Wstęp

Ostatnie kilka lat intensywnych badań prowadzonych w ramach nanotechnologii doprowadziło do opracowania na-

nomateriałów, które pozwoliły na zastosowanie w praktyce eksperymentalnej i klinicznej nanonarzędzi przeznaczonych do obrazowania subkomórkowego oraz molekularnej dia-

gnostyki nowotworów [1-4]. Nanocząsteczki w onkologii są wykorzystywane zarówno w bardzo czułych metodach obrazowania charakteryzujących się wysoką specyficzno-

ścią, ale także mogą być użyteczne jako nośniki dla cyto-

statyków dostarczających leki wybiórczo nacelowane na zmieniono nowotworowo komórki guza. Niestety, aktualna wiedza na temat odpowiednich bioznaczników charaktery-

stycznych dla fenotypowo zmienionej tkanki nowotworo-

wej pozwalających na specyficzne jej obrazowanie na tle tkanek zdrowych jest ograniczona. Taka sytuacja zmusza chemików, biologów, nanotechnologów oraz klinicystów do poszukiwania odpowiednich rozwiązań technicznych, umożliwiających tworzenie specjalnie zaprojektowanych bioaktywnych sond molekularnych, które pozwolą uzyskać wiarygodne dane z obrazowania użyteczne w diagnostyce onkologicznej. Jest co najmniej kilka przeszkód stojących na drodze do opracowania dobrych nanonarzędzi do dia-

gnostyki nowotworów: (1) odpowiedni system dostarcze-

nia nanosondy w okolice tkanki nowotworowej; (2) niska toksyczność i optymalna biodostępność; (3) stabilność na-

nokonstruktu w środowisku płynów ustrojowych; (4) do-

statecznie duża efektywność wzbudzania sygnału niezbęd-

nego do obrazowaniu w warunkach in vivo oraz (5)

Streszczenie

Nanotechnologia jest stosunkowo nową interdyscyplinar-ną dziedziną nauki zajmującą się zarówno projektowaniem jak i inżynierią w skali nano (< 500 nanometrów [nm]). W najbliższym czasie technologia ta może przyczynić się do kolejnego przełomu w nowoczesnej terapii celowanej oraz diagnostyce molekularnej. Superparamagetyczny tlenek żelaza jest obecnie jednym z najważniejszego na-

nomateriałów do biomedycznych zastosowań. Nanoczą-

steczki mają relatywnie dużą powierzchnię co umożliwia ich skonjugowanie z różnymi ligandami (przeciwciała monoklonalne, peptydy) nacelowanymi na komórki no-

wotworowe. Ponadto nanocząsteczki tlenku żelaza mają unikalne właściwości paramagnetyczne, co czyni je do-

skonałym środkiem cieniującym do zastosowań w dia-

gnostyce onkologicznej z wykorzystaniem technik ma-

gnetycznego rezonansu jądrowego. Zrozumienie podstaw tej ciągle rozwijającej się technologii oraz potencjalnych aplikacji klinicznych powinno być potrzebą wszystkich zajmujących się badaniem, diagnostyką oraz leczeniem onkologicznym.

Słowa kluczowe: nanotechnologia, nanocząsteczki, obra-

zowanie, nanokontrasty, tlenek żelaza

Summary

Nanotechnology is relatively new interdisciplinary sci-ence dealing with designing and engineering in a nano-

scale (< 500 nanoscopic meters [nm]). This technology, in near future, may contribute to the next breakthrough in modern targeted therapy and molecular diagnostics. Su-

perparamagnetic iron oxide is currently one of the most important nanomaterials for biomedical applications. Nanoparticles have relatively large surface which allow their conjugation with numerous ligands (monoclonal an-

tibodies, peptides) aimed at cancer cells. Moreover, the iron oxide nanoparticles have unique paramagnetic char-acteristics making them a perfect contrast agent for on-

cological diagnostics applications using nuclear magnetic resonance. Understanding the basis of this constantly de-

veloping technology and its potential clinical application should be a need of all people involved in research, diag-

nostics and treatment of cancer.

Key words: nanotechnology, nanoparticles, imagining, nanocontrasts, iron oxide

kompatybilność z istniejącymi technologiami stosowanymi w obrazowaniu.

Technika magnetycznego rezonansu (MRI, magnetic re-

sonance imaging) dostarcza obrazów wysokiego kontrastu, umożliwia określenie morfologii tkanek oraz szczegółów anatomicznych całego ciała. Technika ta jest najważniej-szym narzędziem do diagnozowania onkologicznego, a przy wysokiej czułości możliwe jest jej dostosowanie do potrzeb obrazowania na poziomie komórkowym i molekularnym [5, 6]. W celu uzyskania bardziej szczegółowego obrazu, w metodzie MRI, stosuje się specjalne kontrasty o właściwo-

ściach magnetycznych. Przyjętym standardem klinicznym w MRI jest użycie Gd-DTPA (gadolinium diethylenetria-

minopentaacetic acid), który jest kontrastem dający silny efekt T1. Z drugiej strony Gd-DTPA ma niską efektywność kontrastową, krótki czas retencji w warunkach in vivo oraz

brak jednoznacznie określonej toksyczności i biokompa-

tybilności z wewnątrzkomórkowym środowiskiem. Nadal poszukuje się innych, alternatywnych rozwiązań, które po-

lepszyłyby jakość uzyskanych obrazów MRI [7-9]. Takim nowym czynnikiem kontrastowym może być nanocząstecz-

kowy magnetyczny tlenek żelaza (ION, iron oxide nanopar-

ticles), który stanowi nową generację nośników przeznaczo-

nych do nowotworowo-specyficznego obrazowania metodą MRI. Magnetyczny ION jest dużo bardziej efektywny niż Gd-DTPA, ponieważ możliwa jest modyfikacja jego właści-wości magnetycznych poprzez zmianę wielkości krystalito-

wego rdzenia i zastosowanie specjalnych powłok okrywają-

cych ION [10]. Ponadto magnetyczny ION charakteryzuje

się długim czasem retencji we krwi, jest biodegradowalny oraz ma niską toksyczność [5, 11-14]. Niniejsza praca jest przeglądem badań z ostatnich kilku lat, przedstawiającym rozwój metod obrazowania nowotworów z użyciem kontra-

stów opartych o magnetyczne ION.

Superparamagnetyczne czynniki kontrastowe do zastosowań w MRI

Kontrasty oparte o superaparamagnetyczne czynniki takie jak IO, mają postać układów koloidalnych zbudowa-

nych z cząstek o wymiarach w granicach 5 – 200 nm. Każda cząstka składa się natomiast z bardzo małych krystalitów zawierających po kilka tysięcy jonów. Superparamagne-

tyzm to zjawisko pojawiające się w niektórych materiałach magnetycznych, które składają się z krystalitów (1 – 10 nm) zwanych nanocząstkami. Pojedynczy krystalit nie ma w so-

bie podziału na odrębne domeny magnetyczne. W tempera-

turze poniżej temperatury Curie lub temperatury Néela ener-gia termiczna nie jest wystarczająca do zerwania oddziały-

wań pomiędzy sąsiadującymi atomami, jednakże może być wystarczająca do zmiany orientacji namagnesowania całe-

go krystalitu. Jeżeli energia termiczna będzie większa niż energia anizotropii magnetycznej, spowoduje to, że moment magnetyczny cząstki będzie mógł się przeorientować. Takie ciągłe fluktuacje sprawiają, że materiał zacznie zachowy-

wać się podobnie jak paramagnetyk. Główną różnica polega jednak na tym, że w paramagnetyku przyłożone pole ma-

gnetyczne wpływa na momenty magnetyczne pojedynczych

Rodzaj IONNazwa handlowa

(producent)

Inne nazwy

(producent)Charakterystyka Piśmiennictwo

USPIO Sinerem® (Guerbet);

Combidex®

(AMAG

Pharmaceuticals)

Ferumoxtran;

AMI-227

(AMAG

Pharmaceuticals)

wielkość krystalitu: 4,3-4,9 nm;

całkowita wielkość: około 50 nm[46]

ClariscanTM

(GE Healthcare)

Feruglose;

PEG-FERRON (GE

Healthcare)

czynnik wewnątrznaczyniowy [82]

SupravistTM

(Bayer Schering

Pharma AG)

SHU-555C

(Bayer Schering

Pharma AG)

nanokontrast przeznaczony do MRA, obecnie w

III fazie badań klinicznych[83]

SPIO EndoremTM

(Guerbet);

Feridex® (AMAG

Pharmaceuticals)

Ferumoxide;

AMI-25 (AMAG

Pharmaceuticals)

wielkość krystalitu: 4.3–4.8 nm; całkowita

wielkość: około 200 nm[46]

Resovist®

(Bayer Schering

Pharma AG)

Ferrixan;

Ferucarbotran;

SHU-555A

(Bayer Schering

Pharma AG)

zawiesina nanocząsteczek opłaszczonych

karboksydekstranem;

rdzeń zawiera kilka krystalitów, każdy o średnicy

około 4,2 nm;

całkowita wielkość: około 62 nm

[84, 85]

Lumirem® (Guerbet);

GastroMARK®

(AMAG

Pharmaceuticals)

Ferumoxsil;

AMI-121 (AMAG

Pharmaceuticals)

zawiesina nanocząsteczek SPIO opłaszczonych

silikonem [86]

MPIO

Abdoscan®

(GE Healthcare)

Ferristene;

OMP

(GE Healthcare)

krystality IO opłaszczone hydrofobowym

polimerem;

wielkość całkowita około 3 μm

[87]

Tab. I. Dostępne kontrasty IO do zastosowań w MRI [na podstawie Magnetic Resonance - Technology Information Portal:

http://www.mr-tip.com]

MRA - magnetic resonance angiography; OMP – oral magnetic particles

atomów, zaś w superparamagnetyku pole oddziałuje na mo-

menty magnetyczne pochodzące od całych krystalitów. Po-

nadto moment magnetyczny dla takich superparamagnetycz-

nych nanocząsteczek IO jest znacznie większy, niż dla chela-

towanych cząsteczek zawierających jon gadolinu [15, 16].Każda z cząstek zbudowana jest z rdzenia składające-

go się z kilku krystalitów i otoczony płaszczem ochronnym (patrz niżej). Wymiary krystalitów wpływają na właściwo-

ści takie jak relaksacja, a całkowita średnica cząstki odpo-

wiada za cechy farmakokinetyczne kontrastu. Ze względu na wielkość cząstek można ION kontrasty podzielić na trzy rodzaje: (1) USPIO (ultrasmall superparamagnetic iron oxi-

de) o wymiarach poniżej 50 nm; (2) SPIO (superparama-

gnetic iron oxide) o wymiarach w granicach 50 nm – 1 μm oraz (3) MPIO (micron-sized particles of iron oxide) duże cząsteczki dochodzące do kilku mikrometrów. Wielkości cząstek USPIO i SPIO pozwalają na ich dożylne zastoso-

wanie, natomiast wymiary MPIO ograniczają ich podane je-

dynie drogą doustną w celu wykonania obrazowania układu pokarmowego. Ponadto nanocząsteczki SPIO są używane jako negatywne kontrasty do obrazowania wątroby, ponie-

waż wykazują się one dużym powinowactwem do siateczki endoplazmatycznej (RES, reticuloendothelial system) ko-

mórek wątroby (Kupffer cells) i śledziony. Natomiast na-

nocząsteczki o wymiarach poniżej 300 nm charakteryzują się długim okresem półtrwania we krwi, co umożliwia ich zastosowanie w angiografii. Nadal poszukuje się również nowych zastosowań dla takich formulacji ION, jak MION (monocrystalline iron oxide particles) czy CLIO (cross-

linked iron oxides) [17].Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) opiera

się na zjawisku jądrowego rezonansu magnetycznego, który jest z powodzeniem stosowany w spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) w laboratoriach fizycz-

nych i chemicznych. W istocie MRI jest tomografią z za-

stosowaniem NMR dla jąder atomów wodoru zawartych w cząsteczkach wody. Woda znajduje się we wszystkich miękkich tkankach ludzkich, jednak w różnych proporcjach w stosunku do innych związków chemicznych. Przy użyciu specjalnej cewki, fale radiowe (RF, radio frequency) są wy-

syłane w kierunku badanego obiektu. Protony atomów wo-

doru pochłaniają energię fali RF i wpadają w rezonans. Za-

leżnie od natężenia sygnału oraz czasu jego trwania protony atomów wodoru przechodzą na wyższy poziom energetycz-

ny. Po wyłączeniu „zakłócenia”, protony wracają do stanu początkowego, wypromieniowując energię, którą wcześniej pozyskały, w postaci sygnału swobodnej relaksacji. Po-

woduje to dające się zarejestrować zmiany sygnału emisji rezonansowej pochodzących z atomów wodoru obecnych w cząsteczkach wody, zawartych w tkankach. Relaksacja to zanikanie sygnału jakie następuje po wyłączeniu oddziały-

wania energii fali RF i jest wynikiem powrotu protonów do stanu równowagi (tzw. relaksacja podłużna, stała czasowa T1) lub też wynika ze wzajemnego oddziaływania momen-

tów magnetycznych sąsiednich protonów (tzw. relaksacja poprzeczna, stała czasowa T2). Relaksacja indukowana przez środki kontrastowe oparta o cząsteczki superparame-

gnetyczne [16] jest opisana przez teorię relaksacji sformuło-

waną przez Curie (classical outer-sphere relaxation theory)

[18]. Teoria ta wyjaśnia jakie jest tempo relaksacji protonów

wodoru znajdujących się w otoczeniu niesparowanych elek-

tronów namagentyzowanych cząstek kontrastu [19]. Takie środki cieniujące charakteryzują się bardzo silnym wzmoc-

nieniem T1, przy równoczesnej zmianie podatność okolic sąsiadujących z kontrastem na oddziaływanie pola magne-

tycznego, co ma wpływ na T2. W zależności od promienia cząstek, nankontrasty USPIO silniej wpływają na T1 (T1-zależne środki, kontrasty pozytywne) w przeciwieństwie do SPIO, które są T2-zależne (kontrasty negatywne) [20-23].

Modyfikacje funkcjonalne ION

Jest wiele różnych metod chemicznych, które mogą słu-

żyć do syntezy magnetycznych ION. Najczęściej stosowane to: metoda oparta o wytrącanie lub współwytrącanie oraz metoda syntezy odwróconej miceli [24, 25]. ION pozba-

wione odpowiedniego zewnętrznego płaszcza są niestabilne w środowisku wodnym i mają tendencję do agregacji i two-

rzenia osadu. Po padaniu in vivo, cząsteczki te często tworzą agregaty we krwi, które następnie ulegają sekwestracji przez makrofagi [26]. Dlatego też powierzchnia ION powinna być pokryta różnego typu polimerami, które eliminują lub znacz-

nie zmniejszają efekt agregacji w warunkach fizjologicz-

nych in vivo. W praktyce można zastosować opłaszczenie in situ w trakcie lub bezpośrednio po syntezie ION [27-29]. Ponadto możliwe jest kapsułkowanie magnetycznych ION w liposomach lub też utworzenie magnetoliposomów [30].

Polimerowe amfifilowe surfaktanty takie jak po-

loksamery, polokasaminy i glikol polietylenowy (PEG, poly(ethylene glycol)) są zwykle używane do utworze-

nia otoczek powierzchniowych ION w celu zmniejszenia lub całkowitego wyeliminowania opsonizacji ION. Wśród wymienionych polimerów amfifilowych najczęściej stoso-

wanym do tworzenia otoczek powierzchniowych jest PEG, który nadaje ION takich pożądanych cech jak: wysoką roz-

puszczalność i stabilność w wodnym środowisku, biokom-

patybilność oraz długi czas retencji we krwi. Bardzo istotną cechą PEG jest możliwość modyfikacji jego grup funkcyj-nych pozwalająca na skonjugowanie z ION różnego rodzaju ligandów lub cząsteczek czynnych farmakologicznie [25, 31-36]. Oczywiście takie opłaszczone ION mają ograni-czoną liczbę miejsc wiązania dla ligandów, ponieważ jest ona limitowana liczbą wolnych grup funkcyjnych zlokali-zowanych w warstwie powierzchniowej ION [33]. Laconte i współpracownicy oraz Yang i współpracownicy wykazali, że masa molekularna PEG znacząco wpływa na stopień bio-

dystrybucji opłaszczonych ION w warunkach in vivo [37, 38]. Dlatego też ważne jest dobranie odpowiedniej grubości warstwy płaszcza PEG podczas projektowania ION prze-

znaczonych do konstrukcji sond używanych do nowotworo-specyficznego obrazowania in vivo.

Poza PEG również inne materiały mogą być używane do tworzenia otoczek ION, należą do nich: poly(TMSMA-r-PEGMA) (TMSMA, 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, PEGMA, poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate)

[26], warstwy kwasu hialuronowego (HA, hyaluronic acid)

[39], modyfikowane dendrymery 3 generacji (3G) klasy poli-(amido-aminowe) (PAMAM, poly(amido amine)) [40].

Ostatnio utworzono również nową klasę superpara-

megnetycznych cząsteczek, które mają jednolitą wielkość

sięgającą 5 – 30 nm. Takie nanocząsteczki mogą zostać opłaszczone trójblokowymi amfifilowymi polimerami, któ-

re dostarczają grup funkcyjnych do skonjugowania z od-

powiednimi ligandami, takimi jak przeciwciała lub krótkie peptydy, które mają duże powinowactwo do biomolekuł specyficznych dla tkanki nowotworowej [41].

Pomimo intensywnych badań nad rozwojem zastosowań ION do kontrastowania metodą MRI, kilka przeszkód nadal nie zostało pokonanych. Głównym wyzwaniem jest opraco-

wanie materiałów powierzchniowych do tworzenia otoczek, które będą nie tylko stabilizować nanocząsteczki w warun-

kach in vivo, ale przede wszystkim będą dostarczać odpo-

wiednich grup funkcyjnych do kontrolowanej biokonjugacji ligandów tworzących sondę. Zbyt słabe związanie materia-

łu tworzącego płaszcz nanocząsteczki, może przyczyniać się do oderwania powłoki i utworzenia agregatów podczas przechowywania kontrastu lub w warunkach użycia in vivo.

Ponadto tak uszkodzony kontrast przestaje być użyteczny w specyficznym obrazowaniu opartym o reakcję ligand ↔ target. Innym istotnym problemem są właściwości magne-

tyczne ION, które wpływają na efektywność obrazów uzy-

skanych w MRI. Właściwości te zależą w znacznym stopniu od morfologii, struktury krystalitu, wielkości oraz jednoli-tości mieszaniny ION. Aktualnie, najwięcej badań związa-

nych z użyciem ION do celów molekularnego obrazowania, poświęconych jest metodą kontroli wielkości i morfologii nanocząsteczek. Cechy te są krytyczne dla właściwości ma-

gnetycznych kontrastów co bezpośrednio wpływa na jakość uzyskanych obrazów MRI, a w konsekwencji na użytecz-

ność kliniczną tej metody. Dla potrzeb takich zastosowań najlepsze są ION o wymiarach w granicach od 5 do 150 nm, wysokiej masie magnetycznej oraz możliwości utworzenia stabilnych konstruktów skoniungowanych z wysoce specy-

ficznymi ligandami dla biomolekuł nowotworowych [17, 42].

Zarejestrowane nanokontrasty IO stosowane w obrazowaniu in vivo

Wśród różnych rodzajów używanych kontrastów in vivo

można wyróżnić dwie podstawowe grupy: niespecyficzne oraz organo-specyficzne środki cieniujące. Pierwsze spo-

śród nich to takie, które nie mają jakiegoś szczególnego powinowactwa do określonych struktur komórkowych lub tkanek, charakteryzują się niską masą cząsteczkową, szyb-

kim klirensem nerkowym, szybko osiągają jednakowe stę-

żenie w kompartmencie śródnaczyniowym i pozanaczynio-

wym. Środki takie są stosowane w obrazowaniu przestrzeni pozakomórkowych (ECF, extracellular fluid agents). Do

pierwszej grupy kontrastów zalicza się również czynniki o większej masie cząsteczkowej, które osiągają duże stęże-

nie śródnaczyniowe, wolno ulegają wydalaniu przez nerki i/lub wątrobę, mają one zastosowanie w technikach obra-

zowania naczyń (MRA, magnetic resonance angiography).

Organo-specyficzne kontrasty wykazują się dużym powi-nowactwem do określonych typów komórek, przy czym zdolność do specyficznej dystrybucji tkankowej może mieć charakter bierny lub czynny (kontrasty celowane). Orga-

no-specyficzne bierne środki cieniujące mają zastosowanie w obrazowaniu wątroby, śledziony, węzłów chłonnych,

szpiku kostnego oraz mózgu. Natomiast kontrasty celowa-

ne, ulegające czynnej biodystrybucji, są tak skonstruowane, aby specyficznie rozpoznawać pewne stany patologiczne, takie jak procesy zapalne i miażdżycowe czy apoptozę, ale także fenotypowo zmienione komórki np. powstające w wy-

niku transformacji nowotworowej. W wielu przypadkach molekularne cele, na które skierowane są takie kontrasty zlokalizowane są wewnątrzkomórkowo.

Nanocząsteczki SPIO używane są w obrazowaniu in

vivo jako kontrasty charakteryzujące się w zależności od stężenia, silnym wzmocnieniem T1 lub T2 [43]. Ze wzglę-

du na znaczne rozmiary cząsteczek kontrastu, bardzo wolno przenika on przez barierę naczyniową, długi czas pozostając w znacznym stężeniu w kompartmencie śródnaczyniowym. Ponadto w przeciwieństwie do środków opartych o chelato-

wany Gd3+, kontrasty ION są wychwytywane poprzez sys-

tem RES wątroby, śledziony i węzłów chłonnych i włączone w ogólnoustrojowy obieg żelaza (ferrytyna, hemosyderyna, hemoglobina), co sprawia że eliminacja z organizmu nie jest prostym procesem opartym o filtrację nerkową. Nano-

kontrasty SPIO po podaniu dożylnym nie akumulują się w hepatocytach ani komórkach metastazowych, ale ulegają sekwestracji przez fagocytujące komórki Kupffera wątro-

by i śledziony, które stanowią jedynie 2-3% całej populacji komórek tych narządów. Ponieważ nanocząsteczki SPIO wykazują się bardzo silnym efektem T2, więc nawet nie-

wielka ich koncentracja pozwala na obrazowanie wątroby z użyciem takich kontrastów. Obecnie jest dostępnych kil-ka zarejestrowanych kontrastów SPIO stosowanych w ob-

razowaniu wątroby i śledziony: AMI-25 (Feridex®, AMAG

Pharmaceuticals lub EndoremTM, Guerbet) oraz Resovist®

(Bayer Schering Pharma AG) (Tabela I) [44]. Komórki zmienione nowotworowo są pozbawione RES lub mają obniżoną aktywność tego systemu, co skutkuje zróżnico-

waną koncentracją kontrastu. Resovist® nie akumuluje się w komórkach metastazowych, ale może się gromadzić w ko-

mórkach rakowych HCC (hepatocellular carcinoma) i FNH (focal nodular hyperplasia). Feridex® nie ulega sekwestracji przez większość typów komórek nowotworowych. Ponie-

waż większość tkanek, takich jak przerzuty, guzy pierwotne, cysty czy gruczolaki charakteryzuje się słabszym powino-

wactwem do kontrastów SPIO, to możliwe jest ich zobrazo-

wanie, dzięki dużej intensywności świecenia na tle zdrowej tkanki, widocznej jako ciemny obszar [45]

Nanocząsteczki o mniejszych średnicach jak USPIO, ferumoxtran-10 (Sinerem®, Guerbet; Combidex®, feru-

moxtran, Advanced Magnetics), SHU-555C (SupravistTM, Bayer Schering Pharma AG) i VSOP-C184 (Ferropharm

GmbH), wykazują się mniejszym efektem relaksacji niż SPIO, ale za to mają korzystniejszy stosunek wartości T1/T2 co czyni je doskonałymi środkami cieniującymi dla tech-

nik MRA (Tabela I) [46-48]. USPIO nie akumulują się tak szybko w układzie RES, jak duże cząsteczki innych kontra-

stów, co skutkuje ich długim okresem biologicznego półtr-wania [49]. Niewielkie wymiary cząsteczek USPIO (mniej niż 10 nm) pozwalają na ich swobodne gromadzenie się w układzie limfatycznym, a przede wszystkim w węzłach chłonnych. Szczególnie dużym powinowactwem do USPIO wykazuje się układ fagocytów jednojądrowych (MPS, mo-

nonuclear phagocyte system) układu limfatycznego. Prawi-

dłowe utkanie tkankowe węzłów chłonnych, widoczne jest w obrazowania z użyciem kontrastu USPIO jako ciemny obszar, podczas gdy obecność przerzutów (mają mniejsze powinowactwo do kontrastu) można stwierdzić po jasnych plamach. Jeden z komercyjnie dostępnych nanokontrastów opartych o technologię USPIO stosowanym w obrazowaniu węzłów chłonnych jest Sinerem® (Guerbet) [50]. Wśród in-

nych możliwych zastosowań takich kontrastów można wy-

mienić: (1) określanie statusu angiogenezy w sąsiedztwie guzów nowotworowych, (2) lokalizacja i stan płytek miaż-

dżycowych oraz (3) obrazowanie zmian w szpiku kostnym. Cząsteczki IO o wymiarach przekraczających 1 μm

(MPIO) jak na przykład Abdoscan® (GE Healthcare) zbu-

dowany z opłaszczonych krystalitów IO o całkowitej wiel-kości 3 μm oraz Lumirem® (Guerbet) znany również, jako GastroMARK® (AMAG Pharmaceuticals) zawiesina SPIO opłaszonych silikonem, są stosowane jako doustne środki cieniujące w obrazowaniu przewodu pokarmowego (Tabe-

la I) [51]. Kontrasty te wypełniając żołądek i jelito cienkie powodują zaciemnienie tych obszarów umożliwiając obra-

zowanie struktur przyległych w tym trzustki, jelita grubego i przewodów żółciowych (cholangiografia MR).

Tworzenie kontrastów celowanych ION przeznaczonych do MRI

Pomimo że liczne wyniki badań wskazują na możliwość zastosowanie ION w diagnostyce i terapii nowotworów [17, 52], to główną przeszkodą ograniczającą szerokie zastoso-

wanie tych nanoobiektów w praktyce klinicznej jest brak sa-

tysfakcjonującej specyficzności kontrastów, tak aby stopień koncentracji osiągany w okolicach rozrostu nowotworo-

wego, pozwalał na uzyskanie silnego sygnału niezbędnego w czułych metodach obrazowania. Jednym z możliwych rozwiązań powyższego problemu jest skonstruowanie spe-

cjalnych nacelowanych sond zbudowanych z ION i sprzę-

gniętych z nim ligandów dla których target zlokalizowany jest na komórkach nowotworowych [53].

Rozwój nowotworu jest procesem wieloetapowym u podłoża, którego leżą różnego rodzaju zmiany strukturalne i funkcjonalne genomu komórek ulegających transformacji. Podczas trwania procesu kancerogenezy zachodzą zmiany, które z czasem doprowadzają do uzyskania przez komórki stransformowane cech, które odróżniają je od tych jakie po-

siadają komórki tkanek zdrowych. Obecność specyficznych dla komórek nowotworowych guza receptorów powierzch-

niowych może zostać wykorzystane jako potencjalne cele dla sond z wbudowanym ligandem sprzęgniętym z ION.

Przy projektowaniu i budowaniu nacelowanych sond kontrastowych zawierających ION wykorzystuje się róż-

nego rodzaju ligandy, takie jak przeciwciała, peptydy czy małe cząsteczki. Dla takich ligandów celem są biomolekuły zlokalizowane na komórkach zmienionych nowotworowo. W ostatnich kilku latach intensywnie badano w eksperymen-

tach prowadzonych w warunkach in vitro i in vivo różnego rodzaju konstrukty z ION, używając do tego celu hodowli nowotworowych linii komórkowych, zwierzęcych modeli różnych postaci nowotworów oraz zwierząt z wszczepien-

nym guzem (Tabela II). Najintensywniej badanym modelem kontrastu ION jest

sonda oparta o ligand jakim jest przeciwciało monoklonalne, który charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosun-

ku do targetu jakim jest pojedynczy epitop danego antyge-

nu [12, 54-63]. Jednym z takich testowanych eksperymen-

talnie kontrastów były MEIO (magnetism-engineered iron

oxide) skoniungowane z herceptyną (również komercyjnie dostępne humanizowane przeciwciało monoklonalne, Tra-

stuzumab). Jest to dobrze scharakteryzowane przeciwciało skierowane przeciwko receptorom Her-2/neu, których nade-

kspresję obserwuj się na komórkach raka piersi. Recepto-

ry te stały się również targetem dla celowanej terapii tego nowotworu. Ponieważ reakcja antygen-przeciwciało jest bardzo specyficzna, to również dla wysoko czułego obra-

zowania MRI stała się ona doskonałym rozwiązaniem. Jak pokazał Lee i współpracownicy możliwe jest wykonanie ta-

kiej detekcji z użyciem sprzęgniętych sond w warunkach in

vivo, małego guza o wielkości 50 mg [62]. Jednakże mimo tak obiecujących wyników, nierozwiązanym problemem po-

zostaje wielkość użytych przeciwciał, które nie pozwalają na uzyskanie satysfakcjonującego stopnia skunjugowania z powierzchnią ION. Ponadto rozmiary takich sond unie-

możliwiają skuteczną ich penetrację przez barierę włośnicz-

kową, a tym samy utrudnione jest uzyskanie wysokiego stopnia koncentracji w okolicach guza nowotworowego. Jedną z możliwych strategii przełamania powyższych ogra-

niczeń jest użycie pojedynczych łańcuchów przeciwciał lub peptydów o niskiej masie cząsteczkowej. Kilka takich roz-

wiązań zostało przetestowanych w badaniach eksperymen-

talnych (Tabela II) [23, 64-71].Peptydy dla których targetem są receptory powierzch-

niowe komórek nowotworowych mogą zostać wchłonięte (internalizacja) do przestrzeni wewnątrzkomórkowej po-

przez endocytozę. Uzyskane w ten sposób wysokie stężenie skonjugowanych ION dostarcza silnego sygnału do detekcji MRI, dlatego też takie peptydy są idealnym ligandem dla nanocząsteczkowych sond używanych jako kontrasty w ob-

razowaniu. Chlorotoksyna jest 36 aminokwasowym pepty-

dem, który ma specyficzne powinowactwo do MMP-2 (ma-

trix metalloproteinase) zlokalizowanego na powierzchni komórek. Proteinaza MMP-2 ulega wysokiej nadekspresji w glejaku i innych podobnych rozrostach nowotworowych, przyczynia się do degradacji macierzy zewnątrzkomórko-

wej prowadząc do wzrostu inwazyjności [72]. Sun i współ-pracownicy pokazali w eksperymencie z użyciem ION opłaszczonych bifunkcjonalnym PEG i sprzęgniętych ko-

walencyjnie z chlorotoksyną, że po dwugodzinnej inkubacji, internalizowane sondy osiągają 10-krotnie większe stężenie wewnątrz komórek glejaka w porównaniu z ION niesprzę-

gniętymi z żadnym ligandem. W badaniach in vivo prowa-

dzonych na mysim modelu, stwierdzono ponadto większy kontrast w obrazowaniu techniką MRI w przypadkach z użyciem nacelowanych ION, niż dla „gołych” kontrastów [73].

Dużym wyzwaniem diagnostyki onkologicznej jest wczesne wykrywanie nowotworów. Antygen uMUC-1 (underglycosylated mucin-1 antigen) jest markerem wcze-

snych zmian nowotworowych, jest on prezentowany na powierzchni komórek niemal wszystkich nabłonkowych gruczolakoraków (adenocarcinoma). uMUC-1 ma kilka istotnych cech, które czynią go doskonałym targetem dla

wczesnej diagnostyki obrazowej: (1) ulega nadekspresji w ponad 50% przypadków raka, a poziom jego ekspresji utrzymuje się podczas rozrostu guza; (2) w komórkach ra-

kowych jest białkiem niskoglikozylowanym w przeciwień-

stwie do tkanek zdrowych gdzie ulega wysokiej glikozyla-

cji, umożliwia to rozróżnienie tych dwóch rodzajów fenoty-

pu w obrazowaniu; (3) jest antygenem powierzchniowym co czyni go dostępnym dla nacelowanych sond kontrastowych. Moor i współpracownicy skonstruowali sondę zbudowaną z rdzenia SPIO opłaszczonego dekstranem (CLIO, cross-

linked iron oxide) i skonjugowanego z peptydem EPPT1 specyficznie rozpoznającym uMUC-1. Tak przygotowany kontrast został użyty in vivo w obrazowaniu techniką MRI i NIRF (near-infrared fluorescence), dodatkowo do tego

celu użyto wyznakowania sondy fluorescencyjnym czyn-

nikiem Cy5.5. Tak przygotowany kontrast daje wysokiej jakości sygnał dostarczający obrazu o szczegółowej loka-

lizacji i stanie guza oraz tkanek go otaczających co czyni go idealnym do zastosowania we wczesnej diagnostyce onkologicznej [64].

Około 37% pacjentek z rakiem piersi ma przerzuty odle-

głe do kości i zajęte węzły chłonne co przyczynia się do ni-skiego odsetka (27%) 5-letnich przeżyć w tej grupie chorych [74]. Możliwość wczesnej detekcji przerzutów za pomocą specjalnie nacelowanych ION mogłoby znacznie poprawić przeżywalność pacjentów z zaawansowaną postacią nowo-

tworu. Ponieważ około 52% komórek raka piersi wykazuje ekspresję receptorów dla LH-RH (liberyna uwalniająca hor-

Nanocząsteczki Cel biologiczny Ligand Nowotwór Piśmiennictwo

SPIO CEA przeciwciało anty-CEA rak okrężnicy (mysz) [56]

MIONantygen

powierzchniowy

przeciwciało

monoklonalne L6

guz wewnątrzczaszkowy LX-1

(szczur)[55]

USPIO receptor dla trasferyny transferyna rak piersi (szczur) [88]

CLIOantygen

uMUC-1peptyd EPPT1

linie komórkowe raka piersi, jelita

grubego, trzustki i płuc oraz model

mysi różnych nowotworów

[64, 65]

Ferumoxides (SPIO)antygen komórek raka

okrężnicy

przeciwciało

monoklonalne A7rak okrężnicy (mysz) [59]

nanokrystality tlenku

żelaza

(Fe3O

4)

receptor

Her-2/neuherceptyna

NIH3T6.7 (model mysi

wszczepienny)[58]

CLIOreceptor dla

bombezyny

peptydy bombezyny

(bombesin peptides)PDAC (mysz) [66]

SPIO kapsułkowany

z czynnikiem

fotodynamicznym

powierzchniowe

antygeny naczyń guzapeptyd F3 glejak (szczur) [67]

SPIO receptor LHRH LHRHlinie komórkowe oraz wszczepienny

guz piersi (mysz) [76]

USPIOantygen

powierzchniowy CD20

przeciwciało

monoklonalne anty-

CD20

chłoniak Burkitta (mysz) [61]

SPIOsurowicze białka

krzepnięciapeptyd CREKA wszczepienny guz piersi (mysz) [68]

USPIO integryna αvβ

3peptyd RGD rak naskórkowy (mysz) [69]

MEIO receptor Her-2/neu herceptynaNIH3T6.7 (model mysi

wszczepienny)[35]

CLIOgen Birc5 kodujący

surwiwinęsiRNA (siSurvivin) gruczolakorak jelita grubego (mysz) [89]

PEG-SPIOreceptor dla kwasu

foliowegokwas foliowy

linia komórkowa ludzkiego

nabłonkowego nowotworu wargi[63]

Dekstran-IO receptor Her-2/neu

Trastuzumab

(humanizowane

przeciwciało

monoklonalne)

mysi model z nadekspresją

receptora Her-2/neu[90]

PEG-IO MMP-2 chlorotoksyna glejak (szczur) [34, 73]

CLIO hepsyna (hepsin) peptyd IPLVVPL rak prostaty (mysz) [23]

CLIOintegryna plektyna-1

(plectin-1)peptyd PTP PDAC (mysz) [70]

SPIO receptor EGFRfragment przeciwciała

anty-EGFR

wszczepienne guzy trzustki i nerek

(mysz) [71]

Tab. II. Testowane in vivo i in vitro ION z przeznaczeniem do celowanej diagnostyki onkologicznej [na podstawie Molecular

Imaging and Contrast Agent Database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=micad]

SPIO – superparamagnetic iron oxide; MION – monocrystalline iron oxide nanoparticles; USPIO – ultrasmall superpara-

magnetic iron oxide; CLIO – cross-linked iron oxide; MEIO - magnetism-engineered iron oxide; PEG-IO – poly(ethylene glycol)-magnetic iron oxide; PEG-SPIO – poly(ethylene glycol)-superparamagnetic iron oxide; CEA – canceroembrionic antigen; uMUC-1 – underglycosylated mucin-1; PDAC – pancreatic ductal adenocarcinoma; LHRH – liberyna uwalniająca hormon luteinizujący; MMP-2 – membrane-bound matrixmetallo proteinase-2; EGFR – epidermal growth factor receptor.

mon luteinizujący, luteinizing hormone-releasing hormo-

ne) [75] to jest to doskonały target dla kontrastów opartych o ION. Nanocząsteczki SPIO skonjugowane z dekapepty-

dem rozpoznającym specyficznie receptory LH-RH, które są zlokalizowane zarówno na komórkach guzów pierwot-nych oraz metastazowych, ulegają w wyniku internalizacji na drodze endocytozy, wewnątrzkomórkowej akumulacji. W badaniach in vitro, po inkubacji stwierdza się 12-krotnie większe stężenie sprzęgniętych nanocząsteczek SPIO w komórkach docelowych w porównaniu z „gołym” nano-

cząsteczkami. Natomiast w badaniach in vivo, 7,5-krotnie stężenie w komórkach guza pierwotnego i 11-krotne w guzach przerzutowych do wątroby. Tak obiecujące wyniki badań in vivo pozwalają sądzić, że takie konstrukty SPIO będą dobrym narzędziem do wysoko czułego obrazowania techniką MRI metastazowych stadiów raka piersi [76].

Angiogeneza jest jednym z kluczowych mechanizmów związanych z szerzeniem się rozrostu nowotworowego. In-

tegryna αvβ

3 jest markerem angiogenezy, a jej ekspresja ko-

reluje ze stopniem zaawansowania nowotworu. Ponieważ ta biomolekuła zlokalizowana jest w nabłonku naczyń krwio-

nośnych otaczających guz, więc target ten jest bezpośrednio dostępny dla ligandów znajdujących się we krwi, co czyni go idealnym dla celowanej diagnostyki obrazowej. Zhang i współpracownicy użyli ION opłaszczonych APTMS (3-aminopropyltrimethoxysilane), który posiada aminowe grupy funkcyjne. Za pomocą tego polimeru można utworzyć pojedynczą warstwę otaczającą ION, do której wiązaniem kowalencyjnym przyłącza się ligandy peptydowe w rodzaju RGD (Arg-Gly-Asp). RGD sprzęgnięte z nanocząsteczkami USPIO opłaszczonymi APTMS, wykazuje powinowactwo do integryny α

vβ

3. Badania in vivo na myszach o zróżnico-

wanym stopniu zaawansowania nowotworu, wykazały po-

zytywny wynik obrazowania techniką MRI, a intensywność świecenia zależała od poziomu α

vβ

3 w naczyniach krwiono-

śnych okalających guz [69]. Aby zwiększyć czułość obrazowania w warunkach in

vivo konieczne jest nie tylko uzyskanie odpowiedniego stopnia kumulacji kontrastu w komórkach nowotworowych ale przede wszystkim w całej masie guza. Większość obec-

nie używanych targetów do celowanej diagnostyki takich jak Her-2/neu, integryna α

vβ

3, czy uMUC-1 ulegają ekspre-

sji jedynie w pewnej subpopulacji komórek rakowych lub konkretnym typie nowotworu. Simberg i współpracownicy syntezowali specjalny peptyd CREKA (Cys-Arg-Glu-Lys-Ala), który skonjugowany z ION, pozwala utworzyć specy-

ficzną dla architektury zrębu danego guza siatkę, która jest widoczna w obrazowaniu. Ponadto nanokontrasty CREKA-SPIO akumulują się w naczyniach krwionośnych okalają-

cych guz, inicjując przy tym procesy zakrzepowe. Powyższe cechy przyczyniają się do uznania tych nanokontrastów za bardzo obiecujące, ponieważ charakteryzuje je: (1) wysoka specyficzność dla różnych typów guzów litych; (2) wzmoc-

nienie sygnału, co zwiększa czułość MRI; (3) embolizacja w wyniku fizycznego zablokowanie naczyń doprowadzających do guza poprzez utworzenie zatorów zakrzepowych [68].

Niskocząsteczkowy kwas foliowy (FA) dla którego re-

ceptory ulegają często nadekspresji w wielu typach nowo-

tworów, również był badany jako potencjalny ligand do ce-

lowanego obrazowania. Zalety jakie wiążą się z użycie FA

w obrazowaniu to: (1) duża stała wiązania ligand-receptor; (2) niski koszt i stosunkowo prosty proces skonjugowania FA z ION; (3) dobra rozpuszczalność zarówno w wodnym jak i organicznym środowisku; (4) brak immunogenności [77]. Sun i współpracownicy zsyntezowali ION otoczony heterobifunkcjonalnym polimerem PEG 600 do którego następnie wiązaniami amidowymi przyłączyli cząsteczki FA. W badaniach in vitro z użyciem takich nanokontrastów przeprowadzonych na liniach komórkowych HeLa (komór-ki ludzkiego nowotworu karku) wykazano 12-krotnie więk-

szy poziom akumulacji sprzęgniętych ION w komórkach, w porównaniu z grupą kontrolną [78]. Ponadto w badaniach in vitro i in vivo wykazano, że takie nanokonstrukty SPIO-PEG-FA mogą być użyteczne w celowanym obrazowaniu naskórkowego raka nosogardzieli (nasopharyngeal epider-

moid carcinoma) [63, 79].Pinkernelle i współpracownicy wykazali w badaniach

in vitro z użycie ION prowadzonych na hodowli linii ko-

mórkowej ludzkiego raka okrężnicy, że niezbędnym mini-malnym stężeniem żelaza potrzebnym do detekcji nano-

kontrastu metodą MRI było 4–5 µg/106 komórek [80]. Przy zastosowaniu celowanych ION próg wykrywalności zależy bezpośrednio od stopnia koncentracji targetu w komórkach docelowych. Na przykład ekspresja receptorów dla kwasu foliowego notowana w komórkach glejaka wynosi tylko 104, dla porównania ekspresja EGFR (epidermal growth

factor receptors) obserwowana w linii komórkowej A431 ludzkiego raka płaskonabłonkowego to 3 x 106 [81]. Ponad-

to takie czynniki jak: stężenie zewnątrzkomórkowe ION, wielkość nanocząsteczki, rodzaj zewnętrznego płaszcza ION oraz czas inkubacji wpływają na dokładność detekcji MRI. W przypadku detekcji w warunkach in vivo pojawia-

ją się kolejne ograniczenia wymagające nowych rozwiązań technicznych. Poniżej zostaną przedstawione najważniejsze problemy wymagające podjęcia badań eksperymentalnych nad kontrastami opartymi o technologię ION. (1) Konieczne jest każdorazowe opracowanie optymalnej liczby ligandów jakie muszą przypadać na pojedynczą nanocząsteczkę. Ide-

alny stosunek liczby ligandów/jedną nanocząsteczkę zależy od: (a) gęstości targetów prezentowanych na komórkach docelowych; (b) siły wiązania ligand-target; (c) masy czą-

steczkowej i wielkości liganda. (2) Należy przeprowadzić szczegółowe badania wewnątrzkomórkowej dystrybucji ION sprzęgniętych z ligandem: (a) jakie są losy nanokon-

trastu internalizowanego na drodze endocytozy; (b) czy en-

dosom ulega degradacji pod wpływem lizosomów; (c) czy nanokontrast jest uwalniany do cytoplazmy komórki lub lokuje się w okolicach jądra komórkowego. (3) Ponieważ rozpiętość używanych dawek w eksperymentach z udziałem modeli zwierzęcych jest bardzo szeroka, od 1 do 250 mg Fe/kg, utrudnia to właściwe porównanie wyników obrazowa-

nia uzyskanych przez różne zespoły badawcze. (4) Nadal nie udało się określić w badaniach ilościowych in vivo nie-

zbędnych dawek nanokontrastów potrzebnych do uzyskania pożądanej jakości obrazów. Ponieważ możliwe jest łączenie techniki MRI z innymi metodami wykorzystującymi tech-

nologie znakowania takie jak radio- czy NIR-znaczniki, to uzyskany w ten sposób multimodalny obraz umożliwi śle-

dzenie biodystrybucji oraz ilościową ocenę rozkładu znako-

wanych ION w organizmie żywym.

Podsumowanie

Mimo że intensywne badania ostatnich lat dostarczyły przekonujących dowodów na możliwość stosowania róż-

nego typu ION w celowanej diagnostyce onkologicznej, to nadal konieczne jest przeprowadzenie wielu prób przedkli-nicznych i klinicznych z zastosowaniem nanokontrasowych sond. Aplikacje do praktyki klinicznej wymagają nowych rozwiązań, które pozwolą pokonać istniejące ograniczenia w stosowaniu celowanych ION. Różnego typu bariery bio-

logiczne uniemożliwiają uzyskanie dostatecznego stężenia kontrastu w sąsiedztwie rozrostu nowotworowego, zmienna ekspresja biomolekuł stanowiących targety dla nacelowa-

nych ION utrudniają uniwersalne zastosowanie nanokontra-

stowych sond molekularnych, brak dostatecznej dystrybucji kontrastu w całej masie guza oraz trudności w uzyskaniu obrazowania przerzutów odległych zlokalizowanych w róż-

nych miejscach organizmu. Badania eksperymentalne nad nanokontrastami opartymi o technologię ION wskazują, że obecnie zarejestrowane preparaty są tylko niewielką czę-

ścią wciąż niewykorzystanego potencjału jaki tkwi w moż-

liwości klinicznego zastosowania nanonarzędzi w diagno-

styce onkologicznej. Najbliższe lata powinny przynieść odpowiedź na pytanie, na ile obrazowanie technikami MRI z wykorzystaniem nanokontrastów ION może zwiększyć skuteczność wczesnego wykrywania zmian nowotworo-

wych oraz pomóc w zwiększeniu efektywności terapii ce-

lowanej będącej domeną współczesnej onkologii klinicz-

nej.

Piśmiennictwo

Jain KK. Role of nanobiotechnology in developing per-1. sonalized medicine for cancer. Technol Cancer Res Tre-

at 2005; 4: 645-50.Nie S et al. Nanotechnology applications in cancer. 2. Annu Rev Biomed Eng 2007; 9: 257-88.Sengupta S, Sasisekharan R. Exploiting nanotechnolo-3. gy to target cancer. Br J Cancer 2007; 96: 1315-9.Wang MD et al. Nanotechnology for targeted cancer 4. therapy. Expert Rev Anticancer Ther 2007; 7: 833-7. Bradbury M, Hricak H. Molecular MR imaging in oncolo-5. gy. Magn Reson Imaging Clin N Am 2005; 13: 225-40.Ito H. Oncology imaging: current status and new appro-6. aches. Int J Clin Oncol 2006; 11: 256-7.Bird CR et al. Gd-DTPA-enhanced MR imaging in pe-7. diatric patients after brain tumor resection. Radiology 1988; 169: 123-6.Bulte JW, Kraitchman DL. Iron oxide MR contrast 8. agents for molecular and cellular imaging. NMR Bio-

med 2004; 17: 484-99.Kim D, Hong KS, Song J. The present status of cell trac-9. king methods in animal models using magnetic resonan-

ce imaging technology. Mol Cells 2007; 23: 132-7.Rogers WJ, Basu P. Factors regulating macrophage endocy-10. tosis of nanoparticles: implications for targeted magnetic re-

sonance plaque imaging. Atherosclerosis 2005; 178: 67-73.Harisinghani MG et al. Noninvasive detection of clini-11. cally occult lymph-node metastases in prostate cancer. N Engl J Med 2003; 348: 2491-9.

Funovics MA et al. MR imaging of the her2/neu and 12. 9.2.27 tumor antigens using immunospecific contrast agents. Magn Reson Imaging 2004; 22: 843-50.Jain TK et al. Iron oxide nanoparticles for sustained de-13. livery of anticancer agents. Mol Pharm 2005; 2: 194-205.Montet X et al. Nanoparticle imaging of integrins on tumor cells. Neoplasia 2006; 8:214-22.Muller RN et al. Relaxation by metal-containing nano-14. systems. Adv Inorg Chem 2005; 57: 239-92.Laurent S et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: syn-15. thesis, stabilization, vectorization, physico-chemical characterizations and biological applications. Chem Rev 2008; 108: 2064-110.Thorek DL et al. Superparamagnetic iron oxide nano-16. particle probes for molecular imaging. Ann Biomed Eng 2006; 34: 23-38.Gueron M. Nuclear relaxation in macromolecules by 17. paramagnetic ions: a novel mechanism. J Magn Reson 1975; 19: 58-66.Gillis P, Koenig SH. Transverse relaxation of solvent 18. protons induced by magnetized spheres: application to ferritin, erythrocytes and magnetite. Magn Reson Med 1987; 5: 323-45.Koenig SH, Kellar KE. Theory of 1/T1 and 1/T2 NMRD 19. profiles of solutions of magnetic nanoparticles. Magn Reson Med 1995; 34: 227-33.Roch A, Muller RN, Gillis P. Theory of proton relaxa-20. tion induced by superparamagnetic particles. J Chem Phys 1999; 110: 5403-11.Vogl TJ et al. Superparamagnetic iron oxide enhanced 21. versus gadolinium-enhanced MR imaging for differen-

tial diagnosis of focal liver lesions. Radiology 1996; 198: 881-7.Kelly KA et al. Detection of early prostate cancer using 22. a hepsin-targeted imaging agent. Cancer Res 2008; 68: 2286–91.Shen T et al. Monocrystalline iron oxide nanocompo-23. unds (MION): physicochemical properties. Magn Re-

son Med 1993; 29: 599-604.Nitin N et al. Functionalization and peptide based deli-24. very of magnetic nanoparticles as an intracellular MRI contrast agent. J Biol Inorg Chem 2004; 9: 706-12.Lee H et al. Antibiofouling polymer-coated superpara-25. magnetic iron oxide nanoparticles as potential magnetic resonance contrast agents for in vivo cancer imaging. J Am Chem Soc 2006; 128: 7383-9.Berry CC et al. Cell response to dextran-derivatised iron 26. oxide nanoparticles post internalisation. Biomaterials 2004; 25: 5405-13.Jodin L et al. Influence of the catalyst type on the growth 27. of carbon nanotubes via methane chemical vapor depo-

sition. J Phys Chem B 2006; 110: 7328-33.Horak D et al. D-mannose-modified iron oxide nanoparticles 28. for stem cell labeling. Bioconjug Chem 2007; 18: 635-44.De Cuyper M, Joniau M. Magnetoliposomes. Formation and 29. structural characterization. Eur Biophys J 1988; 15: 311-9.Kohler N, Fryxell GE, Zhang M. A bifunctional poly-30. (ethylene glycol) silane immobilized on metallic oxide-based nanoparticles for conjugation with cell targeting agents. J Am Chem Soc 2004; 126: 7206-11.

Mikhaylova M et al. Superparamagnetism of magneti-31. te nanoparticles: dependence on surface modification. Langmuir 2004; 20:2472-7.Gupta AK, Gupta M. Synthesis and surface engineering 32. of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials 2005; 26: 3995-4021.Veiseh O. et al. Optical and MRI multifunctional na-33. noprobe for targeting gliomas. Nano Lett 2005; 5: 1003-8.Lee H et al. Thermally cross-linked superparamagnetic 34. iron oxide nanoparticles: synthesis and application as a dual imaging probe for cancer in vivo. J Am Chem Soc 2007; 129: 12739-45.Kumagai M et al. Iron hydroxide nanoparticles coated 35. with poly(ethylene glycol)-poly(aspartic acid) block copolymer as novel magnetic resonance contrast agents for in vivo cancer imaging. Colloids Surf B Biointerfa-

ces 2007; 56: 174-81.LaConte LE et al. Coating thickness of magnetic iron 36. oxide nanoparticles affects R2 relaxivity. J Magn Reson Imaging 2007; 26: 1634-41.Yang L et al. Receptor-targeted nanoparticles for in vivo 37. imaging of breast cancer. Clin Cancer Res 2009; 15: 4722-32.Kumar A et al. Development of hyaluronic acid-Fe2O3 38. hybrid magnetic nanoparticles for targeted delivery of peptides. Nanomedicine 2007; 3: 132-7.Shi X et al. Synthesis, characterization, and intracellular 39. uptake of carboxyl-terminated poly(amidoamine) den-

drimer-stabilized iron oxide nanoparticles. Phys Chem Chem Phys 2007; 9: 5712-20.Gao X et al. In vivo cancer targeting and imaging with semi-40. conductor quantum dots. Nat Biotechnol 2004; 22: 969-76.Wang YX, Hussain SM, Krestin GP. Superparamagnetic 41. iron oxide contrast agents: physicochemical characteri-stics and applications in MR imaging. Eur Radiol 2001; 11: 2319-31.Weissleder R et al. Ultrasmall superparamagnetic iron 42. oxide: characterization of a new class of contrast agents for MR imaging. Radiology 1990; 175: 489-93.Reimer P et al. Clinical results with Resovist: a phase 2 43. clinical trial. Radiology 1995; 195: 489-96.Hamm B et al. Focal liver lesions: characterization with 44. nonenhanced and dynamic contrast material-enhanced MR imaging. Radiology 1994; 190: 417-23.Jung CW, Jacobs P. Physical and chemical properties of 45. superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: feru-

moxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn Reson Imag 1995; 13: 661-74.Weinmann HJ et al. Comparative studies on the effica-46. cy of MRI contrast agents in MRA. Acad Radiol 2002; Suppl. 1: S135–6.Taupitz M et al. New generation of monomer-stabili-47. zed very small superparamagnetic iron oxide particles (VSOP) as contrast medium for mr angiography: prec-

linical results in rats and rabbits. J Magn Reson Imag 2000; 12: 905-11.Mornet S et al. Magnetic nanoparticle design for me-48. dical diagnosis and therapy. J Mater Chem 2004; 14: 2164-75.

Mack MG et al. Superparamagnetic iron oxide-enhan-49. ced MR imaging of head and neck lymph nodes. Radio-

logy 2002; 222: 239-44.Lonnemark M et al. Superparamagnetic particles as an 50. MRI contrast agent for the gastrointestinal tract. Acta Radiol 1988; 29: 599-602.Corot C et al. Recent advances in iron oxide nanocrystal 51. technology for medical imaging. Adv Drug Deliv Rev 2006; 58: 1471-504.Rhyner MN et al. Quantum dots and multifunctional 52. nanoparticles: new contrast agents for tumor imaging. Nanomed 2006; 1: 209-17.Cerdan S et al. Monoclonal antibody coated magnetite 53. particles as contrast agents in magnetic resonance ima-

ging of tumors. Magn Reson Med 1989; 12: 151-63.Remsen LG et al. MR of carcinoma-specific monoclo-54. nal antibody conjugated to monocrystalline iron oxide nanoparticles: the potential for noninvasive diagnosis. AJNR Am J Neuroradiol 1996; 17: 411-8.Tiefenauer LX et al. In vivo evaluation of magnetite na-55. noparticles for use as a tumor contrast agent in MRI. Magn Reson Imaging 1996; 14: 391-402.Artemov D et al. MR molecular imaging of the Her-2/56. neu receptor in breast cancer cells using targeted iron oxide nanoparticles. Magn Reson Med 2003; 49: 403-8.Huh YM et al. In vivo magnetic resonance detection of 57. cancer by using multifunctional magnetic nanocrystals. J Am Chem Soc 2005; 127: 12387-91.Toma A et al. Monoclonal antibody A7-superparamagnetic 58. iron oxide as contrast agent of MR imaging of rectal carcinoma. Br J Cancer 2005; 93: 131-6.Serda RE et al. Targeting and cellular trafficking of ma-59. gnetic nanoparticles for prostate cancer imaging. Mol Imaging 2007; 6: 277-88.Baio G et al. Magnetic resonance imaging at 1.5 T with 60. immunospecific contrast agent in vitro and in vivo in a xenotransplant model. Magma 2006; 19: 313-20.Lee JH et al. Artificially engineered magnetic nanopar-61. ticles for ultra-sensitive molecular imaging. Nat Med 2007; 13: 95-9.Chen TJ et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for 62. noninvasive imaging of folate receptor by MRI. J Bio-

med Mater Res A 2008; 87: 165-75.Moore A et al. In vivo targeting of underglycosylated 63. MUC-1 tumor antigen using a multimodal imaging pro-

be. Cancer Res 2004; 4: 1821-7.Medarova Z et al. In vivo imaging of tumor response 64. to therapy using a dual-modality imaging strategy. Int J Cancer 2006; 118: 2796-802.Montet X, Weissleder R, Josephson L. Imaging pancre-65. atic cancer with a Peptide-nanoparticle conjugate tar-geted to normal pancreas. Bioconjug Chem 2006; 17: 905-11.Reddy GR et al. Vascular targeted nanoparticles for 66. imaging and treatment of brain tumors. Clin Cancer Res 2006; 12: 6677-86.Simberg D et al. Biomimetic amplification of nanopar-67. ticle homing to tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104: 932-6.

Zhang C et al. Specific targeting of tumor angiogenesis 68. by RGD-conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles using a clinical 1.5-T magnetic resonan-

ce scanner. Cancer Res 2007; 67: 1555-62.Kelly KA et al. Targeted nanoparticles for imaging in-69. cipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLoS Med 2008; 5: e85.Yang L et al. Single Chain Epidermal Growth Factor Re-70. ceptor Antibody Conjugated Nanoparticles for in vivo Tumor Targeting and Imaging. Small 2008; 5: 235-43.Veiseh M et al. Tumor paint: a chlorotoxin: Cy5.5 bio-71. conjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res 2007; 67: 6882-8.Sun C et al. In vivo MRI detection of gliomas by chloro-72. toxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes. Small 2008; 4: 372-9.Jemal A et al. Cancer statistics, 2008. CA Cancer J Clin 73. 2008; 58: 71-96.Chatzistamou L et al. Effective treatment of metastatic 74. MDA-MB-435 human estrogen-independent breast car-cinomas with a targeted cytotoxic analogue of luteini-zing hormone-releasing hormone AN-207. Clin Cancer Res 2000; 6: 4158-65.

Leuschner C et al. LHRH-conjugated magnetic 75. iron oxide nanoparticles for detection of breast cancer metastases. Breast Cancer Res Treat 2006; 99: 163-76.Low PS, Henne, WA, Doorneweerd DD. Discovery and 76. development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory dise-

ases. Acc Chem Res 2008; 41: 120-9.Sun C, Sze R, Zhang M. Folic acid-PEG conjugated 77. superparamagnetic nanoparticles for targeted cellular uptake and detection by MRI. J Biomed Mater Res A 2006; 78: 550-7.Chen H et al. Characterization of pH- and tempera-78. ture sensitive hydrogel nanoparticles for controlled drug release. PDA J Pharm Sci Technol 2007; 61: 303-13.Pinkernelle J et al. Imaging of single human carcinoma 79. cells in vitro using a clinical whole-body magnetic re-

sonance scanner at 3.0 T. Magn Reson Med 2005; 53: 1187-92.

Adres do korespondencji:

dr n. farm. Mariusz PanczykZakład Dydaktyki i Efektów KształceniaWydział Nauki o ZdrowiuWarszawski Uniwersytet Medycznyul. Żwirki i Wigury 6102-091 Warszawatel. 22 57 20 490, fax. 22 57 20 491e-mail: mariusz.panczyk@wum.edu.pl