View
33
Download
0
Category
Preview:
DESCRIPTION
Proteomics Waarom DNA alleen niet genoeg is…. Van DNA naar organisme. Eiwitten zijn de belangrijkste schakels tussen DNA en het organisme. DNA RNA Eiwit Cel Organisme - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
ProteomicsWaarom DNA alleen niet genoeg is…
Van DNA naar organisme
Eiwitten zijn de belangrijkste schakels tussen DNA en het organisme.
DNA RNA Eiwit Cel Organisme 30.000 genen vertaald genen in eiwit meer dan 1,000,000 eiwitnetwerk 2 miljard jaar evolutie
Proteomics voor de massa
Een organisme bestaat uit cellen
Proteomics voor de massa
membraan
Porien
Chromatine Chromosomen
Nucleolus Set met 23 paar menselijke chromosomen met alle genetische informatie
De kern van iedere cel bevat chromosomen met de genetische code
Proteomics voor de massa
ATCCGTTATGCTTAGGCAATACGA
Chromosoom
DNA
Een chromosoom is een opgevouwen streng DNA
Proteomics voor de massa
… T G A C …… A C T G …
Het genoom
• DNA is opgebouwd uit 4 bouwstoffen: de basen of nucleotiden A C T G
• Het complete menselijke genoom bestaat uit 3.000.000.000 nucleotiden (basen).
• Al het menselijk DNA is in kaart gebracht. De gegevens liggen opgeslagen in een database
Proteomics voor de massa
..AGC TAT CAA ATG CCG TAG ATC CGT AGT GTA AAC AAG ATC GTT TGG AAA TTG CAG ATC AGT AAG CGT AGA TCG TGT TGA CG......
Genen en het genotype
Alle erfelijke eigenschappen liggen vast in het DNA.
Het stukje DNA dat de code bevat voor een erfelijke eigenschap wordt een gen genoemd.
Een set van alle genen van een organisme wordt het genotype genoemd.
De nucleotiden volgorde van alle genen is bekend.
Proteomics voor de massa
Fenotype
Het fenotype is het totaal van alle waarneembare eigenschappen (kenmerken) van een organisme.
De rups en de vlinder hebben hetzelfde genotype (DNA), maar zijn toch verschillend.Ze hebben een verschillend fenotype.
Proteomics voor de massa
Van Genotype naar Fenotype • Alle 200 celtypen hebben dezelfde set met genen, maar alleen die eiwitten worden aangemaakt die de cel nodig heeft voor zijn taak: Expressie.
• Verschillen in expressie verklaren de verschillende fenotypen.
• Expressie kan beïnvloed worden door omgevings- factoren.
DNA RNA Eiwit- Eiwit Fenotype Synthese
Proteomics voor de massa
Eiwitten bepalen hoe we er uit zien
• DNA bepaalt wie we zijn (genetisch bepaald)
• Eiwitten bepalen hoe we er uit zien.
Proteomics voor de massa
Hoe bepalen eiwitten het fenotype ?
De genen (het DNA) geven slechts de totale catalogus van mogelijke eiwitten.
Maar welke eiwitten en hoeveel van elk wordt bepaald door de expressie van eiwitten.
Hoe en wanneer een eiwit actief wordt, wordtBepaald door de veranderingen die het eiwit nog ondergaat na de expressie:de zogenaamd post-translationele eiwit-veranderingen
De eiwitnetwerken bepalen tenslote het functioneel geheel in de cellen, weefsels en het organisme
Proteomics voor de massa
Ser
Val
Leu Thr
Ala Cys
Wat is een eiwit ?• Eiwitten zijn opgebouwd uit 20 verschillende bouwstenen: de aminozuren.
• Een eiwit kan bestaan uit een keten van 50 tot enkele duizenden aminozuren, de primaire volgorde of sequentie genoemd.
• Een eiwit wordt gevouwen in een complexe 3-dimensionale structuur.
• De volgorde van de aminozuren en ruimtelijke structuur bepalen de functie van het eiwit.
Leu
Proteomics voor de massa
Antilichaam Hemoglobline Insuline Kinase Synthetase
Hoe wordt een eiwit uit DNA vertaald?
Voor elk aminozuur bestaat een unieke combinatie van 3 nucleotiden. De vertaling en aanmaak van eiwitten vindt plaats op de ribosomen van het cytoplasma
Verschillende eiwitten met ruimtelijke structuur
Proteomics voor de massa
Protein Genomics Proteomics
Wat is Proteomics ?
Proteomics is de studie naar eiwitten.
Proteomics is ook het vergelijken van eiwitten tussen verschillende organismen, weefsels of cellen
Proteomics is ook het vergelijken van eiwitpatronen tussen gezonde en zieke mensen.
Proteomics voor de massa
Analyseren van eiwitten
Het analyseren van eiwitten wordt bemoeilijkt door:
• Het grote aantal verschillende eiwitten ( > 1,000,000).• Het hoge moleculaire gewicht van vele eiwitten.• De hoeveelheid materiaal vaak beperkt is. Het kan niet in het lab vermenigvuldigd worden zoals dat wel met DNA kan (PCR).• dat eiwitten snel kapot gaan. • Dure en geavanceerde analyse apparaten, die nodig zijn.
Proteomics voor de massa
Analyseren van eiwitten• Een veel gebruikte techniek om dat ene bepaalde eiwit te isoleren uit een mengsel van duizenden eiwitten is 2D-gelelektroforese.• Deze techniek maakt gebruik van de unieke eigenschappen van elk eiwit, namelijk: het moleculaire gewicht (grootte) en de lading.
1e dimensie: lading
pH 3 pH 10
pH 3 pH 10
pH 3 pH 10
+ -
+ -
2e dimensie: grootte
-
+
In een elektrisch veld bewegen eiwitten naar de pH waar ze neutraal zijn.
In een elektrisch veld bewegen kleinere eiwitten sneller dan grote eiwitten.
200.000 Dalton
1000 Dalton
Proteomics voor de massa
Het resultaat: een eiwitkaart
pH 3 10Molecuul gewicht (grootte)
200,000 Dalton
1000 Dalton
Elk stipje (spotje) op de kaart is een ander eiwit, of een andere variant van een eiwit!
Proteomics voor de massa
spot uitsnijden
Eiwitten in stukjesknippen met enzym
2D-gel
“massaspectrometrie”
Isoleren van een eiwit naar keuze• Het eiwit van interesse wordt uit de gel gesneden en in een reageerbuis gedaan.• Het eiwit wordt in stukjes “geknipt” met een enzym, bijvoorbeeld trypsine, omdat het intacte eiwit te groot is om te karakteriseren.• De stukjes (fragmenten) worden gekarakteriseerd in een Massaspectrometer
Proteomics voor de massa
• MS is een krachtige analytische techniek die wordt gebruikt om (onbekende)
eiwitten te identificeren en/of te kwantificeren.
• Bovendien kunnen de structuur en chemische eigenschappen van het eiwit
worden achterhaald.
Er zijn verschillende methoden:
Time-Of-FlightElectrical field Magnetic field
Wat is Massaspectrometrie (MS)
Proteomics voor de massa
• Mengsel van munten met verschillend gewicht
• Verschillend aantal per munt
• Sorteer op gewicht
• Sorteer op aantal
Gewicht (massa)
Aan
tal
Een apparaat om moleculen te ‘wegen’, een moleculaire weegschaal:
Wat doet Massaspectrometrie
Voor: Na:
massaspectrum
Proteomics voor de massa
Massaspectrometrie met de “Time-Of-Flight “ methode:
“flight tube”
Electrisch veld
De moleculen gaan “hardlopen” onder invloed van een hoog spanningsverschilin de buis, de snelste (kleinste) komt als eerste aan:
start finish
Detector
Proteomics voor de massa
Alle moleculen gaan tegelijkertijd de buis in
Kleine moleculen vliegen sneller!
De snelheid kan worden omgerekend naar een massa.De hoogte van de piek geeft de hoeveelheid aan.
Massaspectrum
Massaspectrometrie met de “Time-Of-Flight “ methode:
Proteomics voor de massa
R R K K R K
knippen van het eiwit met het enzyme trypsine
RR
K
KR
K
Massaspectrometrie bepaalt de massa’s van de brokstukkenHet patroon is uniek voor het eiwit: identificatie van het eiwit!
m/z
rela
tive
inte
nsity
123456
1 2 3 4 5 6
Eiwit:
Trypsine knipt na elkelysine (K) of arginine (R), en maakt daarmee brokstukken die eindigen op K of R:
Massaspectrometrie van een eiwit:
Is te vergelijken met een vingerafdruk van het eiwit!
Proteomics voor de massa
1 2 3 4 5 6
Het massaspectrum van een eiwitmengsel wordt vergeleken met de gegevens in de database
De 30.000 genen van het menselijk genoom met de bijbehorende eiwitten zijn opgeslagen in een database
De computer geeft een lijst met alle mogelijke eiwitten die er in een monster zitten!
Identificatie van een eiwit:
Proteomics voor de massa
Toepassingen van Proteomics:
• Kwantificering van de eiwitexpressie met biomarkers onder specifieke
omstandigheden, bijvoorbeeld bij medische behandeling.
• Toepassing in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen
• Identificatie van eiwitten die een rol spelen bij specifieke ziekten
• Identificatie van eiwit biomarkers specifiek voor eiwit expressie
Proteomics voor de massa
Recommended