Moderní mikroskopie -...

Moderní mikroskopieElektronová mikroskopie (TEM, SEM)

Mikroskopie skenující sondou

Doc.RNDr. Roman Kubínek, CSc.Katedra experimentální fyzikyPřírodovědecké fakulty, Univerzita Palackého v Olomouci

Elektronová mikroskopie

� Transmisní elektronová mikroskopie (TEM a HRTEM)

� Skenovací elektronová mikroskopie (SEM)

Transmisní elektronová mikroskopie

TransmisníElektronovýMikroskop

TransmisníElektronovýMikroskop

Urychlené elektrony jako vlna ve vakuu

h

Ef =

Pohybující se elektron o energii E a hybnosti p má podle Lui de Brogliehoteorie vlnovou povahu; tedy chová se jako vlna o:

frekvenci a vlnové délce , kde h je Planckova konstanta vm

h

e.=λ

Pro vlnovou délku elektronu odvodíme vztah

V praxi pro výpočet λ při známé hodnotě U [V]

Příklad:

U= 10 kV → λ = 0,01226 nmU= 100 kV → λ = 0,0037 nm

eUm

h

cm

eUeUm

h

0

20

0

2

212

≅

+

=λ

[ ]nm226,1

U=λ

Atomy stejného druhu v různě orientované krystalické mříži(v případě levého obrázku, prochází elektrony snadněji)

Kontrast v obraze závisí mimo jiné na:• orientaci krystalů v látce,• na průměrném protonovém čísle atomů preparátu, • na hustotě látky (počtu atomů v krystalické mříži).

Pro transmitované elektrony: v případě obrázku vlevo bude obraz sv ětlejší než v p řípadě obrázku vpravo

Elektrony procházejícípreparátem

� přeměnou kinetické energie elektronů na světlo – pozorování, záznam

� dopadem elektronů na fotografickou emulzi – záznam

Přeměna energie elektronů na světloPodobně jako v klasické TV obrazovce, elektrony bombardujístínítko opatřené luminoforem (fosfor, ZnS atd.)

V komoře TEM, v její spodní části je oválné luminiscenčnístínítko (fosfor – zelená fosforescence), na němž vzniká celkový obraz

Snímání obrazu speciální CCD kamerou - registrujeme změny intenzity jako ČB (šedotónový) obraz.

Zviditeln ění obrazu vytvo řeného elektrony v TEM

Morada (11 MPixelů)

MegaView III

(6 MPixelů)

Parametry:• Rozlišení obrazu - 11 megapixel ů

• Velikost pixelu - 9.0 x 9.0 µm • Kmito čet pixelu - až 25 MHz• Dynamický rozsah - 14 bit ů

• Instalace kamery - p říruba na širokoúhlém portu • Připojení PC - technologie FireWireTM(IEEE 1394) • Spřažení kamery - s optickými čočkami

Vnit řní přenosový čip s elektronickým p řerušova čem umožňuje extrémn ě krátké i extrémn ě dlouhé expozi čníčasy - 1 ms až 60 s. Morada dosahuje až 10 snímk ů za sekundu a frekvenci pixelu 24 MHz.

CCD čip je chlazený Peltierovým zp ůsobem a vzduchem a je stabilizovaný p ři 15°C, poskytuje velmi vysoký pom ěr signál/šum.

Morada používá nové speciáln ě vyvinuté scintilátory, optimalizované pro 100 a 200 keV.

Kamera má video výstup 640 x 408 pixel ů (50 Hz PAL, 60 Hz NTSC).

Digitální kamery pro elektronovou mikroskopii pro instalaci na 35 mm port

Černobílá CCD kamera s vysokým rozlišením instalovaná ve spodní části projekční komory mikroskopu v ose elektronového

svazku. • Uspo řádání CCD čipu a ú činného fosforového scintilátoru na principu optického vlákna. CCD typ: rychlost: 10 nebo 20 Mega Pixel/s, dynamickáplocha: 4096 odstín ů šedi (12 bit), rozlišení: 1280 x 1024), • Expozi ční čas: 100 µs - 160 s. Chlazení kamery Peltierem na teplotu 10 oC, chlazení je sou částí dodávky. • Obrazová data jsou odesílána p řes FireWireTM (IEEE1394), což eliminuje použití p řídavného framegrabberu. • Použití pro biologické aplikace a pro materiálový výzk um s požadavkem na vysoké rozlišení. • Instalace: b ěžné transmisní mikroskopy FEI (Philips), LEO, Jeol

Digitální kamery pro elektronovou mikroskopiiPro instalaci pod projek ční komoru Keen View

Čtyři základní stavební a funkční prvky elektronového mikroskopu:� zdroj elektronů (elektronové dělo),� elektromagnetické čočky,� preparátový stolek (držák, goniometr),� vakuový systém.

Elektronové dělo

Preparátovákomůrka

Systém elektromagnetických čoček a clon

Luminiscenční stínítko

Konstrukce TEM

zdroj elektronů:termoemisní zdroj přímo (nepřímo)žhavená katoda (2700 oC – Wolframové vlákno – vydržíměsíc)

katoda LaB6(2100 oC – hexaborid lanthanu – vydržírok)

autoemisní (studený) zdroj (FEG) –vydrží několik let

� Wehneltův válec (obklopuje katodu) – potenciál -100 V� Křižiště (zdroj elektronů, podobně jako vlákno žárovky) s průměrem cca 50 µm� Urychlovací napětí 100 až 300 kV (obvyklá hodnota TEM)

Konstrukce TEM – elektronovédělo

elektromagnetická čočka průběh magnetického pole (aberace)(solenoid)

Pro ohniskovou vzdálenost elektromagnetické čočky přibližně platí:

Bz0 – magnetická indukce v místě z na oseVýhoda:možnost měnit ohniskovou vzdálenost elmag. čočky změnou proudu ve vinutí cívky (solenoidu).Nevýhoda:Magnetické pole v dutině cívky (čočky) se mění (podle obrázku) a to vede k vadám zobrazení (sférická vada, chromatická vada)

∫=2

1

).(..8

1 2z

z

zo dzzBUm

e

f

Konstrukce TEM –elektromagnetické čočky

kondenzor• fokusuje elektronové paprsky na preparát• promítá křižiště elektronové trysky na preparát • zajišťuje jeho homogenní a intenzivníozáření)objektiv• je určen k tvorbě obrazu (faktor zvětšení50 –100x)projektiv• je tvořen dalšími čočkami, které určujívýsledné zvětšení TEM a „promítají“ obraz na stínítko

Součástí elektronoptického systému v tubusu jsou clony: • Clona kondenzoru odcloní mimoosové elektronové svazky• Aperturní clona (sou část objektivu) ur čuje aperturu elektronového svazku „paprsk ů“

Konstrukce TEM – tubus TEM

Držák vzorku

1. Přesný a jemný posun (krok nm)2. Posun v osách x, y, z,3. Rychlá výměna preparátu

Konstrukce TEM – preparátovákomůrka

EM potřebuje vakuum:• ve vzduchu je elektron absorbován, (dosah elektronového svazku EM ve vzduchu je max. 1 m)• elektronové dělo musí být izolováno vakuem (vzduch nenídobrý izolant),• vzduch obsahuje molekuly O2, N2, CO2 a hydrokarbonáty, které způsobují kontaminaci tubusu a vzorku.

Vakuový systém EM je tvo řen řadouventil ů spojených s výv ěvami

Běžné hodnoty tlaku atmosférický tlak ≈ 0,1 MPa (105 Pa)tlak v kosmickém prostoru ≈ 10-7 Pa

�Vakuum v preparátové komůrce≈ 10-5 Pa� Vakuum v prostoru katody ≈ 10-5 Pa (pro LaB6), 10-7 Pa (FEG)� Vakuum v prostoru stínítka ≈10-3 Pa (je zde film pro záznam obrazu)

Konstrukce TEM – vakuový systém

Schema vakuového systému moderního TEM

3 oddělené vakuované komory1. prostor katody2. prostor preparátu3. projekční komoraTypy vývěv:• rotační vývěva (předvakuum)• difúzní olejová vývěva• iontová (Ti – sublimační, 100 litrů/s)• turbomolekulárníMěření vakua: měrkami Piraniho typuCyklus vzduchem uzavíratelných ventilů

(čerpání rotačními vývěvami cca 30 s.)Čerpání preparátové komory s výměnou

vzorku trvá několik minut.Pro kryoaplikace (biologické vzorky) je nutné

odstranit usazování ledu na povrchu vzorku (kryostat s LN2)

Konstrukce TEM – vakuový systém

Světlé a temné pole

Difrakce

TEM vysokého rozlišení

TEM Tomografie

Rentgenová mikroanalýza

Světlé a temné pole

Difrakce

TEM vysokého rozlišení

TEM Tomografie

Rentgenová mikroanalýza

Základní pracovní režimy TEM

Světlé pole - standardní režim zobrazenírovina preparátuNa tvorbě obrazu se podílí paprsky přímo procházejícípreparátem, boční difrakční maxima jsou zachycena aperturníclonou.aperturní clona (v obrazové ohniskové roviněobjektivu)(obvykle 4 – 8 průměrů AC)

Obraz světlého pole krystalu MnO(krystaly leží na tenké C vrstvě na měděné síťce)

Temné polevysunutím AC excentricky mimo osu, necháme procházet preparátem pouze paprsky 1. difrakčního maxima.Použití pro zvýšení kontrastu krystalických materiál ů

Metoda sv ětlého a tmavého pole

Příklad: dva typy elementárních buněkdvě roviny (vzdálenost rovin 1/2 délky elementární bu ňky) čtyři roviny (1/4 el.buňky)

Pro horizontální směr:

Pro dvě roviny – reciproká vzdálenost = 2 (dva body ve dvojnásobné vzdálenosti od středu), Pro čtyři roviny – reciproká vzdálenost = 4 (čtyřnásobná vzdálenost od středu) Při započítání ostatních směrů dostaneme 3D síť mřížových bodů

1. pro identifikaci krystalů,2. pro stanovení orientace krystalu.Difrakční obrazec vzniká v obrazové ohniskové rovině objektivu

(podobnost se SM) – projektiv je pro sledování obrazu zaostřen na rovinu obrazu vytvořeného objektivem. Pro studium difraktogramů je nutné přeostřit Pr na OOR.

Difraktogram Si difraktogram Si 3(hexagonální symetrie)

TEM jako difraktograf

Splnění několika podmínek:1. náklon vzorku tak, aby umožnil pr ůchod elektronového svazku podél

uspo řádaných atom ů (viz. obrázek atom ů v m řížce),2. použití apertury s velmi malým pr ůměrem pro dosažení úzkého

elektronového paprsku,3. zpravidla se používá vyšší urychlovací nap ětí (nad 300 kV).

TEM obraz atom ů Si s vysokým rozlišenímvzdálenost mezi atomy (bližšími) 0,14 nmskutečná struktura (vlevo nahoře)

Azbestová vlákna na síťce struktura azbestu s vysokým rozlišením

HRTEM - elektronová mikroskopie s vysokým rozlišením

HRTEM (High Resolution Transmission Electron Microscopy)

TEM tomografieCo je třeba k získání 3D informace?

Každý obrázek je 2D projekcí z 3D objektu

Jak získat 3D informaci v TEM?

� Stereo zobrazování (TEM)� Dva stejné obrázky získané při různých náklonech dávají stereo

obraz� Nevýhoda je omezená hloubka ostrosti

� Série řezů (TEM)� Sestavení 3D obrazu ze série řezů jejich složením� Nevýhoda: značná doba pořízení dílčích řezů a jejich analýza.

Dochází ke ztrátě obrazových dat

� Tomografie (TEM)� Získání série obrazových dat z náklonu vzorku a jejich 3D

softwarová rekonstrukce� Výhoda: + rychlost (limitovaná rychlostí zpracování dat v PC

+ obraz s vysokým rozlišením (5 nm)

Automatizovaný Automatizovaný sbsběěr datr dat

ObjemovObjemováárekonstrukce rekonstrukce

obrazuobrazu

Vizualizace Vizualizace

‘3D

TEM Tomografie - princip

� Pořízení obraz ů při náklonu

� Seřazení projekcí

� Rekonstrukce

� Vizualizace a analýza

TEM Tomografie - princip

� Pořízení obrazů při náklonu

� Seřazení projekcí

� Rekonstrukce

� Vizualizace a analýza obrazu

TEM Tomografie - princip

� Pořízení obrazů při náklonu

� Seřazení projekcí

� Rekonstrukce

� Vizualizace a analýza obrazu

TEM Tomografie - princip

� Plně automatizovaný sběr dat

30 – 60 min.� Rekonstrukce 10 min.� Objemové rozpoznání

90 min.

BaBakkteriteriee(Movie 9 sec.)

Courtesy: Dr. Kobayashi, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Osaka, Japan

TEM Tomografie - princip

Hlavní cíl:Získat morfologickou informaci (reprodukovatelným z působem) se snahou potla čit jakékoliv artefakty preparátu.Tenká transparentní fólie – pro zachycení ultratenkých řezů tkání nebo suspenze částic�uhlíková fólie – 20 až 50 nm, �plastická fólie (Formvar ředěný v etylendichloridu <<<<0,5%) – 20 nmPodmínka : stabilita p ři proza řování elektrony, nízká zrnitost, kontrast porovnatelný se vzorkem.Příprava plastické fólie je snadn ější než čisté C vrstvy (pro HRTEM je vhodn ější C fólie)

Síťka pro TEM

– pevná podpora pro fólie (řezy) vyrobená z Cu

(antiferomagnetikum)

Označení MESHMesh 100 (100 čar/palec) Mesh 400

Příprava preparátů pro TEM

Postup nanesení fólie na sí ťkua – sklíčko ponořit do roztoku s Formvaremb – vysušení v bezprašném prostředíc – fólie splavená na hladinu vodyd – síťka na proužku papíru pod fólii

Příprava uhlíkové fólie

Příprava preparátů pro TEM

Vrstvou o tloušťce 100 nm (biologický preparát o ρ = 1 g.cm-3) prochází 50 % elektronů při UN = 50 kV →není možné pozorovat celé buňky.

Obvyklá tlouš ťka tenkého řezu 50 nm .

Pro řezání musí být tkáň speciálně připravena:� odběr tkáně (krájení v kapce fixáže na polyetylénu) nebo buněk (přímo do fixativa)� fixace� odvodn ění� kontrastování� zalití do blo čků� krájení

Příprava preparátů pro TEMUltratenké řezy

Vlastnosti ideální zalévací hmoty (Durcupan, Vestopal ,…):� rozpustnost v etanolu nebo acetonu před polymerizací,� neovlivňuje chemicky vzorek,� nezpůsobuje pnutí ve vzorku,� homogenně tuhá, ale dostatečně plastická,� stabilní při ozařování elektronovým paprskem.Bloček tkáně je párátkem přenesen na dno želatinové kapsle a zalit zalévacíhmotou.

Ořezání bločku do tvaru komolého jehlanu

Ploška by měla mít velikost 0,5 mm

Zalévání vzorku do bločkuUltratenké řezy

UltramikrotomieUltratenké řezy

Zvýraznění povrchové topografie odpařováním kovu ze strany

latexové kuličky (0,3 µm)

stínovanéa) Au b) Au–Pd

Kovy používané na stínování:� vysoká hustota,� inertnost vzhledem k chemickým vlivům a teplotě,� Au, Pd, Cr, Ni, Ge, Pt, U.� Cr pod 5 nm vykazuje granularitu.� Slitina Pt-Pd (3:1) je vhodnější než čistá platina. Slitina dává tloušťku 0,3–1,5 nm.

Stínování těžkými kovy

Vzorky silnější než 0,1 µm nemohou být studovány v TEM (rozptyl, absorpce).

Metoda povrchových replik spočívá v otisku povrchu do tenkého filmu transparentního pro elektrony (C, Formvar atd.).

Tloušťka repliky je cca 20 nm. Z důvodu malého kontrastu je dodatečně stínována.

Způsob vytvá ření replik:a - rozpuštěním vzorkub - odtržením z povrchu a odstraněním pásky

Negativní replika

Nanesení plastického (nebo C) filmu, sloupnutí (obtížné), stínování

Pozitivní replika

postup přípravy pozitivní repliky

Repliky

Freeze dryingzmražení v LN2sublimace ledu ve vakuuporovnání sušení na vzduchu a

metodou Freeze–Drying(zabrání se agregaci částic)

Při mrazovém sušení buněk může být jako mezistupeňzařazeno nanesení uhlíkového filmu pro dosažení lepšího kontrastu

Metody mrazového sušení, lomu a odpařování(Freeze Drying/ Fracturing/ Etching)

Metody umož ňují zkoumání objekt ů ve zmraženém stavu. Odpadá fixace chemickými činidly (a tedy možných chemických reakcí se vzorkem) . Rozlišení je dáno zrnitostí nanášeného kovu, z n ěhož je vyrobena replika.

Freezing Kousek tkán ě (buněčné suspenze) je rychle zmražen (LN 2) a přenesen do vakuovaného prostoru s nízkou teplotou.

Fracturing Zmrzlá tká ň je zchlazeným nožem obnažena (zlomena) a dochází k su blimaci ledu z povrchu (-90 oC) do hloubky 10 – 30 nm.Vytvo ří se reliéf povrchu. Povrchová topografie kopíruje bun ěčné membrány a organely. Povrch se bezprost ředně stínuje kovem a nanáší se C film pro vytvo ření repliky.

Postup:a. izolace tkán ěb. zmraženíc. mrazový lomd. sublimace ledue. stínování a

příprava replikyf. čišt ění repliky

Freeze fracturing (etching)

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM)

JEM 2010 (JEOL) Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) je zobrazovací technikou využívající průchodu urychlených elektronů vzorkem a jeho zobrazenína fluorescenčním stínítku nebo záznamu na film nebo speciální CCD kameru. Podle zvoleného urychlovacího napětí je možné měřit velikosti nanočástic do 0,1 nm.

Aplikace: stanovení velikosti a distribuce částic, morfologie nanočástic, chemického složení, krystalickéstruktury.

Rozlišovací mez 0.194 nm

Urychlovací nap ětí: 80–200 kV

Zvětšení: 50–1,500 000×