Phuong Phap Khoi Pho

NỘI DUNG CHÍNH

TỔNG QUAN VỀ KHỐI PHỔ

KHỐI PHỔ LÀ GÌ?• là phương pháp nghiên cứu các chất, bằng

cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó, dựa trên điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế.

• Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:– Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.

– Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.

– Khối phổ kết hợp điện di

SỰ HÌNH THÀNH VÀ

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Sự ion hoá• nghiên cứu các chất bằng phương pháp khối

phổ, các phân tử chất nghiên cứu phải ở dạng khí hoặc hơi, phải được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp(va chạm điện tử ,bằng trường điện từ ,ion hoá học,chiếu xạ bằng các photon.)

Phương pháp ion hoá bằng

va chạm điện tử

• Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode làm bằng vonfram hoặc reni, bay về anode với vận tốc lớn.

• Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hoá, có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hoá.

Ion hoá bằng trường điện từ

• Tại buồng ion hoá đặt các “mũi nhọn” là bộ phận phát từ trường dưới dạng dây dẫn mảnh (2.5 µm) hay các lưỡi mảnh

• đặt điện áp vào các “mũi nhọn”. cho một trường điện từ có gradien 107-1010 V/cm

• các điện tử sẽ bị bứt khỏi phân tử chất nghiên cứu do hiệu ứng đường hầm nên không gây sự kích thích,vẫn giữ nguyên ở trạng thái cơ bản, do đó các vạch phổ sẽ rất mảnh.

Máy khối phổ

• là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để tìm ra thành phần của nó.

• Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion

. Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:

• phần nguồn ion• phần phân tích khối lượng• phần đo đạc.

Cấu tạo:• Máy gồm một đĩa đựng mẫu, máy bắn laser,

một ống tròn đảo chiều điện cực liên tục và detector.

• Bất kỳ máy khối phổ nào cũng có bốn khối chức năng sau đây:

• Hệ thống nạp mẫu

• Buồng ion hoá

• Bộ phân tích

• Bộ ghi tín hiệu

Dựa vào bộ phận phân tích mà người ta chia các loại máy khối phổ như sau:

• Bộ phận tích từ. • Bộ phận tích tứ cực.• Bộ phận tích theo thời gian • Bộ phận tích cộng hưởng ion cyclotron.

Theo tính năng bộ ghi, người ta chia các máy khối phổ thành hai loại:

• Máy khối phổ ký ghi bằng kính ảnh. Tín hiệu phổ được ghi bằng kính ảnh ở dạng vạch có độ đen khác nhau.

• Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm ion được ghi dưới dạng xung điện bằng các dao động ký điện tử nhiều kênh, hoặc đưa vào máy tính điện tử,tín hiệu sẽ được đưa ra dưới dạng bảng số hoặc đồ thị thích hợp.

Ngày nay trong phân tích khối phổ người ta dùng các máy khối phổ kế.

nguyên lý hoạt động của máy khối phổ• Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành

trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ

• Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion,kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài

• quá trình được thực hiện trong môi trường chân không

• Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp suất môi trường xử lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển).

• Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài.

• Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ trong một máy vi tính.

Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein

• protein được tinh chế rồi cắt bằng enzyme pepsin . Enzyme pepsin cắt polypeptide tại những điểm nhất định trên chuỗi (giống enzyme giới hạn ở acid nucleic).

• Ta có thể dự đoán được các mảnh (fragments) polypeptide sau khi bị cắt

• Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy chạy. Laser ion hoá các fragments làm cho chúng tích điện dương và bật ra bay vào ống.

• Ống này có chiều dài nhất định, 4 phía gắn 2 loại điện cực (+) và (-)

• ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều liên tục làm cho các mảnh polypeptide không bám được vào thành mà bay theo chiều xoắn ốc

• Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố• điện tích (z)

• khối lượng (m)

• Máy khối phổ đo được thời gian, biết trước quãng đường => tính được vận tốc => xác định được chỉ số m/z của fragment.

• Các tín hiệu được phát hiện bởi detector và khuếch đại, cuối cùng biểu diễn trên đồ thị ở dạng các đỉnh (peak). Mỗi đỉnh tương ứng 1 fragment.

• Với máy MS/MS (tandem MS) thì đây mới là lần MS thứ nhất, cho phép hiển thị các fragment của một polypeptide bị cắt bằng pepsin. Lần MS thứ 2 cho phép khẳng định chắc chắn 1 fragment nhất định nhờ hệ thống lọc.

Figure : Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer

Phân tích kết quả:• Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối

lượng khác nhau do đó khối lượng của một trình tự đủ nhỏ cũng nói lên được trình tự của nó. (Giả sử Valin có khối lượng là 3, methionin là 5 thì một fragment có khối lượng là 8 sẽ có trình tự Valin – Methionin hoặc Methionin – Valin).

Sự kết hợp các phương pháp sinh học

phân tử khác_ ứng dụng

Khối phổ kết hợp với sắc kí khí(Gas Chromatography Mass Spectometry)

• Phương pháp Sắc ký khí kết hợp với Khối phổ(viết tắt là GC-MS hoặc GCMS) là một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí.

• Bản chất GC-MS là sự kết hợp của Sắc ký khí (Gas Chromatography) và Khối phổ (Mass Spectometry). Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram (0.000000000001 gram).

Cấu tạo của GC-MS– Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất

thành một mạch theo từng chất tinh khiết– Khối phổ (MS): ) xác định định tính và định

lượng

• A. Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống tại cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 3000C để mẫu trở thành dạng khí.

• B. Vỏ ngoài (oven): Phần vỏ của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò này dao động từ 400C cho tới 3200C.

C. Cột (column): Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30 mét với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.

• Sau khi đi qua cột sắc kí khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ.Ở đây chúng bị ion hóa.Sau khi khối phổ,chúng sẽ tới bộ phận lọc

• dựa trên khối lượng ,bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua.

• Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tínhvà xuất ra kết quả gọi là khối phổ

• Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.

– Máy tính:

Bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiện do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ.

Công dụng– Phân tách: GC-MS có thể phân tách các hỗn

hợp hóa chất phức tạp trong không khí hay trong nước. Ở đây, tốc độ được quyết định bởi tính bay hơi. Chất nào có tính bay hơi cao sẽ di chuyển nhanh hơn chất có tính bay hơi thấp.

– Định lượng: GC-MS có thể định lượng một chất bằng cách so sánh với mẫu chuẩn, là chất biết trước và đã được định lượng chuẩn bằng GC-MS.

• Nhận dạng: Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó. Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã biết. Nếu không tìm được chất tương ứng trong thư viện ,ta thu được một dữ liệu mới và đóng góp vào thư viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định được chính xác loại hợp chất mới này.

• Một số loại GC-MS khác• 1.3.1 Máy sắc kí khí kết hợp khối phổ với

độ phân giải cao(HRGC-HRMS) chuyên phân tích DIOXIN.

• Máy có thể phân tích được hàm lượng siêu vết Dioxin phù hợp với tiêu chuẩn EPA 1613 của Mỹ ở độ phân giải 10.000, giới hạn phát hiện ở mức 0,5ppt.

• Máy có thể đạt đến độ phân giải 80.000, định lượng được đồng thời 17 đồng phân PCDDs / PCDFs trong mẫu vật ở mức giới hạn phát hiện 0,01ppt

• Máy còn có chức năng tự động kiểm tra độ phân giải sau mỗi 12 giờ và tự động dừng phân tích nếu phát hiện độ phân giải giảm thấp hơn giới hạn cho phép.

Ứng dụng

• phân tích Dioxin và Furan trên nhiều lĩnh vực về môi trường : đất, bùn trầm tích, nước sông ngòi, nước ngầm…

• về thủy hải sản : tôm, cá, mực…• về nông sản thực phẩm : gạo, đậu, cà phê,

sữa…• đặc biệt là quy trình phân tích định lượng

Dioxin trong mẫu bệnh phẩm : mô mỡ, huyết thanh, gan…

Máy sắc kí khí kết hợp với khối phổ nhiều lần(GC/MSn)

Chức năng

• Nhận danh, xác định cấu trúc các hợp chất

hữu cơ tổng hợp và tự nhiên tương đối dễ bay

hơi

• Định lượng vi lượng và đa lượng.

Khả năng phân tích

• Dư lượng hóa chất có nồng độ ppb trở lên

• Độc tố, dư lượng thuốc trừ sâu, diệt cỏ, dư

lượng kháng sinh

• Phụ gia công nghiệp, hương liệu, dầu…

Đối tượng mẫu

• Thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ;

• Thực phẩm, nông sản thực phẩm;

• Dược phẩm, hương liệu, tinh dầu;

• Hợp chất tự nhiên khác;

• Sản phẩm công nghiệp.

Sắc lí lỏng kết hợp khối phổ(LS/MS/MS)• Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ là

phương pháp được hiểu là mẫu được phân tách và tinh sạch qua sắc ký, sau đó mẫu được đưa qua máy khối phổ để tiếp tục xác định khối lượng nguyên tử của nó.

• Kết thúc quá trình ta thu được lượng mẫu nhất định và cấu trúc phân tử đó.

ứng dụng• xác định protein • kiểm tra chất lượng nông sản, thực phẩn chế

biến, thức ăn gia súc và thủy hải sản: độc tố nấm mốc, vitamin, thành phần aa, phụ gia thực phẩm, chất hoạt động bề mặt, dư lượng kháng sinh (chloramphenicol, nitrofuran, fluoroquinolone, họ tetracycline, sulfamide…), dư lượng hormone kích thích tăng trưởng đã bị cấm, vi sinh vật có hại, mầu bị cấm trong thực phẩm (các loại Soudan), dư lượng thuốc trừ sâu.

Điện di kết hợp khối phổ• Thường được dùng để xác định protein.

Phương pháp này cho phép ta quan sát và nhận dạng sự hiện diện tất cả các protein ở các trạng thái tế bào

• Khối phổ là phương pháp mang lại năng suất và độ chính xác cao trong quá trình nhận biết những protein đã phân tách bằng điện di 2 chiều.

• Protein được phân tách trên gel polyacrylamide sau đó được đưa vào máy khối phổ để phân tích.Các máy móc ngày nay có thể tự thực hiện các bước phân tích và cho phép chúng ta quan sát được những protein có mực độ lớn.

Sequence

database

Tandem mass spectrum

Mass map

Tandem

mass

spectrometry

MALDI

TOF

or

Gel-separated protein

Hình: xác định protein thu được trong các mẩu sinh học.Protein từ mẩu có thể được phân tách bằng điện di một hoặc hai chiều và protein được nhận dạng bằng cách sử dụng MALDI-TOF và đánh dấu khối peptide.Peptide thu được tại những vị trí đặc biệt của protein đã được phân tách trên gel polyacrylamide có thể được phân tách bằng cách sử dụng khối phổ tandem.Dữ liệu từ khối phổ tandem có thể được dùng để tạo nên 1 cơ sở dữ liệu