Seminario OA

YOLANDA VALDERRAMA HENAOCAROLINA ZAPATA RAMIREZ.

INTRODUCTION

COLLAGENIs the major insoluble fibrous protein in the extracellular matrix and in connective tissue.Collagen makes up approximately 30% of the proteins in the body.

There are at least 16 types of collagen, but 80 – 90 percent of the collagen in the body consists of types I, II, and III.

Type Structural Features Representative Tissues

Fibrillar Collagens

I 300-nm-long fibrils Skin, tendon, bone, ligaments, dentin, interstitial tissues

II 300-nm-long fibrils Cartilage, vitreous humor

III 300-nm-long fibrils; often with type I Skin, muscle, blood vessels

V 390-nm-long fibrils with globular N-terminal domain; often with type I

Similar to type I; also cell cultures, fetal tissues

The basic structural unit of collagen is a Triple Helix.The triple-helical structure of collagen has abundance of three amino acids: glycine, proline, and hydroxyproline

The collagen chains are synthesized as longer precursors called procollagens. Essential cofactor: Vitamin C.

• Collagen helps to give strength to various structures of the body and also protects structures

• Collagen protein is the cement that holds everything together.

OSTEOARTHRITIS (OA)

Is a multifactorial disease involving the whole joint in which loss of cartilaginous matrix is a fundamental feature.

Chondrocytes have great potential to replace the proteoglycan components of the matrix.In the late stages of OA when collagen damage is far advanced, any repair attempt appears to be ineffective leading eventually to joint failure.

OSTEOARTHRITIS

Osteoarthritis (OA) is the most common chronic condition of the joints. It occurs when the cartilage or cushion between joints breaks down leading to pain, stiffness and swelling, pain.

OSTEOARTHRITIS SYMPTOMS

STIFFNESS Particularly in the morning. Affected joints may get swollen after extended activity.

OSTEOARTHRITIS CAUSESOsteoarthritis has no specific cause.Some of the factors that contribute to the development of OA:Genes WeightInjury and overuse

OSTEOARTHRITIS DIAGNOSISThe diagnosis of osteoarthritis includes a medical history and a physical examination.

These may be followed by laboratory tests, X-rays, and a magnetic resonance imaging (MRI) scan.

OSTEOARTHRITIS TREATMENT* Weight management* Physical activity * Medications * Joint replacement surgery

OSTEOARTHRITIS AND COLLAGEN

Various findings indicate a metabolic response of chondrocytes to deposit collagen type III in regions of articular cartilage, presumably as a response to mechanical injury or other matrix damage.

FIGURA 4

Type III collagen could act as a collagen network glue expressed by articular chondrocytes.

This appears to be part of an attempt to repair and constrain the existing collagen network of the extracellular matrix from further damage.This response may be triggered by molecular or mechanical signals, resulting from the joint trauma.

OBJECTIVE

Determine if type III collagen is concentrated in the chymotrypsin-extractable collagen pool from osteoarthritic articular cartilage to assess its potential as a biomarker of Osteoarthritis (OA) pathogenic mechanisms.

MATERIALES Y MÉTODOS

• PACIENTES

Cabezas femorales= 10 osteoartritis 10 controles

Todas las cabezas femorales se mantuvieron congeladas a -80ºC.

EXPERIMENTO 1

• 5 cabezas femorales osteoartritis ( paciente entre 60-80 años, 4 mujeres)

• 5 cabezas femorales controles(paciente entre 78-87 años, 5 mujeres)

SE ANALIZARON PARA EL CONTENIDO DE COLÁGENO TOTAL Y COLÁGENO TIPO QUIMOTRIPSINA EXTRAÍBLE

EXPERIMENTO 2

5 cabezas femorales osteoartritis( paciente entre 50-80 años, 4 mujeres)

5 cabezas femorales control( paciente entre 53-87 años, 2 mujeres)

SE UTILIZARON PARA ESTUDIAR COLÁGENO EXTRAÍDO CON PEPSINA.

ELISA

Prueba inmunoadsorbente ligado a enzima.

Se basa reacción Antígeno-Anticuerpo.

ENZIMAS: Fosfatasas alcalinas Peroxidasa de Rábano.

-BAJO COSTO-FÁCIL DE OBTENER-ALTO NIVEL DE PUREZA-NO ESTÁN PRESENTES EN MUESTRAS BIOLÓGICAS EN CANTIDADES SIGNIFICATIVAS PARA EVITAR INTERFERENCIA.

FALSOS POSITIVOS*PRESENCIA DE FACTOR REUMATOIDEO.*ADSORCIÓN INESPECÍFICA DE LAS PROTEÍNAS A LA FASE SÓLIDA.

FALSOS NEGATIVOS*PRESENCIA DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS.

*PÉRDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DEL REACTIVO

REQUIEREN PASO DE SEPARACIÓN ANTES DE EFECTUAR LA MEDICIÓN DE

LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.HETEROGÉNEO

• SON DE 3 TIPOS:SANDWICH-COMPETITIVO (ANTIGENOS)INDIRECTO ( MEDIR ANTICUERPOS)

TIPO SÁNDWICH: (mide antígeno)

Existe un 1er ac unido habitualmente a una fase sólida.El ag reacciona con él. Se lava y se hace reaccionar con otro anticuerpo que está marcado con una enzima y tras otro lavado se revela el ensayo siendo proporcional el producto formado a la cantidad de ag presente en la muestra.

ENSAYO COMPETITIVOPara medir antígeno. La muestra se hace competir con un Ag marcado frente a un Ac.Se lava para eliminar el componente que ha quedado libre y se revela.La cantidad de producto formado es inversamente proporcional al Ag de muestra.

ENSAYO INDIRECTO ( mide anticuerpos)Se fija Ag a la fase sólida.Se hace reaccionar con la muestra donde está el Ac.Tras un lavado se añade Ig antiglobulina humana (antianticuerpo) marcada con enzima. Se vuelve a lavar y se revela. La cantidad de producto formado es directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

SDS- PAGE

SODIO DUODECIL SULFATO POLIACRILAMIDA GEL ELECTROFORESIS

Es el método más popular para determinar el tamaño del polipéptido en presencia de SDS.

Se utiliza un estándar de tamaño conocido y la movilidad está determinada por el peso molecular y la carga eléctrica de la molécula.

Gracias al SDS la mayoría de las proteínas adquieren una relación CARGA/MASA idéntica por lo que se obtiene un fraccionamiento que obedece a:

* Diferencia de peso * Longitud de la cadena ( tamaño) * Forma de la proteína.

El SDS desnaturaliza las proteínas, elimina sus estructuras secundarias y terciarias y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa.

WESTERN BLOT

Es una técnica analítica usada para detectar una proteína específica, mediante el uso de anticuerpos.Las proteínas procedentes son separadas por electroforesis en gel según su tamaño,por medio de la técnica SDS PAGE.

Las proteínas se transfieren a un filtro, que se incuba con anticuerpos que reaccionan con la proteína de interés.

El anticuerpo unido al filtro puede ser detectado, identificando la proteína contra la cual está dirigido el anticuerpo.

• No necesita sonda • KDa• Fondo blanco y rayas negras.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

La espectrometría de masas (ES) es una técnica de análisis que permite la medición de moléculas.

El espectrómetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos.

El haz de iones produce un patrón específico en el detector, que permite analizar el compuesto.Masa molecular y su estructura.

INMUNOHISTOQUÍMICA

Es la identificación de un tejido por medio de una interacción específica entre un antígeno y un anticuerpo.

El anticuerpo ha sido marcado, la célula se colorea para demostrar la presencia y localización celular de una molécula de interés.

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS Ditiotreitol

RESULTADOS

F- 84y M – 62 y

M – 59y F- 79y

Flourocromo

DISCUSSION WHO WROTE IT INPUT YES OR NOT

Burkhardt D “In the present study it was, therefore, possible to compare normal appearing cartilage from both OA and fracture control hips as others have studied biochemically for noncollagenous matrix components”

Yes

Wotton SF “The findings in the present study build on previous reports thattype III collagen can make an appearance with aging in articularcartilage of mature joints”

Yes

Hosseinininia S “ In our previous human hip cartilage study, cartilage swelling was indicated by increased water content, taking place before apparent macro- and microscopical cartilage changes”

No

Hosseinininia S A significant type III collagen increase in OA cartilage compared with control samples. This was obvious initially on Western blot .

Yes

CONCLUSIONES

Collagen is one of the most abundants proteins in the human body, is essential to keep the elasticity and strength of the articulations. There have been implemented treatments with it to fight OA.

The importance is not just in the collagen’s existance, but the tests that have been done to confirm the over expression of it in patients with OA.

There need to be more studies about collagen to prevent diseases like OA, disease with high prevalence in the world.

With the evidence of type III collagen appearing in articular damage zones as a way to repair and avoid a further injury, this can be considered as an important scientist progress that can be helpful for treatment to articulations diseases.