Tema 29. Ingeniería genética. Definición crear y analizar DNA recombinante Técnicas y...

Tema 29. Ingeniería genética

Definición crear y analizar DNA recombinante

Técnicas y estrategias

1. enzimas de restricción y vectores

2. construcción del DNA recombinante

3. clonación y obtención de un clon

4. caracterización y análisis del fragmento clonado

5. mapas de restricción, Southern (electroforesis e hibridación), PCR, RFLP, VNTR, secuenciación, transgénicos

Aplicaciones de la Ingeniería Genética

1. Estudio del material genético: organización, estructura, expresión y evolución

2. Producción de proteínas humanas/animales en bacterias: insulina, interferón, factores coagulantes, vacunas

3. Organismos transgénicos: levaduras, plantas y vertebrados

4. Humanos: identificación de individuos (genética forense); detección de enfermedades genéticas; terapia génica

5. Medio ambiente: biorremediación (petróleo), metales pesados

enzima de restricción (tipo II)

(sitio de restricción)

palíndromo (4-8 pb)

extremos de secuencias específicas

K12 B

K12 (P1)

100%

100%

100%

0,002%

0,01% 0,01%

Restricción y Modificaciónsistemas de modificación y restricción

enzimas de restricción o endonucleasas de restricción (I)

extremos cohesivos, escalonadosen bisel o pegajosos

enzimas de restricción o endonucleasas de restricción (II)

extremos romos

corte y unión

vectores de clonación

• Moléculas pequeñas y bien caracterizadas

• Contienen:

- un origen de replicación autónomo

- sitios de corte únicos para enzimas de restricción- marcador de selección

• Fácil recuperación de la molécula híbrida

plásmidos20-100 copias/célulafragmento clonado: 5-10 Kpb

fagos

15-20 Kpb

cósmidosHíbrido entre plásmido y fago:‘in vivo’ se mantiene como plásmido; ‘in vitro’ se empaqueta como fago

Fragmento clonado: hasta 45 Kpb

fagos de una cadena

Infección: 1 cadena; replicación: 2 cadenas (≈ plásmidos)

Útiles: secuenciación y mutagénesis

Ej: el más usado M13

BAC: cromosomas artificiales bacterianos

Basados en plásmido F (genes de replicación y control de número de copias)

Vectores de expresión: sitios de restricción flanqueados por promotores

cromosomas artificialesde levadura (YAC)

preparación de fragmentos a clonar

extremos cohesivos

extremos romos: ligasa de T4 puede unir o uso de conectores

adición de colas a extremos romos: desoxinucleotidil transferasa terminal de timo de ternera en extremos 3’ (tras digestión de 5’ con una exonucleasa). Uso de colas poliA/poliG y poliT/poliC (fragmento y vector)

clonación en E. coli

pBR322

pUC18

selección de plásmidos recombinantes

selección del clon deseado (I)

selección del clon deseado (II)

selección del clon deseado (III)

mapa de restricción (I)

caracterización de lassecuencias clonadas

mapa de restricción (II)

model 1 model 2

mapa de restricción: recopilación del número, orden y distancias entre los sitios de corte de enzimas de restricción de una molécula o segmento de DNA

síntesis de cDNAa partir de mRNA

Southern Edward Southern, 70’s

Identificación de lassecuencias clonadas

Southern, Northern y Western

PCR

Polimerasa Taq de Thermus aquaticus

RFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción

Aplicaciones RFLP:- mapeo cromosómico- diagnóstico de

enfermedades- pruebas de paternidad - genética forense

sospechosos

muestra

VNTR: repeticiones en tándem de número variable

Aplicaciones VNTR: - pruebas de paternidad - genética forense - evolución de poblaciones

VNTR: pruebas de paternidad

secuenciación (método Sanger)

gel de secuenciación

Aplicaciones de la secuenciación: estudio de los genes a nivel de - estructura y función - evolución (bases de datos)

Secuencia obtenida (leída de abajo hacia arriba): CATGTCAGCTGT…

secuenciación automática

secuenciación automática

transgénico vegetal

obtención de un transgénico vegetal (I)

obtención de un transgénico vegetal (II)

maíz resistente a herbicida

arroz blanco y arroz dorado (GM; beta-carotenos)

transgénico animal

terapia génica

tipos de terapia génica en mamíferos

One of the six restriction maps shown here is consistent with the pattern of bands shown in the accompanying figure in the gel after digestion with several restriction endonucleases. The enzymes that were used are shown.

(a) From your analysis of the pattern of bands on the gel, select the correct map and explain your reasoning.

(b) In a Southern blot prepared from this gel, the highlighted bands (pink) hybridized with the gene pep. Where is the pep gene located?

problema