Autor: Bc. Ladislav Šigut

Obor: BiofyzikaRok: 2009

1. Stručný popis pigment proteinových

komplexů

2. Metodiky elektronové mikroskopie pro

studium fotosyntetického aparátu

3. Elektronová krystalografie:

Fotosystém I/II a anténní komplexy

4. Jednočásticová analýza: Fotosystém

I/II a anténní komplexy

Optická mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie

Konfokální mikroskopie

Elektronová mikroskopie

Mikroskopie skenovací sondou

CyanobakterieLHC

Fykobilizom = LHC

PS I/II (RC I/II)

Nesou několik molekul

(bakterio)chlorofylu a

různých karotenoidů

Multiproteinovékomplexy

Mnohojednotkovésuperkomplexy

Větší membránové domény

• PS I komplexyStroma

• PS II komplexy + LHC (PSII)Grana

Teoretické 0,04 Å × praxe 1 Å (aberace elmag čoček)

Makromolekuly, oligomery a supramolekulární

seskupení

Studium struktury ( × NMR, RTG krystalografie)

Analýzy různých funkčních stavů

Časově rozlišené studium

Studium konformační flexibility velkých komplexů

Využití

Rozlišení

Velká hloubka ostrosti

(malá apertura)

Soubor 2D projekcí pozorované

3D struktury

Tomografická rekonstrukce:

3D mapa

Radiační citlivost makromolekul

Pohyb vzorku v paprsku elektronů

Nízký kontrast (C, O, H, N)

Vysoký šum => průměrování

Rozlišení

nejlépe 3 Å

2D krystaly malých proteinů

Potenciál řešit strukturu

v atomárním rozlišení

Krystalografická metoda Jednočásticová metoda

Jednotlivé fixované částice

Rozlišení omezeno na 10-25 Å

Produkce velkých 3D krystalů

(obtížná příprava)

Rentgenová krystalografieElektronová krystalografie

Správně uspořádané 2D

krystalické objekty

Vhodná pro studium membránových proteinů

90. léta: určení struktury bakteriorhodopsinu (světlem řízená

protonová pumpa cytoplazmatické membrány halobakterií)

řešena na úroveň rozlišení 3,5 Å (Henderson et al., 1990),

později 3 Å (Grigorieff et al., 1996)

Struktura LHC II: rozlišení 3,4 Å (Kühlbrandt et al., 1994),

RTG krystalografie LHC II špenátu - rozlišení 2,72 Å (Liu et al., 2004)

Vyřešení celkového tvaru PS I komplexu špenátu na rozlišení

25 Å (Kitmitto et al., 1998)

další studie: vazebná místa mobilních elektronových přenašečů

RTG difrakce: 4,4 Å - PS I hrachu (Ben-Shem et al., 2003)

Cyanobakterie: monomerní a trimerní PS I komplex

EM 3D mapa monomerního PS I v rozlišení 8 Å (Karrast et al., 1996)

RTG kryst.: PS I komplex při rozlišení 2,5 Å (Jordan et al., 2001)

Huseníček rolní PS II + LHC II

Kontrast barvením Průměrování 450 projekcí

Trimerní LHC II (S,M, L)

Monomerní LHC II (CP 29, 26, 24)

× Elektronová krystalografie

Studium struktury a dynamiky

struktur, z nichž je obtížné sestavit

2D nebo 3D krystaly (viry,

ribosomy, chaperony, membránové

proteinové komplexy)

Střední rozlišení (do 10 Å) =>

kombinace jednočásticové

rekonstrukce a RTG krystalografie

D1

D2

Výzkum pomocí SPA od konce 70. let

Monomerní a trimerní forma PS I (závisí na růstových

podmínkách)

Nedostatek Fe: náhrada fykobilisomů IsiA proteinem

Kruh 18 podjednotek IsiA kolem PS I (stejně Pcb

protein u prochlorofyt)

Pouze nesymetrické monomery

Zelená řasa Chlamydomonas reinhardtii: LHC I tvoří půlměsíc

na jedné straně PS I komplexu

Vyšší R Cyanobakterie Prochlorofyta

Komplex jádra PS I

PS I – LHC I superkomplex

PcbC – PS I superkomplex

Konec 80. let: nedostatek dat o struktuře PS II s vysokým rozlišením

Využití negativního barvení

Dimerní organizace jádra PS II, výstupky na lumenální straně

přiřazeny O2 vyvíjejícímu komplexu (Bumba et al., 2004)

Monomerní a trimerní

Biochemická analýza: symetricky

2 monomery CP 26, 29 a trimer

Lhcb1, Lhcb2 komplex

Přidání dalších LHC II trimerů: připojení

na 3 různé pozice na PS II

silnou (S), střední (M) a nepevnou (L)

vazbou

Kryo-EM: 3D struktura PS II – LHC II superkomplexu vyšších R

Rozlišení 24 Å (Nield et al., 2000)

Kyslík vyvíjející komplex = tetramer

Červená řasa

PS II Pcb - PS IIPS II - LHC II

ProchlorofytaŠpenát

Vacha et al. (2005) Microscopy and single molecule detection in

photosynthesis

Bibby, T.S. (2003) Structure of a photosystem II supercomplex isolated from

Prochloron didemni retaining its chlorophyll ab light-harvesting system

(http://tinyurl.com/BibbyT-S)

http://www-vis.lbl.gov/Vignettes/ - Cryo-EM

http://tinyurl.com/cryoEM3obr - RC I PS I

http://tinyurl.com/Photosys1 - Photosystem I in cyanobacteria

http://tinyurl.com/Reinhardtii3D

http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/Biology/antpho.html

Děkuji za pozornost

RC – reakční centrum

PS – fotosystém

LHC – světlosběrný komplex

Fykobilizom, Pcb – plní

funkci LHC u nižších

organismů