Spektrofotometrik yöntemler(fazlası için )

SPEKTROFOTOMETRİK SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLERYÖNTEMLER

Doç.Dr. Emre SARANDÖLDoç.Dr. Emre SARANDÖL

Dersin AkışıDersin Akışı

Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı

Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli

Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar

Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri

Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması

ÖzetÖzet

Dersin AmacıDersin Amacı

Biyokimyanın temel ölçüm yöntemi olan Biyokimyanın temel ölçüm yöntemi olan

spektrofotometrik yöntemler hakkında bilgi spektrofotometrik yöntemler hakkında bilgi

sahibi olmaktırsahibi olmaktır

Tıpta Biyokimyanın AmacıTıpta Biyokimyanın Amacı

Bir molekülün Bir molekülün

Var olup olmadığınıVar olup olmadığını(ne olduğu -işlevi)(ne olduğu -işlevi)

MiktarınıMiktarını

belirlemektirbelirlemektir

Tıpta temel araştırmalarTıpta temel araştırmalar

Sağlıklı durumun nasıl işlediğiSağlıklı durumun nasıl işlediği

Hastalıkların nasıl oluştuğuHastalıkların nasıl oluştuğu

Hastalıkların nasıl önlenebileceğiHastalıkların nasıl önlenebileceği

Hastalıkların nasıl tedavi edilebilecekleriHastalıkların nasıl tedavi edilebilecekleri

Tıpta günlük kullanımdaTıpta günlük kullanımda

Ayırıcı tanı Ayırıcı tanı TANITANI

Hastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgiHastalığın gidişi (prognoz) ile ilgili bilgi

Hastalığın seyrinin takibiHastalığın seyrinin takibi

Tedavi seçimini yönlendirirTedavi seçimini yönlendirir

Tedavinin etkili olup olmadığının takibiTedavinin etkili olup olmadığının takibi

Tedaviye ait yan etkilerin takibiTedaviye ait yan etkilerin takibi

Dersin AkışıDersin Akışı

Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı

Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli

Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar

Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri

Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması

ÖzetÖzet

Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli

Varlığı ya da miktarı araştırılan molekül ileVarlığı ya da miktarı araştırılan molekül ile

OLABİLDİĞİNCE ÖZGÜN ETKİLEŞİMEOLABİLDİĞİNCE ÖZGÜN ETKİLEŞİME

giren bir araç gereklidir !giren bir araç gereklidir !

İnternet bağlantılarıİnternet bağlantıları

http://www.youtube.com/watch?v=pCij70_nP-Ehttp://www.youtube.com/watch?v=pCij70_nP-Ehttp://www.youtube.com/watch?http://www.youtube.com/watch?v=tY7oaspQqYQ&feature=relatedv=tY7oaspQqYQ&feature=relatedhttp://www.youtube.com/watch?http://www.youtube.com/watch?v=uqDWbknpiVk&NR=1v=uqDWbknpiVk&NR=1http://www.youtube.com/watch?http://www.youtube.com/watch?v=896vJj6eWYw&NR=1v=896vJj6eWYw&NR=1http://youtube.com/watch?v=bDKyh1-V0nwhttp://youtube.com/watch?v=bDKyh1-V0nwhttp://youtube.com/watch?v=NjpboerFt14http://youtube.com/watch?v=NjpboerFt14http://youtube.com/watch?v=rxnDDfRfXEkhttp://youtube.com/watch?v=rxnDDfRfXEkhttp://youtube.com/watch?v=4tiuRZk8TF4http://youtube.com/watch?v=4tiuRZk8TF4

Spektrofotometrik yöntemlerde bu araçSpektrofotometrik yöntemlerde bu araç

kimyasal ayraçlar ve özgünlüğü arttırmak için kimyasal ayraçlar ve özgünlüğü arttırmak için

yöntemlere eklenen immunolojik veya yöntemlere eklenen immunolojik veya

enzimatik tepkimelerdirenzimatik tepkimelerdir

genelliklegenellikle

RenkliRenkli

BerrakBerrak

Çözeltiler elde ederizÇözeltiler elde ederiz

Dersin AkışıDersin Akışı

Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı

Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli

Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar

Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri

Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması

ÖzetÖzet

Elektromanyetik ışımaElektromanyetik ışıma,, uzayda çok büyük hızla hareket eden bir uzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerjienerji türüdür türüdür

Elektromanyetik ışımanınElektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız gözle algıladığımız görünür ışıkgörünür ışık ve ısı şeklinde ve ısı şeklinde algıladığımız infrared ışınlarıdıralgıladığımız infrared ışınlarıdır

Işık, insan gözüyle görülebilir dalga boylarındaki elektromanyetik radyasyon enerjisidir.

Dalga boyu, iki dalga piki arasındaki mesafedir ki genellikle nanometre (nm), bazen angström (Ao) ve milimikron (mµ) olarak ifade edilir.

Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık, insan gözünün beyaz olarak tanımladığı, farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır.

İnsan gözü, yaklaşık 380-750 nm arasında dalga boylarına sahip olan ışık enerjilerine cevap verebilmektedir.

<380 nm dalga boyundaki ışık Ultraviyole (Mor-ötesi, U.V.)380-440 nm dalga boyundaki ışık Menekşe440-500 nm dalga boyundaki ışık Mavi500-580 nm dalga boyundaki ışık Yeşil580-600 nm dalga boyundaki ışık Sarı600-620 nm dalga boyundaki ışık Turuncu620-750 nm dalga boyundaki ışık Kırmızı>750 nm dalga boyundaki ışık İnfraruj (Kırmızı-ötesi, IR) olarak

tanımlanır.

Bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-750 nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini soğuruyorsa (absorpluyorsa) siyah görünür.

Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir madde sarı renkli, sarı rengi soğuran bir madde mavi renkli görünür.

yeşil rengi soğuran bir madde kırmızı renkli, kırmızı rengi soğuran bir madde yeşil renkli görünür.

Madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılır.

Sarı-MaviKırmızı-Yeşil

Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri:Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri:

Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon)Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon)

Yayılım (emisyon)Yayılım (emisyon)

Geçiş (transmittans)Geçiş (transmittans)

Tutulum (absorbans)Tutulum (absorbans)

Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ Ölçülen ÖzellikÖlçülen Özellik Aletli Analiz YöntemiAletli Analiz Yöntemi

Işın AbsorpsiyonuIşın Absorpsiyonu Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisiSpektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi

Işın Emisyonu Işın Emisyonu Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans, Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans, Fosforesans ve Lüminesans SpektroskopisiFosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi

Işın SaçılmasıIşın Saçılması Türbidimetri, Nefolometri, Raman SpektroskopisiTürbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi

Işın KırılmasıIşın Kırılması Refraktometri, interferometriRefraktometri, interferometri

Işın DifraksiyonuIşın Difraksiyonu X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleriX-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri

Işın rotasyonuIşın rotasyonu Polarimetri, dairesel dikroizmPolarimetri, dairesel dikroizm

Elektrik potansiyeliElektrik potansiyeli Potansiyometri, KronopotansiyometriPotansiyometri, Kronopotansiyometri

Elektrik yüküElektrik yükü KulometriKulometri

Elektrik akımıElektrik akımı Amperometri, PolarografiAmperometri, Polarografi

Elektriksel dirençElektriksel direnç Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)

KütleKütle GravimetriGravimetri

Kütle/yükKütle/yük Kütle spektroskopisiKütle spektroskopisi

Tepkime HızıTepkime Hızı Kinetik yöntemlerKinetik yöntemler

Termal ÖzelliklerTermal Özellikler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlikTermal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik

RadyoaktiviteRadyoaktivite Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleriNötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri

Lambert-Beer kanunu:Lambert-Beer kanunu:

Bir çözeltidenBir çözeltiden

geçen ışıkgeçen ışık miktarı, miktarı, ışığın çözelti içinde ışığın çözelti içinde kat ettiği yol ve kat ettiği yol ve çözelti çözelti konsantrasyonu ile konsantrasyonu ile logaritmik olarak logaritmik olarak ters orantılı, ters orantılı,

emilen ışıkemilen ışık miktarı miktarı ise doğru orantılıdırise doğru orantılıdır

İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UV-görünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).

Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür.

Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir.

Transmittansın tersinin logaritması Absorbans (Optik dansite, A) olarak tanımlanır ki bu, çözeltinin içinden geçen ışığın ne kadarının absorbe edildiğinin (soğurulduğunun) ifadesidir.

Bir çözeltide çözünmüş olan maddenin miktarı veya konsantrasyonu ile %Transmittans (%T) arasında doğrusal olmayan bir ilişki olduğu halde Absorbans (A) arasında doğrusal bir ilişki vardır.

Absorbans (A), yüzde transmittans (%T) ve çözeltideki maddelerin konsantrasyonu (c) arasındaki ilişkiyi Lambert-Beer yasası ifade eder: İçinde çözelti bulunan bir küvetten geçen ışığın transmittansı (I/Io), ışık yolu veya küvet çapının (l) artmasıyla azalır; ayrıca dilüe çözeltinin absorbansı (A), çözeltinin konsantrasyonu (c) ile doğru orantılıdır. ε absorpsiyon katsayısı (ekstinksiyon katsayısı) olarak gösterildiğinde Lambert-Beer yasasının matematiksel ifadesi şu şekilde olur.

Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır.

Bu ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden geçip gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan ışınlardır

Görünen Görünen renkrenk

Absorbe edilen Absorbe edilen renkrenk

Işık Işık λλ (nm) (nm)

-- -- 220-380220-380

Sarı-yeşilSarı-yeşil MenekşeMenekşe 380-440380-440

SarıSarı MaviMavi 440-475440-475

PortakalPortakal Yeşil-maviYeşil-mavi 475-495475-495

KırmızıKırmızı Mavi-yeşilMavi-yeşil 495-505495-505

MorMor YeşilYeşil 505-555505-555

MenekşeMenekşe Sarı-yeşilSarı-yeşil 555-575555-575

MaviMavi SarıSarı 575-600575-600

Yeşil-maviYeşil-mavi PortakalPortakal 600-620600-620

Mavi-yeşilMavi-yeşil KırmızıKırmızı 620-700620-700

Dersin AkışıDersin Akışı

Biyokimyanın AmacıBiyokimyanın Amacı

Biyokimyada ölçüm yapmanın temeliBiyokimyada ölçüm yapmanın temeli

Spektrofotmetri ile ilgili tanımlarSpektrofotmetri ile ilgili tanımlar

Spektrofotometrenin bölümleriSpektrofotometrenin bölümleri

Spektrofotometre ile ölçüm yapılmasıSpektrofotometre ile ölçüm yapılması

ÖzetÖzet

Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir.

Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir.

Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.

Spektrofotometrelerde konsantrasyonu bilinen bir standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans, optik dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır.

Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli absorpladığı dalga boyunda seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda ( yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda) ışık seçilir.

İnternetteki sayfalarİnternetteki sayfalarhttp://web.umr.edu/~gbert/color/AAcolor.html

http://pharmlabs.unc.edu/spectrophotometry/text.htmhttp://pharmlabs.unc.edu/spectrophotometry/text.htm

http://services.juniata.edu/ScienceInMotion/chem/spec-2.htmhttp://services.juniata.edu/ScienceInMotion/chem/spec-2.htm

http://www.chm.davidson.edu/ChemistryApplets/spectrophotometry/index.htmlhttp://www.chm.davidson.edu/ChemistryApplets/spectrophotometry/index.html

http://www.astronomynotes.com/light/chindex.htm

http://www.biology.lsu.edu/introbio/tutorial/Spec/spectrophotometry.html#anchor476241

http://www.umd.umich.edu/casl/natsci/slc/spec21.swf

http://www.shsu.edu/%7Echm_tgc/sounds/DB.mov

http://bioweb.wku.edu/courses/biol121/Protein/Graph_example.htm

http://courses.chem.psu.edu/chem36/UVVIS/index.htm

Özet Özet Miktarını ölçeceğimiz molekül ile olabildiğince Miktarını ölçeceğimiz molekül ile olabildiğince ÖZGÜN ETKİLEŞİMÖZGÜN ETKİLEŞİM

Emilen (absorbe olan) ışık miktarı Emilen (absorbe olan) ışık miktarı konsantrasyonla doğru orantılıdırkonsantrasyonla doğru orantılıdır