC de rs1044925 estiveram associados com baixos

53

níveis de colesterol total e LDL em mulheres, quando comparados com o genótipo AA

(22). Em outro estudo, os genótipos AC e CC foram associados com aumento da

pressão sistólica em fumantes (23). Os genótipos AC e CC do SNP rs1044925

também foram associados com maiores níveis de colesterol total e HDL no soro de

homens com hipercolesterolemia (24).

Esses estudos demonstram o papel do SNP rs1044925 do gene ACAT-1 e sua relação

com algumas desordens lipídicas e que representam risco para doenças

cardiovasculares. Alguns estudos têm sugerido que haja interação entre T. cruzi e o

metabolismo lipídico do hospedeiro (25).

No entanto, até o momento, nenhum estudo investigou esse SNP em indivíduos com

doença de Chagas. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo avaliar o papel

do SNP rs1044925 do gene ACAT-1 em pacientes com e sem manifestações clínicas

sintomáticas da doença.

Materiais e métodos

Sujeitos do estudo

Foram avaliados 135 indivíduos atendidos no Ambulatório de Doenças Tropicais da

Faculdade de Medicina Botucatu (UNESP), interior do Estado de São Paulo, Brasil.

Botucatu se localiza entre -22° 51’ 08’’ de latitude e -48° 25’ 56’’ de longitude.

Os indivíduos incluídos eram de ambos os sexos e com idades variando de 36 a 83

anos, apresentando diferentes formas clínicas da doença de Chagas crônica. Para

confirmação do diagnóstico da doença de Chagas foi constatato positividade em

testes sorológicos para T. cruzi pelas técnicas de Quimioluminescência,

Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Hemaglutinação indireta (HAI).

54

Indivíduos com forma clínica indeterminada foram classificados pela ausência de

sintomatologias da doença e resultados normais em exames de eletrocardiograma

convencional, estudo radiológico de tórax, esôfago e cólon.

Indivíduos com forma clínica cardíaca foram classificados por meio de alterações em

exames de eletrocardiograma (principalmente alterações inespecíficas da

repolarização ventricular acompanhadas, sobrecarga de átrio esquerdo, de intervalo

QTc prolongado, baixa voltagem dos complexos QRS, fibrilação atrial, bloqueios

atrioventriculares, bloqueios de ramo e taquicardia sinusal) (26). Também foram

verificadas presença de alterações em exames de ecocardiograma, tais como:

trombos intracavitários, derrame pericárdio, aumento das dimensões das câmaras

cardíacas, regurgitação valvar atrioventricular e comprometimento da função sistólica

ventricular esquerda (27).

A classificação da forma digestiva da doença envolve principalmente, alterações no

esôfago e cólon. Foram avaliados os resultados de exames de: radiografia simples de

tórax em PA ou perfil (para verificar presença de megaesôfago), radiografia

contrastada do esôfago, radiografia simples de abdomen e radiografia contrastada do

cólon - enema opaco (27).

Indivíduos com forma mista da doença, foram classificados devido a presença de

alterações da forma clínica cardíaca e digestiva da doença, concomitantemente.

Os sujeitos do estudo foram divididos em dois grupos: grupo 1 constituído de

indivíduos chagásicos crônicos com forma assintomática da doença de Chagas e

grupo 2 constituído de indivíduos chagásicos crônicos sintomáticos com formas

clínicas cardíaca, digestiva e mista da doença.

Os resultados dos exames foram verificados pela consulta do prontuário clínico dos

pacientes e, a partir desse, foram coletados dados clínicos dos indivíduos, como:

55

naturalidade, procedência, idade, peso e altura (para cálculo do índice de massa

corpórea) e comorbidades, para caracterização da amostra

Critérios de exclusão

Deste estudo foram excluídas as gestantes

Comitê de Ética

Todos os indivíduos aceitaram participar do estudo mediante assinatura do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) aplicado no momento da consulta. O

estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de

Botucatu - UNESP (CEP – Parecer nº 1.576.662).

Cálculo do IMC (Índice de Massa Corpórea)

Em relação aos dados antropométricos, foi considerado o peso em quilogramas (kg)

e a altura em centímetros (cm). Foi utilizada a seguinte fórmula para cálculo do IMC:

Peso / Altura x Altura

A classificação para adultos (de 20 a 59 anos) foi aplicada mediante os seguintes

valores: < 18,5 foram classificados com baixo peso; ≥ 18,5 e < 25 eutrofia; ≥ 25 e < 30

com sobrepeso e ≥ 30 foram classificados como obesos. Para idosos ( > 60 anos) a

classificação dos valores foi: ≤ 22 àqueles com baixo peso, > 22 e < 27 eutrofia e ≥ 27

sobrepeso (28).

Coleta de sangue e isolamento de leucócitos

Foram coletados 5 mL de sangue periférico dos sujeitos de estudo e após

centrifugação de 15 minutos a 15000 rpm foi realizada a separação da papa

56

leucocitária. Nesta porção do sangue foi adicionado 1mL de tampão de lise de células

vermelhas - RCLB (pH: 7,6 1X: 10mM de Tris; 5mM de MgCl2 e 10mM de NaCl) e

realizada a centrifugação a 15000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado

e o pellet armazenado em temperatura -20ºC.

Extração de DNA

A extração de DNA foi realizada com o Kit PureLink® Genomic DNA Mini Kits K182001

(Invitrogen, Carlsbad, USA) de acordo com as recomendações do fabricante e o DNA

foi quantificado em aparelho espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare, Little

Chalfont, Buckinghamshire, UK).

Reação da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

Foram utilizados os primers forward 5’-TATATTAAGGGGATCAGAAGT-3’e reverse

5’-CCACCTAAAAACATACTACC- 3’ para o gene ACAT-1.

A PCR foi realizada em volume final de 25 µL, contendo 2,5µL de DNA genômico, 10

pmol de cada primer, 1,0 unidade de Taq polymerase e 1,0 mM de MgCl2, 500 uM de

dNTPs. A ciclagem foi realizada segundo Wu et al (2010) (22) com algumas

modificações. Denaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, 35 ciclos com denaturação a

95ºC por 45 segundos, anelamento a 55ºC por 1 minuto, extensão a 72ºC por 50

segundos e ciclo final a 72ºC por 10 minutos. A verificação do produto amplificado foi

realizada em gel de agarose a 2% para observação do fragmento de 389 pb.

Digestão com enzima de restrição (RFLP)

Para análise do SNP do gene ACAT-1 (rs1044925) foi utilizado 10 µL do produto da

PCR amplificado e 0,5 µL da enzima de restrição RsaI – Rhodopseudomonas

sphaeroides (New England BioLabs, Boston, MA, USA – R0167S) para a digestão a

57

37ºC overnight. O resultado das amostras digeridas foi checado em gel de agarose a

2% e foram visualizados em transiluminador ultravioleta. O tamanho das bandas

referente a cada genótipo são: AA – 389 pb, AC – 389, 279 e 110 pb e CC – 279 e

110 pb (Tabela 1).

Análise estatística

Para análise da faixa etária dos participantes foi realizado a média e desvio padrão e

Teste t de Student para amostras independentes (29). A comparação entre os dados

gerais dos pacientes, genótipos e frequências alélicas foi realizada através do teste

de associação de Goodman complementado com as comparações múltiplas entre e

dentro de populações multinomiais (30,31) considerando o nível de 5% de

significância. As frequências alélicas foram testadas para Equilíbrio de Hardy-

Weinberg.

Resultados

Caracterização da amostra

Os 135 pacientes chagásicos, eram provenientes, principalmente, do interior do

Estado de São Paulo (SP), Brasil. Apenas dois indivíduos eram procedentes de

Siqueira Campos, Paraná. Os pacientes foram agrupados por microrregiões do

Estado de São Paulo, exceto dois indivíduos mencionados anteriormente, do Estado

do Paraná. As microrregiões em destaque, correspondem às procedências dos

pacientes, principalmente: Itapeva (45), Botucatu (33), Avaré (31) e Ourinhos (13)

(Figura 1). Todos os indivíduos são brasileiros e naturais de cidades dos Estados de

São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Bahia, Alagoas e Mato Grosso.

58

Dentre eles, 18 pacientes eram naturais de Itaporanga (SP), 14 de Itaí (SP) e 9 de

Taquarituba (SP) (Figura 2).

Dos 135 pacientes chagásicos incluídos no estudo, 86 (63,7%) eram assintomáticos

e 49 (36,3%) sintomáticos. No grupo de indivíduos sintomáticos, 22 (44,9%)

apresentavam forma cardíaca da doença, 18 (36,7%) indivíduos apresentavam forma

digestiva e nove (18,4%) indivíduos tinham forma mista da doença.

Entre os pacientes assintomáticos, faziam parte 46 (53,5%) homens e 40 (46,5%)

mulheres e no grupo dos sintomáticos, 23 (46,9%) homens e 26 (53,1%) mulheres. A

média de idade no grupo de indivíduos assintomáticos foi de 59,0±8,0 anos (média ±

desvio padrão) e no grupo dos sintomáticos, de 61,5±9,1 anos. Não houve diferença

significativa em relação a distribuição do sexo e média de idade entre os grupos (p >

0,05).

Em relação ao índice de massa corpórea, apresentavam sobrepeso 48,8% dos

indivíduos assintomáticos e 36,7% dos indivíduos sintomáticos.

Dos 135 pacientes incluídos em nosso estudo, 98 (72,6%) apresentavam presença de

comorbidades como: hipertensão, hipercolesterolemia, diabetes ou associação entre

elas. Entre os indivíduos assintomáticos, 57 (58,2%) apresentavam comorbidades.

Apresentavam hipercolesterolemia 15 pacientes (26,3%) e 24 (42,1%) associação de

mais de uma comorbidade. Entre os sintomáticos, 41 (41,8%) indivíduos

apresentavam comorbidades. Destes, 11 (26,9%) eram hipertensos e 24 (58,5%)

apresentavam associação de comorbidades (Tabela 2). Não houve diferença

significativa quando comparado todas as variáveis “IMC” e “comorbidades” entre os

grupos (p > 0,05).

Genotipagem do SNP rs1044925 do gene ACAT-1

59

Para os genótipos do SNP rs1044925 as amostras se apresentaram em Equilíbrio de

Hardy-Weinberg.

Com relação aos resultados do polimorfismo do gene ACAT-1 entre os grupos, houve

maior frequência dos genótipos AA e AC nos indivíduos assintomáticos quando

comparados com sintomáticos (p = 0,047 e p = 0,016). Não houve diferença

significativa entre o genótipo CC quando comparado entre os dois grupos (p > 0,05).

Também não houve diferença significativa entre os genótipos AA, AC e CC quando

comparados dentro dos grupos estudados (p > 0,05) (entre indivíduos assintomáticos

e entre indivíduos sintomáticos) (Tabela 3).

Com relação às frequências alélicas, não houve diferença significativa entre os alelos

A e C quando comparados entre e dentro dos grupos de indivíduos assintomáticos e

sintomáticos (p > 0,05) (Tabela 4). Os resultados foram mostrados como genótipos

AA, AC e CC em foto do gel de agarose (Figura 3).

Discussão

A doença de Chagas ainda gera debate, principalmente, em relação às diferentes

manifestações clínicas que indivíduos chagásicos exibem na fase crônica. Acredita-

se que fatores como ambiente, parasita e fatores genéticos do hospedeiro possam

contribuir para a gravidade da doença (32).

No presente estudo, os chagásicos crônicos eram provenientes, principalmente de

microrregiões do Estado de São Paulo como: Itapeva. Botucatu, Avaré e Ourinhos

(Figura 1). Esses indivíduos são naturais de vários Estados do Brasil, principalmente,

cidades do interior do Estado de São Paulo como: Itaporanga, Itaí e Taquarituba

(Figura 2). Essas regiões correspondem ao fluxo de atendimento do Ambulatório de

60

Doenças Tropicais em Botucatu e estão inseridas em uma área endêmica para a

doença de Chagas.

A média de idade no grupo de indivíduos assintomáticos foi de 59 anos e no grupo

dos sintomáticos, de 61,5 anos, não havendo diferença significativa entre os grupos.

A média de idade avançada dos pacientes chagásicos crônicos sugere papel da

eficácia dos programas de controle vetor da doença de Chagas no país, que iniciou

em meados dos anos 50 (33). No entanto, esse fator não descarta a ocorrência de

vetores contaminados pelo T. cruzi, uma vez que essas campanhas foram destinadas

principalmente ao combate do vetor Triatoma infestans (34-36). No Estado de São

Paulo há presença de outras espécies secundárias de triatomíneos com potencial de

infectividade como Panstrongylus megistus e Triatoma sordida (37).

Além disso, à medida em que indivíduos envelhecem, há maior susceptibilidade ao

aparecimento de comorbidades, independente da infecção pela doença de Chagas

(38). No presente estudo, 66,3% dos chagásicos assintomáticos apresentavam

alguma comorbidade associada à infecção e o mesmo foi observado em 83,7% dos

chagásicos sintomáticos. Do total de 135 chagásicos, 24 (58,5%) sintomáticos e 24

(42,1%) assintomáticos apresentaram associação de mais de uma comorbidade, além

da infecção pelo T. cruzi. Acredita-se que cerca de 88% da população mundial com

idade igual ou superior a 65 anos apresente pelo menos uma desordem crônica (39).

Indivíduos que apresentam mais de uma comorbidade são mais propensos a inaptidão

física e maior ocorrência de interações adversas medicamentosas devido a

polifarmácia (39).

No grupo de indivíduos assintomáticos, 21,1% apresentavam hipertensão e 26,3%

hipercolesterolemia. Já no grupo de indivíduos sintomáticos, 26,9% eram hipertensos

e 12,2% apresentavam hipercolesterolemia. Em um estudo conduzido por Vicco et al

61

(2014) foi encontrada maior frequência de hipertensão em indivíduos com doença de

Chagas (34%) quando comparado com indivíduos sem a infecção (13%) (40). A

hipertensão também foi associada com insuficiência cardíaca em chagásicos (40). Em

outro estudo foi verificado que, de 878 chagásicos, 37% apresentavam hipertensão

arterial, principalmente indivíduos com comprometimento cardíaco e com idade > 45

anos (41). Gurgel & Almeida (2007) através de análises de prontuários de indivíduos

submetidos a necropsia, verificaram que, de 101 indivíduos chagásicos, 33 (32,7%)

eram hipertensos (42).

No presente estudo, 17% dos chagásicos (independente da presença/ausência de

sintomas clínicos) apresentavam hipertensão. Essa parcela é inferior quando

comparado aos estudos citados anteriormente, o que pode ser justificado pelo fato

dessa desordem ser influenciada por vários fatores como: obesidade, alcoolismo,

sexo, idade, entre outros (42). Além do mais, a prevalência da hipertensão pode variar

entre populações, embora ainda não se saiba exatamente os fatores que influenciam

essas discrepâncias (43).

No entanto, observamos que esse dado é semelhante quando comparado à

população geral no país no qual estima-se que seja de 20% indivíduos hipertensos

(44).

Com relação a diabetes, foi encontrada em 5,2% de 135 chagásicos do presente

estudo. Santos et al (1999) observaram que entre 362 mulheres chagásicas, houve

prevalência de 10,5% de diabetes mellitus (45).

As comorbidades encontradas nos pacientes do presente estudo (hipertensão,

hipercolesterolemia e diabetes) são consideradas fatores de risco para

desenvolvimento de condições cardíacas como infarto (46) e aterosclerose (47). Além

62

dos distúrbios ocasionados pela cardiopatia chagásica crônica, essa forma clínica

pode elevar o risco de infarto nesses indivíduos (Malik et al, 2015).

No entanto, não se sabe ao certo o impacto dessas morbidades na progressão da

doença. As desordens crônicas de indivíduos de idade avançada, a infecção

chagásica crônica e suas formas clínicas graves ressaltam a importância de uma

atenção especial nesses pacientes.

Outra informação levantada no presente estudo é a respeito do IMC. Embora não

tenha sido encontrada diferença significativa entre o IMC e os grupos estudados, foi

observada prevalência de 32,6% de chagásicos com eutrofia, 44,4% com sobrepeso,

e 17,8% com obesidade no grupo de indivíduos assintomáticos e sintomáticos. Geraix

et al (2007) encontraram prevalência 62,1% obesos em chagásicos (49).

De acordo com o Ministério da Saúde, estima-se que haja 60% de obesos no país

(50). O IMC de indivíduos pode variar de acordo com a população de estudo, pois

envolvem fatores ambientais, psicossociais e fisiológicos (51). Assim como as

morbidades mencionadas anteriormente, o sobrepeso e obesidade são consideradas

fatores de risco para desenvolvimento de doenças cardiovasculares bem como,

aumento da pressão arterial, colesterol e glicose (52,53).

No presente estudo, foi observado diferença significativa entre os genótipos AA e AC

do SNP rs1044925 do gene ACAT-1 entre os indivíduos chagásicos assintomáticos

em relação aos sintomáticos. Esse dado sugere caráter protetor na patogênese da

doença entre os carreadores desses genótipos.

Nesse sentido, um estudo realizado com uma população da China, os genótipos AC

e CC de rs1044925 estiveram associados com baixos níveis de colesterol total e LDL

em mulheres, quando comparados com o genótipo AA (22). Os genótipos AC e CC

também foram associados com aumento da pressão sistólica em fumantes (23). Em

63

outro estudo os genótipos AC e CC do SNP rs1044925 foram associados com maiores

níveis de colesterol total e HDL no soro de homens com hipercolesterolemia (24).

No presente estudo, foi observado 14,9% de chagásicos com hipercolesterolemia em

ambos os grupos. Na literatura foi encontrado 22,7% de hipercolesterolemia entre 66

chagásicos crônicos estudados (49).

O colesterol é uma importante molécula constituinte de membranas celulares que está

envolvida em diversos processos fisiológicos, tais como manutenção da fluidez da

membrana, metabolismo de ácidos biliares e hormônios esteroides (54,55). O excesso

de colesterol livre pode ser prejudicial para as células, portanto se faz necessário sua

conversão em ésteres de colesterol que se organizam em gotas de lipídios

citoplasmáticos (56,57). Sabe-se que essas gotas de lipídios estão envolvidas em

diversos processos inflamatórios (58,59).

Estudos recentes têm avaliado o papel do metabolismo lipídico do hospedeiro na

infecção por T. cruzi (25). Johndrow et al (2014) encontraram aumento dos níveis de

colesterol intracelular em tecidos de coração de um indivíduo de estágio final da forma

cardíaca da doença de Chagas, fato que não foi observado em tecido do coração de

um indivíduo que faleceu devido a cardiopatia isquêmica (60). Também encontraram

aumento de LDL no pâncreas e coração de animais infectados com uma cepa crônica

do T. cruzi 90 dias pós infecção (60). Fernandes et al (2007) também verificaram que

a depleção do colesterol em células infectadas por formas infectantes

(tripomastigotas) e não-infectantes (amastigotas) do T. cruzi in vitro resultou em

diminuição da invasão desses parasitas, que foi recuperada após a repleção de

colesterol celular (61).

Por outro lado, Nagajyothi et al (2014) observaram que camundongos infectados pelo

T cruzi (cepa de fase aguda) e submetidos a uma dieta rica em gordura apresentaram

64

diminuição da parasitemia e aumento da taxa de sobrevida em comparação com

camundongos com dieta regular de gordura. Também foi observado que as alterações

morfológicas do coração de camundongos submetidos a dieta rica e gordura foram

menos acentuadas em comparação com os animais que mantiveram uma dieta

regular de gordura (62).

Esses estudos sugerem envolvimento do colesterol na infecção por T. cruzi. No

entanto, grande parte dos trabalhos realizados remetem à fase aguda da infecção e

observa-se divergências a respeito do papel do colesterol na patogênese da doença

de Chagas.

Conclusão

No presente trabalho, encontramos maior frequência entre os genótipos AA e AC em

indivíduos chagásicos assintomáticos quando comparado com sintomáticos. Tal

resultado sugere que os carreadores dos referidos genótipos apresentem caráter

protetor em relação à presença de manifestações clínicas sintomáticas da doença na

fase crônica.

Este dado é inédito e pode trazer grandes contribuições para melhor entendimento da

patogênese da doença e acompanhamento clínico dos pacientes.

Mais estudos deverão ser realizados no intuito de avaliar a importância do

metabolismo lipídico na infecção e para que haja melhor esclarecimento do papel

funcional dos SNPs nas manifestações clínicas de indivíduos chagásicos em diversas

populações.

65

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69

Tabela 1 - Relação dos genes e as respectivas enzimas de restrição utilizadas, sítio de corte da enzima e genótipos pesquisados em indivíduos com doença de Chagas crônica sintomática e assintomática

Gene/ SNP Enzima de restrição

Sítio de corte da enzima Genótipos

ACAT-1 (rs1044925)

RsaI 5’...GT↓AC...3’ 3'...CA↑TG...5'

AA – 389 pb; AC - 389, 279 e 110 pb; CC - 279 e 110 pb

70

Figura 1. Procedência dos pacientes chagásicos crônicos agrupados por microrregiões do Estado de São Paulo, Brasil, genotipados para gene ACAT-1* *Exceto dois pacientes provenientes de Siqueira Campos, Paraná, Brasil

71

72

Tabela 2. Distribuição do sexo, média de idade e desvio padrão, índice de massa corpórea e comorbidades de 135 pacientes chagásicos crônicos subdivididos por forma clínica assintomática e sintomática, procedentes de diferentes municípios do Brasil

Formas clínicas (n = 135)

Assintomática

(n = 86) Sintomática

(n = 49) Valor - p

Sexo n (%)

Masculino 46 (53,5) 23 (46,9) p > 0,05 Feminino 40 (46,5) 26 (53,1) p > 0,05

Total n (%) 86 (100) 49 (100)

Média de idade e desvio padrão 59,0±8,0 anos 61,5±9,1 anos p > 0,05

Índice de massa corpórea

n (%) Baixo peso 3 (3,5) 4 (8,2) p > 0,05

Eutrofia 27 (31,4) 17 (34,7) p > 0,05 Sobrepeso 42 (48,8) 18 (36,7) p > 0,05 Obesidade 14 (16,3) 10 (20,4) p > 0,05

Total n (%) 86 (100) 49 (100)

Presença de comorbidades

n (%) Hipertensão 12 (21,1) 11 (26,9) p > 0,05

Hipercolesterolemia 15 (26,3) 5 (12,2) p > 0,05 Diabetes 6 (10,5) 1 (2,4) p > 0,05

Comorbidades associadas

24 (42,1) 24 (58,5) p > 0,05

Total 57 (58,2) 41 (41,8) Teste de associação de Goodman considerando o nível de significância de 5%. Valor de p: comparação de categorias de resposta (colunas) dentro do grupo (linhas). Teste t de Student foi aplicado para amostras independentes

73

Tabela 3. Distribuição dos genótipos de ACAT-1 segundo pacientes assintomáticos e sintomáticos com doença de Chagas crônica, procedentes de diferentes municípios do Brasil

Genótipos ACAT-1

Formas clínicas n (%)

Assintomáticos Sintomáticos Total

AA 34 (63,0) Ba 20 (37,0) Aa 54 (40,0)

AC 43 (66,2) Ba 22 (33,8) Aa 65 (48,1)

CC 9 (56,3)Aa 7 (43,7) Aa 16 (11,9) TOTAL 86 (63,7) 49 (36,3) 135 (100)

Teste de associação de Goodman considerando o nível de significância de 5%. Letras maiúsculas: comparação de categorias de resposta (colunas) dentro do grupo (linhas), sendo B > A e AB não difere de A e B. Letras minúsculas: comparação de grupos (linhas) fixada a categoria de resposta (coluna), sendo b > a e ab não difere de a e b

74

Tabela 4. Distribuição das frequências alélicas do gene ACAT-1 segundo pacientes assintomáticos e sintomáticos com doença de Chagas crônica, procedentes de diferentes municípios do Brasil

Genótipos ACAT-1 Formas clínicas

n (%)

Assintomáticos Sintomáticos

A 97 (56,1) Aa 76 (43,9) Aa

C 55 (56,7) Aa 42 (43,3) Aa

TOTAL 152 118 Tabela 4. Teste de associação de Goodman considerando o nível de significância de 5%. Letras maiúsculas: comparação de categorias de resposta (colunas) dentro do grupo (linhas), sendo B >A e AB não difere de A e B. Letras minúsculas: comparação de grupos (linhas) fixada a categoria de resposta (coluna), sendo b > a e ab não difere de a e b

75

76

Avaliação do SNP -308A (A/G) do gene TNF-α e sua relação com as diferentes

formas clínicas da doença de Chagas crônica

Thaysa Buss Carvalho1*, Carlos Roberto Padovani2, Luiz Roberto de Oliveira Júnior¹, Ana Carla Pereira Latini 1,3, Cilmery Suemi Korokawa 1,4, Paulo Câmara Marques Pereira1, Rodrigo Mattos dos Santos1

1 Departament of Tropical Diseases and Imaging Diagnosis, Botucatu Medical School, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil.

2 Departament of Biostatistics, Botucatu Biosciences Institute São Paulo State University (UNESP - Univ Estadual Paulista)

3 Departament of Molecular Biology, Lauro de Souza Lima Institute, Bauru, São Paulo, Brazil.

4 Departament of Pediatrics, Botucatu Medical School, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil.

*Author for correspondence

Email: thata_carv@hotmail.com

Periódico a ser submetido: PLOS Neglected Tropical Diseases

77

Resumo

A doença de Chagas ainda constitui um problema de saúde pública, principalmente

em alguns países das Américas. Indivíduos na fase crônica da doença podem

apresentar ausência de sintomas ou desenvolver formas clínicas sintomáticas como:

cardíaca, digestiva ou mista (cardíaca e digestiva). O motivo pelo qual alguns

indivíduos na fase crônica da doença permanecem assintomáticos, e outros

desenvolvem sintomas severos, ainda é desconhecido. Diante disso, através da

técnica PCR-RFLP foi investigada associação entre o SNP -308A (G/A) (rs1800629)

do gene TNF-α e a manifestação para formas clínicas sintomáticas em individuos com

doença de Chagas crônica. De 124 indivíduos, 79 (63,7%) eram assintomáticos e 45

(36,3%) sintomáticos, sendo que, nesse último grupo, faziam parte: 21 (46,7%)

indivíduos com forma clínica cardíaca, 16 (35,5%) com forma clínica digestiva e 8

(17,8%) com forma clínica mista da doença. Foi encontrada diferença significativa

entre a presença do alelo A no grupo dos indivíduos sintomáticos quando comparado

com os assintomáticos (p = 0,045). Também houve diferença significativa entre os

grupos e maior frequência entre o genótipo GG e alelo G nos indivíduos

assintomáticos quando comparado com os sintomáticos (p = 0,001 e p = 0,008,

respectivamente). Os dados sugerem que o alelo A do gene TNF- α (SNP -308A/G)

possa estar relacionado com a manifestação das formas clínicas sintomáticas na

doença de Chagas crônica e o alelo G e genótipo GG desse SNP, com efeito protetor

quanto a presença de sintomas clínicos na fase crônica da doença.

78

Resumo do autor

Após mais de uma década da descoberta da doença de Chagas, alguns aspectos a

respeito da patogênese da doença ainda não são muito bem compreendidos.

Indivíduos na fase crônica podem apresentar ausência de sintomatologia ou

acometimento de órgãos do sistema digestivo, cardíaco ou ambos (forma mista). Não

se sabe ao certo o motivo pelo qual indivíduos com a mesma infecção apresentam

diferentes manifestações clínicas. Nesse sentido, a variabilidade genética entre

indivíduos, como os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), que correspondem a

quase 90% da variação do genoma humano, podem explicar as diferentes

manifestações encontradas nos pacientes. Um SNP presente na região promotora do

gene TNF-α, região -308 (GA) têm sido relacionado com aumento da produção da

proteína e com formas mais graves de algumas doenças infecciosas. O presente

estudo encontrou, em 124 indivíduos chagásicos, predominância do alelo G e

genótipo GG desse SNP em indivíduos chagásicos assintomáticos, sugerindo caráter

protetor quanto a presença de sintomas da doença na fase crônica. Também houve

associação entre o alelo A e a presença de manifestações clínicas sintomáticas da

doença, que representa dado importante na busca de estratégias para melhor

acompanhamento clínico desses indivíduos.

Introdução

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, ainda constitui

ameaça à saúde pública em muitos países das Américas [1,2]. Estima-se que a

79

doença ocasione cerca de 10.000 mortes por ano e que 8 milhões de pessoas estejam

infectadas [3]. No Brasil, aproximadamente duas a três milhões de pessoas vivem com

a doença [4,5] que é responsável por cerca de 6.000 mortes por ano [7,8].

A transmissão do parasita pode ocorrer por meio do contato com o inseto triatomíneo

(transmissão vetorial), pelo consumo de alimentos contaminados com as fezes do

inseto (transmissão oral), da mãe para o bebê (transmissão vertical), por acidentes

laboratoriais, transplante de órgãos ou transfusão de sangue [8]. Cerca de uma a duas

semanas após a inoculação do parasita, o indivíduo entra na fase aguda da doença

[9], geralmente apresentando sintomas pouco específicos como: linfocitose atípica,

mal-estar, febre, hepatoesplenomegalia, entre outros [10]. Após essa fase da doença,

indivíduos se tornam cronicamente infectados e podem apresentar ausência de

sintomas (forma clínica indeterminada) ou apresentarem acometimento de órgãos do

sistema digestivo, coração ou ambos [11].

Os chamados “indeterminados”, representam cerca de 70% dos indivíduos infectados

[12]. Estes não apresentam sintomas da doença, nem anormalidades em exames

físicos e radiológicos de tórax, cólon e esôfago [13]. Tais indivíduos podem apresentar

a forma clínica indeterminada por toda a vida ou desenvolver formas mais severas da

doença com acometimento de órgãos específicos [14].

A forma mais grave da doença de Chagas crônica é a cardíaca [15] que afeta em torno

de 20% dos indivíduos [16] e é responsável por cerca de 21.000 mortes por ano [17].

Indivíduos com essa forma clínica podem desenvolver tromboembolismo, arritmias,

insuficiência cardíaca [16], cardiomiopatia [18], aneurisma ventricular [19],

cardiomegalia [20] e morte súbita que pode ser causada por bloqueio cardíaco

completo, assistolia, taquicardia ou fibrilação ventricular [21,22].

80

Aproximadamente 10% dos indivíduos chagásicos podem apresentar forma clínica

digestiva da doença e manifestações como: perda de peso, constipação, disfagia,

refluxo esofágico, tosse, regurgitação, odinofagia, e dor abdominal [23,24]. Essa forma

clínica da doença é caracterizada, principalmente pelo aparecimento de megaesôfago

e megacólon chagásico [25,26].

Cerca de 2 a 5% dos casos, indivíduos desenvolvem forma mista da doença, ou seja,

apresentam sintomas da forma clínica cardíaca e digestiva [27,8]

Não se sabe exatamente o motivo pelo qual, alguns indivíduos entram na fase crônica

apresentando manifestações graves da doença e outros não. Além disso, ainda não

é muito bem compreendido os fatores que levam indivíduos indeterminados

progredirem para as formas clínicas sintomáticas.

Vários fatores podem contribuir para a evolução da doença. Um aspecto importante a

ser investigado na doença de Chagas são os fatores genéticos do hospedeiro que são

bastante informativos e podem explicar a heterogeneidade encontrada em indivíduos

que vivem com a doença em áreas endêmicas [28]. Geralmente os estudos são

baseados em três abordagens: a importância do parasita no dano tecidual; estudos

que tem como alvo o sistema imune e foco genômico da interação entre os dois

genomas (do parasita e do genoma humano) [29]. De acordo com este último item, o

tropismo tecidual poderia constituir processo influenciado por fatores genéticos do

parasita e do hospedeiro [29-31].

Cerca de 90% da variabilidade do genoma humano corresponde a SNPs (Single

Nucleotide Polymorphisms) [32] que compreendem a uma mudança em um único

nucleotídeo por outro em uma sequência de DNA [33] e tem frequência de mais de

1% na população humana [34]. Esses polimorfismos se tornaram marcadores de

escolha em análises genéticas populacionais por serem bastante comuns [35,36].

81

Um deles se localiza na região promotora no gene TNF-α, posição -308 (rs1800629)

no cromossomo 6p21.3 [37,38] dentro do complexo de histocompatibilidade (MHC)

classe III [39], no qual a adenina é o alelo incomum (TNF2) e a guanina o alelo comum

(TNF1) [40]. Alguns estudos têm associado esse SNP com o desenvolvimento de

formas mais graves de doenças infecciosas, como: malária cerebral em crianças [41],

leishmaniose mucocutânea [42] e dengue hemorrágica [43]. Além disso, o alelo A

desse SNP têm sido relacionado com aumento da produção da proteína TNF-α

[44,45].

Com relação à doença de Chagas, os trabalhos mostram dados conflitantes. Em um

estudo foi encontrado maior frequência do TNF2 em pacientes com a forma cardíaca,

comparado àqueles com a forma indeterminada da doença [46] e Drigo et al (2006)

mostraram associação desse alelo com a redução de sobrevida nos pacientes com

cardiomiopatia chagásica crônica [47]. Criado et al (2012), observaram risco para

desenvolvimento da cardiopatia chagásica em colombianos carreadores do alelo A

desse SNP [48]. No entanto, em outros dois estudos conduzidos em populações

diferentes, os autores não encontraram associação entre TNF2 e susceptibilidade

para forma cardíaca da doença [49,50].

Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar a associação entre o SNP

-308 (G/A) do gene TNF-α em pacientes chagásicos crônicos e verificar se o

polimorfismo está associado com manifestações clínicas sintomáticas da doença em

uma população do Brasil. Foi encontrada diferença significativa entre as frequências

alélicas e genótipos entre os grupos, o que representa dado importante para

compreensão da patogênese da doença e na busca de estratégias para melhor

acompanhamento clínico dos pacientes.

82

Métodos

Sujeitos do estudo

Foram avaliados 124 indivíduos atendidos no Ambulatório de Doenças Tropicais da

Faculdade de Medicina Botucatu (UNESP), interior do Estado de São Paulo, Brasil.

Botucatu se localiza entre 22° 51’ 08’’ ao sul e 48° 25’ 56’’ a oeste, a cidade está

inserida em uma região endêmica para doença de Chagas.

Os indivíduos incluídos eram de ambos os sexos e com idades variando de 36 a 83

anos, apresentando diferentes formas clínicas da doença de Chagas crônica. Para

confirmação do diagnóstico da doença de Chagas foi constatato positividade em

testes sorológicos para T. cruzi pelas técnicas de Quimioluminescência,

Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Hemaglutinação indireta (HAI).

Indivíduos com forma clínica indeterminada foram classificados pela ausência de

sintomatologias da doença e resultados normais em exames de eletrocardiograma

convencional, estudo radiológico de tórax, esôfago e cólon.

Indivíduos com forma clínica cardíaca foram classificados por meio de alterações em

exames de eletrocardiograma (principalmente alterações inespecíficas da

repolarização ventricular acompanhadas, sobrecarga de átrio esquerdo, de intervalo

QTc prolongado, baixa voltagem dos complexos QRS, fibrilação atrial, bloqueios

atrioventriculares, bloqueios de ramo e taquicardia sinusal) [51]. Também foram

constatadas presença de alterações em exames de ecocardiograma, tais como:

trombos intracavitários, derrame pericárdio, aumento das dimensões das câmaras

cardíacas, regurgitação valvar atrioventricular e comprometimento da função sistólica

ventricular esquerda [52].

83

A classificação da forma digestiva da doença envolve principalmente, alterações no

esôfago e cólon. Foram avaliados os resultados de exames de: radiografia simples de

tórax em PA ou perfil (para verificar presença de megaesôfago), radiografia

contrastada do esôfago, radiografia simples de abdomen e radiografia contrastada do

cólon - enema opaco.

Indivíduos com forma mista da doença, foram classificados devido a presença de

alterações da forma clínica cardíaca e digestiva da doença, concomitantemente.

Os sujeitos do estudo foram divididos em dois grupos: grupo 1 constituído de

indivíduos chagásicos crônicos com forma assintomática da doença de Chagas e

grupo 2 constituído de indivíduos chagásicos crônicos sintomáticos com formas

clínicas cardíaca, digestiva e mista da doença.

Os resultados dos exames foram verificados pela consulta do prontuário clínico dos

pacientes e, a partir desse, foram coletados dados clínicos dos indivíduos, como:

naturalidade, procedência, idade, peso e altura (para cálculo do índice de massa

corpórea) e comorbidades para caracterização da amostra.

Critérios de exclusão

Deste estudo foram excluídas as gestantes

Comitê de Ética

Todos os indivíduos aceitaram participar do estudo mediante assinatura do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) aplicado no momento da consulta. O

estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de

Botucatu - UNESP (CEP – Parecer nº 1.576.662).

84

Cálculo do IMC (Índice de Massa Corpórea)

Em relação aos dados antropométricos, foi considerado o peso em quilogramas (kg)

e a altura em centímetros (cm). De acordo com o Ministério da Saúde, foi utilizada a

seguinte fórmula para cálculo do IMC: Peso / Altura x Altura.

A classificação para adultos (de 20 a 59 anos) foi aplicada mediante os seguintes

valores: < 18,5 foram classificados com baixo peso; ≥ 18,5 e < 25 eutrofia; ≥ 25 e < 30

com sobrepeso e ≥ 30 foram classificados como obesos. Para idosos ( > 60 anos) a

classificação dos valores foi: ≤ 22 àqueles com baixo peso, > 22 e < 27 eutrofia e ≥ 27

sobrepeso [53].

Coleta de sangue e isolamento de leucócitos

Foram coletados 5 mL de sangue periférico dos sujeitos de estudo e após

centrifugação de 15 minutos a 15000 rpm foi realizada a separação da papa

leucocitária. Nesta porção do sangue foi adicionado 1mL de tampão de lise de células

vermelhas - RCLB (pH: 7,6 1X: 10mM de Tris; 5mM de MgCl2 e 10mM de NaCl) e

realizada a centrifugação a 15000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado

e o pellet armazenado em temperatura -20ºC.

Extração de DNA

A extração de DNA foi realizada com o Kit PureLink® Genomic DNA Mini Kits K182001

(Invitrogen, Carlsbad, USA) de acordo com as recomendações do fabricante e o DNA

foi quantificado em aparelho espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare, Little

Chalfont, Buckinghamshire, UK).

85

Realização da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

Foram utilizados os primers forward 5’ –GAGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT- 3’ e

reverse 5’ –GGGACACACAAGCATCAAG- 3’ para o gene TNF-α.

A PCR foi realizada em volume final de 25 µL, contendo 2,5µL de DNA genômico, 10

pmol de cada primer, 1,0 unidade de Taq gold polymerase e 1,0 mM de MgCl2 e 500

uM de dNTPs. A ciclagem do gene TNF- α foi de: denaturação inicial a 96ºC por 12

minutos, 35 ciclos com denaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 59ºC por

1 minuto, extensão a 72ºC por 2 minutos e ciclo final de 72ºC por 10 minutos [54].

Após a eletroforese em gel de agarose a 2% os produtos amplificados de fragmento

de 147 pares de bases (pb) foram visualizados em transiluminador ultravioleta.

Digestão com enzima de restrição (RFLP)

Para análise do SNP no gene TNF-α região – 308A (rs1800629) foi utilizado 10 µL do

produto da PCR amplificado e 0,5 µL da enzima de restrição NcoI - Nocardia corallina

(New England BioLabs, Boston, MA, USA – R0193L) para digestão a 37ºC em

termociclador por 2 horas seguido por 65ºC por 10 minutos. O resultado das amostras

digeridas foi verificado em gel de agarose a 3% e visualizados em transiluminador

ultravioleta. Os genótipos foram diferenciados pelo tamanho de seus fragmentos: GG

– 126 e 21 pb, GA – 147, 126 e 21 pb e AA – 147 pb (Tabela 1).

Tabela 1 - Relação dos genes e as respectivas enzimas de restrição utilizadas, sítio de corte da enzima e genótipos pesquisados em indivíduos com doença de Chagas crônica sintomática e assintomática

Gene/SNP Enzima de restrição

Sítio de corte da enzima Genótipos

TNF- α (rs1800629)

NcoI 5’... C↓CATGG...3’ 3'...GGTAC↑C...5'

GG – 126 e 21 pb; GA - 147,126 e 21 pb; AA - 147 pb

86

Análise estatística

Para análise da faixa etária dos participantes foi realizado a média e desvio padrão. A

comparação entre os dados clínicos dos pacientes, genótipos e frequências alélicas

foi realizada através do teste de associação de Goodman complementado com as

comparações múltiplas entre e dentro de populações multinomiais [55,56]

considerando o nível de 5% de significância. Para amostras independentes foi

utilizado Teste t de Student [57]. As frequências alélicas foram testadas para Equilíbrio

de Hardy-Weinberg.

Resultados

Caracterização da amostra

Os 124 pacientes chagásicos, foram provenientes, principalmente, do interior do

Estado de São Paulo, Brasil. Apenas dois indivíduos eram procedentes de Siqueira

Campos, Paraná. Os pacientes foram agrupados por microrregiões do Estado de São

Paulo, exceto dois indivíduos mencionados anteriormente, do Estado do Paraná. As

microrregiões em destaque, correspondem às procedências dos pacientes,

principalmente: Itapeva (43), Botucatu (30), Avaré (23) e Ourinhos (13) (Figura 1).

Os pacientes são todos são brasileiros e compreendem naturalidades dos Estados de

São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Bahia, Alagoas e Mato Grosso. Os

pacientes eram naturais, principalmente, das seguintes cidades do interior de São

Paulo: Itaporanga (19), Itaí (11), Taquarituba (11), Barão de Antonina (5) e Taguaí (5)

(Figura 2).

Dos 124 pacientes chagásicos, 79 (63,7%) eram assintomáticos e 45 (36,3%)

sintomáticos. No grupo de indivíduos sintomáticos, 21 (46,7%) apresentavam forma

87

cardíaca da doença, 16 (35,5%) indivíduos apresentavam forma digestiva e oito

(17,8%) indivíduos tinham forma mista da doença.

Entre os pacientes assintomáticos, faziam parte 42 (53,2%) homens e 37 (46,8%)

mulheres; e no grupo dos sintomáticos, 20 (44,5%) homens e 25 (55,5%) mulheres.

A média de idade entre indivíduos assintomáticos foi de 59,3±8,16 anos (média ±

desvio padrão) e nos sintomáticos de 61,1±8,62 anos. Não houve diferença

significativa entre a distribuição do sexo e média de idade entre os grupos

assintomático e sintomático (p > 0,05)

Em relação ao índice de massa corpórea, não houve diferença entre nenhuma variável

quando comparado entre os grupos (p > 0,05). Dentre os assintomáticos, 25 (31,6%)

apresentavam eutrofia, e sobrepeso e obesidade, 39 (49,4%) 12 (15,2%),

respectivamente. Entre os sintomáticos, 15 (33,3%) apresentavam eutrofia, 16

(35,6%) sobrepeso e 10 (22,2%) obesidade.

Dos 124 pacientes incluídos em nosso estudo, 92 (74,2%) apresentavam presença de

comorbidades como: hipertensão, hipercolesterolemia, diabetes ou associação entre

elas. Entre os indivíduos assintomáticos, 54 (58,7%) apresentavam comorbidades.

Deste grupo de pacientes, 14 (25,9%) eram hipertensos e 23 (29,1%) apresentavam

comorbidades associadas. Entre os sintomáticos, 38 (41,3%) indivíduos

apresentavam comorbidades. Dentre eles, 10 (26,1%) eram hipertensos e 24 (53,3%)

apresentavam comorbidades associadas. Estatisticamente não houve diferença entre

os grupos em relação a qualquer variável “comorbidade” (p > 0,05) (Tabela 2).

88

Tabela 2. Distribuição do sexo, média de idade e desvio padrão, índice de massa corpórea e comorbidades de 124 pacientes chagásicos crônicos subdivididos por forma clínica assintomática e sintomática, procedentes de diferentes municípios do Brasil

Formas clínicas (n = 124)

Assintomática

(n = 79) Sintomática

(n = 45) Valor –

p* Sexo n (%)

Masculino 42 (53,2) 20 (44,5) p > 0,05 Feminino 37 (46,8) 25 (55,5) p > 0,05

Total 79 (100) 45 (100)

Média de idade e desvio padrão

59,3±8,16 61,1±8,62

Índice de massa corpórea

n (%)

Baixo peso 3 (3,8) 4 (8,9) p > 0,05 Eutrofia 25 (31,6) 15 (33,3) p > 0,05

Sobrepeso 39 (49,4) 16 (35,6) p > 0,05 Obesidade 12 (15,2) 10 (22,2) p > 0,05

Total 79 (100) 45 (100)

Presença de comorbidades

n (%)

Hipertensão 14 (25,9) 10 (26,3) p > 0,05 Hipercolesterolemia 13 (24,1) 3 (7,9) p > 0,05

Diabetes 4 (7,4) 1 (2,6) p > 0,05 Comorbidades

associadas 23 (29,1) 24 (53,3) p > 0,05

Total 54 (58,7) 38 (41,3)

Teste de associação de Goodman considerando nível de significância de 5%. *Valor de p: comparação de categorias de resposta (colunas) dentro do grupo (linhas). O teste t de Student foi aplicado para amostras independentes

89

Genotipagem SNP -308A (G/A)

Com relação aos resultados dos genótipos do polimorfismo do gene TNF- α entre os

grupos, houve maior frequência do genótipo GG nos indivíduos assintomáticos

quando comparados com sintomáticos (p = 0,001). Não houve diferença significativa

entre os genótipos GA e AA quando comparados entre os dois grupos (p > 0,05).

Quando observada a distribuição dos genótipos dentro do grupo de indivíduos

assintomáticos, houve maior predominância do genótipo GG quando comparado com

o genótipo AA (p = 0,045). Não houve diferença entre o genótipo GA em comparação

com os demais genótipos neste grupo (p > 0,05). Dentro do grupo dos sintomáticos,

houve maior frequência do genótipo AA em relação ao genótipo GG (p = 0,045) e não

houve diferença entre o genótipo GA em relação aos demais (p > 0,05) (Tabela 3). Os

resultados foram mostrados como genótipos GG, GA e AA em foto do gel de agarose

(Figura 3).

Tabela 3. Distribuição dos genótipos do SNP -308A (rs1800629) do gene TNF-α de 124 pacientes chagásicos crônicos subdivididos por forma clínica assintomática e sintomática, procedentes de diferentes municípios do Brasil

Genótipos TNF-α Formas clínicas

n (%)

Assintomática Sintomática Total n (%)

GG 57 (68,7) Bb 26 (31,3) Aa 83 (66,9)

GA 18 (62,1) Aab 11 (37,9) Aab 29 (23,4)

AA 4 (33,3) Aa 8 (66,7) Ab 12 (9,7)

TOTAL n (%) 79 (63,7) 45 (36,3) 124 (100) Teste de associação de Goodman considerando o nível de significância de 5%. Letras maiúsculas: comparação de categorias de resposta (colunas) dentro do grupo (linhas), sendo B > A e AB não difere de A e B; Letras minúsculas: comparação de grupos (linhas) fixada a categoria de resposta (coluna), sendo b > a e ab não difere de a e b

90

Em relação às frequências alélicas, foi observada diferença significativa quando

comparado entre os grupos estudados. Houve predominância do alelo G entre o grupo

dos assintomáticos em comparação com os sintomáticos (p = 0,008) e predominância

do alelo A nos sintomáticos em relação aos assintomáticos (p = 0,045).

Quando comparadas as frequências alélicas dentro dos grupos estudados, houve

maior frequência do alelo G dentro do grupo de indivíduos assintomáticos e maior

frequência do alelo A dentro do grupo dos sintomáticos (p = 0,003). (Tabela 4). As

amostras não se apresentaram em Equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Tabela 4. Distribuição das frequências alélicas do SNP -308A (G/A) do gene TNF-α de 124 pacientes chagásicos crônicos subdivididos por forma clínica assintomática e sintomática, procedentes de diferentes municípios do Brasil

Alelos TNF-α

Formas clínicas n (%)

Assintomáticas Sintomáticas Total n (%)

G 118 (60,5) Bb 77 (39,5) Aa 195 (78,6)

A 20 (37,7) Aa 33 (62,3) Bb 53 (21,4)

TOTAL 138 110 248 (100) Teste de associação de Goodman considerando o nível de significância de 5%. Letras maiúsculas: comparação de categorias de resposta (colunas) dentro do grupo (linhas), sendo B > A e AB não difere de A e B. Letras minúsculas: comparação de grupos (linhas) fixada a categoria de resposta (coluna), sendo b > a e ab não difere de a e b

Discussão

A doença de Chagas continua sendo um problema de saúde pública em áreas

endêmicas e os mecanismos envolvidos na patogênese da doença não estão bem

elucidados.

91

Os indivíduos chagásicos que participaram do presente estudo, eram provenientes,

principalmente, das seguintes microrregiões do Estado de São Paulo: Itapeva (43),

Botucatu (30), Avaré (23) e Ourinhos (13). Os pacientes eram naturais de vários

Estados brasileiros como: Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Bahia, Alagoas e Mato

Grosso. No entanto, 19 indivíduos eram naturais de Itaporanga, 11 de Itaí, 11 de

Taquarituba, 5 de Barão de Antonina e 5 de Itaí, que compreendem cidades do interior

do Estado de São Paulo. Essas regiões correspondem ao fluxo de atendimento do

Ambulatório de Doenças Tropicais em Botucatu e estão incluídas em uma área

endêmica para a doença de Chagas.

A média de idade entre indivíduos assintomáticos foi de 59,3±8,16 anos (média ±

desvio padrão) e dos sintomáticos de 61,1±8,62 anos. De acordo com o Organização

Mundial da Saúde, aqueles idade superior a 60 anos são considerados idosos [58]. À

medida em que indivíduos atingem essa faixa etária, podem apresentar disfunções

relacionadas à perda de visão, audição, problemas respiratórios e complicações do

sistema cardiovascular [59].

Do total de indivíduos do presente estudo (sem distinção entre assintomáticos e

sintomáticos), 24 (19,3%) apresentavam hipertensão, 16 (12,9%) hipercolesterolemia,

5 (4,0%) diabetes e 47 (37,9%) presença de comorbidades associadas.

Três estudos de levantamento de dados clínicos foram conduzidos com pacientes

chagásicos com idade superior ou igual a 60 anos no Brasil. Alves et al (2009)

observaram média de 2.8 ±1.8 comorbidades por indivíduo independente da doença

de Chagas. Dentre essas desordens, 56,7% indivíduos apresentavam hipertensão

arterial e 10% diabetes mellitus [60]. Pereira et al (2015) verificaram que 86,6% dos

chagásicos apresentavam pelo menos uma comorbidade, dos quais 67%

apresentavam hipertensão arterial e 14,4% diabetes mellitus [61]. E Almeida et al

92

(2007) encontraram 59% de chagásicos com comorbidades associadas à infecção por

T. cruzi e 39,3% de hipertensão arterial nesses indivíduos [62]. Em comparação com

o observado na literatura, os pacientes do presente estudo apresentaram taxas

inferiores de hipertensão arterial e diabetes, além de também ter sido observado

menor índice de comorbidades associadas.

Na população brasileira estima-se que a prevalência de hipertensão seja de 20% [63].

Em nosso estudo, encontramos índice de hipertensão semelhante nos pacientes

avaliados, de 19,3%. Com relação a hipercolesterolemia, os estudos são escassos.

Em diferentes populações do Brasil foi encontrada prevalência de hipercolesterolemia

em 27,9% de crianças de 6 a 4 anos [64] e 35% em crianças de 7 a 14 anos [65]. Na

população do nosso estudo, esse índice foi de 12,9%. Já em relação a prevalência de

diabetes no país, dados mostram um aumento dessa desordem na população com

idade igual ou superior a 20 anos de 3,3% em 1998 para 5,3% em 2008 [66]. Em

nossos pacientes o índice de diabetes foi de 4,0%.

Sabe-se que essas morbidades oferecem risco para desenvolvimento de doenças

cardiovasculares [67]. No entanto, não é possível predizer o impacto dessas

desordens em indivíduos portadores da doença de Chagas, especialmente naqueles

com forma cardíaca. Porém, esse fato não descarta a importância de atenção especial

à esses pacientes.

Além disso, com relação ao IMC dos chagásicos no presente estudo, foi encontrado

44,3% de indivíduos com sobrepeso e 17,7% de obesos entre os indivíduos

assintomáticos e sintomáticos.

Alves et al (2009) relataram 5,6% de chagásicos com obesidade [60], já Geraix et al

(2007) observaram diferentes graus de obesidade em 62,1% de indivíduos chagásicos

estudados [68].

93

Estima-se que 60% da população brasileira seja obesa [69]. Fatores como obesidade

e sobrepeso, além contribuírem para o desenvolvimento de doenças

cardiovasculares, também são considerados fatores de risco para o aparecimento das

morbidades relatadas anteriormente (hipertensão, hipercolesterolemia e diabetes)

[70].

As amostras genotipadas para o polimorfismo de interesse não se apresentaram em

Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Tal fator pode ser explicado por nossa população de

estudo compreender apenas grupo de casos, ou seja, com a doença. Portanto, não

são escolhidos aleatoriamente, mas sim pelo fato de possuírem a mesma infecção

[71-74].

Em relação aos resultados da genotipagem e frequências alélicas do SNP -308

(rs1800629) do gene TNF-α foi encontrada diferença significativa quando comparado

o grupo de indivíduos assintomáticos com sintomáticos.

Foi observada predominância do genótipo GG nos indivíduos assintomáticos quando

comparado com indivíduos sintomáticos. Com relação às frequências alélicas, foi

encontrada maior frequência do alelo G no grupo de indivíduos assintomáticos e maior

frequência do alelo A no grupo de indivíduos sintomáticos. Os resultados sugerem

caráter protetor do alelo G e genótipo GG em relação às manifestações clínicas

sintomáticas na fase crônica da doença de Chagas. Já a predominância do alelo A no

grupo de indivíduos sintomáticos, sugerem susceptibilidade desses carreadores em

relação aos sintomas clínicos da doença.

O gene TNF-α codifica uma importante citocina pró-inflamatória produzida

principalmente por macrófagos, monócitos e células T e B [44] que está envolvida em

processos moduladores de diversas doenças [75].

94

Em relação à esse polimorfismo, têm sido denominado como TNF2 quando há

presença da adenina (alelo incomum) e TNF1 quando há presença da guanina (alelo

comum) [40]. Esse SNP tem sido estudado em algumas doenças infecciosas.

Homozigotos de TNF2 foram associados desenvolvimento de malária cerebral em

crianças, principalmente nos casos em que houve progressão para sequelas

neurológicas ou óbito [41]. Na infecção causada pelo Mycobacterium leprae, Sapkota

et al (2010) observaram efeito protetor do polimorfismo TNF2 no desfecho clínico dos

indivíduos infectados [76] e Roy et al (1997) encontraram associação entre os

genótipos GA e AA, bem como, alelo A na manifestação da hanseníase lepromatosa

(forma grave da infecção) [77]. O TNF2 também foi associado com a susceptibilidade

para a manifestação da forma clínica mucocutânea da leishmaniose [42] e com o

desenvolvimento da dengue hemorrágica [43].

Na doença de Chagas, a literatura é controversa em relação aos resultados

encontrados. Drigo et al (2006) avaliaram a relação do SNP -308(G/A) do gene TNF-

α em uma população do Brasil com a sobrevida em pacientes com cardiomiopatia

chagásica crônica. Foi observado que os carreadores do alelo TNF2 apresentaram

redução de sobrevida e elevado risco de morte [47]. No entanto, Drigo et al (2007) em

um trabalho publicado no ano seguinte não encontraram associação entre as

frequências alélicas desse SNP em chagásicos com cardiomiopatia em relação a

indivíduos na forma clínica indeterminada da doença [50]. A falta de associação desse

polimorfismo também foi observada em um estudo de Beraún et al (1998) quando

comparado chagásicos crônicos com indivíduos controle (sem a infecção) e

chagásicos com cardiomiopatia em relação aos indivíduos assintomáticos, em uma

população do Peru [49].

95

Porém, em um estudo conduzido por Rodriguez-Perez et al (2005) em mexicanos, foi

encontrado maior frequência do alelo A e genótipo GA do SNP -308 (rs1800629) em

indivíduos com cardiomiopatia chagásica crônica em comparação com chagásicos

com forma indeterminada da doença [46].

Criado et al (2012) em uma população da Colômbia verificaram associação entre o

alelo A do SNP -308 (rs1800629) com cardiomiopatia chagásica e do genótipo GG

com baixo risco para desenvolvimento dessa condição clínica em chagásicos.

Além do envolvimento desse SNP com diversas doenças infecciosas, o alelo TNF2 do

SNP -308(G/A) têm sido relacionado com maior produção da proteína TNF-α em

relação ao alelo TNF1 [44].

Com relação à doença de Chagas, estudos destacam a importância desta citocina

durante a fase aguda da doença para que haja controle da parasitemia [78-80] e

embora não se saiba exatamente seu papel na sua fase crônica, o TNF-α já foi

encontrado em cardiomiócitos de camundongos infectados por T. cruzi [81] e em

células de infiltrados inflamatórios de humanos com miocardite indicando relação

entre essa citocina e o desenvolvimento da cardiopatia chagásica [82-84].

Em relação a forma digestiva da doença. Mendes et al (2017) não encontraram níveis

significativos de TNF-α no plasma de indivíduos com essa forma clínica [85] e Crema

et al (2006) encontraram baixos níveis dessa citocina em indivíduos com esofagopatia

chagásica avançada. [86].

Até o momento, não há relatos na literatura a respeito da participação do SNP -

308(G/A) na forma digestiva da doença. No presente estudo, encontramos associação

entre o SNP -308A (rs1800629) em relação à manifestação de formas clínicas. Os

resultados sugerem caráter protetor do genótipo GG e alelo G desse polimorfismo em

relação às manifestações clínicas sintomáticas da doença. Já o predomínio do alelo

96

A no grupo de indivíduos sintomáticos (de formas clínicas cardíaca, digestiva e mista),

sugere susceptibilidade à manifestação de sintomas na fase crônica da doença.

O presente estudo traz novos dados a respeito do papel do SNP rs1800629 do gene

TNF-α com o desenvolvimento clínico da doença de Chagas. Se faz necessário que

novos estudos sejam replicados com esse SNP em diferentes populações com

indivíduos de formas clínicas da doença de Chagas crônica a fim de se conhecer

melhor o complexo envolvimento deste polimorfismo nas diferentes manifestações da

doença.

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102

Figura 1. Procedência dos pacientes chagásicos crônicos agrupados por microrregiões do Estado de São Paulo, Brasil, genotipados para gene TNF-α* *Exceto dois pacientes provenientes de Siqueira Campos, Paraná, Brasil

103

104

105

106

No presente estudo foram encontradas diferenças significativas quando

comparado os genótipos GG e alelo G do SNP -308 (rs1800629) do gene TNF-α e

genótipos AA e AC do SNP rs1044925 (gene ACAT-1) em indivíduos chagásicos

crônicos assintomáticos em relação aos sintomáticos. Também foi observada

diferença significativa entre a presença do alelo A do polimorfismo do gene TNF-α em

indivíduos sintomáticos em relação aos assintomáticos.

Não foi encontrada diferença significativa quando comparado os dados

clínicos (sexo, média de idade, IMC e comorbidades) entre os chagásicos com e sem

sintomas da doença genotipados para o gene TNF-α e ACAT-1.

Os resultados encontrados sugerem efeito protetor do genótipo GG e alelo

G do SNP-308 (rs1800629) do gene TNF-α; e genótipos AA e AC do SNP rs1044925

do gene ACAT-1 quanto a manifestações clínicas sintomáticas da doença de Chagas

crônica. A presença do alelo A do polimorfismo do gene TNF-α sugere papel na

susceptibilidade em relação às manifestações clínicas em chagásicos crônicos.

O presente estudo traz novos dados a respeito do papel dos polimorfismos

estudados em relação aos sintomas clínicos em pacientes com doença de Chagas.

Novos estudos são necessários para aprimorar o conhecimento do papel desses

SNPs em diferentes populações com indivíduos de formas clínicas da doença, a fim

de se conhecer melhor o complexo envolvimento destes polimorfismos nas diferentes

manifestações clínicas da doença.

107

108

Anexo I: Periódico submetido (na íntegra)

ACAT-1 gene rs1044925 SNP and it’s and its relation with different clinical forms of chronic Chagas' disease

Thaysa Buss Carvalho1, Carlos Roberto Padovani2, Luiz Roberto de Oliveira Júnior¹, Ana Carla Pereira Latini 1,3, Cilmery Suemi Korokawa 1,4, Rodrigo Mattos dos Santos1, Paulo Câmara Marques Pereira1

1 Department of Tropical Diseases, Botucatu Medical School, São Paulo State University (UNESP - Univ Estadual Paulista)

2 Departament of Bioestatistics, Botucatu Biosciences Institute São Paulo State University (UNESP - Univ Estadual Paulista)

3 Departament of Molecular Biology, Lauro de Souza Lima Institute

4 Departament of Pediatrics, Botucatu Medical School, São Paulo State University (UNESP - Univ Estadual Paulista)

Corresponding author: Thaysa Buss Carvalho

Address: Laboratório de Moléstias Infecciosas – UNIPEX – FMB UNESP; Rua Dr. Walter Mauricio Correa s/n

E-mail: thata_carv@hotmail.com

109

Abstract

Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, although discovered more than

a century ago. Individuals in the chronic phase of the disease may present asymptomatic

clinical form or symptomatologies related to the cardiac, digestive systems or both (mixed

clinical form). SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) has been identified as important

markers in genetic analysis.

One of them is localized to the ACAT-1 gene (cholesterol acyltransferase 1) (rs1044925) and

has been linked to lipid disorders and risk for developing atherosclerosis.Therefore, the

objective of the present study was to evaluate the association between the ACAT-1 gene

rs1044925 SNP in relation to the presence of symptomatic clinical manifestations in patients

with chronic Chagas' disease.

A total of 135 individuals with chronic Chagas' disease, 86 (63.7%) asymptomatic individuals

and 49 (36.3%) symptomatic patients (22 with cardiac clinical form, 18 with digestive form and

9 with mixed form) participated in the study. To evaluate the polymorphism, the PCR-RFLP

technique and agarose gel visualization were used. The results suggests a protective

character of the AA and AC genotypes of the rs1044925 SNP (p = 0.047 and p = 0.016,

respectively) in relation to the presence of symptomatic clinical manifestations of the disease

in chronic chagasic individuals.

Keywords: Chagas disease - Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) - ACAT-1

110

Introduction

Chagas disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi is still endemic in many countries

(1). According to the World Health Organization, it is estimated that eight million people around

the world are infected and the infection has spread to non-endemic regions (2). In the United

States, for example, about 300,000 people are infected (3). In Brazil, it is estimated that

between two and three million people have acquired the disease and 600,000 have symptoms

related to the chronic phase (4).

The disease has two clinical phases: acute and chronic. In the acute phase, individuals present

high parasitemia and non-specific symptoms such as: malaise, fever, hepatosplenomegaly

and atypical lymphocytosis (5). After two to four months, individuals enter the chronic phase

of the disease and may present asymptomatic clinical form or symptomatologies related to the

cardiac, digestive systems or both (mixed clinical form) (6).

Approximately 70% of the infected individuals have an undetermined clinical form (7) and

presents no abnormalities in physical and radiological exams or symptoms of the disease (8).

The cardiac clinical form, which affects approximately 20% of the infected individuals,

corresponds to the most serious manifestation of the disease and may promote arrhythmias,

thromboembolism and heart failure in these patients (9).

On the other hand, the digestive clinical form involves mainly damage to the esophagus and

colon with consequent megaesophagus and megacolon. The most common manifestations of

this clinical form are: mild achalasia, motility disorders, dysphagia and regurgitation (5).

A small percentage of chronic chagasic patients (2-5%) present clinical for both digestive and

cardiac manifestations of the disease and are referred to as mixed or cardiodigestive form (10).

One of the most intriguing questions of the disease’s chronic phase is the fact that leads

individuals to present different clinical manifestations. So far it is not known the main factor

responsible for some individuals developing symptoms of the disease and others do not.

Information on human genetic predisposition has progressed greatly in recent years and the

111

search for host molecular markers are potential targets for explaining susceptibility in some

infections (11).

One type of marker widely used in genetic studies comprises the Single Nucleotide

Polymorphisms (SNPs), which result in an exchange of one nucleotide for another in a DNA

sequence (12). They represent for about 90% of the variation in the human genome (13) and

have a frequency of more than 1% in the human population (14). Because they are fairly

common, these polymorphisms has been extensively investigated. Some studies have already

demonstrated the role of these polymorphisms in susceptibility to some common diseases

such as diabetes and cancer (15-17) and progression to severe forms of infectious diseases

such as malaria (18) and leprosy (19).

The SNP rs1044925 (A/C) is located on the ACAT-1 (cholesterol acyltransferase 1) gene and

has been extensively investigated in lipid disorders. This gene encodes the ACAT-1 enzyme

that is responsible for esterification of intracellular cholesterol (20) and has been related to the

formation of foam cells in macrophages, which is characteristic of the first stages of

atherosclerotic lesions (21).

With regard to this polymorphism, Wu et al (2010) found that in a population of China, the AC

and CC genotypes of rs1044925 were associated with low levels of total cholesterol and LDL

in women, when compared to the AA genotype (22). In another study, the AC and CC

genotypes were associated with increased systolic pressure in smokers (23). The rs1044925

SNP AC and CC genotypes were also associated with higher levels of total cholesterol and

HDL in serum of men with hypercholesterolemia (24).

These studies demonstrate the role of the ACAT-1 gene rs1044925 SNP and its relationship

to some lipid disorders and that prone a risk for cardiovascular disease. Some studies have

suggested that there is an interaction between T. cruzi and the lipid metabolism of the host

(25).

112

To date, no study has investigated this SNP in individuals with Chagas' disease. Therefore,

the present study aims to evaluate the role of the rs1044925 SNP of the ACAT-1 gene in

patients with and without clinical symptomatic manifestations of the disease.

Material and Methods

Study subjects

A total of 135 individuals attended at the Tropical Diseases Outpatient Clinic of Botucatu

Medical School (UNESP), in the interior of the State of São Paulo, Brazil were evaluated.

Botucatu is located between 22 ° 51 '08' 'to the south and 48 ° 25' 56 '' to the west.

The included individuals were of both sexes and ranged in age from 36 to 83 years, presenting

different clinical forms of chronic Chagas' disease. In order to confirm the diagnosis of Chagas'

disease, it was verified positivity for T. cruzi serological tests using the Chemiluminescence,

Indirect Immunofluorescence (ELISA) and ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Subjects with undetermined clinical form were classified by the absence of symptoms of the

disease and normal results in conventional electrocardiogram examinations, radiological study

of the thorax, esophagus and colon.

Individuals with cardiac clinical form were classified by electrocardiogram abnormalities

(mainly non-specific alterations of the ventricular repolarization followed, left atrial overload,

prolonged QTc interval, low QRS complex voltage, atrial fibrillation, atrioventricular block,

branch block and sinus tachycardia) (26). Changes in echocardiogram examinations may also

be observed, such as: presence of intracavitary thrombi, pericardial effusion, enlargement of

the cardiac chambers, atrioventricular valve regurgitation, and impairment of left ventricular

systolic function (27).

113

The classification of the digestive form of the disease mainly involves changes in the

esophagus and colon. Were evaluated the results of chest X-ray in PA or profile (to check the

presence of achalasia), contrasted the esophagus radiography, radiography of the abdomen

and contrast radiography of the colon - barium enema examinations (27).

Subjects with mixed (cardiodigestive) form of the disease were classified due to presence of

changes in the cardiac and digestive clinical form of the disease, concomitantly.

The study subjects were divided into two groups: group 1 consisting of chronic Chagas

'individuals with asymptomatic form of Chagas' disease and group 2 consisting of chronic

Chagasic symptomatic individuals with clinical, cardiac, digestive and mixed forms of the

disease.

The results of the exams were verified by consulting the patients' medical records and, from

this, clinical data was collected from individuals: naturalness, origin, age, weight and height (in

order to calculate body mass index) and comorbidities for characterization of the sample.

Exclusion Criteria

From this study, pregnant women were excluded

Ethics Committee

All individuals accepted to participate in the study by signing the Informed Consent Term

applied at the time of the consultation. The study was approved by the Research Ethics

Committee of the Faculty of Medicine of Botucatu - UNESP (CEP - Opinion no. 1,576,662).

Calculation of BMI (Body Mass Index)

114

In relation to anthropometric data, the weight in kilograms (kg) and height in centimeters (cm)

were considered. The following formula was used to calculate the BMI: Weight / Height x

Height.

The classification for adults (20 to 59 years) was applied using the following values: <18.5

were classified as low weight; ≥ 18.5 and <25 eutrophy; ≥ 25 and <30 were overweight and ≥

30 were classified as obese. For the elderly (> 60 years) the classification of the values was:

≤ 22 for those with low weight,> 22 and <27 eutrophic and ≥ 27 overweight (28).

Blood collection and leukocytes isolation

5 mL of peripheral blood were collected from the study subjects and after centrifugation of 15

minutes at 15000 rpm the separation of the WBC was performed. In this portion of the blood

was added 1mL of red cell lysis buffer (RCLB (pH: 7.6 1X: 10mM Tris; 5mM MgCl2 and 10mM

NaCl) and centrifugation performed at 15,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was

discarded and the pellet stored at -20 ° C.

DNA extraction

DNA extraction was performed with the PureLink® Genomic DNA Mini Kits K182001

(Invitrogen, Carlsbad, USA) according to the manufacturer's recommendations and the DNA

was quantified in NanoVue Plus spectrophotometer apparatus (GE Healthcare, Little Chalfont,

Buckinghamshire, UK).

PCR reaction (Polymerase Chain Reaction)

Forward primers 5'-TATATTAAGGGGATCAGAAGT-3 'and reverse 5'-

CCACCTAAAAACATACTACC-3' were used for the ACAT-1 gene.

115

PCR was performed in a final volume of 25 μl containing 2.5 μl of genomic DNA, 10 pmol of

each primer, 1.0 unit of Taq polymerase and 1.0 mM of MgCl2, 500 μM of dNTPs. Cicles were

performed according to Wu et al (2010) (22) with some modifications. Initial denaturation at

95ºC for 5 minutes, 35 cycles with denaturation at 95ºC for 45 seconds, annealing at 55ºC for

1 minute, extension at 72ºC for 50 seconds and final cycle at 72ºC for 10 minutes. Verification

of the amplified product was performed on 2% agarose gel to observe the 389 bp fragment.

Restriction enzyme digestion (RFLP)

For analysis of the ACAT-1 gene SNP (rs1044925), 10 μL of the amplified PCR product and

0.5 μL of restriction enzyme RsaI- Rhodopseudomonas sphaeroides (New England BioLabs,

Boston, MA, USA-R0167S) were used for digestion at 37° C overnight. The results of the

digested samples were checked on 2% agarose gel and visualized in ultraviolet

transilluminator. The size of the bands for each genotype are: AA - 389 bp, AC - 389, 279 and

110 bp and CC - 279 and 110 bp (Table 1).

Statistical analysis

For the analysis of the age group of the participants, the mean and standard deviation and

Student's t test for independent samples were performed (29). Comparison between general

patient data, genotypes and allelic frequencies was performed using the Goodman association

test, supplemented with multiple comparisons between and within multinomial populations

(30,31), considering the 5% level of significance. Allelic frequencies were tested for Hardy-

Weinberg Equilibrium.

Results

116

Sample characterization

The 135 chagasic patients came mainly from the interior of São Paulo State (SP), Brazil. Only

two individuals were from Siqueira Campos, Paraná. Patients were grouped by microregions

of São Paulo State, except for two individuals previously mentioned, from Paraná State. The

microregions in particular, correspond to the patient's origins, mainly: Itapeva (45), Botucatu

(33), Avaré (31) and Ourinhos (13) (Figure 1). All individuals are Brazilian and natural from

cities of São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Bahia, Alagoas and Mato Grosso

States. Among them, 18 patients were from Itaporanga (SP), 14 from Itaí (SP) and 9 from

Taquarituba (SP) (Figure 2).

Of the 135 chagasic patients included in the study, 86 (63.7%) were asymptomatic and 49

(36.3%) were symptomatic. In the group of symptomatic individuals, 22 (44.9%) presented

cardiac form of the disease, 18 (36.7%) individuals presented digestive form and nine (18.4%)

individuals had mixed form of the disease.

Among the asymptomatic patients, 46 (53.5%) were men and 40 (46.5%) were women; in the

symptomatic group, 23 (46.9%) were men and 26 (53.1%) women. The mean age in the group

of asymptomatic individuals was 59.0 ± 8.0 years (mean ± standard deviation) and in the

symptomatic group, 61.5 ± 9.1 years. There was no significant difference between sex

distribution and mean age between groups (p> 0.05).

In relation to the body mass index, 48.8% of the asymptomatic individuals and 36.7% of the

symptomatic individuals were overweight.

Of the 135 patients included in our study, 98 (72.6%) had comorbidities such as: hypertension,

hypercholesterolemia, diabetes or association between them.

Among the asymptomatic individuals, 57 (58.2%) had comorbidities. Fifteen patients (26.3%)

had hypercholesterolemia and 24 (42.1%) had an association of more than one comorbidity.

Among the symptomatic individuals, 41 (41.8%) individuals had comorbidities. Eleven (26.9%)

were hypertensive and 24 (58.5%) had comorbidities associations (Table 2). There was no

117

significant difference when comparing all variables "BMI" and "comorbidities" between the

groups (p> 0.05).

ACAT-1 gene rs1044925 SNP genotyping

For the rs1044925 SNP genotypes, the samples were presented in Hardy-Weinberg

equilibrium.

Regarding the results of the ACAT-1 gene polymorphism among the groups, there was a

higher frequency of the genotypes AA and AC in asymptomatic individuals compared with

symptomatic individuals (p = 0.047 and p = 0.016). There was no significant difference between

the CC genotype when compared between the two groups (p> 0.05). There was also no

significant difference between the AA, AC and CC genotypes when compared within the

studied groups (p> 0.05) (between asymptomatic individuals and between symptomatic

individuals) (Table 3).

Regarding the allelic frequencies, there was no significant difference between the A and C

alleles when compared to and within the groups of asymptomatic and symptomatic individuals

(p> 0.05) (Table 4). The results were shown as AA, AC and CC genotypes in agarose gel

photo (Figure 3).

Discussion

Chagas disease still raises debate, mainly regarding the different clinical manifestations that

chagasic individuals exhibit in the chronic phase. It is believed that factors such as

environment, parasite and genetic factors of the host can contribute to the severity of the

disease (32).

In the present study, chronic chagasic patients came mainly from microregions of São Paulo

State, such as: Itapeva, Botucatu, Avaré and Ourinhos (Figure 1). These individuals are native

118

from several states in Brazil, mainly in the interior of São Paulo State, such as: Itaporanga, Itaí

and Taquarituba (Figure 2). These regions correspond to the flow of care from the Ambulatory

of Tropical Diseases in Botucatu and are inserted in an area endemic for Chagas' disease.

The mean age in the group of asymptomatic individuals was 59 years and in the symptomatic

group 61.5 years, with no significant difference between these groups. The mean age of

Chagas' chronic patients suggests the role of the efficacy of Chagas disease vector control

programs in the country, which began in the mid-1950s (33). However, this factor does not rule

out the occurrence of vectors contaminated by T. cruzi, since these campaigns were mainly

aimed at combating the vector Triatoma infestans (34-36). In São Paulo State, there are other

secondary species of triatomines with potential for infectivity, such as Panstrongylus megistus

and Triatoma sordida (37).

In addition, as individuals age, there is greater susceptibility to comorbidities, independent of

infection with Chagas' disease (38). In the present study, 66.3% of the asymptomatic chagasic

patients presented some comorbidity associated with the infection. The same was observed

in 83.7% of symptomatic chagasic patients. Of the total of 135 chagasic patients, 24 (58.5%)

symptomatic and 24 (42.1%) asymptomatic had an association of more than one comorbidity,

in addition to T. cruzi infection. It is believed that about 88% of the world's population aged 65

years and over present at least one chronic disorder (39). Individuals who present more than

one comorbidity are more prone to physical inactivity and greater occurrence of adverse drug

interactions due to polypharmacy (39).

In the group of asymptomatic individuals, 21.1% had hypertension and 26.3% had

hypercholesterolemia. In the group of symptomatic individuals, 26.9% were hypertensive and

12.2% had hypercholesterolemia. In a study conducted by Vicco et al (2014), a higher

frequency of hypertension was found in individuals with Chagas' disease (34%) when

compared to individuals without the infection (13%) (40). Hypertension was also associated

with heart failure in chagasic patients (40). In another study, of 878 chagasic patients, 37%

had arterial hypertension, mainly individuals with cardiac involvement and >45 years of age

119

(41). Gurgel & Almeida (2007) analyzed the records of individuals submitted to necropsy, and

found that of 101 chagasic patients, 33 (32.7%) were hypertensive (42).

In the present study, 17% of chagasic patients (regardless of presence / absence of clinical

symptoms) had hypertension. This portion is lower when compared to the studies cited above,

which may be justified by the fact that this disorder is influenced by several factors such as:

obesity, alcoholism, sex, age, among others (42). Moreover, the prevalence of hypertension

may vary among populations, although the factors that influence these discrepancies are not

yet known (43). However, we observed that this data is similar when compared to the general

population in the country in which it is estimated that there are 20% of hypertensive individuals

(44).

Regarding diabetes, it was found in 5.2% of 135 chagasic patients of the present study. Santos

et al. (1999) observed that among 362 chagasic women, there was a prevalence of 10.5% of

diabetes mellitus (45).

The comorbidities found in the present study (hypertension, hypercholesterolemia and

diabetes) are considered risk factors for the development of cardiac conditions such as

myocardial infarction (46) and atherosclerosis (47). In addition to the disorders caused by

chronic chagasic cardiopathy, this clinical form may increase the risk of infarction in these

individuals (Malik et al, 2015).

However, the impact of these morbidities on disease progression is uncertain. The chronic

disorders of these elderly individuals, chronic chagasic infection and their severe clinical forms

emphasize the importance of a special attention in these patients.

Other information raised in the present study is about BMI. Although no significant difference

was found between the BMI and the studied groups, a prevalence of 32.6% of chagasic

patients with eutrophy was observed, 44.4% were overweight, and 17.8% were obese in the

group of asymptomatic and symptomatic individuals. Geraix et al (2007) found a prevalence

of 62.1% obese in chagasic patients (49).

120

According to the Ministry of Health, it is estimated that there are 60% of obese people in the

country (50). The BMI of individuals may vary according to the study population, since they

involve environmental, psychosocial and physiological factors (51). As with the previously

mentioned morbidities, overweight and obesity are considered risk factors for the development

of cardiovascular diseases as well as increased blood pressure, cholesterol and glucose

(52,53).

In the present study, a significant difference was observed between the AA and AC genotypes

of the ACAT-1 gene rs1044925 SNP among asymptomatic and symptomatic chagasic

individuals. This data suggests a protective character in the pathogenesis of the disease

among the carriers of these genotypes.

Accordingly, in a study carried out with a population of China, the AC and CC genotypes of

rs1044925 were associated with low levels of total cholesterol and LDL in women when

compared to the AA genotype (22). AC and CC genotypes were also associated with increased

systolic pressure in smokers (23). In another study, the AC and CC genotypes of the

rs1044925 SNP were associated with higher levels of total cholesterol and HDL in the serum

of men with hypercholesterolemia (24).

In the present study, 14.9% of chagasic patients with hypercholesterolemia were observed in

both groups. In the literature, 22,7% of hypercholesterolemia was found among 66 chronic

chagasic patients studied (49).

Cholesterol is an important molecule, constituent of cell membranes that is involved in several

physiological processes, such as maintenance of membrane fluidity, bile acid metabolism and

steroid hormones (54,55). The excess of free cholesterol can be harmful to the cells, so it is

necessary to convert them into cholesterol esters that are organized into drops of cytoplasmic

lipids (56,57). It is known that these lipid droplets are involved in several inflammatory

processes (58,59).

121

Recent studies have evaluated the role of host lipid metabolism in T. cruzi infection (25).

Johndrow et al. (2014) found increased levels of intracellular cholesterol in heart tissues of a

late stage individual with the cardiac form of Chagas' disease, a fact that was not observed in

heart tissue of an individual who died due to ischemic heart disease (60). They also found

increased LDL in the pancreas and heart of animals infected with a chronic T. cruzi strain 90

days post infection (60). Fernandes et al (2007) also found that cholesterol depletion in T. cruzi

infected cells by infecting forms (trypomastigote) and non-infective (amastigotes) in vitro

resulted in decreased invasion of these parasites, which was recovered after cell cholesterol

plenum (61).

On the other hand, Nagajyothi et al. (2014) observed that mice infected with T. cruzi (acute

phase strain) and submitted to a high fat diet showed decreased parasitemia and increased

survival rate compared to mice with regular fat diet. It was also observed that the morphological

alterations of the heart of mice submitted to rich diet and fat were less pronounced in

comparison with the animals that maintained a regular diet of fat (62).

These studies suggest cholesterol involvement in T. cruzi infection. However, much of the

literature refers to the acute phase of infection and the differences are observed regarding the

role of cholesterol in the pathogenesis of Chagas' disease.

Conclusion

In the present work, we found a higher frequency between AA and AC genotypes in

asymptomatic chagasic individuals when compared to symptomatic individuals. This result

suggests that the carriers of these genotypes have a protective character in relation to

symptomatic clinical manifestations of the disease in the chronic phase. This data is

unprecedented and can bring great contributions to a better understanding of the pathogenesis

of the disease and clinical follow up of the patients. Further studies should be carried out in

order to evaluate the importance of lipid metabolism in the infection and to clarify the functional

122

role of this polymorphism in the clinical manifestations of chagasic individuals in different

populations.

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Table 1 - Relation of genes and as respective restriction enzymes, enzyme cleavage site and genotypes surveyed in patients with chronic symptomatic and asymptomatic Chagas disease

Gene/ SNP Restriction

Enzyme Enzyme cutting site Genotypes

ACAT-1 (rs1044925)

RsaI 5’...GT↓AC...3’ 3'...CA↑TG...5'

AA – 389 bp; AC - 389, 279 e 110 bp; CC - 279 e 110 bp

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Figure 1. Origin of chronic chagasic patients grouped by microregions of the State of São Paulo, Brazil, genotyped for ACAT-1 gene *

* Except for two patients from Siqueira Campos, Paraná, Brazil

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Table 2. Distribution of sex, mean age and standard deviation, body mass index and comorbidities of 135 chronic chagasic patients subdivided by asymptomatic and symptomatic clinical form, from different Brazilian municipalities

Clinical forms (n = 135)

Asymptomatic

(n = 86) Symptomatic

(n = 49) P value

Sex n (%) Male 46 (53,5) 23 (46,9) p > 0,05

Female 40 (46,5) 26 (53,1) p > 0,05 Total n (%) 86 (100) 49 (100)

Mean age and

standard deviation 59,0±8,0 years 61,5±9,1 years p > 0,05

Body mass index n (%)

Underweight 3 (3,5) 4 (8,2) p > 0,05 Normal range 27 (31,4) 17 (34,7) p > 0,05 Overweight 42 (48,8) 18 (36,7) p > 0,05

Obese 14 (16,3) 10 (20,4) p > 0,05 Total n (%) 86 (100) 49 (100)

Comorbidities n (%)

Hypertension 12 (21,1) 11 (26,9) p > 0,05

Hypercholesterolemia 15 (26,3) 5 (12,2) p > 0,05 Diabetes 6 (10,5) 1 (2,4) p > 0,05

Associated comorbidities

24 (42,1) 24 (58,5) p > 0,05

Total 57 (58,2) 41 (41,8) Goodman's association test considering the level of significance of 5%. P value: comparison of response categories (columns) within the group (rows). The Student's t-Test was applied for independent samples

130

Table 3. Distribution of ACAT-1 genotypes according to asymptomatic and symptomatic patients with chronic Chagas' disease, coming from different Brazilian municipalities

ACAT-1 Genotypes

Clinical forms n (%)

Asymptomatic Symptomatic Total

AA 34 (63,0) Ba 20 (37,0) Aa 54 (40,0)

AC 43 (66,2) Ba 22 (33,8) Aa 65 (48,1)

CC 9 (56,3)Aa 7 (43,7) Aa 16 (11,9) TOTAL 86 (63,7) 49 (36,3) 135 (100)

Goodman's association test considering the level of significance of 5%. Capital letters: comparing response categories (columns) within the group (rows), where B> A and AB does not differ from A and B. Lower case letters: group comparison (rows) fixed to response category (column), being b> a and ab does not differ from a and b

Table 4. Distribution of allelic frequencies of the ACAT-1 gene according to asymptomatic and symptomatic patients with chronic Chagas’ disease, coming from different Brazilian municipalities

ACAT-1 Genotypes Clinical forms

n (%)

Asymptomatic Symptomatic

A 97 (56,1) Aa 76 (43,9) Aa

C 55 (56,7) Aa 42 (43,3) Aa

TOTAL 152 118 Goodman's association test considering the level of significance of 5%. Capital letters: comparing response categories (columns) within the group (rows), where B> A and AB does not differ from A and B. Lower case letters: group comparison (rows) fixed to response category (column), being b> a and ab does not differ from a and b

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Anexo II: Parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa

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134

135

Anexo III – Mudança de título

136

Anexo IV – Termo de consentimento livre e esclarecido

137

Anexo V – Comprovante de submissão de manuscrito