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Mémoire de soutenance présenté en vue de l’obtention d’une
habilitation à diriger des recherches
Université Paris Saclay
Etude de machines moléculaires impliquées dans la dynamique des
génomes bactériens et phagiques
Soutenu le 30/06/2021 par François LECOINTE
Chargé de recherche à INRAE, Equipe Phages, Unité Micalis, Centre
INRAE de Jouy-en-Josas
Composition du Jury :
Mireille Ansaldi, Directrice de Recherche, CNRS
Patrice Polard, Directeur de Recherche, CNRS
Patrick Calsou, Directeur de Recherche, INSERM
Fabrice Confalonieri, Professeur des Universités, Université
Paris-Saclay
Paulo Tavares, Directeur de Recherche, CNRS
1
Curriculum vitae
Nom, prénom : LECOINTE François
Né le : 20 juin 1973 à Issy-les-Moulineaux (92)
Tél. : 01 34 65 20 81
E-mail : francois.lecointe@inrae.fr
DIPLOMES ET FORMATION ____
1998-2002 Thèse de Doctorat en Microbiologie de l’Université Pierre et Marie Curie,
Paris.
Mention très honorable. Travaux réalisés au Laboratoire d’Enzymologie et
Biochimie Structurales (CNRS, Gif/Yvette, directeur J. Janin) dans l’équipe du
Dr. Henri Grosjean.
Sujet de thèse : Etude d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et
de leurs fonctions dans le métabolisme cellulaire chez S. cerevisiae.
Membres du jury : Dr. Pierre Thuriaux (rapporteur), Dr. Pierre Plateau
(rapporteur), Dr. Bruno Lapeyre (examinateur), Pr. Jean-Pierre Rousset
(examinateur), Pr. Maurice Claisse (président), Dr. Henri Grosjean (directeur de
thèse).
1997 DEA de Microbiologie Fondamentale, Mention Très Bien, Major de
promotion, Université Pierre et Marie Curie, Paris.
Magistère de Biotechnologies 3ème année, Mention Très Bien, Major de
promotion, Université Paris Sud, Orsay.
1996 Maîtrise de Biologie Moléculaire et Génétique.
Magistère de Biotechnologies 2ème année, Mention Assez Bien, Université Paris
Sud, Orsay.
1995 Licence de Biochimie option Biologie Moléculaire et Génétique, Mention
Assez Bien.
Magistère de Biotechnologies 1ère année, Mention Assez Bien, Université Paris
Sud, Orsay.
1993-94 DEUG B Sciences de la nature et de la vie, Mention Assez Bien, Université
Paris Sud, Orsay.
1992 PCS0, Université Paris Sud, Orsay.
1991 Bac série F7 (Biochimie), Lycée de la Vallée de Chevreuse, Gif-sur-Yvette.
2
EXPERIENCE PROFESSIONNELLE ____
Après la thèse
2015-auj. Chargé de recherche 1ère classe (CRCN depuis 2018) à l’INRA (INRAE
depuis 2020) Unité Micalis (directeur Dr. S. Aymerich puis Dr. P. Noirot), INRA, Jouy-en-
Josas, dans l’équipe PHAGES dirigée par la Dr. M.A. Petit.
Sujet de recherche : Compréhension des mécanismes de recombinaisons
phagiques à la base de leur évolution. Impact des phages tempérés sur la
physiologie de leur hôte.
2007-2015 Chargé de recherche 1ère classe à l’INRA Laboratoire : Unité de Génétique Microbienne (directeur Dr. S.D. Ehrlich) puis
Unité Micalis depuis 2010 (directeur S. Aymerich), INRA, Jouy-en-Josas, dans
l’équipe du Dr. P. Noirot.
Sujets de recherche : Caractérisation du mécanisme de recombinaison
illégitime chez les bactéries. Etude de la dynamique de complexes
nucléoprotéiques chez Bacillus subtilis et de son impact sur l’expression des
gènes.
2004-2007 Chargé de recherche 2ème classe à l’INRA
Laboratoire : Unité de Génétique Microbienne (directeur Dr. S.D. Ehrlich),
INRA, Jouy-en-Josas, dans l’équipe du Dr. P. Polard.
Sujet de recherche : Identification et caractérisation des complexes
multiprotéiques impliqués dans la réplication et la réparation du chromosome de
B. subtilis.
Sept.-nov. Stagiaire post-doctoral 2004 Laboratoire : Institut de Biochimie et de Biophysique Moléculaire et Cellulaire
à l’Université Paris Sud, Orsay, dans l'équipe du Pr. H. van Tilbeurgh.
Sujet de recherche : Etude structurale de l'ADN topoisomérase VI des Archaea
et de la polymérase X de Deinococcus radiodurans.
Nov. 2002- Attaché Temporaire d'Enseignement et de Recherche (ATER)
août 2004 Laboratoire : Institut de Génétique et de Microbiologie à l’Université Paris sud,
Orsay, dans l'équipe de la Pr. S. Sommer.
Sujet de recherche : Etude de la radiorésistance chez D. radiodurans.
Avant la thèse
Oct.1997- Scientifique du contingent au Laboratoire de Physiopathologie de
juil. 1998 l’Infection (Institut Pasteur - Paris), dans l’équipe du Dr. G. Marshal
Sujet de recherche : Construction d’un mutant de gène codant pour un facteur
de virulence potentiel chez Mycobacterium tuberculosis.
Janv.-août Stage de DEA au Laboratoire d’Enzymologie et Biochimie Structurales
1997 (CNRS à Gif-sur-Yvette)
Sujet de recherche : Caractérisation de la protéine Deg1 chez la levure.
3
Juin-juil., Stage en Microbiologie industrielle au Laboratoire LACTEOL (Houdan - 78).
sept. 1996 Sujet de recherche : Etude de la croissance de deux en culture mixte ou isolée
et mesure de leurs activités antimicrobiennes.
Juin-juil. Stage à l’Institut de Génétique et de Microbiologie à l’Université Paris sud,
1995 Orsay, dans l'équipe du Pr. P. Forterre.
Sujet de recherche : Développement d’un outil génétique par curage du
plasmide pGT5 chez Pyrococcus abyssi.
Juin-juil. Stage en Microbiologie industrielle au Laboratoire LACTEOL (Houdan - 78).
1994 Sujet de recherche : Suivi de l’activité antibiotique d’un L. acidophilus au cours
du processus industriel de fermentation.
ENSEIGNEMENT ____
2017-2020 Jury de soutenance de stages en M1 Master BIOLOGIE-SANTE, Spécialité
Microbiologie Appliquée et Génie Biologique (MAGB) et en M2 Spécialité
Génétique et environnement (env. 10h éq.TD/an). Université Paris Sud/Paris
Saclay.
2015-2016 TP en Biotechnologies en M2, Jury de soutenance de stages en M1-Pro Master
BIOLOGIE-SANTE, Spécialité MAGB. (30h éq.TD/an). Université Paris Sud.
2011-2014 (>64h éq.TD/an dans le cadre d’une Prime d’Excellence Scientifique attribuée
par l’INRA).
- TD M1 - Instabilité Génomique et Pathologies Associées du Master
BIOLOGIE SANTE, Spécialité Génomes, Cellules, Développement (GCDE).
Université Paris Sud.
- Cours M2 - Criblage Génomique/Génomique fonctionnelle du Master
BIOLOGIE-SANTE, Spécialité GCDE. Université Paris Sud.
- TP en Biotechnologies en M2 Pro Master BIOLOGIE-SANTE, Spécialité
MAGB. Université Paris Sud.
- Jury de soutenance de stages, M1 Pro Master BIOLOGIE-SANTE, Spécialité
MAGB. Université Paris Sud.
- Cours de Chimie Générale, L2 pro Biotechnologie. Université Paris Sud.
- Cours M2 du Master Biotechnologies Microbiologie Aliment Nutrition
Environnement, spécialité Biotechnologies microbiennes. Université de
Lorraine.
2005-2006 TP en M2 du Master BIOLOGIE-SANTE Spécialité GCDE (2 semaines en
2006 et 3 semaines en 2005). Université Paris Sud.
2002-2004 ATER. TP et TD de Biochimie et Biologie Moléculaire pour des étudiants de 1er
et 2nd cycles (96h éq.TD/an). Université Paris Sud.
1998 à 2001 Moniteur. TP et TD de Microbiologie pour des étudiants de DEUG. (64h
éq.TD/an). Université Paris VII.
4
ACTIVITES D’ENCADREMENT ____
Nov 2018-auj. Direction de la thèse de Pauline Misson portant sur la caractérisation du module
de recombinaison du phage Gally et de son impact sur la viabilité et la tolérance
de la souche Escherichia coli LF82 en macrophage.
2018 Encadrement du stage de M2 de Pauline Misson (janv. à juin 2018) sur le même
sujet que la thèse.
2017 Encadrement du stage de M1 de Pauline Misson (mai à juin 2017) portant sur la
caractérisation de la protéine Mu-Gam du phage Gally de la souche entéro-
pathogène LF82.
2015 Encadrement du stage de L2 « bioplus » de Florian de Ceuyper (mai à juin 2015)
portant sur la caractérisation de la recombinase Sak4 du phage PA73.
2014 Encadrement du stage de M1 d’Emilie Rollier (fév. à juin 2014) ayant pour but
l’adaptation du système CRIPR-Cas9 chez B. subtilis.
2011 Encadrement du stage de M2 d’Héloïse Simonson (janv. à juil. 2011) portant sur
la caractérisation du NHEJ chez B. subtilis.
2006-2010 Co-encadrement, avec le Dr. P. Polard, de la thèse d’Audrey Costes sur l’étude
fonctionnelle du rôle de la protéine SSB dans le maintien de l’intégrité du
génome de la bactérie B. subtilis.
2006 Encadrement du stage M2 d’Audrey Costes sur l’étude fonctionnelle in vivo de
la protéine RecG de B. subtilis.
2000 Co-encadrement, avec le Dr. H. Grosjean, du DEA de Stéphanie Vougier sur la
caractérisation biochimique de la protéine Pus4 chez la levure.
ACTIVITES D’EVALUATION DE LA RECHERCHE ____
Evaluation de thèses
Examinateur dans les jurys de thèse de Lingli Zhang de l’équipe du Pr P. Leblond (Université
de Lorraine, thèse soutenue le 23/09/2014), de Solenne Ithurbide de l’équipe de
la Pr. S. Sommer (Université Paris-Sud, soutenue le 23/09/2015), de Karima
Benferhat de l’équipe du Dr. E. Le Cam (Institut Gustave Roussy, soutenue le
27/08/2018) et de Léo Zangelmi de l’équipe du Dr. P. Boulanger (I2BC, soutenue
le 06/12/2018).
Invité au jury de thèse de Grégory Hoff de l’équipe du Pr. P. Leblond (Université de
Lorraine, thèse soutenue le 13/12/2016).
Membre des comités de thèse de Solenne Ithurbide (équipe de la Pr. S. Sommer à
l’Université Paris-Sud), Karima Benferhat (équipe du Dr. E. Le Cam à l’Institut
Gustave Roussy). Je suis actuellement tuteur de Nicolas Eugénie, étudiant en 4ème
année de thèse (dirigée par le Dr. P. Servant à l’université Paris-Sud).
5
Jury de recrutement
J’ai fait partie des jurys de recrutement de Maître de Conférences à
l’Université Paris-Sud en 2009 (Poste N 679), 2010 (poste N 579), 2011 (poste
MCU0551), 2015 (N 64-65 MCF0065) et 2016 (N 64-65 MCF681).
Relecteur d’articles
J’ai réalisé la critique d’articles soumis aux journaux suivants : Proteomics (2008),
Plos Genetics (2009, 2013), BMC Microbiol. (2011), Mol. Mic. (2017), NAR
(2014, 2018, 2018), Viruses (2018), Scientific Reports (2018), Future of Science
(2019), DNA Repair (2020).
ACTIVITES D’ANIMATION DE LA RECHERCHE ____
Sept. 2019- Co-responsable de l’équipe Préparation/laverie de l’unité Micalis constituée
auj. de 7 agents.
2015-2019 Membre élu du conseil académique de l’Université Paris-Saclay.
2016-2019 Membre élu suppléant du conseil de département des Sciences de la Vie de
l’Université Paris-Saclay.
PUBLICATIONS DANS DES JOURNAUX A COMITE DE LECTURE ____
Articles de recherche
1. Lossouarn, J., Briet, A., Moncaut, E., Furlan, S., Bouteau, A., Son, O., Leroy, M., DuBow, M.S.,
Lecointe, F., Serror, P., and Petit, M.A. Enterococcus faecalis countermeasures defeat a virulent
Picovirinae bacteriophage. Viruses, 2019. 11(1).
2. Hutinet, G., Besle, A., Son, O., McGovern, S., Guerois, R., Petit, M.A. &, Ochsenbein, F., and
Lecointe, F. & Sak4 of phage HK620 is a RecA remote homolog with single-strand annealing activity
stimulated by its cognate SSB protein. Front Microbiol, 2018. 9: p. 743. & co-auteurs de
correspondance.
3. Hoff, G., Bertrand, C., Zhang, L., Piotrowski, E., Chipot, L., Bontemps, C., Confalonieri, F.,
McGovern, S., Lecointe, F., Thibessard, A., and Leblond, P. Multiple and Variable NHEJ-Like Genes
Are Involved in Resistance to DNA Damage in Streptomyces ambofaciens. Front Microbiol, 2016. 7: p.
1901.
4. McGovern, S., Baconnais, S., Roblin, P., Nicolas, P., Drevet, P., Simonson, H., Pietrement, O.,
Charbonnier, J.B., Le Cam, E., Noirot, P., and Lecointe, F. C-terminal region of bacterial Ku controls
DNA bridging, DNA threading and recruitment of DNA ligase D for double strand breaks repair.
Nucleic Acids Res, 2016. Vol 44, Issue 10, p 4785-4806.
5. Nicolas, P., Mader, U., Dervyn, E., Rochat, T., Leduc, A., Pigeonneau, N., Bidnenko, E.,
Marchadier, E., Hoebeke, M., Aymerich, S., Becher, D., Bisicchia, P., Botella, E., Delumeau, O.,
Doherty, G., Denham, E.L., Fogg, M.J., Fromion, V., Goelzer, A., Hansen, A., Hartig, E., Harwood,
6
C.R., Homuth, G., Jarmer, H., Jules, M., Klipp, E., Le Chat, L., Lecointe, F., Lewis, P., Liebermeister,
W., March, A., Mars, R.A., Nannapaneni, P., Noone, D., Pohl, S., Rinn, B., Rugheimer, F., Sappa, P.K.,
Samson, F., Schaffer, M., Schwikowski, B., Steil, L., Stulke, J., Wiegert, T., Devine, K.M., Wilkinson,
A.J., van Dijl, J.M., Hecker, M., Volker, U., Bessieres, P., and Noirot, P. Condition-dependent
transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science, 2012. 335(6072):
p. 1103-6.
6. Buescher, J.M. &, Liebermeister, W. &, Jules, M. &, Uhr, M. &, Muntel, J. &, Botella, E. *,
Hessling, B. *, Kleijn, R.J. *, Le Chat, L. *, Lecointe, F. *, Mader, U. *, Nicolas, P. *, Piersma, S. *,
Rugheimer, F. *, Becher, D., Bessieres, P., Bidnenko, E., Denham, E.L., Dervyn, E., Devine, K.M.,
Doherty, G., Drulhe, S., Felicori, L., Fogg, M.J., Goelzer, A., Hansen, A., Harwood, C.R., Hecker, M.,
Hubner, S., Hultschig, C., Jarmer, H., Klipp, E., Leduc, A., Lewis, P., Molina, F., Noirot, P., Peres, S.,
Pigeonneau, N., Pohl, S., Rasmussen, S., Rinn, B., Schaffer, M., Schnidder, J., Schwikowski, B., Van
Dijl, J.M., Veiga, P., Walsh, S., Wilkinson, A.J., Stelling, J., Aymerich, S., and Sauer, U. Global network
reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 2012. 335(6072):
p. 1099-103. & co-premiers auteurs, * co-6ème auteurs.
7. Delumeau, O., Lecointe, F., Muntel, J., Guillot, A., Guedon, E., Monnet, V., Hecker, M.,
Becher, D., Polard, P., and Noirot, P. The dynamic protein partnership of RNA polymerase in Bacillus
subtilis. Proteomics, 2011. 11(15): p. 2992-3001.
8. Costes, A.&, Lecointe, F. &, McGovern, S., Quevillon-Cheruel, S., and Polard, P. The C-
terminal domain of the bacterial SSB protein acts as a DNA maintenance hub at active chromosome
replication forks. PLoS Genet, 2010. 6(12): p. e1001238. & co-premiers auteurs.
9. Leulliot, N., Cladiere, L., Lecointe, F., Durand, D., Hubscher, U., and van Tilbeurgh, H. The
family X DNA polymerase from Deinococcus radiodurans adopts a non-standard extended
conformation. J Biol Chem, 2009. 284(18): p. 11992-9.
10. Graille, M., Cladiere, L., Durand, D., Lecointe, F., Gadelle, D., Quevillon-Cheruel, S.,
Vachette, P., Forterre, P., and van Tilbeurgh, H. Crystal structure of an intact type II DNA
topoisomerase: insights into DNA transfer mechanisms. Structure, 2008. 16(3): p. 360-70.
11. Lecointe, F., Serena, C., Velten, M., Costes, A., McGovern, S., Meile, J.C., Errington, J.,
Ehrlich, S.D., Noirot, P., and Polard, P. Anticipating chromosomal replication fork arrest: SSB targets
repair DNA helicases to active forks. EMBO J, 2007. 26(19): p. 4239-51.
12. Jolivet, E. &, Lecointe, F. &, Coste, G., Satoh, K., Narumi, I., Bailone, A., and Sommer, S.
Limited concentration of RecA delays DNA double-strand break repair in Deinococcus radiodurans R1.
Mol Microbiol, 2006. 59(1): p. 338-49. & co-premiers auteurs.
13. Pitarque, S., Herrmann, J.L., Duteyrat, J.L., Jackson, M., Stewart, G.R., Lecointe, F., Payre, B.,
Schwartz, O., Young, D.B., Marchal, G., Lagrange, P.H., Puzo, G., Gicquel, B., Nigou, J., and
Neyrolles, O. Deciphering the molecular bases of Mycobacterium tuberculosis binding to the lectin DC-
SIGN reveals an underestimated complexity. Biochem J, 2005. 392(Pt 3): p. 615-24.
14. Lecointe, F. &, Shevelev, I.V. &, Bailone, A., Sommer, S., and Hubscher, U. Involvement of an
X family DNA polymerase in double-stranded break repair in the radioresistant organism Deinococcus
radiodurans. Mol Microbiol, 2004. 53(6): p. 1721-30. & co-premiers auteurs.
15. Lecointe, F., Coste, G., Sommer, S., and Bailone, A. Vectors for regulated gene expression in
the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Gene, 2004. 336(1): p. 25-35.
7
16. Lecointe, F., Namy, O., Hatin, I., Simos, G., Rousset, J.P., and Grosjean, H. Lack of
pseudouridine 38/39 in the anticodon arm of yeast cytoplasmic tRNA decreases in vivo recoding
efficiency. J Biol Chem, 2002. 277(34): p. 30445-53.
17. Pintard, L. &, Lecointe, F. &, Bujnicki, J.M., Bonnerot, C., Grosjean, H., and Lapeyre, B. Trm7p
catalyses the formation of two 2'-O-methylriboses in yeast tRNA anticodon loop. EMBO J, 2002. 21(7):
p. 1811-20. & co-premiers auteurs.
18. Grosshans, H., Lecointe, F., Grosjean, H., Hurt, E., and Simos, G. Pus1p-dependent tRNA
pseudouridinylation becomes essential when tRNA biogenesis is compromised in yeast. J Biol Chem,
2001. 276(49): p. 46333-9.
19. Lecointe, F., Simos, G., Sauer, A., Hurt, E.C., Motorin, Y., and Grosjean, H. Characterization
of yeast protein Deg1 as pseudouridine synthase (Pus3) catalyzing the formation of psi 38 and psi 39 in
tRNA anticodon loop. J Biol Chem, 1998. 273(3): p. 1316-23.
Article de revue
1. Bertrand, C., Thibessard, A., Bruand, C. &, Lecointe, F. &, and Leblond, P. & Bacterial NHEJ:
a never ending story. Mol Microbiol, 2019. 111(5): p. 1139-51. & co-auteurs de correspondance.
Chapitres de livre
1. Namy, O., Lecointe, F., Grosjean, H., and Rousset, J.P. Translational Recoding and RNA
Modifications. Topics in Current Genetics, 2005. Vol 12, pp 309-340. H. Grosjean (Ed): Fine-Tuning
of RNA Functions by Modification and Editing, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg.
2. Thibessard, A., Bertrand, C., Bartlett E.J., Doherty, A.J., Bruand, C., Leblond, P. and
Lecointe, F. Nonhomologous End-Joining in Bacteria. A paraître en aout 2021 dans Encyclopedia of
Biochemistry 3rd Edition doi:10.1016/B978-0-12-819460-7.00150-X.
COMMUNICATIONS ____
Communications orales
- 12ème Colloque des 3R, 2017, Presqu’île de Giens, France.
Sak4 of phage HK620 is a RecA remote homolog with single-strand annealing activity stimulated by its
cognate SSB protein.
- Congrès « Phages On Marseille », 2016, Toulouse, France.
Sak4 of phage HK620 is a RecA paralog with single-strand annealing activity stimulated by its cognate
SSB protein.
- Conférencier invité à l’atelier satellite du Colloque annuel 2015 des utilisateurs de SOLEIL : "INRA-
SOLEIL : l’Approche Synchrotron en Agriculture, Alimentation et Environnement", 2015, Gif sur
Yvette, France. Mécanismes de réparation des cassures double brin de l’ADN par le système NHEJ
chez B subtilis.
- BaSysBio 3rd Spring Meeting, 2010, Bruxelles, Belgique.
ChIP-chip: Novel targets of CcpA and role of CcpA during the carbon source media shift.
- Symposium Micalis, 2009, Jouy-en-Josas, France. Par Lecointe F. et Nicolas P.
Deux exemples d'études ayant nécessité le développement du ChIP on chip chez Bacillus subtilis
8
- Journée thématique "Interactome et spectrométrie de masse", 2008, Jouy-en-Josas, France.
Utilisation du SPA-Tag chez Bacillus subtilis: identification d'une plateforme d'interaction dans l'usine
réplicative bactérienne.
- Colloque du « RNA club », 2002, Gif-sur-Yvette, France.
Etude d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et de leurs fonctions dans le métabolisme
cellulaire chez S. cerevisiae.
- 9ème rencontre de l’école doctorale B2M, 2001, Paris, France.
Caractérisation d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et rôle au niveau de la traduction
génétique chez S. cerevisiae.
Posters (* : présentés par F. Lecointe)
- Hutinet, G., Besle, A., Son, O., McGovern, S., Guerois, R., Ansaldi, M., Djedid, A., Petit, M.A.,
Ochsenbein, F. and Lecointe, F*. Sak4 of phage HK620 is an SSB-stimulated annealase that is involved
in the lytic development of the phage. Congrès « PHAGES-sur-Yvette”, 2017, Gif sur Yvette, France.
- Lecointe, F*., Mc Govern, S., Baconnais, S., Roblin, P., Nicolas, P., Drevet, P., Simonson, H.,
Piétrement, O., Charbonnier, J.-B., Le Cam, E., Noirot, P. Characterization of the non homologous end
joining (NHEJ) mechanism in B. subtilis: the dual role of the C-terminal part of Ku. 11ème colloque
des 3R, 2015, Presqu'île de Giens, France.
- Lecointe, F*., Mc Govern, S., Simonson, H., Drevet, P., Roblin, P., Charbonnier, J.-B., Noirot, P.
Caractérisation du mécanisme de recollement d'extrémités non homologues (NHEJ) chez Bacillus
subtilis. 10ème colloque des 3R, 2013, Presqu'île de Giens, France.
- Pigeonneau, N., Lecointe, F., Nicolas, P., Noirot, P. New DNA binding sites for CcpA, the major
regulator of the carbon catabolite response in Bacillus subtilis. Congrès Systems Biology of
Microorganisms, 2010, Paris, France.
- Delumeau, O., Lecointe, F., Guillot, A., Monnet, V., Polard, P., Noirot, P. The dynamic protein
partnership of RNA polymerase in Bacillus subtilis. Congrès Systems Biology of Microorganisms,
2010, Paris, France.
- Lecointe, F. *, Costes, A., McGovern, S., Cheruel, S., Polard, P. SSB: coordinateur des mécanismes
de réparation des fourches de réplication ? Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation",
2009, Presqu’île de Giens, France.
- Lecointe, F. *, Sérèna, C., Velten, M., McGovern, S., Costes, A., Meile, J.C., Errington, J., Noirot, P.,
Polard, P. Un rôle général de SSB dans la surveillance des fourches de réplication chez les bactéries.
Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation", 2007, Presqu’île de Giens, France.
- Jolivet, E., Lecointe, F., Coste, G., Bailone, A., Sommer, S. Une concentration limitante de protéine
RecADr retarde la réparation des cassures de l’ADN et augmente la radiosensibilité de mutants
9
déficients pour ddrA. Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation", 2005, Presqu’île de
Giens, France.
- Lecointe, F. *, Bailone, A., Sommer, S. Mécanismes de radiorésistance chez Deinococcus
radiodurans. Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation", 2003, Presqu’île de Giens,
France.
- Lecointe, F. *, Motorin, Y., Grosjean, H. Purification et caractérisation biochimique de l'ARNt:
pseudouridine 38/39 synthétase (Pus3p) de S. cerevisiae. Congrès SIFRARN, Société Française de
Biochimie et Biologie Moléculaire, 2000, Toulouse, France.
- Lecointe, F. *, Motorin, Y., Grosjean, H. La protéine Deg1 de S. cerevisiae est une pseudouridine
synthétase catalysant la formation de 38 et 39 dans la boucle anticodon des ARNt. 7ème rencontre de
l’école doctorale B2M, 1999, Paris, France.
- Motorin, Y., Lecointe, F., Simon, C., Foiret, D., Keith, G., Simos, G., Hurt, E., Grosjean, H. Two
multisite specific tRNA:pseudouridine synthases from yeast. Congrès SIFRARN, Société Française de
Biochimie et Biologie Moléculaire, 1998, Strasbourg, France.
10
AVANT PROPOS
Ma recherche a toujours porté sur la caractérisation de mécanismes moléculaires mis en jeu
dans différents aspects du métabolisme des acides nucléiques et plus particulièrement sur les
mécanismes assurant la transmission de l’information génétique.
Pendant ma thèse, sous la direction du Dr. Henri Grosjean (1998-2002, LEBS, CNRS
Université Paris VI), j'ai identifié et caractérisé l'activité de deux enzymes de modification des
ARNt chez la levure S. cerevisiae, toutes deux influant sur l'efficacité de la traduction
génétique. Ce travail est décrit dans la première partie de ce dossier.
J'ai ensuite rejoint l'équipe de la Pr. Suzanne Sommer (2002-2004, IGM, Université Paris
XI) au cours d'un premier stage post doctoral pour travailler sur un micro-organisme fascinant,
Deinococcus radiodurans, capable de réparer son génome fragmenté en milliers de fragments
en seulement quelques heures. La seconde partie de ce document décrit les outils que j'ai mis
au point pour faciliter son étude ainsi que le rôle de la polymérase X dans la réparation des
cassures double-brin de l'ADN chez cette bactérie. J'ai initié le travail de caractérisation
structurale de cette enzyme au cours d'un second stage post-doctoral chez le Pr. Herman van
Tibeurgh (sept-nov 2004, IBBMC, université Paris XI).
L'étude des protéines isolées impliquées dans ces mécanismes assurant la pérennité et
l'expression des génomes, bien qu'essentielle, s'est avérée limitée pour comprendre les
mécanismes dans leur ensemble et expliquer des processus, même simples. Suite à mon
recrutement à l'INRA, je me suis donc focalisé sur l'identification des machines moléculaires,
i.e. des complexes protéiques ou nucléoprotéiques, assurant ces mécanismes, et sur la
caractérisation des interactions assurant leur cohésion et leur dynamique. Ces travaux portant
sur i) l'interactome de la protéine SSB de B. subtilis, et son rôle dans le redémarrage de la
réplication et la réparation de l'ADN, ii) la caractérisation de complexes nucléoprotéiques
impliqués dans l'expression du génome de cette bactérie, et iii) la caractérisation des protéines
Ku et LigD intervenant dans la réparation par NHEJ, sont décrits dans la troisième partie de ce
document. Ces travaux ont été réalisés dans les équipes dirigées par le Dr. Patrice Polard puis
par le Dr. Philippe Noirot (2004-2015, INRA, Jouy-en-Josas).
Depuis 2015, au sein de l'équipe dirigée par le Dr. Marie-Agnès Petit (INRA(E), Jouy-en-
Josas, je poursuis mon étude sur le NHEJ en m'intéressant au rôle d'un orthologue de Ku et de
ses partenaires chez les phages. J'étudie également un autre mécanisme de réparation par
recombinaison, le SSA, impliquant un paralogue de la recombinase RecA, Sak4, et son
partenaire SSB. Outre l'aspect fondamental de cette recherche visant à décrire les mécanismes
11
moléculaires mis en jeu dans ces processus de recombinaison phagiques, je cherche également
à savoir s'ils sont utiles au cycle de vie des phages, voire à leur hôte bactérien. Ces travaux sont
décrits dans la quatrième partie du présent document.
12
I- Thèse de doctorat : octobre 1998 - octobre 2002
Etude d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et de leurs
fonctions dans le métabolisme cellulaire chez S. cerevisiae.
Introduction
J'ai préparé une thèse sous la direction du Dr. Henri Grosjean au sein du Laboratoire
d’Enzymologie et Biochimie Structurales (LEBS) du CNRS à Gif-sur-Yvette. Mon sujet de
thèse a porté sur les modifications enzymatiques de nucléotides au cours de la maturation des
ARN de transfert (ARNt), ainsi que sur les rôles joués par certaines de ces modifications sur le
métabolisme cellulaire chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
Chez S. cerevisiae, comme dans tout type de cellules, la biosynthèse des ARNt fonctionnels
est un processus complexe au cours duquel le produit initial de transcription de gènes subit une
série de transformations biochimiques très diverses, chacune catalysées par des enzymes
spécifiques (Hopper 2013). Parmi ces multiples transformations (telles que le raccourcissement,
l’épissage d’introns…), les modifications post-transcriptionnelles de nucléotides sont
particulièrement nombreuses et variées. A ce jour, 25 types différents de nucléotides modifiés
ont été répertoriés dans les 42 différents ARNt cytoplasmiques, dont le taux de modification de
certains d’entre eux peut atteindre 15% (Hopper 2013). Ce taux de modification est moindre
dans les ARNt de mitochondries (9.5 %, (Phizicky et al. 2010a)). Dans les ARNt
cytoplasmiques de cellules humaines ce taux de modification peut atteindre 20 % de leurs
nucléotides (8.7 % dans les ARNt de mitochondries). Plus de 110 nucléotides modifiés
différents ont été à ce jour répertoriés dans les ARNt séquencés de différentes origines
cellulaires (McCown et al. 2020). La majorité de ces nucléotides modifiés résultent de réactions
enzymatiques simples de type méthylation, thiolation, réduction ou désamination. D’autres
résultent de réactions plus complexes, voire de cascades de réactions chimiques donnant lieu à
des nucléotides dits hypermodifiés qui impliquent la participation de plusieurs types d’enzymes
pour leur biosynthèse. Les modifications qui interviennent au niveau de la boucle de l’anticodon
des ARNt sont celles qui ont la plus grande incidence lors de la traduction des ARN messagers
en protéines, et par voie de conséquence sur l’homéostasie et la croissance cellulaire (Agris et
al. 2017, Pollo-Oliveira et al. 2019, Accornero et al. 2020)
13
Travaux de thèse
Au cours de mon travail de thèse, je me suis concentré dans un premier temps sur
l’identification et la caractérisation de deux nouvelles enzymes de modification (une isomérase,
Pus3p, et une méthyltransférase, Trm7p) ayant chacune pour site d’action des nucléotides de la
tige-boucle de l’anticodon des ARNt. Dans un deuxième temps, nous avons analysé le rôle joué
par ces nucléotides modifiés au niveau de la traduction génétique et de la maturation des ARNt.
La levure S. cerevisiae a été utilisée comme modèle de cellules eucaryotes, étant données les
nombreuses informations déjà acquises à l’époque concernant le processus de maturation des
ARNt et leur contenu en nucléotides modifiés, mais encore très peu sur les enzymes impliquées.
(Figure 1).
Figure 1 : Localisation et nature des nucléotides modifiés des ARNt cytoplasmiques et
mitochondriaux de S. cerevisiae. Les pseudouridines (ψ) et 2’-O-méthylnucléotides (Gm, Cm et Um),
pour lesquels j’ai identifié les enzymes responsables de leur formation, sont entourés en rouge.
Cartographies réalisées d’après les banques de séquences d’ARNt http://trnadb.bioinf.uni-
leipzig.de/DataOutput/ (Juhling et al. 2009) et https://iimcb.genesilico.pl/modomics (Boccaletto et al.
2018) ainsi que la revue de (Hopper 2013). Certaines modifications d’uridine et d’adénosine aux
positions 34 et 37 restent à caractériser à ce jour.
1) Identification et caractérisation d’une ARNt : 2’-O-méthyltransférase (Pintard et al.
2002)
En partant de l’observation d'une forte similarité de séquence entre la protéine Ybr061p de
S. cerevisiae et une authentique 2’-O-methyltransférase (RrmJ) agissant sur les ARN chez E.
14
coli (Caldas et al. 2000, Pintard et al. 2002), nous avons cherché à déterminer si Ybr061p
pouvait catalyser des méthylations dans les ARNt. En analysant le contenu en nucléotides 2’-
O-méthylés (méthylation sur le ribose) des ARNt totaux purifiés (marqués radioactivement in
vivo au 32P), nous avons pu montrer que l’inactivation de YBR061c conduit à une réduction du
taux de nucléotides 2’-O-méthylés, principalement dans la région de l’anticodon (voir Figure
1). Ce résultat a ensuite été confirmé et précisé in vitro en montrant que la protéine Ybr061p,
étiquetée par une queue hexahistidine et purifiée d’une souche ΔYBR061c, est capable de
méthyler spécifiquement les nucléotides en positions 32 et 34 de la boucle anticodon d’un
transcrit synthétique, et donc non modifié, d’ARNt-Phe de S. cerevisiae. De plus, lorsque
Ybr061p est mutée au niveau du site probable de fixation du cofacteur S-adénosyl méthionine
(un aspartate en position 49), l’enzyme devient environ 500 fois moins active que la protéine
sauvage. Ces différents résultats nous ont donc permis de conclure que le gène YBR061c de S.
cerevisiae code pour l’ARNt : 2’-O-méthyltransférase, catalysant la formation des 2’-O-
méthylnucléotides aux positions 32 et 34 dans l’ARNt spécifique de la phénylalanine
(anticodon GmAA). La protéine, très conservée chez les eukaryotes, a été renommée Trm7p
(7ème tRNA méthyltransférase caractérisée dans la levure) et s’est avérée catalyser également la
méthylation des riboses 32 et 34 de l’ARNt-Trp (CmCA) et probablement de l’ARNt-Leu
(ncm5UmAA).
Au cours de cette étude in vitro nous avons observé une différence d’efficacité de Trm7p
dans la 2’-O-méthylation des nucléosides en position 32 et 34 du transcrit d'ARNt-Phe. Cette
différence est fortement atténuée lorsqu’un extrait cellulaire d’un mutant ΔYBR061c est ajouté
à la protéine purifiée dans le test. Ce résultat suggère que : i) la 2’-O-méthylation de la position
34 est peut-être dépendante d’autres modifications sur l’ARNt et/ou ii) un (ou des) cofacteur(s)
probablement protéique(s) serai(en)t nécessaire pour modifier efficacement chacune des deux
positions 32 et 34 des ARNt. La fin de la thèse ne m’a pas permis de trancher entre ces deux
hypothèses. L’utilisation d’une méthode de purification de complexes protéiques (Tandem
Affinity Purification, TAP), publiée peu de temps avant ma thèse (Rigaut et al. 1999), m’aurait
sans doute permis de trancher entre ces deux hypothèses. Dès ce moment-là, il était déjà très
clair pour moi que la caractérisation des enzymes de modifications basée uniquement sur
l’étude de protéines purifiées, indépendamment de leurs partenaires potentiels dans la cellule,
bien que fort utile, n’était pas suffisante. Cette idée de caractériser le partenariat protéique d’une
protéine d’intérêt et ainsi d'identifier des machines moléculaires complètes en vue d’en
caractériser les propriétés biochimiques ne m’a alors plus lâchée et a été l’une des lignes
directrices de mes recherches ultérieures dès mon recrutement à l’INRA.
15
Cette analyse par purification en tandem a été réalisée quelques années plus tard par un autre
groupe dans le cadre d’une étude globale, visant à caractériser les complexes protéiques formés
par plus de 4000 protéines chez la levure. Elle suggère que Trm7p interagit avec 2 protéines,
Trm732p et Trm734p (Krogan et al. 2006). Une analyse fine des complexes contenant Trm7p
a montré que cette méthyltransférase forme en fait un complexe indépendant avec chacune de
ces deux protéines. De manière remarquable, le complexe Trm7p-Trm734p permet la
méthylation du nucléotide en position 34 alors que le complexe Trm7p-Trm732p cible la
position 32 (Guy et al. 2012). Ainsi la méthyltransférase Trm7p est guidée sur son substrat par
l’un ou l’autre de ces cofacteurs protéiques en fonction de la position à modifier. Cette propriété
est d’ailleurs partagée par d’autres enzymes de modification d’eucaryotes (Guy et al. 2014).
Par ailleurs, l’analyse détaillée du mutant ΔYBR061c par l’équipe de Bruno Lapeyre du
CRBM au CNRS de Montpellier, avec lequel nous avons collaboré pour ce travail, a montré
une diminution importante du temps de génération, accompagnée par une diminution
d’incorporation d’acides aminés au cours de la croissance, par rapport à la souche sauvage. Cela
démontrait que Trm7p est impliquée dans l’efficacité de la traduction génétique chez la levure.
Cette conclusion a été confirmée et précisée plus tard par le groupe d’Eric Phizicky. Il a montré
que l’origine du défaut de croissance du mutant ΔTRM7 était non seulement liée à l’absence de
2’O-methyl sur le ribose en position 34 et 32 de l’ARNt-Phe (GmAA) (Guy et al. 2012), mais
aussi à l’activation de la voie de contrôle des acide-aminés, vraisemblablement due à un défaut
de chargement de l’ARNt-Phe hypomodifié (Han et al. 2018). La relation entre les 2’-O-
méthylnucléotides 32 et 34 et le chargement de l’ARNtPhe et/ou le défaut de croissance du
mutant ΔTRM7 peut toutefois être indirecte. En effet, l’absence de ces modifications a
également pour conséquence un défaut de formation de la Wyebutosine en position 37 dans la
tige boucle de l’anticodon de l’ARNt-Phe correspondant (Guy et al. 2012). Ceci démontre
l’interdépendance de certaines modifications dans les ARNt et la complexité à caractériser
l’effet de l’inactivation d’un gène de modification en particulier.
2) Identification et caractérisation d’une ARNt : pseudouridine synthétase (Lecointe et
al. 1998)
Le gène DEG1 de S. cerevisiae de fonction inconnue a été identifié par l’analyse
transcriptionnelle de la région centromérique du chromosome VI et son inactivation a montré
un impact sur le taux de croissance des cellules (Carbone et al. 1991). La protéine Deg1p
présente de fortes similarités de séquences avec l’enzyme TruA d’E. coli qui catalyse la
16
formation de pseudouridines (ψ, isomérisation d’une uridine) aux positions 38, 39 et 40 dans
les ARNt (Kammen et al., 1988). Partant de ces observations, nous avons comparé le contenu
des ARN en pseudouridines dans la souche sauvage et une souche ΔDEG1, mesuré in vitro les
capacités de pseudouridylation des extraits cellulaires correspondants, ainsi que celles de la
protéine Deg1p purifiée sur des ARNt transcrits in vitro. Les résultats obtenus nous ont permis
de conclure que Deg1p est l’ARNt : ψ synthétase qui catalyse la formation de pseudouridines
aux positions 38 et/ou 39 (Figure 1) dans au moins 22 ARNt cytoplasmiques et 9 ARNt
mitochondriaux. L’enzyme a été renommée Pus3p. Enfin nous avons montré que le mutant
ΔDEG1 présente un phénotype de thermosensibilité. Le rôle de Pus3p dans ce phénotype a été
étudié plus en détail par la suite par le groupe de Phizicky. Il a montré que l’absence de
pseudouridine en position 38 de l’ARNt-Gln(UUG) est en partie responsable de cette
thermosensibilité (Han et al. 2015).
3) Rôle de Pus3p dans la traduction génétique (Lecointe et al., 2002).
L’une des questions importantes que l’on se posait durant mon travail de thèse concernait le
rôle cellulaire des enzymes de modification des ARNt. En effet, à l'exception de TRM7 et PUS3
(voir plus haut), l'inactivation des gènes codant pour les enzymes de modification des ARNt,
connus chez S. cerevisiae au moment de notre travail, ne laissait pas transparaître de phénotype
de croissance important, ne donnant lieu apparemment à aucun phénotype sur la croissance des
cellules dans les conditions habituelles de ce genre de tests (milieu complet à 30°C). Le fait que
l’inactivation de PUS3 affectait le taux de croissance de la levure à 30°C et que cet effet était
amplifié à 37°C nous a amenés à proposer l’hypothèse d’un rôle des ψ38/39 sur la traduction
génétique. Pour valider cette hypothèse, j’ai utilisé un outil original développé par le groupe de
Jean-Pierre Rousset à l’Institut de Génétique et Microbiologie (Université Paris-Sud)
permettant d'étudier le rôle in vivo de facteurs agissant en cis et en trans sur des processus
d’erreurs de traduction programmés (Stahl et al. 1995). J’ai montré que l’absence des ψ38 et/ou
39 dans des ARNt suppresseurs naturels d’ambre, d’opale ou d’ochre diminue d’un facteur 2 la
fréquence de translecture des codons stop correspondants. De même, l’absence de ψ39 sur un
ARNt-Leu diminue d’un facteur 2 le décalage de phase de lecture en +1 sur une séquence
dérivée du site de décalage du rétrotransposon Ty1. L’ensemble de ces résultats suggérait donc
que les ψ38 et/ou 39 augmentent la potentialité des ARNt modifiés à lire d’autres codons que
ceux qu’ils sont supposés lire et donnent ainsi plus de plasticité à la traduction génétique. Ce
résultat inattendu contrastait avec l’idée qui prévalait à l’époque et qui proposait que le rôle des
17
nucléotides modifiés de la boucle anticodon des ARNt était plutôt d’assurer une plus stricte
spécificité de reconnaissance de l’anticodon avec le codon complémentaire de l'ARNm sur le
ribosome. Nos observations originales initiales ont été plus tard validées pour Pus3p avec un
autre système de translecture (Klassen et al. 2017).
4) Etude du rôle de de l’ARNt : pseudouridine synthétase Pus1p (Grosshans et al. 2001)
Dans le même esprit de recherche du rôle des modifications de nucléotides dans les ARNt,
le groupe d’Eduard Hurt (Biochemi-Zentrum, Heildeberg), avec lequel nous collaborions, a
montré que l’inactivation curieusement non-létale de PUS1, une enzyme multi-sites et bi-
spécifique, formant les pseudouridines aux positions 26, 27, 28, 34, 35, 36, 65, et/ou 67 (selon
l’ARNt cytoplasmique considéré (Simos et al. 1996, Motorin et al. 1998)) et en position 44 de
l’ARNsn U2 (Massenet et al. 1999) chez S. cerevisiae, devient co-létale avec une mutation dans
le gène codant pour une autre ARNt ψ-synthétase, Pus4p, une enzyme site-spécifique pour la
position 55 dans tous les ARNt cytoplasmiques. Pour ma part, j’ai d’abord complété cette
information en démontrant que cette mutation de PUS4 ne permet pas la formation de ψ55 dans
les ARNt. Ensuite, alors que des mutants nuls de PUS1 et PUS4 pris isolément n’ont aucun
effet sur la croissance, la combinaison des deux inactivations est létale. Cela démontre ainsi que
la modification de certains nucléotides devient essentielle lorsque la modification d’autres
nucléotides est compromise. Dans le même ordre d’idée, le groupe d’E. Hurt a également
montré que la mutation C50U de l’ARNt-Gln mineur est co-létale avec l’inactivation de PUS1.
Cette mutation dans le bras Tψ (voir Figure 1) pourrait déstabiliser la structure
tridimensionnelle de l’ARNt correspondant. J’ai complété cette information en démontrant que
cette mutation ralentit significativement la vitesse de modification de cet ARNt par d’autres
enzymes de modification, suggérant que Pus1p peut devenir essentielle si d’autres étapes de la
maturation des ARNt sont altérées. Cette conclusion a également été proposée plus tard pour
d’autres enzymes de modification des ARNt de S. cerevisiae. Par exemple, le phénotype de
thermosensibilité de la souche inactivée du gène PUS3 (voir précédemment) est spécifiquement
causé par le défaut de modification de l’uridine en position 38 de l’ARNt-Gln (UUG) ainsi que
par le défaut de thiolation du nucléotide mcm5U en position 37 du même ARNt (Han et al.
2015). Ceci montre de plus que l’absence d’une même modification à une même position dans
différents ARNt peut avoir un impact délétère sur la physiologie de la cellule dépendant de
l’hypomodification d’un seul ARNt particulier.
18
Autres avancées et perspectives dans le domaine
De toute évidence, la recherche portant sur les modifications post-transcriptionnelles
d’ARNt permet de mettre en évidence des liens inattendus entre différents éléments de la
synthèse protéique et constitue une source importante de nouvelles idées sur le métabolisme
cellulaire en général. Le premier âge d'or de cette recherche portait sur la localisation et la
caractérisation des différents types de nucléotides modifiés, principalement dans les ARNt et
les ARNr (où ils ont été historiquement identifiés) et à identifier les enzymes responsables de
leur formation (période 1960-2010). Cette période a aussi permis de découvrir une partie des
rôles joués par ces modifications sur i) l’efficacité de traduction, ii) la formation de structures
tridimensionnelles correctes et stables des ARNt requises pour leurs interactions avec la
machinerie traductionnelle et iii) l’aminoacylation des ARNt (pour revue, (Phizicky et al.
2010b)).
Cette recherche est maintenant rentrée dans un deuxième âge d’or lié à la découverte de
nucléotides modifiés dans la quasi-totalité des ARN cellulaires (y compris les ARNm) ainsi
qu’à la caractérisation des enzymes de modification correspondantes (McCown et al. 2020) La
mise en évidence de nouvelles modifications post-transcriptionnelles tient notamment au
développement de technologies haut-débit permettant l’identification d’un certain nombre de
nucléotides modifiés dans les ARN, qu’ils soient en quantité importante (ARNr, ARNt) ou non
(ARNm, ARNnc…) (pour revues, (Helm et al. 2017, Anreiter et al. 2020)). Ces méthodologies
permettent d’ouvrir de nouvelles voies de recherche, comme par exemple celles étudiant l’effet
de l’environnement sur le patron de modifications global des ARN. En effet, il devient de plus
en plus évident que des modifications post-traductionnelles ont un rôle de senseurs/marqueurs
de conditions physiologiques ou environnementales particulières. L’impact de l’état
physiologique des cellules sur le degré de modifications des ARN, ou encore l’effet de
l’environnement cellulaire, comme la privation de nutriments, les stresses oxydants ou encore
les rayonnements UV et les variations de températures, commencent à être démontrés et
explorés plus systématiquement. Chacun de ces éléments, pris individuellement ou combinés,
peut moduler le degré de modification des ARNt et ainsi perturber/modifier/voire réguler le
métabolisme normal de la cellule (pour revues récentes, (Pollo-Oliveira et al. 2019, Accornero
et al. 2020, Edwards et al. 2020)). On parle ainsi aujourd’hui d’épitranscriptomique, c’est-à-
dire de la caractérisation des altérations des modifications post-transcriptionnelles faisant suite
à des variations de l’état physiologique de la cellule, et de l'impact de ces altérations sur la
production de protéines. Le plus grand défi pour le futur sera certainement d’associer ces
19
changements de production à une ou plusieurs modifications post transcriptionnelles en
particulier sachant que certaines d’entre elles sont interdépendantes et qu’elles ne jouent pas
nécessairement le même rôle lorsqu’elles sont présentes sur un ARNt donné (voir plus haut).
Dans le cas des ARNt de plusieurs organismes modèles, dont S. cerevisiae, la quasi
intégralité du set d’enzymes nécessaires à leur modification est aujourd’hui caractérisée.
Cependant, l’impact de ces modifications sur les multiples interactions des ARNt avec les autres
constituants de la cellule restent en grande partie encore à découvrir (pour revues, (Hopper
2013, de Crecy-Lagard et al. 2019, Pollo-Oliveira et al. 2019, de Crecy-Lagard et al. 2020)).
De plus, l’identification d’un grand nombre d’enzymes de modification permet non seulement
de pouvoir corréler la fonction biochimique des enzymes et les phénotypes des mutants
correspondants, mais aussi de relier, dans certains cas, une enzyme de modification et la
modification associée à une maladie génétique ou à un cancer (Barbieri et al. 2020, Chujo et al.
2021) pour revues). Un nombre significatif de désordres neurologiques chez l’homme est déjà
associé à un défaut de modification des ARNt. Par exemple, des mutations du gène FTSJ1
humain, codant pour un homologue de la protéine Trm7p de S. cerevisiae (Li et al. 2020)
caractérisée pendant ma thèse, ont pour conséquence une diminution drastique de la quantité de
Ftsj1p (et donc la formation des 2’-O-méthylnucléotides aux positions 32 et 34 d’ARNt substrat
de Ftsj1p) et sont associées à une forme non spécifique de déficience intellectuelle liée au
chromosome X (pour exemple, (Freude et al. 2004)). Cette pathologie de déficience mentale
est également observée chez des patients dont le gène PUS3 (homologue à celui de la levure) a
perdu sa fonction (absence de ψ38/39 dans les ARNt) (Shaheen et al. 2016). D’autres mutations
de PUS3 seraient aussi à l’origine d’autres types de pathologies (de Paiva et al. 2019).
20
II- Travaux post-doctoraux : Novembre 2002 – Novembre 2004
Etude de la radiorésistance chez Deinococcus radiodurans
Introduction
Suite à mon travail de thèse, j'ai rejoint l’équipe du Pr. Suzanne Sommer à l’Institut de
Génétique et Microbiologie de l’Université Paris XI. Le travail réalisé au sein de ce groupe m’a
permis de mettre à profit les compétences acquises pendant la préparation de ma thèse pour
m’intéresser à un autre aspect du métabolisme des acides nucléiques que constitue la réparation
de l’ADN. Cette équipe s'attache à élucider les mécanismes de la radiorésistance chez la
bactérie Deinococcus radiodurans et en particulier les mécanismes de la réparation de l'ADN.
Cette bactérie, isolée à partir de boîtes de conserves stérilisées par irradiation aux rayons gamma
(Anderson 1956) présente en effet la particularité de pouvoir résister à de très fortes doses de
rayonnements ionisants (Figure 2A), mais aussi à d’autres agents génotoxiques qui peuvent être
endogènes (stress oxydant par exemple) ou exogènes (différents agents chimiques ou conditions
environnementales) (Confalonieri et al. 2011, Slade et al. 2011, Daly 2012). Par exemple, D.
radiodurans est capable de réparer plusieurs milliers de cassures double brin (CDB) générées
directement ou indirectement par irradiation γ en seulement quelques heures (Figure 2B). Cette
propriété fait de D. radiodurans l’un des organismes les plus radiorésistants sur la planète.
Figure 2 : D. radiodurans, une bactérie extrêmement radiorésistante. A. Courbes de survie
d'organismes représentatifs exposés au rayonnement γ. Les flèches indiquent le nombre approximatif de
DSB infligés par génome haploïde à la dose qui tue 90% des organismes. Pour information, la grande
majorité des organismes sur Terre sont hautement sensibles aux radiations et sont tués après exposition
à des doses inférieures à 500 Gy. Figure tirée de (Daly 2012). B. Cinétique de la réparation des cassures
double brin de l'ADN dans des cellules de D. radiodurans exposées à une irradiation γ de 6800 Gy.
L’ADN de D. radiodurans est analysé par PFGE après digestion par l’enzyme NotI. Figure tirée de
(Blasius et al. 2008).
A B
21
Les mécanismes à l’origine de cette extrême radiorésistance font l’objet de nombreuses
études. Lors de mon stage post-doctoral, les hypothèses suivantes étaient envisagées :
i) la présence d’un nucléoïde de structure de type anneau dont la compacité élevée
permettrait d’éviter une dispersion des fragments d’ADN après cassures (Levin-Zaidman et al.
2003, Zimmerman et al. 2005). Cette propriété serait d’autant plus importante que la structure
génomique de D. radiodurans est assez complexe (deux chromosomes de 2640 et 412 kb, un
mégaplasmide (177Kbp) et un plasmide (45Kbp), chacun présent entre 4 et 10 copies suivant
les conditions de croissance (Hansen 1978, White et al. 1999)), et que des doses de radiation
générant plus de 100 cassures ne s’accompagnent d’aucune baisse de viabilité (Daly et al. 1996)
ni de réarrangements chromosomiques importants (voir Figure 2B).
ii) une protection accrue des macromolécules contre l’oxydation. Le séquençage du génome
de D. radiodurans (White et al. 1999) a montré la présence de nombreux gènes impliqués dans
la détoxification des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dont la présence dans la cellule
altère l’intégrité des macromolécules comme les protéines et l’ADN. La présence des protéines
correspondantes pourrait limiter l’effet délétère des ROS générés suite à une irradiation. En ce
sens, la plupart des gènes les codant sont surexprimés après irradiation (Liu et al. 2003, Tanaka
et al. 2004) et certains, comme sodA et katE1, après avoir été inactivés isolément, ont été
identifiés comme intervenant dans la radiorésistance, bien que modérément (Markillie et al.
1999). D’autre part, Daly et ses collaborateurs ont montré que le ratio manganèse/fer est assez
élevé chez D. radiodurans, une propriété partagée par différentes bactéries présentant une
capacité élevée à résister à une irradiation ionisante (Daly et al. 2004). Le Mn2+, associé à
d’autres métabolites comme des bases, l’orthophosphate ou des acides aminés, est capable de
se complexer aux ROS et ainsi de les piéger, atténuant de fait leur toxicité (pour revue, (Culotta
et al. 2013)).
iii) une production de protéines et des circuits de régulation radio-induits spécifiques à D.
radiodurans. L’étude réalisée par Tanaka et al. (Tanaka et al. 2004) visant à étudier les
variations de transcriptome de D. radiodurans en réponse à une irradiation ou à une
dessiccation, condition générant aussi des CDB de l’ADN, a montré entre autre que plusieurs
dizaines de gènes spécifiques aux Deinococcaceae codant pour des protéines nommées Ddr
(DNA damage response) de fonctions inconnues, sont surexprimés dans ces conditions. Ces
résultats suggèrent l’existence potentielle d’un mécanisme de résistance aux radiations et à la
dessiccation inédit chez cette bactérie. De plus, l’induction de l’expression de la recombinase
RecA de D. radiodurans est indépendante de la présence des deux homologues de la protéine
LexA de E. coli, essentielle à la mise en place de la réponse SOS chez cette bactérie (Narumi
22
et al. 2001, Bonacossa de Almeida et al. 2002). La découverte de la protéine IrrE, une protéine
qui n’a aucun homologue bactérien connu et qui est un régulateur positif de l’expression de
RecA ainsi que d’autres gènes de réparation, impliquerait une régulation de la voie de réparation
des CDB de l’ADN par recombinaison homologue dépendante de RecA spécifique à cette
bactérie (Earl et al. 2002, Hua et al. 2003). Ceci ouvrait de nouvelles et excitantes hypothèses
de travail alors que les études visant à l’obtention de sa séquence et des études de génomique
comparative, montrant que D. radiodurans possède quantitativement un arsenal de protéines de
réparation de l’ADN connues comparable, voir même inférieur, à celui de bactéries
radiosensibles, suggéraient plutôt que D. radiodurans serait doté d’un système de réparation
classique, mais peut-être plus efficace que dans d’autres bactéries (White et al. 1999, Makarova
et al. 2001).
iv) un mécanisme de réparation des CDB de l’ADN particulièrement efficace (Figure 2B).
Ces lésions sont extrêmement génotoxiques puisqu’elles vont bloquer la réplication de l’ADN
et provoquer la mort de la bactérie si elles ne sont pas réparées. D. radiodurans possède des
gènes qui codent pour l’ensemble des protéines nécessaires à la recombinaison homologue
RecA-dépendante à l’exception de RecB et RecC, impliquée chez E. coli dans l’étape
présynaptique de la RH, i.e. le processing des extrémités des CDB pour le chargement de la
protéine RecA (Makarova et al. 2001). Les protéines RecFOR, associées à d’autres protéines
(SSB, hélicase, nucléase…) sont proposées d’assurer cette étape présynaptique chez D.
radiodurans (Bentchikou et al. 2010, Confalonieri et al. 2011). L’étape synaptique est assurée
par RecA, protéine ubiquitaire chez les bactéries, et son rôle dans la reconstitution à l’identique
des chromosomes après irradiation chez D. radiodurans est essentiel (Daly et al. 1994, Daly et
al. 1996). Toutefois, une réparation partielle des CDB rapidement mise en place après cassure
et RecA-indépendante a été identifiée (Daly et al. 1996). Ce dernier résultat implique que
d’autres mécanismes de réparation des CDB indépendants de la protéine RecA, comme le NHEJ
(Non-Homologous End Joining), un mécanisme majeur de réparation des cassures de l’ADN
chez l’homme qui venait d’être identifié chez les bactéries ((Weller et al. 2002) et voir ci-après),
ou le SSA (Single Strand Annealing), mécanisme permettant l’appariement de régions
homologues localisées au voisinage des cassures (voir Figure 8), pourraient agir en conjonction
avec la recombinaison pour une réparation efficace des cassures chez D. radiodurans. La
caractérisation des produits de deux gènes, ddrA et pprA, de D. radiodurans dont l’inactivation
diminue la capacité de D. radiodurans à tolérer une exposition aux rayons gamma, renforce
cette hypothèse. En effet, la protéine PprA se fixe préférentiellement aux extrémités de l’ADN
double brin (ADNdb), les protégeant de l’action d’une exonucléase et stimule l’activité de
23
différentes ADN ligases. Cela pourrait impliquer PprA dans un mécanisme de type NHEJ
(Narumi et al. 2004). DdrA présente quant à elle une homologie de séquence avec la protéine
d’appariement simple brin (SSAP pour single strand annealing protein) RAD52 eucaryote (Iyer
et al. 2002). Bien que cette activité d’appariement n’ait pas été démontrée, DdrA se fixe
préférentiellement aux extrémités 3’ de l’ADN simple brin (ADNsb), le protégeant ainsi de
l’action d’exonucléase. Un rôle de DdrA dans le SSA ou dans la protection des substrats de
recombinaison dépendant de RecA a ainsi été proposé (Harris et al. 2004).
Travaux post-doctoraux
Pour valider ou invalider ces différentes hypothèses, la mise à disposition d’outils génétiques
pour la communauté est un élément essentiel. La construction d’un de ces outils a fait l’objet
d’une partie de mon stage post-doctoral chez la Pr. Suzanne Sommer, et une application directe
a permis d’étudier l’effet de l’induction de recA après un traitement endommageant l’ADN. La
recherche et la caractérisation d’une protéine potentiellement impliquée dans un mécanisme de
NHEJ chez D. radiodurans a fait l’objet d’une deuxième partie de mon travail, tout d’abord
chez la Pr. S. Sommer puis chez le Pr. Herman van Tilbeurgh au cours d’un second post-doc.
Ces travaux sont brièvement décrits ci-dessous.
1) Construction de vecteurs permettant de moduler l’expression des gènes chez D.
radiodurans et étude du rôle de l’induction de recA après traitement génotoxique (Lecointe
et al. 2004a, Jolivet et al. 2006).
Du fait de l’intérêt que représente la bactérie D. radiodurans comme bactérie modèle pour
étudier les mécanismes de radiorésistance, un certain nombre d’outils génétiques avaient déjà
été développés chez cet organisme. Cependant, des systèmes qui auraient permis une expression
contrôlée et modulable des gènes n’étaient pas disponibles.
Nous avons adapté un système d’expression contrôlée initialement développé chez B.
subtilis pour construire deux vecteurs d’expression chez D. radiodurans. Le premier vecteur
est réplicatif et permet de moduler l’expression des gènes sous contrôle d’un promoteur (Pspac,
(Yansura et al. 1984)) en fonction du nombre de copies du gène codant pour le répresseur du
système (lacI) et de la concentration en inducteur (IPTG). Ce vecteur a été utilisé à de
nombreuses reprises dans l’équipe. Il nous a par exemple permis de montrer que l’induction de
recA après exposition des cellules à la mitomycine C, un agent pontant de l’ADN causant entre
autre des CDB, conduisant à la surexpression de recA et portant la quantité de protéines de
24
11.000 à 44.000 molécules par cellule (Bonacossa de Almeida et al. 2002), était essentielle à la
survie des bactéries traitées continuellement par cet agent génotoxique (Lecointe et al. 2004a).
A l’inverse, nous avons montré que l’induction de recA n’a aucun effet sur la résistance des
bactéries à une dose ponctuelle d’irradiation γ. Ceci suggère que la surexpression de recA n’est
essentielle à la survie de D. radiodurans que lorsque celle-ci est continuellement exposée à un
traitement endommageant l’ADN (Jolivet et al. 2006). De même, l’absence de surexpression
de recA a un effet délétère additionnel sur la radiosensibilité d’un mutant ddrA, suggérant que
ddrA et recA n’interviennent pas dans la même voie de réparation (Jolivet et al. 2006).
Le second vecteur est intégratif et permet, suivant la partie clonée du gène d’intérêt, i) une
inactivation conditionnelle des gènes pour identifier par exemple des gènes essentiels ou
montrer l’effet de la déplétion progressive des protéines correspondantes, ii) l’inactivation d’un
gène d’intérêt et iii) l’expression conditionnelle des gènes en aval sur l’opéron. Ce système a
été validé par l’obtention d’une souche inactivée pour gyrA (codant pour une des sous-unités
de l’ADN gyrase essentielle) dont la viabilité est conditionnelle à l’expression ectopique du
gène (Lecointe et al. 2004a).
2) Découverte d’une polymérase de la famille X chez D. radiodurans, mise en évidence
de son implication dans la radiorésistance et étude structurale (Lecointe et al. 2004b,
Leulliot et al. 2009).
La caractérisation de PprA (Narumi et al. 2004) laissait suspecter la présence d’un
mécanisme de réparation des DSB chez D. radiodurans de type NHEJ, bien que cette bactérie
soit dépourvue des deux protéines essentielles à ce mécanisme, LigD et Ku, rencontrées dans
d’autres bactéries (voir la partie III de ce document traitant du NHEJ). En fonction des
extrémités cassées, la ligation peut nécessiter une maturation préalable des extrémités par une
ADN polymérase. L’analyse du génome de D. radiodurans a montré l’existence d’un
homologue potentiel des ADN polymérases de la famille X, la protéine codée par le gène
DR0467 (Makarova et al. 2001). Certaines polymérases de cette famille chez les mammifères
(λ, µ et la Tdt) sont impliquées dans le NHEJ alors que la polymérase β est impliquée dans la
réparation par excision des bases endommagées (BER pour Base Excision Repair ; pour revue,
(Hoitsma et al. 2020)). Les polymérases de la famille X sont rares chez les bactéries, elles sont
cependant retrouvées chez Bacillus subtilis et Mycobacterium tuberculosis, deux bactéries
capables de réparer des DSB par NHEJ (Weller et al. 2002). Ces protéines présentent la
particularité de posséder deux domaines, un domaine N-terminal homologue au domaine
25
polymérase des ADN polymérases X eucaryotes, et un domaine C-terminal PHP (Polymerase
and Histidinol Phosphatase) non retrouvé dans les polymérases X eucaryotes mais présent chez
les ADN polymérases bactériennes de type C (Aravind et al. 1998). Nous nous sommes
demandés si le gène DR0467 était fonctionnel chez D. radiodurans et s’il jouait un rôle dans la
réparation de l’ADN. En collaboration avec l’équipe du Dr. Ulrich Hubscher à Zurich, nous
avons montré que le gène DR0467 est exprimé de façon constitutive chez D. radiodurans et
qu’il code pour une ADN polymérase présente à environ 3000 molécules par cellule.
L’inactivation de DR0467 entraîne une sensibilisation des bactéries à des doses élevées de
rayonnement γ (supérieur à 10 kGy), accompagnée d’un retard dans la réparation des cassures
de l’ADN, ainsi qu’un retard dans la reprise de la division cellulaire après irradiation. Ces
résultats suggéraient un rôle de la protéine DR0467, renommée PolX, dans la réparation des
cassures de l’ADN (Lecointe et al. 2004b).
Le NHEJ bactérien requiert LigD, une enzyme possédant l’ensemble des activités
nécessaires à la maturation des extrémités cassées, i.e. des activités de ligase, de polymérase et
de nucléase (pour revue, (Bertrand et al. 2019)). De manière inattendue, PolX de D.
radiodurans possède, en plus de son activité polymérase, une activité 3’-5’ exonucléase sur
l’ADN simple et double brin inédite pour des polymérases de cette famille (Blasius et al. 2006),
une activité ensuite confirmée chez d’autres homologues bactériens (Banos et al. 2008b,
Nakane et al. 2009). Cette activité est inhibée en présence de structures de type tige-boucle sur
l’ADN. Le domaine polymérase et le domaine PHP sont requis pour un niveau de
radiorésistance sauvage (Blasius et al. 2006). Alors que chez D. radiodurans l’activité nucléase
est portée par le domaine polymérase de PolX, chez B. subtilis c’est le domaine PHP qui est
responsable de cette activité (Banos et al. 2008b).
Afin de caractériser la structure de PolX et d’en apprendre plus sur la mécanistique de cette
protéine, j’ai initié, au cours d’un second stage post-doctoral chez le Pr. Herman van Tilbeurgh,
la préparation d’une grande quantité de cette polymérase (ainsi que de la topoisomérase VI de
Sulfolobus shibatae, non décrite ici (Graille et al. 2008)). La structure de l’apoenzyme a été
obtenue quelques années plus tard dans le groupe d’Herman (Leulliot et al. 2009). Elle a montré
que PolX de D. radiodurans adopte une conformation étendue, très vraisemblablement inactive
en terme d’activité polymérasique, dans laquelle les sous-domaines « doigts-paume-pouce » et
le sous-domaine de 8 kD spécifique des ADN polymérases de la famille X sont éloignés les uns
des autres en comparaison de leurs positionnements dans la polymérase λ humaine (Figure 3B
vs 3C). De façon intéressante cette structure étendue du domaine polymérase semble être
stabilisée par le domaine PHP (absent dans les polymérases X eucaryotes), ce qui pourrait
26
impliquer un rôle régulateur de ce domaine sur l’activité de la polymérase. L’obtention des
structures de la PolX de Thermus thermophilus en complexe binaire avec un dNTP et ternaire
avec ce même dNTP, plus un substrat d’ADN db avec une brèche d’un nucléotide, montre que
la présence d’ADN est effectivement à l’origine d’un changement structural important de la
protéine au niveau des sous domaines 8kD et « doigts », requis pour la fixation de l’ADN et la
catalyse (Nakane et al. 2012a).
Figure 3 : Structure de la polymérase X de D. radiodurans. A. Représentation schématique de
différentes ADN polymérases de la famille X. NLS, signal de localisation nucléaire; BRCT, domaine
C-terminal de BRCA1. HhH, motif helice tige-boucle hélice. PHP, domaine Polymerase et Histidinol
Phosphatase. h, humain; S.c., S. cerevisiae. PolXDr de D. radiodurans. PolXBs de Bacillus subtilis,
PolXMt de Methanothermobacter thermautotrophicus et PolXTaq de Thermus aquaticus. Adapté de
(Lecointe et al. 2004b). B. Représentation schématique de Polλ en complexe avec un substrat d’ADN
contenant une brèche simple brin (PDB code 2BCR). C. Représentation schématique de PolX de D.
radiodurans (Leulliot et al. 2009).
Autres avancées et perspectives dans le domaine
Jusqu’à aujourd’hui, aucune preuve de l’existence d’un mécanisme de type NHEJ n’a été
démontrée chez D. radiodurans, même si, à ma connaissance, l'utilisation de méthodologies
dédiées à la recherche spécifique de ce type de mécanisme, comme celles permettant une
cassure unique ciblée sur un chromosome (de type CRISPR ou I-SceI, non réparable par
recombinaison homologue RecA-dépendante) ou celles utilisant la transformation de plasmides
linéarisés et la recherche d’évènements de ligature dépendants d’une recombinaison non
homologue, n'a pas été publiée. Quelle pourrait alors être la fonction de PolX ? Le fait qu’une
souche inactivée de polX soit légèrement sensible à l’exposition au peroxyde d’hydrogène, que
la PolX in vitro présente une activité ADN polymérase très peu processive ainsi qu’une activité
5'-deoxyribose-5-phosphate (dRP) lyase, impliquerait que cette enzyme intervienne dans la
résistance au stress oxydant chez cette bactérie en participant au mécanisme BER, comme son
PHP
A B C
27
orthologue humain Polβ (Khairnar et al. 2009). Cette hypothèse, initialement proposée sur la
base de la caractérisation de l’enzyme PolX purifiée de B. subtilis (Banos et al. 2008b, Banos
et al. 2008a) a été validée in vivo pour différentes PolX bactériennes (Nakane et al. 2012b,
Barajas-Ornelas Rdel et al. 2014). Les équipes des Dr. De Vega et Masui ont également
caractérisé d’autres activités enzymatiques portées par ces PolX bactériennes (3’phosphatase,
3’phosphodiesterase et apurinique/apyrimidique (AP) endonuclease) potentiellement requises
pour la maturation des extrémités de produits intermédiaires de réparation de la voie BER en
vue de leur extension avant ligature (Banos et al. 2010, Nakane et al. 2012b, Zafra et al. 2017).
Le rôle de PolX dans la radiorésistance de D. radiodurans pourrait alors s’expliquer par le
fait que les radiations ionisantes sont à l’origine d’une multitude de lésions provoquées
directement, ou indirectement via la production de ROS. La réparation de certaines de ces
lésions dépend d’un mécanisme de type BER (pour revue, (Sage et al. 2017)). Ainsi, pour que
D. radiodurans puisse survivre à une irradiation, la bactérie doit réparer les CDB mais aussi
l’ensemble des lésions qui pourraient bloquer la réplication de l’ADN. Le fait que l’inactivation
de polX ne montre un effet délétère sur la survie des cellules que pour des doses importantes de
radiations (Lecointe et al. 2004b) suggère i) que l’activité de PolX est redondante à l’activité
d’une autre ADN polymérase, probablement l’ADN Polymérase I impliquée chez E. coli dans
le BER, et ii) que l’abondance des lésions de bases après une forte irradiation requiert la
présence d’au moins deux ADN polymérases impliquées dans le BER.
Cependant, les PolX bactériennes présentent une activité 3’-5’ exonucléase et la PolX de B.
subtilis est capable de cliver des extrémités sortantes 3’ non appariées (Banos et al. 2008b), des
substrats potentiels résultant d’un mécanisme de réappariement d’extrémités cassées par NHEJ
ou par SSA. Cela laisse alors la possibilité que la PolX de D. radiodurans ait une deuxième
fonction en rapport direct avec la réparation des DSB. La dualité de fonctions d’ADN
polymérases impliquées dans le BER et le NHEJ chez les bactéries comme chez les eucaryotes
n’est pas sans précédent (pour exemple, (Thapar et al. 2019) et pour revue (Bertrand et al.
2019)). Par exemple, la ligase multifonctionnelle LigD de B. subtilis, essentielle au NHEJ chez
cette bactérie, présente aussi une activité dRP lyase requise pour un mécanisme de type BER
(de Ory et al. 2016, de Ory et al. 2019). D’autre part, les activités de PolX sont compatibles
avec son intervention dans le mécanisme ESDSA décrit plus bas.
Comme mentionné précédemment, aucun mécanisme de type NHEJ n’a été démontré chez
D. radiodurans. La réparation, rapide, partielle et RecA-indépendante, de l’ADN fragmenté
juste après irradiation (Daly et al. 1996) et la reconstitution partielle des chromosomes de la
bactérie, 24h après irradiation et indépendante de RecA (Slade et al. 2009, Devigne et al. 2013),
28
impliquent donc un autre processus. Cet autre mécanisme pourrait être le SSA et la protéine
impliquée DdrB, une protéine de type Single Strand Binding (SSB) (Norais et al. 2009). Celle-
ci est douée d’activité SSA et l’inactivation de son gène couplée à celle de recA inhibe toute
reconstitution des chromosomes de D. radiodurans après irradiation (Xu et al. 2010).
Le faible retard de réparation des cassures dans un mutant ddrB suggère toutefois que la
réparation RecA-dépendante est extrêmement efficace. Ce type de réparation implique un
mécanisme inédit chez cette bactérie, nommé ESDSA (Extended Synthesis-Dependent Strand
Annealing, (Zahradka et al. 2006)). Celui-ci fait intervenir une première étape de maturation
des extrémités cassées, permettant ainsi l’invasion de molécules d’ADN homologues, la
synthèse d’ADN et l’appariement des fragments d’ADN néosynthétisés. Dans un deuxième
temps, la recombinaison homologue des fragments longs, issus de la première étape, permet la
recircularisation des chromosomes de la bactérie et la reprise de la division cellulaire (Figure
4A). Le mécanisme SSA dépendant de DdrB pourrait être lié au mécanisme d’ESDSA puisque
la synthèse massive d’ADN au cours de l’ESDSA est retardée après irradiation dans un mutant
inactivé de ddrB (Bouthier de la Tour et al. 2011).
La réparation des DSB par ESDSA implique cinq des huit gènes impactant le plus la
radiorésistance chez cette bactérie (recA, recO, recF, recR et polA ; (Zahradka et al. 2006, Slade
et al. 2009, Bentchikou et al. 2010)). Cependant, la réparation des DSB n’est qu’une des étapes
à l’origine de la radiorésistance de cette bactérie. Le lecteur est invité à consulter une revue
récente traitant de la radiorésistance. Elle présente l’ensemble des processus révélés à ce jour
liés à ce phénotype, les protéines impliquées connues et leur conservation ou non dans
différentes espèces de Deinococcus radiorésistantes (Lim et al. 2019). Je ne mentionnerai ici
brièvement que les travaux des équipes des Dr. Daly et Radman qui ont clairement mis en
évidence le rôle essentiel du manganèse intracellulaire dans ce processus (pour revues, (Daly
2012, Krisko et al. 2013, Qi et al. 2020 )). Comme dit précédemment, le ratio Mn2+/Fe2+ est
particulièrement élevé chez D. radiodurans et d’autres espèces radiorésistantes par rapport à
des espèces radiosensibles. De manière remarquable, ce ratio est anticorrélé avec l’oxydation
des protéines après irradiation (Figure 4B), une propriété qui serait liée au piégeage des ROS
par les complexes formés avec le manganèse dans la cellule. Ainsi, la quantité de manganèse
élevée chez D. radiodurans assure une protection à l’oxydation de ces protéines (mais aussi de
l’ADN) après irradiation, permettant le maintien du métabolisme cellulaire et donc la réparation
de l’ADN endommagé.
29
Figure 4 : Deux mécanismes essentiels de la radiorésistance de D. radiodurans. A. Le mécanisme
de réparation des DSB par ESDSA. Etapes 1 à 4 : maturation des extrémités et chargement de RecA
permettant la formation d’une D-loop et la synthèse d’ADN par PolIII et PolI. Il est à noter que PolX,
de par ses activités, pourrait participer à la réparation des brèches issues du BER (croix rouges sur les
molécules d’ADN). Etapes 5 à 6 : synthèse convergente d’ADN et dissociation des brins. Etapes 7 à 8 :
appariement des brins néosynthétisés, maturation des produits appariés pour la formation de longues
molécules d’ADN. Ici aussi, les activités de PolX permettraient à cette dernière de participer. L’étape 9
fait intervenir une recombinaison homologue classique permettant la recircularisation des chromosomes
de D. radiodurans (figure tirée de (Slade et al. 2009)). B. Relation entre le ratio intracellulaire de Mn/Fe,
la radiorésistance et le degré d’oxydation des protéines après irradiation pour différentes bactéries (tirée
de (Slade et al. 2011)).
A B
30
III- Travaux réalisés dans l’équipe du Dr. P. Polard puis du Dr. P. Noirot : Décembre 2004 - Mars 2015
J’ai obtenu un poste de CR2 à l’INRA dans l’unité de Génétique Microbienne de Jouy-en-
Josas. La mission associée au profil du poste était l’identification et la caractérisation
fonctionnelle des assemblages multiprotéiques et nucléoprotéiques impliqués dans la
dynamique du génome chez la bactérie modèle à Gram+ B. subtilis. L’approche que j’ai
proposée pour répondre à cette mission permettait de trouver de nouvelles protéines impliquées
dans la dynamique des génomes bactériens, mais aussi potentiellement de trouver de nouvelles
fonctions à des protéines déjà connues et de rechercher à intégrer au niveau cellulaire des
mécanismes moléculaires décortiqués in vitro. Cette technique, dite de purification par affinité
en tandem (ou TAP pour Tandem Affinity Purification), développée par l’équipe de B. Séraphin
(Rigaut et al. 1999), vise à caractériser des complexes multiprotéiques d’intérêt par
l’intermédiaire de la purification sélective d’un de leur constituant, dans des conditions de
purification suffisamment douces pour maintenir les interactions entre molécules. La TAP
permet ainsi d’identifier les protéines composant un complexe et, sur la base de la connaissance
de la fonction du complexe et/ou de certaines protéines qui le composent, de proposer une
fonction aux protéines du complexe dont le rôle était jusqu’alors inconnu. Suite à mon
recrutement, j’ai adapté la TAP à B. subtilis et initié mes recherches en caractérisant les
complexes formés par une trentaine de protéines impliquées dans la dynamique du génome. Les
premières étaient impliquées dans la réactivation des fourches de réplication de l’ADN arrêtées,
les suivantes dans la régulation transcriptionnelle chez B. subtilis.
Identification et caractérisation du partenariat multiple de SSB et son rôle
chez B. subtilis
Introduction
J’ai en particulier utilisé l’approche de TAP pour participer, dans l’équipe dirigée par le Dr.
Patrice Polard, à l’étude du fonctionnement du primosome PriA-dépendant de B. subtilis, un
appareil multiprotéique spécialisé dans le redémarrage de la réplication de l’ADN
chromosomique. Le chromosome de B. subtilis, comme pour la plupart des bactéries, est une
molécule circulaire. Sa réplication est initiée au niveau d’une origine de réplication unique,
OriC, reconnue par l’initiateur de réplication DnaA (pour revue, (Hansen et al. 2018)). Par le
31
biais d’interactions entre les protéines primosomiques, différentes selon la bactérie étudiée
((Brezellec et al. 2016) et pour revue, (Jameson et al. 2017)), deux réplisomes, c’est-à-dire les
machineries multiprotéiques en charge de la réplication (Figure 5A), vont être chargés à chaque
extrémité de la bulle de réplication et vont répliquer le chromosome jusqu’au site de
terminaison. Cette réplication bidirectionnelle implique que chaque réplisome est en charge de
la synthèse de la moitié du chromosome, ce qui représente chez B. subtilis plus de 2Mb (Figure
5B). Cependant, les fourches de réplication peuvent rencontrer divers obstacles au cours de leur
cheminement. Bien qu’une partie de ces obstacles, notamment des lésions sur l’ADN, puisse
être, au moins in vitro, contournée sans effondrement de la fourche de réplication ((Heller et al.
2006, Yeeles et al. 2011) et pour revue, (Marians 2018)), d’autres, comme des démantèlements
de réplisome ou des collisions entre le réplisome et des protéines associées à l’ADN (pour revue
(Michel et al. 2017)), vont entraîner l’arrêt de la réplication et la mort cellulaire si un nouveau
réplisome n’est pas rechargé après résolution du problème à l’origine de l’arrêt (Figure 5B). Il
est estimé qu’un réplisome chargé à OriC se dissociera de sa matrice ADN au moins une fois
avant la terminaison de la réplication (Cox et al. 2000). Comme DnaA n’initie pas la réplication
en dehors d’OriC, les bactéries ont mis en place un système de redémarrage de la réplication
(pour revue (Windgassen et al. 2018)). Chez E. coli, le redémarrage de la réplication requiert
les protéines PriA, PriB, PriC et DnaT. Ces protéines ont été caractérisées en utilisant le phage
ΦX174 dont l’initiation de la réplication au site pas (Primosome Assembly Site), une structure
branchée de l’ADN ressemblant à une fourche de réplication, dépend de ces protéines (pour
revue, (Marians 1992)). Pour ce phage, PriA est l’initiateur de la réplication (homologue
fonctionnel de DnaA à OriC) en se fixant au site PAS et en permettant le recrutement des autres
protéines du primosome. Bien que PriA soit une protéine conservée chez les bactéries, les autres
protéines primosomiques ne le sont pas. Chez B. subtilis le primosome, impliqué dans
l’initiation de la réplication du plasmide pAMβ1 contenant une site ssiA, homologue structurel
du site pas du phage ΦX174, et dans le redémarrage de la réplication de fourches
chromosomiques arrêtées, est constitué de PriA, DnaD, DnaB et DnaI, ((Bruand et al. 1995,
Marsin et al. 2001, Polard et al. 2002, Velten et al. 2003, Bruand et al. 2005), Figure 5C). PriA
n’est pas seulement une protéine de recrutement. Elle est aussi une hélicase ADN de la famille
SF2 dont l’activité, in vitro, est régulée par la structure de la fourche reconnue et par la protéine
de fixation à l’ADNsb, SSB. PriA est ainsi capable de remodeler la fourche arrêtée en cas de
besoin, notamment si de l’ADNsb n’est pas disponible sur le brin retardé (Jones et al. 1999,
Jones et al. 2001), un substrat requis pour le chargement de l’hélicase réplicative. L’activité
hélicase de PriA de E. coli est stimulée in vitro en présence de SSB, et cette stimulation requiert
32
une interaction physique entre le domaine C-terminal de SSB et PriA (Cadman et al. 2004).
La protéine SSB (RPA chez les eucaryotes) est une protéine ubiquitaire et essentielle chez
les êtres vivants. Sa fonction première est de se fixer sur les intermédiaires d’ADNsb issus des
processus de réplication (Figure 5A), de recombinaison et de réparation de l’ADN. Sa fixation
va permettre de recouvrir et ainsi de protéger l’ADN de l’action de protéines inadéquates, ou à
l’inverse, de faciliter l’action d’enzymes sur ce substrat.
Figure 5 : Le redémarrage de la réplication chez B. subtilis. A. Représentation schématique du
réplisome de B. subtilis (figure tirée de (Jameson et al. 2017). B. Réplication bidirectionnelle du
chromosome bactérien et représentation schématique illustrant l'arrêt et l'effondrement de la fourche de
réplication. Le schéma de différents types de fourches reconnues par PriA est représenté : des fourches
en cours de réplication et abandonnées par leur réplisome et directement re-démarrables, des fourches
issues des processus de réparation de l'ADN, de l'initiation de la réplication de l'ADN de certains phages
et plasmides ou encore liées à la transcription. L'ADN parental est indiqué en noir, le néosynthétisé en
gris et l'ARN en rouge. SSB est affiché en orange (issu de (Windgassen et al. 2018)). C. Modèle
d’assemblage du primosome dépendant de PriA chez B. subtilis. (i) La fourche arrêtée et réparée est
fixée par PriA. (ii) PriA assiste la fixation de DnaD. (iii) DnaD active la fixation de DnaB sur l’ADNsb
voisin. (iv) Le complexe DnaC-DnaI est recruté sur le brin leading pour redémarrer la réplication (issu
de Marsin, 2001 #360}).
A
C
B
33
Dans ce dernier cas, l’accès à l’ADN est facilité via une interaction physique entre SSB et son
partenaire ou via l’inhibition de la formation de structures secondaires sur l’ADNsb. Les SSB
des modèles E. coli et B. subtilis se composent de trois régions (pour revue, (Antony et al.
2019)). La région N-terminale contient un domaine OB (Oligonucleotide / oligosaccharide
Binding fold) responsable de la tétramérisation de SSB et de sa fixation à l’ADN. La région C-
terminale de 6 acides aminés (ou 9 selon les publications, région nommée TIP) est
amphipathique, elle est constituée de résidus acides et de résidus hydrophobes hautement
conservés entre les différentes SSB bactérienne. Cette région, chez E. coli, est essentielle à la
viabilité cellulaire et est requise pour assurer les interactions de SSB avec ses multiples
partenaires protéiques, dont PriA, mais pas avec l’ADN ((Curth et al. 1996), pour revue (Antony
et al. 2019)). Cette extrémité amphipathique est séparée du domaine N-terminal par une région
centrale, nommée IDL (Intrinsically Disordered Linker), riche en glycine et proline et ne
présentant pas de structure secondaire évidente. L’IDL n’est pas essentielle puisque des mutants
de la SSB d’E. coli (SSBEc) constituée de la région N-terminale fusionnée directement avec
l’extrémité amphipathique sont viables (Curth et al. 1996). L’IDL est cependant impliquée dans
des interactions protéine-protéine (voir ci- dessous).
Figure 6. Architecture de la SSB d’E. coli. (A) Schéma du domaine OB de liaison à l'ADN, de
l’extrémité acide en C-terminal (TIP) et de la région IDL. La séquence du TIP de la SSB de B. subtilis
est DISDDDLPF. (B) Structure de SSB liée à l'ADNsb (bâtonnets noirs) représentée avec ses quatre
sous-unité colorées. Les IDL sont représentés s'étendant loin du noyau de liaison à l'ADN (tirée de
(Antony et al. 2019)).
Travaux de recherche
Caractérisation de l’interactome de SSB chez B. subtilis et de son rôle dans la dynamique du
génome (Lecointe et al. 2007, Costes et al. 2010)
Le redémarrage de la réplication dépendant de PriA était bien caractérisé in vitro chez B.
34
subtilis, comme chez E. coli. Cependant le mécanisme par lequel PriA est chargée sur une
fourche de réplication arrêtée et réparée restait une énigme. En effet, comment PriA, protéine
peu abondante ((~ 50 molécules/cellule, (Polard et al. 2002)) est-elle capable d’atteindre son
site d’action dans la cellule alors que la fourche de réplication est susceptible d’être fixée par
un grand nombre de protéines différentes impliquées dans sa réparation ? De manière plus
générale, comment sont coordonnés les processus cellulaires impliqués dans le sauvetage des
fourches de réplication ?
Nous avons montré que la protéine de fusion GFP-PriA est continuellement co-localisée
avec des protéines du réplisome vraisemblablement au niveau de l’usine réplicative (UR) : le
˝compartiment˝ de la cellule où l’ADN est répliqué (Lemon et al. 1998). In vitro, PriA de B.
subtilis (PriABs) interagit avec la SSB de B. subtilis (SSBBs) et cette interaction requiert la partie
C-terminale de SSBBs, comme chez E. coli. Pour rechercher en quoi cette interaction intervenait
dans le profil de localisation de PriA dans la cellule, nous avons créé un mutant d’interaction
de PriA (PriAZF) en substituant les deux motifs à doigts de zinc (souvent impliqués dans
l’interaction entre macromolécules) de PriABs par celui de PriA de E. coli (PriAEc). La protéine
chimère obtenue présentait in vitro une interaction avec l’ADN similaire à celle obtenue avec
la protéine sauvage, mais était incapable d’interagir avec la SSBBs et ne localisait plus à l’UR
in vivo. Cela suggérait que le profil de localisation continuel de PriABs à l’UR était dépendant
de l’interaction de cette dernière avec SSBBs (présente également continuellement à l’UR,
(Meile et al. 2006)). Cependant, comme PriAEc est capable d’interagir avec la SSBBs, cette
hypothèse restait à valider. Cette validation est venue grâce à l’utilisation d’une souche mutante
de B. subtilis codant pour une SSB tronquée de ses 35 acides aminés en C-terminal. Pour
l’anecdote, j’ai obtenu ce mutant de B. subtilis (pas de mutant viable du C-terminus connu chez
E. coli) par un heureux hasard en essayant de fusionner une étiquette d’affinité (appelée SPA)
au gène SSB, en vue de caractériser son partenariat par TAP (voir ci-dessus). A ma grande
surprise, l’unique clone que j’ai obtenu sur une boîte oubliée plusieurs jours sur ma paillasse ne
codait pas pour une protéine SSB-SPA, mais pour une protéine tronquée de ses 35 derniers
résidus (SSBΔ35). Après reconstruction d’un mutant « propre » ssb𝛥35 nous avons pu
confirmer que PriABs localise à l’UR de manière dépendante de la queue C-terminale de SSBBs.
Nous avons étendu cette observation à deux autres hélicases de la famille SF2 également
impliquées dans le sauvetage des fourches de réplication arrêtées, RecG et RecQ, pour
lesquelles nous avons pu confirmer aussi la présence de SSBBs dans leur interactome respectif.
La surexpression nécessaire du mutant PriAZF pour augmenter la survie d’une souche de B.
subtilis n’exprimant qu’une très faible quantité de PriABs sauvage montre que le rôle de
35
l’interaction entre SSBBs et PriABs est, a minima, de permettre à cette dernière d’atteindre
efficacement son site d’action dans la cellule en la concentrant continuellement à proximité de
la fourche de réplication. Ceci permet aussi de palier à la faible quantité de PriABs produite dans
les cellules. Sur la base de ces résultats, nous avons proposé que la protéine SSBBs joue, en plus
de son rôle de protection de l’ADNsb, le rôle de plate-forme dans l’UR pour différentes ADN
hélicases, facilitant ainsi leur action de réparation des fourches de réplication arrêtées. Une
partie de ce travail a été menée par Mlle Céline Serena, en thèse à l’époque sous la direction de
P. Polard et par Mlle Audrey Costes dont j’ai co-encadré, avec P. Polard, le stage de M2
(Lecointe et al. 2007).
L’interactome de SSBEc est constitué de plus d’une dizaine de protéines. Afin de déterminer
si d’autres protéines de la dynamique du génome pouvaient être recrutées à l’UR via SSBBs, A.
Costes, dont j’ai ensuite co-encadré la thèse avec P. Polard entre 2007 et 2010, et moi-même
avons mené deux études. La première visait à déterminer, dans un mutant de ssb dépourvu de
sa partie C-terminale (ssbΔ35 comme ssbΔ6 présentaient des résultats identiques), le profil de
localisation des protéines de réparation de l’ADN connues pour être localisées à l’UR dans un
contexte sauvage. La deuxième étude, sans a priori, visait à caractériser l’interactome de la
SSBBs par TAP. Nous avons ainsi identifié neuf nouveaux partenaires de SSB. L’analyse de cet
interactome et les connaissances sur les fonctions des protéines le constituant, acquises à
l’époque ou ultérieurement par d’autres équipes, indiquent que l’interactome de SSB est
conservé entre E. coli et B. subtilis en terme de fonction : la réplication (DnaE chez B. subtilis),
la recombinaison (RecQ, YpbB/RecS, RecJ, RecO, RecG, RecD2), la réparation (XseA (sous
unité de l’exonucléase VII), Ung, SbcC) et le redémarrage (PriA), même si certaines protéines
sont spécifiques de la bactérie étudiée ((Torres et al. 2017b) et pour revues : (Lenhart et al.
2012, Alonso et al. 2013, Antony et al. 2019), Figure 7A)). Une autre protéine de l’interactome
de SSBBs, RarA, fonctionnellement mal caractérisée, est également impliquée dans des
processus de réparation/recombinaison et/ou de redémarrage de la réplication (Carrasco et al.
2018, Romero et al. 2019a, Romero et al. 2019b, Jain et al. 2020, Romero et al. 2020). Ainsi,
certaines protéines impliquées dans la réactivation des fourches en cas d’arrêt sont
continuellement présentes avec SSB dans l’UR. Quel est le rôle de cette présence continue ?
Nous avons montré qu’un mutant ssbΔ35, en plus de présenter un défaut de viabilité en
condition non stressante, est extrêmement sensible aux UV et que la réponse SOS est altérée
dans ce contexte. Ce mutant présente aussi la particularité d’être thermosensible et nous avons
montré que la surexpression de RecO (médiateur du chargement de RecA) atténue ce
phénotype, indiquant que SSBBs joue aussi un rôle de concentrateur de protéines de la réparation
36
de l’ADN au niveau de la fourche de réplication. Enfin, le phénotype de thermosensibilité de
mutants de réplication est amplifié dans un contexte ssbΔ35 suggérant que le C-terminus de
SSBBs devient essentiel lorsque des stresses portent atteinte au réplisome bactérien. Ces
résultats ont ainsi montré qu’en plus de son rôle de protection de l’ADN, SSBBs est également
impliquée dans sa réparation en tant que plate-forme d’interactions pour de multiples protéines
de la dynamique des génomes (Figure 7A). Ce travail a fait l’objet d’un article qu’A. Costes a
signé en co-premier auteur (Costes et al. 2010).
Figure 7. L'interactome de SSBBs et son rôle. A. Modèle du rôle du C-terminus de SSBBs dans la
réparation des dommages des fourches de réplication. La réactivation de la fourche de réplication est
décrite comme un processus en deux temps. Le premier vise à restaurer l’intégrité structurelle de la
fourche inactivée (étapes 1, 2 et 3). Le deuxième consiste à réassembler le réplisome sur la fourche
réparée (étape 4). La fourche active en cours de réplication est représentée avec le réplisome (rond gris
foncé). SSBBs (ronds gris clairs), qui recouvre le brin retardé, est entouré par son interactome représenté
sous forme de cylindre. L’étape 0 (flèche pointillée) représente un démantèlement de réplisome sans
nécessité de réparation de la fourche avant réactivation. Les flèches pleines (étapes 1, 2, 3, 4)
représentent toutes les autres voies de réparation de la fourche qui pourraient faire intervenir les
partenaires de SSBBs (Costes et al. 2010). B. structure de SSBBs et du mutant SSBΔ60+6 et localisation
de partenaires de SSBBs dans le contexte sauvage (ssb) ou mutant (ssbΔ60+6). DAPI en bleu, signal
GFP en vert.
B
ssb ssbΔ60+6
SSB
Nter IDL
SSBΔ60+6
TIP
A
37
Un deuxième aspect du travail de thèse d’A. Costes a consisté à comprendre comment sont
régulées ces interactions protéine-protéine alors que tous les partenaires semblent requérir le
même domaine C-terminal amphipathique de SSBBs. En effet, la fourche de réplication est le
lieu où les machineries en charge de la réplication, de la réparation et du redémarrage sont
amenées à être utilisées. A première vue, pour être efficace, ces mécanismes doivent être au
moins régulés temporellement s’ils ne le sont pas spatialement. Dans ce cadre, A. Costes a créé
toute une série de mutants de la queue C-terminale, caractérisé les effets de ces mutations sur
la viabilité cellulaire après stress et localisé les partenaires de SSBBs. Ce travail a permis de
montrer un rôle potentiel de l’IDL (voir Figure 6A) dans l’interaction de certaines protéines
avec SSBBs. En effet, un mutant SSBΔ60+6, dépourvu de cette région et sur lequel l’extrémité
C-terminale amphipathique de 6 acides aminés est fusionnée au domaine N-terminal (Figure
7B), permet la localisation de PriABs (non montré) et de RecG à l’UR, mais pas celle de DnaE
ou RecO. D’autre part, A. Costes a pu montrer in silico l’existence de trois domaines dans l’IDL
de SSBBs similaires à la TIP, en ce sens qu’ils sont constitués d’acides aminés polaires et
d’acides aminés hydrophobes. De manière intéressante, l’un de ces domaines se retrouve à
l’extrémité du mutant ssbΔ35. La mutation de la partie hydrophobe de ce motif altère encore
plus les défauts de viabilité du mutant ssbΔ35. Ces résultats suggérent que ce motif peut être
important pour la fonction de SSBΔ35 et potentiellement de la protéine sauvage. D’autre part,
le travail d’A. Costes montrait que toutes les pièces de l’interactome n’interagissent pas de la
même manière avec SSB et proposait un rôle de l’IDL dans la composition de cet interactome
chez B. subtilis. Le comportement différent des partenaires en fonction des mutants de SSBBs
suggérait également que SSBBs soit un des éléments régulateurs de l’accès des protéines de
réactivation à la fourche de réplication arrêtée.
Autres avancées et perspectives dans le domaine
Comme mentionné précédemment, les résultats de thèse d’A. Costes suggéraient un rôle de
l’IDL dans les interactions de SSB avec une partie de ses partenaires. Cette hypothèse semble
désormais être validée pour la SSBEc puisque les travaux de l’équipe du Dr. Piero Bianco, sur
la caractérisation de l’interaction entre SSBEc et RecG ou RecO d'E. coli, montre un rôle
important de cette région (Bianco et al. 2017). L’IDL et la TIP sont aussi impliquées, à des
degrés divers en fonction du mode de fixation de SSBEc à l’ADNsb, dans l’interaction de SSBEc
avec elle-même. Cette interaction est à l’origine de la coopérativité de fixation de cette protéine
sur l’ADNsb ((Kozlov et al. 2015, Tan et al. 2017) et pour revue (Antony et al. 2019)). Ceci
38
implique que l’interaction de certains partenaires avec SSBEc (et SSBBs par extension) puisse
être à l’origine de la désorganisation du filament de SSBEc sur l’ADNsb, provoquant ainsi une
diminution de l’effet barrière de SSB (effet de protection de l’ADNsb vis-à-vis de la fixation
de protéines non désirées), une étape importante pour permettre le chargement d’autres
protéines de réparation de l’ADN, telle que PriAEc (pour revue, (Antony et al. 2019)). Il est à
noter qu’une partie des phénotypes observés pour la souche ssbΔ35 pourrait aussi être liée à
une altération des capacités de fixation de la protéine SSBΔ35 sur l’ADNsb par rapport à la
protéine sauvage, même si in vitro nous n’avons pas été en mesure de vérifier cette hypothèse.
Quel que soit le rôle de l’IDL, une constante dans les études réalisées est la nécessité de la
présence de la TIP pour observer les interactions entre SSB et ses partenaires, chez B. subtilis
comme chez E. coli. Pour le groupe de Bianco, la TIP aurait seulement un rôle régulateur sur
la structure de l’IDL et ses capacités à interagir avec les partenaires de SSBEc. Cette hypothèse
n’explique toutefois pas l’identification de la surface d’interaction entre l’extrémité hydrophobe
de la TIP de SSBEc et la poche hydrophobe de plusieurs partenaires de SSBEc (Antony et al.
2019). D’autre part, des travaux récents de l’équipe du Dr. Thimothy Lohman, ayant pointé ces
contradictions, montrent que des peptides constitués de la TIP et de parties plus ou moins
importantes de l’IDL de la SSBEc ont la même affinité pour différents partenaires de SSBEc
(Shinn et al. 2019). Ce travail a de plus montré que tous les partenaires testés n’ont pas la même
affinité pour la TIP seule, suggérant que cette région pourrait avoir un rôle régulateur dans
l’accès des partenaires de SSBEc à la fourche. Quoiqu’il en soit, les travaux de l’équipe de
Bianco (et ceux d’A. Costes) relancent la question de la mécanistique d’interaction de SSB avec
son interactome et montrent le besoin crucial d’obtenir la structure de différents complexes
SSB/partenaire en présence ou non d’ADN ainsi que l’obtention de mutants de séparation de
fonctions, mutants dont les partenariats différents permettront de mieux comprendre le rôle de
chacune des interactions.
Outre l’impact de ces études sur l’interaction en elle-même, celles-ci permettent également
de comprendre son rôle dans les mécanismes en charge des fourches arrêtées. Ainsi, l’obtention
de la structure de PriAEc en présence de la TIP de SSB et la caractérisation de l’interaction en
molécule unique montrent que la fixation de PriAEc sur une fourche de réplication dont le brin
retardé est couvert de SSBEc change le mode de fixation de SSBEc à l’ADN et a pour
conséquence de libérer de l’ADNsb. Cette exposition permettrait par la suite le chargement des
autres protéines primosomiques et enfin de l’ADN hélicase réplicative (Bhattacharyya et al.
2014). Par conséquent, la capacité de PriAEc à interagir avec SSBEc a donc deux fonctions :
faciliter l’accès de PriAEc à son substrat et lever l’effet barrière de SSBEc vis-à-vis des protéines
39
primosomiques et de l’ADN hélicase.
Une des questions relevées par nos études concerne la nature des foyers de fluorescence
observés soit par fusion de la GFP sur des partenaires de SSBBs soit sur la SSBBs elle-même.
Comme dit précédemment, DnaE fusionnée à la GFP forme des foyers de fluorescence
dépendant de la queue C-terminale de SSBBs. DnaE est une ADN polymérase essentielle chez
B. subtilis dont le rôle serait d’allonger de quelques nucléotides les amorces ARN des fragments
d’Okazaki sur le brin retardé avant leur prise en charge par l’autre ADN polymérase réplicative
PolC (Sanders et al. 2010, Li et al. 2019). Ce modèle d’action essentielle mais limitée à la
fourche de DnaE reste cependant discuté (Paschalis et al. 2017, Seco et al. 2017). Quoi qu’il en
soit, le fait que DnaE-GFP ne forme pas de foyer dans la ssbΔ35 implique que cette protéine
fusion en activité sur la fourche n’était pas visible par épifluorescence avec le matériel dont
nous disposions. De la même manière, la très grande majorité des cellules observées ont des
foyers de type UR pour les différentes protéines de réactivation partenaires de SSB, dans des
conditions de croissance normale (i.e. sans agents endommageant l’ADN). Ceci implique que
les foyers observés seraient des formes de stockage des protéines partenaires sous une forme
non active, en attente d’un substrat. Nous avons proposé que ces protéines interagissent avec
les tétramères de SSBBs fixés sur l’ADNsb au niveau de la fourche de réplication (Figure 7A).
Cependant, la quantité importante de tétramères de SSBBs (environ 5000 chez B. subtilis, thèse
de Céline Sérena) et la fixation d’environ une soixantaine seulement d’entre eux sur les
fragments d’Okazaki présents sur les deux fourches (estimation basée sur un mode de fixation
de SSBBs sur 35 nt pour une taille de fragment d’Okazaki d’environ 1 kb), impliquent qu’une
majorité de la SSBBs n’est pas associée à l’ADNsb. Dans ce cas, pourquoi visualise-t-on des
foyers de protéines interagissant avec SSB co-localisant avec d’autres protéines du réplisome
dont la localisation est indépendante de SSBBs? Qu’est-ce qui définit la compartimentation de
ces protéines au niveau ou à proximité de l’UR ? Où est localisée la SSBBs en excès ?
Un élément de réponse, avec les connaissances disponibles, était que les queues C-terminales
des tétramères de SSBBs non fixés à l’ADN pourraient interagir avec les domaines OB-fold et
ainsi ne plus être disponibles pour interagir avec les partenaires de SSBBs. Cette hypothèse était
basée sur l’observation qu’une interaction entre le domaine C-terminal acide et le domaine OB
fold chez les protéines SSB des phages T4 (gp3, (Wu et al. 1999)) et T7 (gp2.5, (Marintcheva
et al. 2008)) influe sur l’interaction entre ces SSB et l’ADNsb. Le rôle de la TIP de la SSBEc
sur interaction avec l’ADNsb a également été montré (Kozlov et al. 2010, Su et al. 2014). Ainsi,
la majorité des SSB, non liée à l’ADNsb, pourrait simplement ne pas être capable d’interagir
avec les protéines de l’interactome, laissant ces dernières fixées sur les nucléofilaments de SSB
40
à la fourche. Une seconde explication peut désormais être avancée suite aux travaux récents
montrant la propriété de la SSBEc à former des condensats par séparation de phase liquide-
liquide dans des conditions compatibles avec le milieu intracellulaire (Harami et al. 2020). Ces
condensats se forment par de multiples interactions entre les protéines SSBEc via leurs différents
domaines, l’absence de l’IDL et de la TIP altérant fortement la formation de ces structures. La
présence d’une région intrinsèquement désordonnée est une marque des protéines présentant
cette capacité à former des condensats par séparation de phase (pour revue (Alberti et al. 2019)).
En plus de concentrer la protéine SSBEc elle-même, ces condensats peuvent accueillir et
concentrer spécifiquement des protéines de l’interactome ainsi que de l’ADNsb. Ainsi, les
foyers de fluorescence des partenaires de SSBBs que nous observions dans nos études pourraient
contenir l’ensemble des SSBBs de la cellule, formant un condensat unique échafaudé à partir
des molécules de SSBBs fixées à l’ADNsb. La dynamique de mouvement de SSBEc au sein de
ces condensats (Harami et al. 2020) permettrait de séquestrer les partenaires afin d’éviter une
action néfaste sur la réplication en conditions normales et de les libérer en cas de besoin. Cette
capacité à former des condensats mise à jour pour la SSBEc, et vraisemblablement existant pour
la très grande majorité des SSB bactériennes qui présentent quasi systématiquement une région
IDL, nécessite désormais de comprendre les déterminants à la base de cette propriété, une étape
essentielle à la production de mutants de séparation de fonction. Ces derniers permettraient de
différencier les différents rôles de la partie C-terminale de cette protéine et de caractériser les
différents rôles de SSB au sein de la cellule.
Etude de la régulation transcriptionnelle en réponse à des changements
environnementaux chez B. subtilis.
Suite au départ de P. Polard de l’INRA en 2007, j’ai recherché une équipe d’accueil en ayant
pour objectif de développer, parallèlement à ce travail sur SSBBs avec A. Costes restée la moitié
de sa thèse à l'INRA, ma propre thématique de recherche associée à l’étude de la dynamique
des génomes bactériens et au sein de laquelle je pouvais apporter mon expertise de
caractérisation des complexes multiprotéiques. J’ai rejoint l’équipe du Dr. Philippe Noirot dans
l’unité Micalis qui s’orientait vers la biologie des systèmes. Cette thématique, visant à élaborer
des modèles mathématiques prédisant l’évolution de systèmes biologiques en réponse à des
changements environnementaux, était pour moi un moyen complémentaire d’appréhender les
réponses cellulaires de B. subtilis confronté à une multitude de stresses induisant des dommages
41
à l’ADN, et ainsi de caractériser l’ensemble des gènes impliqués dans les mécanismes de
réparation et leurs interactions potentielles.
Les interactions protéine-protéine ne sont pas ou peu prises en compte dans les modèles
mathématiques pour la biologie systémique. Or, ces interactions peuvent fortement influer sur
l’activité des protéines et donc sur l’élaboration de modèles prédictifs. En me basant sur ce
besoin et avec l’aide du Dr. Olivier Delumeau, un post-doctorant que nous avons recruté dans
le cadre du projet européen BaSysbio, nous avons optimisé la méthodologie TAP chez B.
subtilis afin de caractériser des complexes multiprotéiques à grande échelle. Nous l’avons
standardisée au sein du consortium afin que puissent être comparés les résultats générés par les
différentes équipes associées au projet Basysbio. Une application directe de cette technique a
été d’étudier la dynamique de la composition de l’ARN polymérase de B. subtilis dans
différentes conditions de croissance (Delumeau et al. 2011).
Par ailleurs, la compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation
transcriptionnelle est un maillon important de la biologie des systèmes. Pour cela, j’ai
développé et standardisé une technique d’immunopurification de la chromatine permettant de
cartographier les sites de fixation de protéines d’intérêt sur le chromosome de B. subtilis.
Dans le cadre du projet BaSysbio, j’ai utilisé cette technique pour deux études. La première
visait à caractériser la réponse cellulaire de B. subtilis à un changement de source carbonée dans
le milieu de culture. La Dr. Nathalie Pigeonneau, stagiaire post-doctorale que j’ai encadrée et
formée à cette technique, et moi-même, avons cartographié les sites de fixation sur le
chromosome de CcpA, un des régulateurs de la répression catabolique. Une analyse in silico
comparant ces sites aux gènes différentiellement exprimés après le changement de source
carbonée montre que sur les 200 gènes les plus impactés par ce changement, près de 60%
seraient régulés par CcpA, confirmant l’impact majeur de ce régulateur. Ce travail a été intégré
dans une étude globale qui a été publiée dans Science (Buescher et al. 2012).
La deuxième étude visait à cartographier l’ensemble des unités transcriptionnelles du
génome de B. subtilis par caractérisation de son transcriptome dans une centaine de conditions
de croissance différentes. Ces conditions incluaient des croissances en présence d’agents
génotoxiques, d’un intérêt particulier pour ma thématique de recherche sur le NHEJ (voir ci-
dessous). Ce travail a permis entre autres de réaliser une classification des promoteurs basée
sur l’expression des gènes associés. J’ai identifié les sites sur lesquels se fixe le facteur sigma
de ménage. Ceci a contribué à valider l’hypothèse selon laquelle cette classification repose
essentiellement sur la reconnaissance des promoteurs par les facteurs sigma. Cette classification
a ainsi permis de prédire un rôle à des gènes de fonctions encore inconnues (Nicolas et al. 2012).
42
Etude du NHEJ bactérien
Introduction
A partir de 2011, dans l’équipe de P. Noirot, j’ai parallèlement développé un nouvel axe de
recherche visant à caractériser le mécanisme de réparation des CDB par recombinaison
illégitime, le NHEJ, chez les bactéries, et plus exactement à i) caractériser les intervenants et ii)
comprendre les interactions mises en jeu aboutissant à un mécanisme de réparation efficace.
Chez les bactéries, le mécanisme majeur de réparation des CDB est la recombinaison
homologue (HR) faisant intervenir la recombinase ubiquitaire RecA (pour revue,
(Kowalczykowski 2015)). Ce mécanisme nécessite la présence d’une région homologue à la
région lésée et intacte dans la même cellule (Figure 8). Ainsi, ce système ne peut être efficace
que chez les bactéries présentant plusieurs copies de leur chromosome (cas par exemple de D.
radiodurans) ou chez des bactéries haploïdes en phase active de réplication où tout ou partie
du(es) chromosome(s) est dupliqué postérieurement à la division cellulaire. Pour ces dernières,
se pose alors la question de leur capacité à réparer des CDB dans des conditions non réplicatives,
telles que la phase stationnaire ou la sporulation, ou encore dans des conditions à faible taux de
croissance où la réplication est ralentie et où les portions de chromosome non répliquées peuvent
être plus importantes et donc plus sensibles aux CDB. D’abord basée sur des études in silico
identifiant un homologue bactérien des protéines Ku70/80 humaines, Ku, dont le gène est
souvent à proximité d’un gène codant une ADN ligase ATP-dépendante (Aravind et al. 2001,
Doherty et al. 2001), puis validée expérimentalement (Weller et al. 2002), la découverte du
mécanisme de NHEJ chez les bactéries permettait d’envisager de répondre, au moins
partiellement, à cette question. En effet, ce mécanisme assure la ligature de deux extrémités
d’ADNdb sans avoir besoin d’une région homologue intacte et pourrait donc être un mécanisme
de choix dans des conditions ne permettant pas la réplication de l’ADN. Cette hypothèse a été
validée par l’observation de l’efficacité du NHEJ principalement au cours de la germination des
spores de B. subtilis (Wang et al. 2006) ou en phase stationnaire chez Mycobacterium smegmatis
et Sinorhizobium meliloti après irradiation par rayonnement ionisant (Pitcher et al. 2007b,
Stephanou et al. 2007, Kobayashi et al. 2008, Dupuy et al. 2017). Il faut toutefois noter que le
NHEJ n’est pas un mécanisme conservé chez les bactéries, à l’inverse de ce qui est observé chez
les eucaryotes. En effet, seulement environ 20% des bactéries séquencées présentent un
homologue de Ku et/ou de la ligase LigD et ce mécanisme est distribué de manière sporadique
43
dans le règne bactérien (McGovern et al. 2016, Sharda et al. 2020). Bien qu’aucun mode de vie
bactérien (comme la sporulation) n’ait pu être corrélé à la présence du NHEJ dans les bactéries,
des associations positives entre bactéries disposant de ce mécanisme et un pourcentage de bases
en GC élevé, une taille de génome élevée ou encore un taux de croissance faible ont été
identifiées (Weissman et al. 2019, Sharda et al. 2020).
Alors que le NHEJ chez les eucaryotes implique plus d’une dizaine de protéines différentes
(pour revues, (Frit et al. 2019, Zhao et al. 2020)), chez Mycobacterium tuberculosis (Weller et
al. 2002), le premier NHEJ bactérien décrit in vitro (Figure 8), ce mécanisme repose sur un
système minimal composé de seulement deux enzymes, Ku et LigD. Ce système minimal
s’explique en partie par le fait que LigD de M. tuberculosis est composée de trois domaines
responsables de la multifonctionnalité de cette enzyme, qui est à la fois une ADN ligase, une
polymérase et une 3’-5’ exonucléase (Della et al. 2004). Le domaine polymérase possède une
variété importante d’activités nucléotidyl transférases, telles que d’ADN et ARN polymérase
ADN-dépendante, d’extension de brins sans matrice et de remplissage de brèches simple brin
contenant ou non un site abasique (pour revues, (Shuman et al. 2007, Gu et al. 2008, Brissett et
al. 2009)). D’autre part, LigD présente une activité 5’-2-deoxyribose-5-phosphate (dRP) lyase
impliquée dans le mécanisme de réparation par excision de base (BER) et permettant de réparer
un site abasique dans un duplex d’ADN à proximité d’une extrémité (de Ory et al. 2016, de Ory
et al. 2019). Ainsi, LigD présente un nombre important des activités requises dans le NHEJ pour
permettre de réparer une CDB dont les extrémités ne sont pas directement ligaturables ou dont
la présence de lésions à proximité altère l’efficacité de ligature (bases oxydées, sites abasiques,
extrémités 3’P…). Ceci est notamment le cas pour les CDB induites par rayonnement ionisant,
supposées être entourées par d’autres lésions de l’ADN (concept du cluster de lésions, (Ward
1994)). Les activités de LigD sont portées par des enzymes distinctes, parfois redondantes, chez
les eucaryotes, expliquant en partie le nombre plus élevé de participants.
Les études in silico de l' équipe du Dr. Koonin et du Dr. Doherty ont montré que la protéine
Ku bactérienne présente un domaine N-terminal très semblable au domaine central des Ku70 et
Ku80 eucaryotes, formant l’hétérodimère Ku70/80 ((Aravind et al. 2001, Doherty et al. 2001),
Figure 9A). Ce domaine central chez les Ku eucaryotiques forme la structure caractéristique en
anneau de Ku70/80, à l’intérieur duquel peut passer une molécule d’ADNdb ((Walker et al.
2001), Figure 9B).
44
Figure 8. Exemples de mécanismes de réparation des CDB. A. Mécanismes de réparation des CDB
par recombinaison non homologue (NHEJ) ou homologue (SSA, SDSA, DSBR). Les boites jaunes,
uniquement montrées en haut de la figure, correspondent à des séquences répétées, essentielles au
mécanisme de réparation par appariement (SSA). La voie DSBR (DSB repair) est la voie de
recombinaison homologue communément utilisée chez les bactéries pour réparer une DSB. (adapté de
(Ertl et al. 2017)). B. Modèle du NHEJ chez les procaryotes. Une CDB est reconnue par Ku (ovale violet)
qui va alors recruter l’holoenzyme LigD (soit un polypeptide soit plusieurs, ovale bleu) dont les activités
polymérase, nucléase et ligase vont permettre la maturation des extrémités, l’appariement des 2 brins via
leur microhomologie et leur religature (adapté de (Pitcher et al. 2007a)).
Cette structure permet d’expliquer certaines propriétés de la Ku70/80 eucaryote, telle que sa
capacité à former un nucléofilament in vitro en s’enfilant sur l’ADN telles des perles sur un
collier (de Vries et al. 1989, Paillard et al. 1991, Downs et al. 2004), de recruter les protéines du
NHEJ et de glisser afin de mettre les extrémités d’ADN cassées à disposition de ces protéines
(Yoo et al. 1999) ou encore de dissocier des complexes nucléoprotéiques potentiellement
gênants pour la réparation par NHEJ (Roberts et al. 2007). Les domaines N- et C- terminaux des
Ku70 et Ku80 sont, quant à eux, impliqués dans les diverses interactions avec leurs partenaires
protéiques multiples, ou avec l’ADN, même si, pour ce dernier, le rôle d’une telle interaction
reste à caractériser. Ainsi, le rôle premier de Ku70/80 dans le NHEJ eucaryotique est, à l’instar
de la protéine SSB (voir précédemment), de servir de base à l’échafaudage d’un complexe
multiprotéique capable de réparer l’ADN, ici une CDB. Bien qu’un rôle de Ku70/80 dans l’étape
synaptique du NHEJ ait été proposé par le passé, où l’hétérodimère à lui seul permettrait le
maintien à proximité des extrémités d’ADN avant leur ligature (Ramsden et al. 1998), il
semblerait que cette étape soit en fait assurée par deux voies différentes, l’une dépendante de
Ku/70/80 et de XRCC4/LIG4 et l’autre de la polymérase µ (pour revue, (Zhao et al. 2020)).
45
Cette étape n’a pas été caractérisée dans le NHEJ bactérien.
Le modèle de NHEJ bactérien présenté dans la figure 8, basé sur la capacité de Ku à former
un complexe avec de l’ADNdb linéaire, permettant le recrutement de LigD et la stimulation de
ses différentes activités (Weller et al. 2002, Gong et al. 2005, Zhu et al. 2010, de Vega 2013,
Kushwaha et al. 2013b), propose un rôle de la Ku bactérienne identique à celui de de la Ku70/80
eucaryote, i.e. recruter les autres protéines impliquées, un rôle ainsi plutôt passif.
Travaux de recherche
1) Rôle de Ku dans le NHEJ bactérien (McGovern et al. 2016)
Le modèle présenté figure 8 n’implique cependant pas les diverses propriétés de fixation de
la Ku bactérienne à l’ADN. En effet, la Ku de M. tuberculosis multimérise sur l’ADNdb linéaire,
suggérant qu’elle est capable de s’enfiler sur cette molécule comme son homologue eucaryote
(Weller et al. 2002). Ensuite, les Ku de M. smegmatis et de B. subtilis sont capables de se fixer
sur un ADNdb ne présentant pas d’extrémités et chez M. smegmatis, cette propriété est liée à la
présence du domaine C-terminal de la Ku (Kushwaha et al. 2013b, de Ory et al. 2014). Le rôle
de ce domaine, riche en lysine, non présent chez les eucaryotes et non ubiquitaire chez les
bactéries, restait à définir dans le NHEJ bactérien. De manière remarquable, chez M. smegmatis,
ce domaine est défini comme une région de faible complexité (Kushwaha et al. 2013a). Ce type
de domaine est souvent classé parmi les domaines IDL, similaire à celle rencontrée dans la
région centrale des protéines SSB (voir précédemment). Afin de caractériser le rôle de ce
domaine C-terminal de Ku, nous avons initié, en collaboration avec le Dr. Pierre Nicolas (Unité
MAIAGE, INRAE), une analyse in silico de l’ensemble des séquences des Ku procaryotiques
disponibles en 2014 (2645 génomes séquencés). Nous avons montré i) qu'environ 24% des
procaryotes dispose d’une (20,2%) ou plusieurs Ku (3,5%, jusqu’à 6 Ku) ; ii) que toutes les Ku
bactériennes sont constituées d’un domaine N-terminal homologue au domaine central des Ku
eucaryotiques formant l’anneau autour de l’ADN (Ku core, Figure 9A et B) ; iii) que plus de
99,9% d’entre elles présentent un domaine C-terminal minimal d’une dizaine d’acide aminés
(nommé MC pour minimal C-terminus) ; iv) plus de 93% des Ku bactériennes contiennent un
domaine C-terminal étendu (EC pour extended C-terminus) d’au moins dix acides aminés, riche
en lysines et dont le pI moyen est de 11,4, à comparer au 5,5 du Ku core associé au MC.
Les protéines Ku et LigD de B. subtilis forment un système minimal de NHEJ dans lequel
les deux protéines suffisent à ligaturer deux molécules d’ADNdb linéaire et pour lequel aucune
autre protéine n’est connue pour intervenir (de Vega 2013).
46
Figure 9. La protéine Ku. A. Domaines constituant les protéines Ku chez les êtres vivants et les phages.
Le noyau de Ku (Ku core bleu), responsable de la structure en forme d'anneau, est conservé parmi ces
protéines. Les Ku procaryotes contiennent un domaine C-terminal minimal (MC, vert) impliqué dans la
liaison avec LigD. La plupart de ces Ku contiennent un domaine C-terminal étendu (EC, rouge) qui se
lie à l'ADNdb. Très rarement, ce domaine est remplacé par un domaine Helix-Extension-Helix (HEH),
phylogénétiquement lié au domaine SAP présent dans la Ku70 humaine. Les astérisques désignent un
domaine N-terminal rarement présent. Les domaines impliqués dans l'interaction avec les partenaires
des Ku humaines sont le domaine von Willebrand A (vWA) et le site de liaison à DNAPKcs (CS). NLS
: signal de localisation nucléaire. CTD : domaine C-terminal. Figure tirée d’un chapitre à paraître dans
l’Encyclopedia of Biological Chemistry. B. Structure de la Ku70/80 humaine en présence d’une
molécule d’ADNdb. Ku70 est en rouge, Ku80 en orange et l’ADNdb, traversant l’anneau formé par
l’hétérodimère, en gris. Deux vues pivotées de 90° par rapport à l’axe noir sont montrées (adapté de
(Walker et al. 2001)). C. Capacité de Ku de B. subtilis et des mutants C-terminaux à former des
nucléofilaments (comme ceux pointés par les flèches blanches) par enfilage sur l’ADNdb linéaire à
partir des extrémités (molécules d’ADN nues identifiables par les astérisques). A haute concentration
(150 mM), Ku forme des complexes de hauts poids moléculaire avec l’ADNdb alors que les mutants
forment toujours des nucléofilaments, bien que de taille plus importante qu’à 30 mM. Les barres
indiquent 100 nm (Adapté de (McGovern et al. 2016)).
C
A B
Ku KuΔEC Ku core
47
Ku de B. subtilis répond au schéma classique d’une Ku procaryotique avec un domaine MC
de 18 résidus et un domaine EC de 40 résidus dont le pI moyen est de 11,7. Afin de déterminer
le rôle de ces différents domaines C-terminaux, nous avons purifié la protéine sauvage Ku de B.
subtilis ainsi que deux mutants, l’un dépourvu du EC (protéine KuΔEC) et l’autre dépourvu de
l’intégralité du C-terminus (protéine Ku core). Nous avons montré que ces trois protéines
forment des homodimères. L’enveloppe moléculaire obtenue par SAXS et la modélisation
moléculaire (collaboration avec le Dr. Pierre Roblin au synchrotron Soleil) montrent que le
mutant Ku core présente une structure en anneau semblable à celle du domaine Ku core de la
Ku70/80 humaine (Figure 9B). La protéine sauvage adopte une forme plus étendue, liée à la
présence du domaine en anneau mais également à la présence des domaines C-terminaux non
structurés. Ce résultat et la faible complexité en acides aminés suggèrent que ce domaine est
bien une région IDL, comme initialement proposé pour le domaine homologue de la Ku de M.
smegmatis (Kushwaha et al. 2013a). Nous avons ensuite montré que Ku stimule l’activité de
ligature de LigD in vitro. Cette stimulation est sensiblement altérée avec le mutant KuΔEC et
inexistante avec le mutant Ku core. Nous avons montré pour la première fois une interaction
physique directe, et indépendante de l’ADN, entre Ku et LigD. Alors que l’affinité de LigD pour
Ku et KuΔEC est similaire (collaboration avec l’équipe du Dr. Jean Baptiste Charbonnier, CEA
Saclay), le mutant Ku core est incapable d’interagir avec LigD. Le domaine MC est donc
nécessaire à l'interaction entre Ku et LigD, et son absence dans la protéine Ku core explique son
incapacité à stimuler la ligase. L’analyse des propriétés de fixation de Ku et des mutants à
différents types de molécules d’ADN nous a permis de conclure que i) le domaine Ku core et le
domaine EC sont chacun capables de se fixer à l’ADNdb qu’il soit circulaire ou linéaire ; ii) le
domaine Ku core est suffisant pour que la protéine Ku forme des nucléofilaments à partir des
extrémités de molécules d’ADNdb linéaire et cela en direction du centre de ces molécules
(collaboration avec l’équipe du Dr. E. Le Cam, IGR, Villejuif, Figure 9C) ; iii) cette propriété
est à l’origine de la protection des extrémités de l’ADN par Ku vis-à-vis d’exonucléases, mais
également vis-à-vis d’une endonucléase agissant à proximité d’une extrémité d’ADN ; iv) le
domaine EC provoque une diminution de la taille de ces nucléofilaments ; v) l’EC est requis
pour la formation de complexes nucléoprotéiques de haut poids moléculaires, générés par
l’assemblage de multiples molécules d’ADN et de protéines, maintenues ensemble via des
interactions protéine-protéine et/ou protéine-ADN, observables en MET (Figure 9C) et
permettant à Ku d’assurer un pontage efficace entre molécules d’ADNdb linéaire, en absence
de LigD.
48
L’ensemble des données obtenues au cours de cette étude nous a permis de proposer plusieurs
rôles à la protéine Ku procaryotique dans le NHEJ, dépendants des domaines qui la constitue.
i) La capacité de Ku à interagir avec de l’ADN sans extrémités (via le Ku core et/ou le domaine
EC) permet de positionner Ku sur son substrat en attente d’une cassure. Une fois cette lésion
produite, Ku s’enfile sur ces extrémités et recrute LigD sur son site d’action, stimulant alors les
activités de cette dernière. Dans le cas de B. subtilis, la présence de Ku est même requise pour
observer de la ligature par LigD in vitro. Nous avons montré que cette étape est assurée par une
interaction directe entre les deux protéines et est dépendante du domaine MC de Ku. La
concentration de Ku aux extrémités de l’ADN, liée à la présence de son domaine EC qui tend à
limiter le mécanisme d’enfilage, permettrait de contrebalancer la faible interaction existant entre
les deux protéines.
ii) La capacité de Ku dépendante de son domaine EC, à former des complexes nucléoprotéiques
permettant le pontage de deux molécules d’ADNdb linéaire pourrait jouer un rôle important
dans l’étape synaptique du NHEJ dans la bactérie. Cette étape permettrait d’assurer le maintien
des extrémités cassées à proximité dans la cellule, afin d’éviter leur dispersion et d’éventuels
remaniement chromosomiques. Les données collectées en MET au cours de notre étude nous
ont permis de proposer que Ku réaliserait cette étape synaptique par le biais d’interactions
protéine-protéine et/ou protéine-ADN, entre des nucléofilaments positionnés latéralement
(Figure 10). Ce type de structures est qualifiée de synapses flexibles (Zhao et al. 2020). Notre
étude n'a pas permis de caractériser l’étape assurant la formation d’une synapse fermée requise
pour la ligature par LigD, dans laquelle les deux extrémités se font face. Une étude récente
montre que cette étape est aussi dépendante de Ku mais que le domaine C-terminal n'est pas
requis (Oz et al. 2021). Enfin, le positionnement de LigD sur ces nucléofilaments formés par Ku
reste encore à caractériser à ce jour.
Figure 10. Les différents complexes nucléoprotéiques impliquant Ku. Les différents modes de
fixation de Ku de B. subtilis à l’ADN (1, 2, 3) et les différents types de pontages supposés, basés sur les
analyses des données de MET (4 et 5) sont présentés. Les modèles 3, 4 puis 5 sont obtenus en augmentant
la concentration en Ku. L’homodimère Ku est schématisé avec son domaine noyau en forme de beignet
(blanc et rouge) et avec les domaines C-terminaux de chaque monomère le constituant (traits oranges).
49
iii) La capacité de Ku à se fixer aux extrémités de l’ADN permet de les protèger de l’action de
nucléases, autres que l’holoenzyme LigD. Ainsi, dans des conditions physiologiques où le NHEJ
et la RH se trouvent être fonctionnels dans une même cellule (voir ci-dessous), cette activité de
Ku pourrait jouer un rôle dans le choix du mécanisme de réparation de DSB à employer, en
inhibant par exemple la nucléase AddAB de B. subtilis (résultats non publiés) ou AdnAB chez
les mycobactéries (Sinha et al. 2009), requises pour la maturation des extrémités de l’ADN en
vue du chargement de RecA. Ce rôle de Ku rappelle celui de son homologue eucaryote dans la
compétition entre ces deux mécanismes de réparation en phase S et G2 (pour revue, (Zhao et al.
2020)).
iv) La capacité de Ku à s’enfiler sur l’ADN pourrait aussi permettre de laisser l’accès aux
extrémités à son partenaire LigD et de réparer des sites abasiques à proximité des cassures. En
effet, la Ku bactérienne, comme la Ku70/80 humaine (Roberts et al. 2010) et LigD, présente une
activité dRP-lyase, capable de couper un site abasique à proximité d’une cassure. Cependant la
spécificité de substrat pour Ku et LigD est différente, ce qui suggère que ces deux protéines ont
évolué pour permettre la réparation de sites abasiques sur différentes configurations
d’extrémités d’ADN (de Ory et al. 2019).
v) Si l’enfilage de Ku sur l’ADN peut avoir des effets positifs, le domaine EC, présent dans la
très grande majorité des Ku bactériennes, limite cette capacité. Ce domaine pourrait éviter une
propagation de Ku sur la molécule d’ADN pouvant affecter l’activité d’autres machineries en
charge du métabolisme de l’ADN.
Ainsi, le rôle de Ku dans le NHEJ bactérien pourrait être bien plus proactif qu’initialement
proposé. La mise au point des premiers tests de NHEJ in vitro réalisés dans cette étude avec la
protéine Ku a été réalisée par Mlle Héloise Simonson dont j’ai encadré le stage de M2. Une partie
de ce travail a été réalisée par Mr Stephen McGovern, assistant ingénieur de l’équipe dont j’avais
la responsabilité. Tous deux signent la publication correspondante (McGovern et al. 2016).
2) Caractérisation du mécanisme de NHEJ chez Streptomyces ambofaciens :
multiplicité des acteurs impliqués dans ce mécanisme (Hoff et al. 2016)
La structure à trois domaines de LigD de M. tuberculosis est retrouvée chez d’autres espèces,
mais n’est pas conservée dans le monde bactérien. LigD peut être constituée uniquement d’un
domaine ligase, ou de celui-ci fusionné à un domaine polymérase ou nucléase (pour revue
(Bertrand et al. 2019), Figure 11). Par exemple, la LigD de B. subtilis ne contient pas de
50
domaine nucléase (de Vega 2013). De plus, comme nous l’avons vu précédemment, plus de 3%
des espèces "Ku positives" contiennent dans leurs génomes de 2 à 6 gènes codant pour un
homologue de Ku (McGovern et al. 2016). A ce degré de complexification supplémentaire par
rapport au système à 2 protéines proposé initialement chez M. tuberculosis (Weller et al. 2002),
s’ajoute le fait qu’un nombre important d’espèces "NHEJ positives" codent pour plusieurs
protéines présentant des similarités de séquences avec différents domaines de la LigD de M.
tuberculosis (Figure 11, et voir ci-dessous). Ainsi, le chromosome de M. smegmatis code pour
quatre ligases ATP-dépendantes, LigB, LigC1, LigC2 et la tri-fonctionnelle LigD (Gong et al.
2005). La ligase LigC1 (contenant uniquement un domaine ligase), est impliquée dans le BER
(Plocinski et al. 2017), mais est aussi utilisée dans le NHEJ lorsque le domaine Ligase de LigD
est inactivé (Gong et al. 2005, Akey et al. 2006, Aniukwu et al. 2008, Bhattarai et al. 2014).
L'ensemble de ces observations montre qu'en plus d'un mécanisme de NHEJ minimal,
certaines bactéries pourraient disposer d'un NHEJ impliquant d'autres protéines aux activités
redondantes ou complémentaires (Core + accessory NHEJ actors dans la figure 11), ou encore
de plusieurs voies différentes de NHEJ (Multiple NHEJ dans la figure 11).
Figure 11. Les protéines du NHEJ dans différentes bactéries possédant un système allant du
NHEJ minimal à des systèmes plus complexes. Les domaines Ligase (LigDom), Polymérase (PolDom)
et/ou Nucléase (NucDom) constituant LigD sont présents dans un seul polypeptide ou sous forme de
domaines autonomes. Les protéines ayant le même nom dans différents organismes ne sont pas
nécessairement codées par des gènes orthologues. ✧ indique les acteurs qui ont été impliqués
expérimentalement dans la réparation des DSB. ♦ dans M. tuberculosis désigne des protéines accessoires
impliqués dans le NHEJ, sur la base d'études de leurs homologues chez M. smegmatis. Chez S.
ambofaciens, les acteurs accessoires impliqués dans la réponse aux dommages à l'ADN sont mis en
évidence par une astérisque (Hoff et al., 2016; 2018). Tiré de (Bertrand et al. 2019).
51
Afin de trancher entre ces différentes hypothèses, la caractérisation in vitro et in vivo de
l'ensemble des acteurs potentiellement impliqués est nécessaire. Dans ce sens, j’ai entamé un
travail collaboratif avec le Pr. Pierre Leblond (Université de Lorraine) afin d'initier la
caractérisation du NHEJ chez Streptomyces ambofaciens. Cette bactérie au génome linéaire
contient un grand nombre d’ensembles (clusters) de gènes dont l’expression aboutit à la
formation de métabolites secondaires à fort intérêt industriel (antibiotiques, anticancéreux…).
Le NHEJ pourrait intervenir dans les multiples recombinaisons que subissent ces clusters,
celles-ci étant à l’origine de la diversité des produits codés. Par une approche in silico, P.
Leblond et son équipe ont identifié plusieurs gènes présentant des similarités de séquence avec
les gènes codant Ku et les différents domaines de LigD des mycobactéries, donc potentiellement
impliqués dans le NHEJ (Figure 11). La mutation de ces gènes a montré que 3 homologues de
Ku, 2 homologues du domaine ligase et 2 homologues du domaine polymérase de LigD sont
impliqués dans la réparation de l'ADN et la radiorésistance de spores de S. ambofaciens. J’ai
montré que les produits de trois de ces gènes (KuA, KuB et KuC) sont capables de protéger les
extrémités d'un ADNdb linéaire de l'action d'une exonucléase. De plus, ces trois protéines
stimulent l'activité de la LigD de B. subtilis. Ainsi les spores de S. ambofaciens contiennent 3
protéines Ku intervenant dans le NHEJ. L'inactivation des 3 gènes ku a un effet cumulatif sur la
radiorésistance des spores par rapport aux inactivations individuelles, suggérant que les trois Ku
interviennent dans le NHEJ et que leur activité n'est pas (au moins en partie) redondante. Il en
est de même pour les deux ligases LigC et LigD et les deux polymérases PolK et PolR (Hoff et
al. 2016).
Ces résultats soulèvent de multiples questions sur i) la spécificité de substrat de ces
différentes enzymes, ii) les interactions physiques et fonctionnelles existantes entre elles et enfin
iii) l'expression des gènes correspondants dans différentes conditions de croissance. Ces
questions ont fait l'objet de demandes de financement à l'ANR, décrites ci-dessous.
Autres avancées et perspectives dans le domaine (pour revue, (Bertrand et
al. 2019))
Avec le Dr. Claude Bruand (INRAE, Toulouse) et l'équipe de P. Leblond, nous avons
récemment publié une revue (Bertrand et al. 2019) et un chapitre d'ouvrage, en cours de parution
dans l’Encyclopedia of Biological Chemistry, décrivant les données récentes obtenues sur le
mécanisme de NHEJ bactérien et les perspectives futures concernant le NHEJ chez les
procaryotes et les phages. Sans citer l'ensemble des points décrits dans ces manuscrits, je
52
reviendrai ici sur ce qu'il me semble être les points cruciaux restant à élucider.
La découverte des multiples fonctions du domaine EC de Ku soulève la question de son
impact dans l’environnement cellulaire et la nécessité de mesurer les effets de la suppression de
ce domaine in vivo sur les capacités de réparation des CDB. De même, l’existence de
nucléofilaments formés par Ku s’enfilant sur l’ADN cassé reste à démontrer in vivo. Cette
question se pose puisque les données de microscopie à super résolution sur le système NHEJ
humain tend à montrer que l’hétérodimère Ku70/80 est présent aux extrémités de l’ADN, mais
ne forme pas de filament étendu (la résolution ne permettant toutefois pas de connaitre la
stoechiométrie de cette protéine aux extrémités, (Reid et al. 2015)). La présence de DNA-PKcs,
formant un complexe avec Ku70/80 chez l’homme et ne présentant pas d’homologue bactérien,
pourrait être à l’origine du maintien de Ku70/80 aux extrémités et empêcher sa propagation à
l’intérieur de la molécule dans certaines conditions (Calsou et al. 1999). L'utilisation de la
microscopie à super résolution et/ou de ChiP-seq permettrait de confirmer ou non la présence
de nucléofilaments contenant Ku chez les bactéries et d'estimer leur taille.
Une autre question importante concernant Ku concerne le nettoyage de la région réparée,
i.e. comment Ku est éliminée de la molécule d'ADN. En effet, l'enfilage de Ku sur une molécule
d'ADN in vitro va piéger la protéine sur l'ADN après réparation (Paillard et al. 1991, Oz et al.
2021). Chez les eucaryotes, l'élimination de Ku70/80 de l'ADN passe par sa polyubiquitination
et sa prise en charge par le protéasome (pour revue, (Kragelund et al. 2016)). La question reste
ouverte chez les bactéries. Une étude portant sur la formation et la stabilité de foyers de
fluorescence de la protéine fusion Ku-GFP sur des DSB dans des mutants de protéases, ainsi
qu'une approche in vitro, permettant d'identifier potentiellement la(es) protéase(s) active sur Ku,
permettraient peut-être de répondre à cette question. Une alternative à la présence de protéases
pourrait être un changement structurel important de Ku, après réparation, lié à une modification
de la protéine. Dans ce sens, la déacétylase Sir2 chez M. smegmatis interagit avec Ku (Li et al.
2011) et est impliquée dans son acétylation. Un effet direct de l'acétylation de Ku sur ses
propriétés biochimiques n'est pas connu, mais l'efficacité du NHEJ à circulariser un plasmide
linéaire est anti-corrélée au degré d'acétylation de Ku (Zhou et al. 2015) et est corrélée à la
présence de Sir2 (Li et al. 2011). L'identification de l'acétyltransférase responsable de la
modification de Ku permettrait de caractériser finement in vitro les effets de l'acétylation sur les
caractéristiques biochimiques de Ku (affinité pour l'ADN, pour LigD, capacité à s'enfiler,
stabilité sur l'ADN…).
Nous avons montré que le domaine EC de Ku de B. subtilis n'est pas structuré et que la
diversité des acides-aminés la composant est faible (McGovern et al. 2016), rappelant celle de
53
la Ku de M. smegmatis (Kushwaha et al. 2013a). Ces caractéristiques sont similaires à celles du
domaine IDL de la SSB bactérienne impliqué dans la formation de condensats par séparation de
phase liquide-liquide dans certaines conditions (Harami et al. 2020). Il serait intéressant de voir
si Ku partage cette même propriété et d'en caractériser le rôle dans le NHEJ. Cette propriété
pourrait-elle être à l'origine des complexes Ku/ADN de hauts poids moléculaires observés en
MET (Figure 9C) et potentiellement à l'origine de la capacité de Ku à ponter des molécules
d'ADNdb linéaire? Cette propriété pourrait aussi faciliter l'interaction entre Ku et LigD, une
interaction qui est faible (de l'ordre de 10 µM) in vitro dans les conditions de nos expériences.
Sans tomber dans la recherche systématique de la capacité d'une protéine à promouvoir ce type
de condensat (Leslie 2021), il n'en reste pas moins que le parallèle avec la région IDL de SSB
peut être fait et mérite qu'on s'y intéresse.
L’optimisation des conditions de purification de Ku et de LigD de B. subtilis a permis
d’obtenir des quantités importantes de ces protéines. Ce travail important de S. McGovern a
nécessité la modification des gènes pour une expression optimale chez E. coli et l’établissement
d’un protocole de purification particulier pour éviter de perdre Ku sur les cassures de l’ADN
générées au cours de la lyse cellulaire. Les quantités obtenues permettent d’envisager la
cristallisation de ces deux enzymes, isolées ou en complexe, avec ou sans ADN, afin de
caractériser pour la première fois un complexe nucléoprotéique complet permettant le NHEJ.
La multiplicité des partenaires impliqués chez d'autres bactéries, et a fortiori chez les
eucaryotes, rendent difficilement atteignable cet objectif.
Comme nous l’avons vu précédemment, nous avons caractérisé trois Ku chez S. ambofaciens.
L'étude des interactions physiques entre ces Ku et les polymérases et ligases putatives, révélées
par cette étude, par double hybride en approche matricielle ou par TAP, permettrait de clarifier
les différents complexes NHEJ présents chez cette bactérie et d'identifier potentiellement la ou
les nucléases impliquées dans ce mécanisme (non identifiées par l'approche in silico réalisée par
P. Leblond). Cette étape importante permettrait par la suite de reconstituer des complexes
fonctionnels afin d'en étudier les caractéristiques (efficacité, fidélité, redondance, spécificité…).
Par ailleurs, l'étude de la régulation de ces différents gènes permettrait i) d'identifier les
protéines agissant ensemble et/ou ii) d'identifier les conditions de vie permettant à S.
ambofaciens de disposer d'un mécanisme NHEJ. Nous avons vu que ce mécanisme est au moins
fonctionnel dans les spores de S. ambofaciens, comme c'est le cas chez B. subtilis où l'opéron
unique ku-ligD est sous le contrôle du facteur sigma alternatif SigG et du facteur de transcription
SpoVT produits au cours de la sporulation (Wang et al. 2006). Cependant, au cours de l'étude
visant à la ré-annotation du génome de B. subtilis, liée à la caractérisation de son transcriptome
54
dans une centaine de conditions de croissance différentes (Nicolas et al. 2012), nous avons
observé une induction modérée de cet opéron dans la condition de croissance après un passage
à basse température. Dans cette condition sigG et spoVT ne sont pas sur-exprimés, suggérerant
que l'opéron ku-ligD est différemment régulé en fonction des conditions de croissance. La
fonctionnalité du NHEJ dans cette condition n'a toutefois pas été testée. Il se pourrait dès lors
que les multiples protéines du NHEJ de S. ambofaciens soient produites dans d'autres conditions
que la sporulation, permettant à cette bactérie d'assurer une partie des multiples évènements de
recombinaison dont son chromosome fait l'objet (Hoff et al. 2018).
La présence de multiples systèmes NHEJ actifs au sein d'une même bactérie et dans des
conditions différentes n'a été révélée que récemment. Sinorhizobium meliloti code pour quatre
orthologues de Ku et quatre de LigD (numérotés de 1 à 4 respectivement). L'équipe de C. Bruand
a montré que les gènes ku2 et ligD2 forment un système NHEJ capable de ligaturer un plasmide
préalablement linéarisé dans des cellules en phase exponentielle de croissance. Ces mêmes
gènes sont efficaces dans des conditions de stress (croissance à haute température ou phase
stationnaire), mais dans ces conditions ils sont secondés par un deuxième set de gènes NHEJ:
ligD3, ku3 et ku4. Ces derniers sont spécifiquement induits en stress et sont sous le contrôle du
facteur sigma EcfG (Dupuy et al. 2019). Cette étude renforce les premières observations du rôle
des multiples Ku chez cette bactérie (Kobayashi et al. 2008) et montre pour la première fois que
différents homologues de Ku et LigD sont impliqués dans le NHEJ dans des phases de
croissances ou des conditions de vie spécifiques. Ceci pose la question de l'existence de
systèmes NHEJ multiples dans d'autres bactéries, comme S. ambofaciens.
Cette étude remet aussi en lumière le fait déjà observé chez les mycobactéries (Gong et al.
2004, Gong et al. 2005, Aniukwu et al. 2008) qu'il existe chez des bactéries, des conditions dans
lesquelles le NHEJ est opérationnel en même temps que la RH (phase exponentielle) et soulève
la question de la compétition entre ces deux systèmes de réparation des CDB. Il est à noter que
la mise en évidence d'un NHEJ fonctionnel en phase exponentielle chez les mycobactéries et S.
meliloti a nécessité l'utilisation d'approches comme la ligature de plasmides linéarisés ou la
coupure de site unique sur le chromosome (système I-SceI), une cassure non réparable par RH
en raison de l'absence de régions homologues. En effet, la survie NHEJ-dépendante de cellules
irradiées n'a pu être observée que sur des cellules en phase stationnaire, la mutation des gènes
du NHEJ n'ayant pas, ou très peu, d'impact après irradiation sur la survie des cellules en phase
exponentielle de croissance. Il est intéressant de noter que l'inactivation de gènes de NHEJ chez
Streptomyces avermitilis et M. smegmatis stimule la RH, montrant ainsi que les deux systèmes
sont en compétition (Gupta et al. 2011, Zhang et al. 2012). A l'inverse, l'inactivation de recA
55
n'augmente pas l'efficacité de réparation de cassures I-SceI induite chez M. smegmatis (Gupta
et al. 2011). Ceci suggère que le mécanisme de NHEJ est particulièrement inefficace sur des
DSB en phase réplicative bien que ces protéines soient présentes dans cette phase dans les
bactéries non sporulantes étudiées (Bhattarai et al. 2014, Zhou et al. 2015). Se pose alors la
question de la régulation de ce mécanisme dans cette condition.
Ces différents questionnements sur le NHEJ multiple, associés aux aspects plus moléculaires
révélés par notre étude sur la Ku de B. subtilis, ont été à la base de différents projets de recherche
collaboratifs ayant fait l'objet de demandes de financement à l'ANR. Dans un premier temps,
ces projets visaient à caractériser spécifiquement le mécanisme chez B. subtilis et étaient basés
sur une collaboration entre les équipes de J.B. charbonnier (structure), E. Le Cam (MET), P.
Roblin (SAXS) et moi-même (biochimie et génétique). Ces projets et demandes de financement
ont évolués vers la compréhension de ce mécanisme dans des bactéries à NHEJ multiples (C.
Bruand et P. Leblond), tout en gardant un aspect moléculaire sur un système minimal (E. Le
Cam et moi-même). Les 5 demandes réalisées depuis 2014 n'ont pas été retenues. Je poursuis
néanmoins ces études sur le NHEJ via l'étude d'un homologue de Ku chez les phages (voir ci-
dessous).
56
IV- Travaux réalisés dans l’équipe du Dr. M.A. Petit : de mars 2015 à aujourd'hui
Mécanistique de la recombinaison chez les phages tempérés et rôles pour le
phage et son hôte
La connaissance que j’ai acquise sur le NHEJ chez les bactéries est une aide précieuse pour
mes recherches sur les phages, les virus des bactéries, depuis 2015 dans l’équipe du Dr. Marie-
Agnès Petit, que j’ai rejointe suite au départ de P. Noirot de l'INRA. La lutte contre les bactéries
pathogènes pose un problème de santé majeur du fait de i) l’adaptation d’un grand nombre de
ces pathogènes aux antibiotiques actuels et ii) l’absence de recherche de nouvelles molécules
pendant de nombreuses années dans les industries pharmaceutiques. Dans ce contexte, les
phages pourraient offrir une alternative intéressante dans le traitement de maladies infectieuses,
par le biais de la phagothérapie. Cependant, les phages sont capables d’évoluer avec une
efficacité remarquable, ce qui pourrait poser des problèmes de contrôle de ces entités au cours
de leur utilisation chez l’hôte (pour exemple, (De Sordi et al. 2017)). Un premier aspect de ma
recherche porte sur l’étude des machineries moléculaires impliquées dans les mécanismes de
recombinaison, à la base de l’évolution des génomes phagiques, qui est donc cruciale pour
comprendre les dynamiques phages/hôtes. Un deuxième aspect de ma recherche vise à
comprendre en quoi ces mécanismes de recombinaison interviennent dans le cycle de vie des
phages et s'ils peuvent interférer dans la physiologie de leur hôte bactérien, dans des
environnements "naturels", où les conditions sont potentiellement moins propices à la
réplication des génomes et où les bactéries sont par conséquent potentiellement plus vulnérables
aux CDB. Dans cette équipe, je cherche donc à caractériser des mécanismes phagiques de
recombinaison illégitime ou des mécanismes apparentés ne nécessitant qu’une brève région
d’ADN homologue pour recombiner, comme le SSA. Je m’intéresse à ces mécanismes dans les
phages tempérés, qui par nature sont les plus aptes à influencer la physiologie de leur hôte sans
nécessairement les éliminer.
Introduction
1) Le mosaïcisme, les morons et la recombinaison chez les phages
Les phages, dont le génome est très majoritairement à ADNdb (plus de 95%, pour ceux
disponibles dans les banques de données (Dion et al. 2020)), se catégorisent en deux grands
groupes définis par la nature des cycles infectieux qu'ils réalisent. Les phages dits virulents
n'effectuent qu'un seul type de cycle, i.e. un cycle lytique. Ce cycle se décompose en trois
57
grandes étapes correspondant à i) l'infection de l'hôte bactérien par le phage et à l'injection du
génome de ce dernier, ii) la réplication du matériel génétique du phage et la synthèse des
protéines nécessaires à la formation des nouvelles capsides et iii) l'empaquetage du génome dans
ces capsides et la libération des nouveaux virions après lyse cellulaire (Figure 12). Le deuxième
groupe correspond aux phages dits tempérés. Ces phages, en plus de pouvoir réaliser un cycle
lytique comme il est observé avec les phages virulents, sont également capables de réaliser un
cycle lysogénique au cours duquel le génome du phage, après injection, n'est pas directement
répliqué, mais au contraire maintenu dans la cellule sous forme épisomale ou intégrée dans le
chromosome bactérien, on parle alors de prophage. Le prophage est alors maintenu dans la
bactérie lysogène de façon stable au cours des divisions, en se répliquant en même temps que le
chromosome bactérien, jusqu'à ce qu'un stimulus extérieur aboutisse à son réveil et à la mise en
place d'un cycle lytique, comme décrit précédemment ((Lwoff 1953), Figure 12). La lysogénie
est un phénomène fréquemment rencontré dans le monde bactérien puisqu'environ la moitié des
espèces séquencées à ce jour présentent au moins un prophage dans leur chromosome et qu'un
génome bactérien peut contenir jusqu'à 20% de séquences phagiques (Casjens 2003, Touchon
et al. 2016). D'autres types de cycles existent chez les phages comme les cycles chroniques et
pseudolysogèniques. Ceux-ci ne seront pas décrits ici mais schématisés dans la figure 12
(Weinbauer 2004). De même, les phages dits défectifs ou cryptiques sont d'anciens phages
tempérés intégrés dans le chromosome bactérien et ayant perdu la capacité à s'induire et à
réaliser un cycle lytique. Ils peuvent toutefois intervenir, selon leur degré de dégradation, dans
la physiologie de leur hôte (pour exemples, (Kunkel et al. 1990, Ansaldi et al. 2004, Wang et al.
2010, Lang et al. 2012, Ragunathan et al. 2019)) et interviennent dans le cycle de phages actifs
en échangeant avec eux des gènes via des mécanismes de recombinaison (De Paepe et al. 2014).
A l'état prophage, les phages tempérés sont considérés comme dormants et seuls quelques
gènes les composant sont exprimés. Il s'agit majoritairement des gènes du module de lysogénie
impliqués dans la répression du cycle lytique (exemple du gène cI du phage lambda). Cependant,
d'autres gènes peuvent s'exprimer dans cet état. Ces gènes, acquis par transfert horizontaux,
échappent en effet au contrôle transcriptionnel du prophage puisqu'ils portent leurs propres
promoteurs et terminateurs transcriptionnels. Ces gènes autonomes font partis des morons
(Juhala et al. 2000), i.e. des gènes "accessoires" n'ayant pas de fonction dans le cycle de vie du
phage à proprement parler, mais qui peuvent conférer à l'hôte bactérien un avantage sélectif
(protection contre d'autres phages, capacité à coloniser différentes niches et à survivre dans ces
environnements, capacité souvent associée à la virulence (Taylor et al. 2019)).
58
Figure 12. Les différents types de cycles de vie des phages. Tiré de (Weinbauer 2004).
Par conséquent, les morons sont indirectement impliqués dans le maintien des phages qui les
codent (Hendrix et al. 2000). Toutefois, les gènes phagiques codant pour les protéines Acr (anti-
CRISPR) sont souvent classés parmi les morons, bien qu'ils affectent directement le cycle
phagique (Borges et al. 2017). Enfin, il est à noter que certains morons interviennent en première
ligne dans la virulence de bactéries pathogènes, les exemples les plus connus étant probablement
les morons codant la shiga-toxine, la toxine cholérique ou encore la toxine diphtérique (Cumby
et al. 2012). L'identification des morons dans les phages tempérés est souvent aisée puisque ces
gènes sont rarement conservés entre phages apparentés et leur intégration dans le phage perturbe
souvent la synténie des gènes (Figure 13). En effet, le génome des phages, et plus
particulièrement celui des tempérés, peut être considéré comme une combinaison spécifique de
modules de gènes impliqués dans une même fonction. On distingue les modules d'intégration,
de régulation de la lysogénie, de réplication /recombinaison, de structure et d'assemblage et de
lyse. Les études de génomique comparative des génomes phagiques, et plus anciennement la
recherche d'hybrides entre phages apparentés, montrent que ces modules géniques sont
échangeables entre phages : on emploie ainsi le terme de mosaïque pour définir la structure des
génomes de phages (pour revue, (Hatfull 2008), Figure 13).
59
Figure 13. Alignements du génome de différents phages tempérés apparentés à P2. Cette figure
illustre la composition modulaire des phages (fonction des gènes homologues indiquée en haut). Elle
illustre également la notion de mosaïcisme puisqu'on peut voir que dans ces modules tous les gènes ne
sont pas nécessairement conservés. Ceci suggère des transferts plus ou moins complets de gènes dans
ces modules entre phages au cours de leur évolution. L'acquisition de morons peut perturber la synténie
des gènes (ici en position 2), ou se produire en extrémité de module fonctionnel (position 1). Enfin cette
figure pose la question de la nature des événements de recombinaison ayant lieu aux bornes de ces
différents modules puisque les morons intégrés et leurs extrémités ne sont pas homologues. Cette figure
suggère que des évènements de recombinaison illégitime, en plus de la recombinaison homologue,
pourraient être à l'origine de l'acquisition des morons et de l'interchangeabilité des modules phagiques
(tirée de (Wiles et al. 2013)).
Ce mosaïcisme est plus important chez les tempérés que chez les virulents, les échanges de
gènes au cours de leur évolution y étant plus importants (Mavrich et al. 2017). L'insertion d'un
gène de fonction différente dans ces modules, ou à leur extrémité, permet facilement d'émettre
l'hypothèse que ce gène est un moron.
Le mosaïcisme observé dans les génomes phagiques et l'acquisition de morons ont pour
origine des évènements de recombinaison entre phages ou entre phages et génome bactérien. Le
type de recombinaison utilisé a longtemps été un sujet d'étude important et âprement discuté.
En effet, la longueur limitée des séquences aux bornes de ces modules, souvent correspondantes
aux bornes de gènes, et leur similarité souvent restreinte entre phages phylogénétiquement
éloignés suggèrent que les évènements de recombinaison entre ces modules soient de nature
illégitimes ou tout au plus homéologues (séquences recombinées non parfaitement homologues)
(Juhala et al. 2000).
60
2) La recombinaison hom(é)ologue chez les phages et la famille des Sak4
Comment les phages recombinent-ils ? Bien qu'ils puissent tirer parti de la recombinase RecA
de leur hôte bactérien, les phages codent souvent pour leur propre machinerie de recombinaison
(pour revue, (Menouni et al. 2015)). Les recombinases phagiques ont été classées en trois super-
familles : les Rad52-like, les Rad51-like et les Gp2.5-like (Lopes et al. 2010). De manière
intéressante, les phages codant pour une recombinase ont plus de chance d'avoir acquis
récemment au cours de leur évolution des gènes d'un phage non apparenté, montrant le rôle de
ces recombinases dans l'évolution et le mosaïcisme de leurs génomes (de Sousa et al. 2021).
Les gènes codant des recombinases ne sont pas retrouvés de façon aléatoire dans les phages.
En effet, les phages dont le génome est inférieur à 20kb en sont dépourvus (incluant tous les
phages à génome à ARN simple et double brin ainsi que ceux à ADNsb). Pour les autres, des
phages à ADNdb exclusivement, environ 60% d'entre eux, en contiennent (Lopes et al. 2010).
De plus, la nature de la recombinase (très peu de phages codent pour plusieurs d'entre elles)
codée par un phage reflète le type de cycle infectieux. Les recombinases Rad52-like sont ainsi
essentiellement rencontrées dans les génomes de tempérés alors que les orthologues de Rad51
sont majoritairement rencontrés dans les virulents. Les recombinases Gp2.5-like sont quant à
elles retrouvées dans les deux types de phages (Lopes et al. 2010). Gp2.5 du phage virulent T7,
Redβ du phage tempéré λ et UvsX du phage virulent T4, tous infectant E. coli, sont
respectivement les recombinases des familles Gp2.5-like, Rad52-like et Rad51-like les plus
étudiées.
Gp2.5 de T7 est une protéine de fixation à l'ADNsb essentielle à la réplication de T7 et
impliquée également dans sa recombinaison (pour revue, (Hernandez et al. 2019)). Cette
protéine est un homodimère, chaque monomère étant constitué i) d'un domaine de fixation à
l'ADNsb (OB-fold) similaire à celui de la SSB bactérienne, à l'exception de la présence d'une
longue hélice α et ii) d'une queue C-terminale acide de 28 résidus rappelant la TIP des SSB
bactérienne ((Hollis et al. 2001) et voir précédemment). Cette dernière est essentielle à la
formation de particules infectieuses et est requise pour interagir avec l'ADN polymérase et
l'hélicase-primase de T7 (Kim et al. 1994). Contrairement à la SSBEc, Gp2.5 présente une
activité d'appariement simple-brin (SSA, voir Figure 8), potentiellement dépendante de l'hélice
α spécifique à Gp2.5 (Rezende et al. 2003, Lopes et al. 2010), mais sa capacité à tolérer une
divergence entre les séquences à apparier reste inconnue. Cette protéine, dans un extrait
cellulaire de E. coli et en présence de l'exonucléase gp6 de T7, est à l'origine de la réparation in
vitro de CDB (Yu et al. 2001).
61
Redβ du phage lambda a été particulièrement bien étudiée depuis sa découverte en 1966
((Radding 1966, Radding et al. 1966) et pour revue (Brewster et al. 2020)). Cette protéine
présente une activité SSA, ATP-indépendante (Kmiec et al. 1981) permettant in vivo
l'appariement de deux ADNsb pouvant présenter une divergence de séquence jusqu'à 17% (Li
et al. 2013) sur quelques dizaines de nucléotides. Le module de recombinaison du phage λ est
également 100 fois plus efficace que RecA dans la formation de recombinants entre séquences
inversées présentant une divergence de 22% (Martinsohn et al. 2008). Redβ est directement
responsable d'une grande partie des évènements de recombinaison observés sur des séquences
présentant 12% de divergence entre le phage λ et le prophage défectif Rac chez E. coli, RecA
n'ayant qu'un effet limité (De Paepe et al. 2014). Ainsi, les propriétés de Redβ, partagées par
d'autres recombinases Rad52-like, permettent d'expliquer son rôle dans le mosaïcisme et les
échanges de gènes par recombinaison homéologue entre phages.
Cette capacité de Redβ, et d'autres Rad52-like phagiques comme son homologue RecT du
phage Rac, à apparier deux ADNsb plus ou moins complémentaires, est à l'origine du
développement d'un outil d'édition du génome particulièrement efficace chez E. coli et les
bactéries apparentées, appelé le recombineering, au début des années 2000 par les équipes des
Dr. Francis Stewart et Don Court (pour revue (Court et al. 2002)). Brièvement, cet outil repose
sur l'appariement d'un oligonucléotide (porteur d'une ou plusieurs mutations) avec le brin retardé
au niveau de la fourche de réplication du chromosome bactérien (Figure 14). Redβ augmente de
104 à 105 fois cet évènement extrêmement rare dans un contexte sauvage (Ellis et al. 2001). Un
ADNdb peut également être utilisé, permettant par exemple d'introduire une cassette de
résistance à un antibiotique. Dans ce cas, l'expression ectopique du module de recombinaison
complet du phage λ est requise. Ce module contient redα codant pour une exonucléase 5'-3'
interagissant avec Rebβ. Redα génère des extrémités d'ADNsb 3' sortantes sur l'ADNdb utilisé
(ou dégrade l'intégralité de l'un des deux brins) afin que Redβ se charge sur l'ADNsb généré et
promeuve l'appariement simple brin avec une région complémentaire sur le chromosome au
niveau du brin retardé. Un autre gène du module de recombinaison, gam, intervient aussi dans
ce processus en codant pour une protéine inhibant l'activité de l'exonucléase RecBCD (Karu et
al. 1975), protégeant ainsi la molécule d'ADNdb transformée dans la bactérie avant sa prise en
charge par le couple Redα-Redβ. Bien que le modèle de fonctionnement du recombineering à
partir d'ADNsb soit bien admis par la communauté (Court et al. 2002), celui à partir d'ADNdb
reste sujet à discussion ((Brewster et al. 2020) et Figure 14). Nous verrons ci-dessous que ces
modèles sont continuellement mis à jour et que la protéine SSB de l'hôte bactérien a été
récemment mise en évidence comme acteur de la recombinaison dépendante de Redβ.
62
Figure 14. Recombinaison
dépendante du système Red
du phage λ. Le
recombineering. A. Modèle
du recombineering simple
brin. L'oligonucléotide couvert
de Redβ est apparié à la
séquence homéologue
(mutation d'intérêt en jaune)
sur le brin retardé. B, C et D.
Modèles de recombineering
double-brin nécessitant la
maturation de la molécule
d'ADNdb par Redα soit
uniquement aux extrémités
(B), soit seulement sur un brin
(C et D). Des modèles
d'appariement d'un ADNsb
maturé complètement avant
son appariement (C) ou
parallèlement à la dégradation
du brin non complémentaire
(D) ont été proposés (Figure
tirée de (Weller et al. 2014)).
La superfamille des Rad51-like est composée de deux familles de recombinases. Les
recombinases de type UvsX sont des orthologues des recombinases RecA et Rad51. UvsX est
ainsi capable de catalyser la réaction d'invasion et d'échange de brins (pour revues, (Liu et al.
2010, Morrical 2015)). Comme pour RecA, UvsX nécessite des cofacteurs pour catalyser cette
réaction. La formation d'extrémités d'ADNsb est assurée par l'exonucléase de T4 (Gp46/47).
Ces extrémités sont rapidement fixées par la SSB du phage (Gp32) et le chargement de UvsX,
ATP-dépendant, va nécessiter l'intervention de UvsY, une protéine médiatrice de la
recombinaison (RMP pour Recombination Mediator Protein, homologue fonctionnel de
RecOR), interagissant avec UvsX et capable de lever la barrière Gp32. La réaction d'invasion
de brin peut alors avoir lieu. Celle-ci est suivie par l'étape de migration de branche, étape
facilitée en présence de l'hélicase UvsW (Gajewski et al. 2011).
La deuxième famille est composée des recombinases de type Sak4. Le premier gène sak4 a
été initialement identifié via la recherche de mutations permettant à des prophages infectant
Lactococcus lactis d'échapper au système AbiK de leur hôte, un système de défense inhibant
l'infection. Quatre groupes de mutations dans les gènes, nommés sak, sak2, sak3 et sak4, ont été
63
identifiés. Les trois premiers codent pour des recombinases de type Rad52 et par analogie il a
été proposé une fonction de recombinase au produit de sak4 (Bouchard et al. 2004). La capacité
d'une Sak4 à promouvoir des évènements de recombinaison in vivo a été validée plus tard en
montrant que l'expression du gène sak4 du phage PA73 infectant Pseudomonas aeruginosa est
capable de promouvoir des évènements de recombineering à partir d'ADNsb, aussi efficacement
que UvsX de T4 mais bien moins (<1000 fois) que Redβ (Lopes et al. 2010). Est-ce que cette
activité de recombineering faible est une propriété intrinsèque à cette enzyme, ou Sak4 requiert-
elle un (ou des) cofacteur protéique pour l'aider dans cette activité ?
D'autre part, Sak4 est constituée du domaine cœur de RecA et de Rad51, un domaine
impliqué dans la fixation et l'hydrolyse de l'ATP ainsi que dans la fixation à l'ADN. Ce domaine
est également retrouvé dans les paralogues eucaryotes (ou archéens) de Rad51, impliqués dans
la formation du filament de Rad51 sur l'ADNsb et dans sa stabilisation (pour revue, (Bonilla et
al. 2020); Figure 15). Sak4 est dépourvue du domaine N-terminal de RecA, notamment des 30
premiers résidus qui sont impliqués dans l'interaction entre les protomères de RecA dans les
filaments hélicoïdaux formés par cette protéine (Story et al. 1992). Sak4 est également
dépourvue du domaine C-terminal de RecA contenant un deuxième site de fixation à l'ADN
impliqué dans la réaction d'invasion et d'échange de brin (Yang et al. 2020), suggérant que Sak4
n’est pas capable de catalyser ces deux réactions. Aucune autre étude n'a été réalisée sur cette
mini-RecA et le mécanisme lui permettant d'apparier deux ADNsb entre eux reste à caractériser.
Une première partie de ma recherche actuelle, résumée ci-dessous, vise donc à caractériser le
mécanisme de recombinaison dépendant de Sak4 du phage HK620 infectant E. coli et à identifier
l'ensemble des acteurs impliqués dans ce processus.
3) Autres fonctions des recombinases phagiques
La fonction première d'une recombinase est d'assurer la réparation des CDB. Comme nous
l'avons vu, cette propriété est utilisée par les phages pour assurer leur évolution via des transferts
de gènes. Cette propriété peut également être utilisée pour une autre fonction qui, à l'inverse du
transfert de gènes et du mosaïcisme, n'est pas conservée entre phages. En effet, un rôle plus ou
moins important dans la réplication du génome a pu être identifié pour certains phages. Un
mutant redβ produit par exemple environ cinq fois moins de phages λ au cours d'un cycle lytique
(De Paepe et al. 2014), alors que la recombinase Gp35, une autre recombinase de type Rad52
produite par le phage virulent SPP1 infectant B. subtilis, est essentielle à la réplication du
génome phagique (pour revue, (Weigel et al. 2006)).
64
Figure 15. La protéine Sak4. A. Alignement de Sak4 avec différentes recombinases de la superfamille
Rad51-like. B. Modèle de structure 3D de Sak4 et comparaison avec les structures de différentes
recombinases de cette superfamille, tirée de (Lopes et al. 2010).
Ce rôle essentiel de Gp35 serait lié à sa capacité, via son activité SSA, à promouvoir la transition
de la réplication en cercle roulant (σ) de SPP1 à partir d'une forme réplicative bidirectionnelle
de type θ (Ayora et al. 2002). La réplication en cercle roulant permet la production de
concatémères requis pour l'empaquetage des chromosomes phagiques dans les capsides. Dans
le cas de λ, cette transition ne semble pas être liée à la recombinaison, mais plutôt à des
changements d'activité transcriptionnelle au niveau de l'origine de réplication du phage
(Takahashi 1977, Narajczyk et al. 2007). Du côté des recombinases de type Rad51, UvsX est
requise pour l'initiation de la réplication recombinaison-dépendante du phage T4 (George et al.
2001, Morrical 2015). Il apparaît donc une hétérogénéité dans le rôle de ces recombinases au
niveau de la réplication des phages, en cohérence avec l'absence de recombinases dans 40% des
phages à ADNdb (>20kb).
65
4) La recombinaison illégitime chez les phages
Comme déjà mentionné, l'absence de régions homologues, aux bornes d'un certain nombre
d'évènements de recombinaison identifiés dans les génomes phagiques, a longtemps laissé
supposer que la recombinaison chez les phages pouvait aussi être illégitime (Hendrix et al. 1999,
Hendrix et al. 2000, Juhala et al. 2000, Morris et al. 2008). La présence d'un gène codant pour
une protéine homologue à la protéine Ku bactérienne dans le génome de certains
mycobacteriophages et son implication, avec la LigD de l'hôte bactérien, dans la
recircularisation du chromosome phagique après infection, a été une première preuve de
recombinaison illégitime chez les phages (Pitcher et al. 2006). Cependant, la forte similarité de
séquence de cette Ku phagique avec la Ku bactérienne et son absence dans tous les autres phages
séquencés à ce jour suggèrent que le gène codant pour Ku a été acquis récemment par ces
mycobactériophages en infectant des mycobactéries, famille de bactéries compétentes en NHEJ.
Des orthologues phagiques plus lointains de la protéine Ku bactérienne et partageant le
domaine cœur de cette dernière ont toutefois été identifiés (voir Figure 9A). Ces orthologues
présentent in vitro des propriétés de fixation et de protection de l'ADNdb très similaires à Ku.
La plus étudiée, la protéine Gam du phage Mu (dénommée par la suite Mu-Gam, à ne pas
confondre avec la Gam de λ) inhibe l'activité de RecBCD en se fixant aux extrémités double-
brins de l'ADN (Williams et al. 1981, Akroyd et al. 1986a, Akroyd et al. 1986b, Abraham et al.
1990, d'Adda di Fagagna et al. 2003). Cette capacité de Mu-Gam à se fixer efficacement aux
DSB est d'ailleurs à l'origine de la production d'un outil permettant de visualiser les DSB in vivo
et de mesurer la fréquence de tels évènements chez E. coli (et dans des cellules humaines) dans
différentes conditions de croissance (Shee et al. 2013). Mu-Gam a été initialement proposée
comme étant une protéine intervenant dans la transposition du phage Mu (Goosen et al. 1982).
Cependant, l'absence d'extrémités d'ADNdb dans les différentes étapes de ce mécanisme et la
présence d'orthologues de Mu-Gam dans d'autre phages tempérés à cycle lysogénique sans
transposition suggèrent que Mu-Gam est impliquée dans un autre processus. L'absence
d'homologues de LigD chez les phages ne permet toutefois pas de conclure quant à un rôle d'une
Mu-Gam dans la recombinaison illégitime de type NHEJ.
66
Travaux de recherche en cours et projets
1) Caractérisation de l'activité de recombinaison de Sak4 du phage HK620
1.1) Identification de la machinerie de recombinaison impliquant Sak4 (Hutinet et al.
2018)
Un gène codant pour une Sak4 est présent dans plus de 20% des phages codant pour une
recombinase, faisant de ce gène de recombinaison le deuxième plus abondant, derrière les gènes
codant une RAD52-like (50%, (Lopes et al. 2010)). Une approche in vivo a montré que la Sak4
du phage PA73 présente une activité de recombineering permettant l’intégration de molécules
d’ADNsb au niveau des fourches de réplication actives chez les bactéries (Lopes et al. 2010).
Toutefois, cette Sak4 ne présente qu'une activité limitée, similaire à celle d'UvsX, et très
inférieure à la recombinase de type RAD52 Redβ (Lopes et al. 2010). Est-ce que ce type
d'activité est une spécificité des RAD52-like, ou d'autres cofacteurs sont-ils requis pour que
Sak4 soit efficace ? Cette activité de recombineering est-elle synonyme d'une activité de SSA
pour Sak4, comme proposé pour Redβ ? Enfin, Sak4 est-elle capable de réaliser, à l'instar de
ses paralogues RecA et UvsX, des évènements d'échanges de brins, des étapes essentielles à la
Réparation des DSB Dépendante d'Homologie de séquence (HDR). Ces différentes questions
ont fait l'objet du travail de thèse de Mr Geoffrey Hutinet, encadrée par M. A. Petit avant mon
arrivée dans l'équipe.
G. Hutinet avait initié la caractérisation in vitro de la Sak4 du phage PA73 présentant une
étiquette en N-Terminale destinée à faciliter sa purification, dont la présence s'est révélée par
la suite essentielle au maintien de la solubilité de cette Sak4. Cependant, il s'est avéré que cette
étiquette modifiait les activités de cette protéine. J’ai donc repris ce travail en purifiant et
caractérisant une Sak4 non étiquetée d'un autre phage (HK620, phylogénétiquement proche du
phage P22 et infectant E. coli). J'ai montré que cette protéine (Sak4HK620) requiert de l'ATP pour
se fixer à l’ADNsb et qu'elle ne se fixe pas à l'ADNdb. Sak4HK620 présente une activité de SSA
in vitro, ATP-dépendante, et limitée par rapport à UvsX, RecA et Redβ. Cependant, comme
pour RecA et Redβ, Sak4 est capable d'apparier deux oligonucléotides présentant jusqu'à 20%
de divergence.
Via la dissection du module de recombinaison, nous avons montré que Sak4HK620, comme
son homologue chez PA73, présente une activité de recombineering faible (fréquence d'environ
3.10-7, c’est-à-dire 15 fois au-dessus du recombineering spontané), indépendante de RecA, mais
que la co-expression du gène sak4 et de celle du gène situé immédiatement après lui dans
l'opéron, stimule fortement cette activité de recombineering (fréquence de 10-5, similaire à celle
67
obtenue avec le module de recombinaison de λ). La recherche de fonction à ce second gène via
l'utilisation de l'outil Phagonaute (Delattre et al. 2016) a montré i) qu'il code pour une protéine
présentant une homologie lointaine avec la SSB bactérienne (nommée SSBHK620) et ii) qu'un
gène sak4 et un gène ssb-like sont très souvent co-occurrents chez les phages et proches l'un de
l'autre sur le génome. La stimulation de l'activité SSA de Sak4HK620 est dépendante de la
présence des six derniers acides-aminés de SSBHK620, des résidus similaires à ceux de la TIP de
la SSBEc et impliquée dans les interactions protéine-protéine (voir précédemment). Le module
de recombinaison de HK620 est capable d'apparier un oligonucléotide présentant jusqu'à 12%
de divergence avec son homologue sur le brin retardé, comme le module de recombinaison de
λ, faisant de Sak4 une recombinase potentiellement à l'origine du mosaïcisme des génomes
phagiques l'exprimant.
J’ai montré que SSBHK620, bien que moins affine, présente des propriétés de fixation à
l'ADNsb similaires à celle de la SSBEc et qu'elle stimule fortement l'activité SSA de Sak4HK620
in vitro. Cette dernière propriété est remarquable puisque l'activité SSA de RecA est a contrario
inhibée par SSBHK620, comme elle l'est par la SSBEc, la conséquence pour RecA étant sa
dépendance vis-à-vis de protéines médiatrices de la recombinaison pour assurer son chargement
sur l'ADNsb. De même, l'activité SSA des recombinases phagiques caractérisées jusqu'alors
n'était pas connue pour être dépendante d'une protéine de type SSB.
La stimulation de l'activité SSA de Sak4HK620 est dépendante de la partie C-terminale de
SSBHK620, comme observé pour le recombineering in vivo. J’ai caractérisé le mécanisme
moléculaire de cette stimulation de Sak4HK620 par SSBHK620 en montrant que ces deux protéines
interagissent sur l’ADN, de façon dépendante du C-terminus de SSBHK620.
Comme nous venons de le voir, Sak4 présente certaines similarités fonctionnelles avec
RecA, dont elle partage le domaine central impliqué dans la fixation et l'hydrolyse de l'ATP.
Cependant, RecA n'est pas capable de réaliser l'activité de recombineering simple-brin in vivo.
Une autre différence notable que nous avons montrée est que, à l'inverse de RecA et SSBEc,
Sak4HK620 et SSBHK620 sont incapables de promouvoir la réaction d'échange de brins in vitro, et
que le duo Sak4HK620/ SSBHK620 est environ 500 fois moins efficace que RecA pour recombiner
un ADN exogène via conjugaison. Enfin, Sak4 n'interfère pas sur l'activité d'échange de brins
de RecA.
Cette étude nous a permis de montrer que Sak4 est une recombinase ATP-dépendante
capable d'apparier in vitro et in vivo des molécules d'ADNsb (SSAP pour Single Strand
Annealing Protein). D'un point de vue évolutif et fonctionnel, Sak4 est une recombinase très
intéressante, à mi-chemin entre une RMP et une recombinase de type RecA catalysant la
68
réaction d'échange de brins. En effet, Sak4 partage la fonction de SSAP avec des RMP chez les
eucaryotes (RAD52), les bactéries (RecO) et les phages (UvsY). Ces RMP sont capables de
stimuler l'activité de leurs recombinases respectives (Rad51, RecA et UvsX) lorsque la SSB
correspondante (RPA, SSB et Gp32) bloque leur accessibilité à l'ADNsb (pour revues,
(Kowalczykowski 2015, Morrical 2015)). Ces RMP interagissent avec leurs SSB respectives,
de la même manière que Sak4. Cette dernière n'est cependant pas une RMP puisqu'elle n'affecte
pas l'activité de RecA. D’un autre côté, Sak4, qui serait structurellement une mini-RecA (Lopes
et al. 2010), ne présente qu'une partie de l'activité de recombinaison de RecA, i.e. le SSA, mais
pas l'échange de brin. A l'inverse de RecA, Sak4 ne requiert pas de RMP puisque c'est sa propre
SSB qui lui permet d'être recrutée sur l'ADNsb. Ceci soulève la question suivante : est-ce que
le gain de la fonction d'échange de brins par RecA (via son domaine C-terminal, absent chez
Sak4) pourrait avoir eu pour conséquence une perte d'interaction avec la SSB bactérienne et
donc la nécessité d'avoir recours à des RMP pour accéder à son substrat ADN ? En ce sens,
nous avons pu montrer que les SSBBs et SSBEc sont aussi capables de stimuler (bien que moins
efficacement que SSBHK620) l'activité SSA de SAk4HK620 (résultats non publiés).
1.2) Etude mécanistique de la réaction de recombinaison catalysée par Sak4HK620 et
SSBHK620 (en cours)
Une partie de mon projet de recherche actuel vise désormais à décrire le mécanisme de
recombinaison dépendant de Sak4 par des approches mutationnelles (mutants ATPase) et
structurales, réalisées en collaboration avec les Dr. E. Le Cam (IGR, Villejuif) et F. Ochsenbein
(CEA, Saclay). J'ai tout d’abord montré de manière surprenante que Sak4 est une ATPase DNA-
indépendante (non observé avec RecA) et que sa fixation à l'ADNsb augmente son activité
ATPasique (propriété partagée avec RecA). La présence d'un nucléotide dérivé de l'adénosine
promeut la formation de filaments de Sak4 (Figure 16A). La taille de ces structures dépend de
la nature du nucléotide utilisé, allant d'une dizaine de nm en présence d'ADP à plusieurs µm en
présence d'ATPγS, un nucléotide faiblement hydrolysé par Sak4 (10 fois moins que l'ATP en
présence d'ADNsb). RecA forme également des filaments (ainsi que d'autres structures
quaternaires, non visualisées avec Sak4), mais ces derniers ne requièrent pas la présence de
nucléotides (Williams et al. 1986). Au contraire même, l'ATP (mais pas l'ATPγS) inhibe la
formation de ces filaments (Flory et al. 1982).
69
Comme RecA, Sak4 forme des nucléofilaments sur l'ADNsb (Figure 16B). Ces structures
requièrent la présence d'ATP mais pas son hydrolyse. Cependant, un mutant ATPase - de Sak4
présente une affinité plus faible pour l'ADNsb.
Figure 16. Structures formées
par Sak4. A. Formation de
filaments de Sak4 en présence de
différents nucléotides dérivés de
l'adénosine et de MgCl2 en
microscopie électronique par
transmission (MET). En leur
absence les grilles sont vierges de
toutes structures visibles. B.
Formation de nucléofilaments de
Sak4 sur l'ADNsb (flèche rouge
pour exemple) en présence de
MgCl2 et d'ATP. Le substrat
ADN est une molécule double
brin de 600pb (flèche bleue pour
exemple) étendue par une
extension 5' simple brin (flèche
jaune pour exemple).
Nous cherchons à savoir désormais si cette diminution d'affinité est liée à un défaut de fixation
sur l'ADN ou à une diminution de la stabilité du nucléofilament. Enfin, j'ai pu montrer que
l'activité d'hydrolyse de l'ATP était nécessaire à la réaction d'appariement de brin catalysée par
Sak4, cette même activité ne nécessitant pas d'ATP pour RecA (Hutinet et al. 2018). Malgré
plusieurs tentatives de cristallisation, aucune piste n'a pour le moment été trouvée pour obtenir
des cristaux de Sak4. Nous travaillons actuellement à caractériser la fixation de SSBHK620 sur
l'ADN par MET. L'ensemble de ces nouvelles données associé à notre précédente étude nous
permet de proposer deux modèles non exclusifs permettant de décrire le mécanisme utilisé par
Sak4 pour réaliser la recombinaison par SSA (Figure 17). L'utilisation de la microscopie à super
résolution et/ou la MET nous permettra de trancher entre ces deux modèles.
Des études récentes, postérieures à notre publication sur Sak4, montrent que le duo SSAP
phagique / SSB n'est plus une spécificité de Sak4. En effet, le domaine C-terminal de Redβ du
phage λ présente une structure 3D proche de celle de la protéine Orf du même phage (Caldwell
et al. 2019), connue pour interagir avec la SSBEc (Maxwell et al. 2005) et faciliter le chargement
de RecA sur des ADNsb recouverts de SSB en absence de RecFOR (Sawitzke et al. 1992,
Poteete 2004). Comme Orf, Redβ interagit physiquement avec la SSBEc et un modèle de
recombineering simple-brin mis à jour, proche de celui présenté dans la Figure 17 (panneau de
B
A
70
droite), a été proposé ((Caldwell et al. 2019). La SSB, présente sur le brin retardé, faciliterait
l'évènement d'appariement entre ce brin et un oligonucléotide recouvert de Redβ, via une
interaction entre les deux protéines.
Figure 17. Modèles mécanistiques de l'appariement simple brin par Sak4HK620 et sa SSBHK620. Ces
deux modèles se différencient par la manière dont sont prise en charge les deux molécules d'ADNsb
complémentaires. A gauche, SSBHK620 se fixe en premier et attire Sak4HK620, facilitant ainsi la fixation de
cette dernière sur l'ADN (monomérique ou déjà polymérisée ?) et ainsi la réaction d'appariement. A
droite, chaque molécule d'ADN est prise en charge par une protéine distincte et l'affinité des deux
protéines l'une pour l'autre facilite le mécanisme SSA dépendant de Sak4HK620.
Des données récentes montrent que la surexpression de la SSBEc augmente l'efficacité de
recombineering simple-brin (mais pas double-brin !) par Redβ, chez E. coli elle-même, mais
aussi chez des espèces bactériennes phylogénétiquement éloignées, dans lesquelles l'expression
de la SSAP seule ne permet pas ou très peu d'évènements de recombinaison de ce genre, et
semblent conforter ce nouveau modèle mécanistique (Filsinger et al. 2021). Il est à noter que
cette dernière étude va sans doute permettre de développer et d'uniformiser l'outil de
recombineering à de multiples espèces bactériennes, jusqu'alors réfractaires au système λ-Red.
De même, nous serons amenés à rechercher si le couple Sak4-SSB d'HK620 peut-être
transférable chez d'autres espèces bactériennes. Le but ici n'est pas tant de rentrer en
compétition avec le système λ-Red mais plutôt de proposer une alternative à ce système en ce
sens que le recombineering double-brin λ-Red-dépendant ne semble pas être transférable
(Filsinger et al. 2021). Le modèle de recombinaison catalysée par le phage λ propose que
l'exonucléase Redα dégrade l'ADNdb substrat et recrute Redβ sur l'ADNsb naissant.
71
Le couple Sak4HK620/SSBHK620 ne présente pas d'activité exonucléase et nous n'avons pas non
plus identifié d'activité hélicase, une activité qui aurait aussi pu permettre de générer de
l'ADNsb. Cependant, la co-expression de sak4HK620 et ssbHK620 permet de réaliser des
évènements de recombineering à partir d'ADNdb in vivo (résultat non publié). Ceci suggère
qu'E. coli code pour une (des) enzyme(s) capable(s) de préparer un ADNdb en vue de sa prise
en charge par Sak4-SSB. Nos premières études montrent que RecBCD est en partie impliquée,
mais que d'autres enzymes bactériennes peuvent intervenir. Les gènes phagiques à proximité
immédiate de sak4 et ssb sur le génome de HK620 ne sont pas impliqués dans ce processus
(non publié), mais d'autres gènes pourraient intervenir. Pour cela, je chercherai d'éventuels
partenaires à Sak4 et SSB en utilisant la méthodologie TAP, efficace pour identifier des
complexes de protéines phagiques (voir ci-dessous).
Pour finir, une autre question que l'on se pose sur Sak4HK620 concerne son rôle dans le
métabolisme du phage. Ce travail est réalisé avec la Dr. Mireille Ansaldi (Lab. de Chimie
Bactérienne, Marseille). Nous avons déjà montré que Sak4 n'est pas essentielle à la formation
de virions HK620 (non publié). Ce résultat s'est révélé surprenant suite à la mise en évidence
de l'essentialité de l'homologue de Sak4 codé par le phage tempéré φ11 infectant
Staphylococcus aureus (Neamah et al. 2017). Cette dernière étude propose que Sak4φ11 soit
requise dans la réplication du génome phagique en assurant la transition de la réplication θ à σ.
Nous devrons chercher à savoir si un mutant de sak4HK620 altère la production de virions et si
oui, identifier l'étape limitante du processus d'induction.
L'ensemble de ce projet de recherche fera l'objet d'une demande de financement à l'ANR en
2021.
2) Caractérisation du module de recombinaison du phage Gally d'E.coli LF82 et impact
sur la physiologie de son hôte bactérien
L'absence de recombinase dans plus de 40% des phages à ADNdb (>20kb, (Lopes et al.
2010)) et le fait que leur présence ait un impact variable sur le cycle de vie phagique (voir
précédemment) soulève la question d'un éventuel rôle de ces protéines dans la physiologie de
leur hôte bactérien. En d'autres termes, est ce que certaines de ces recombinases pourraient se
comporter comme des morons ? En effet, de par leur capacité à réparer des CDB, les
recombinases de phages tempérés pourraient en théorie être utilisées par leur hôte bactérien pour
améliorer leurs capacités de réparation des cassures générées suite à des stresses génotoxiques.
Bien sûr, ces recombinases, au même titre que les autres protéines impliquées dans le cycle
72
lytique des phages tempérés, ne sont pas produites à l'état lysogénique, tout du moins en
conditions classiques de laboratoire et dans les phages modèles étudiés jusqu'alors. Comme nous
l'avons vu précédemment, un certain nombre de gènes phagiques échappent au contrôle
transcriptionnel du phage. Dans quelle mesure cette observation ne pourrait-elle pas s'étendre à
d'autres gènes du phage, et notamment des gènes codant pour des recombinases ?
Quel sens cela aurait-il pour les bactéries ? En conditions de croissance compatibles avec la
réplication, ces dernières disposent déjà d'un mécanisme de recombinaison homologue
dépendant de RecA pour réparer leurs CDB. Mais dans des conditions peu propices à la
réplication, et donc à la présence de régions homologues au sein d'une même cellule, nous avons
vu que seul 20 % des bactéries codent pour un système NHEJ. Ceci soulève la question des 80%
de bactéries restantes et la façon dont elles réparent leur ADN dans ces conditions. Comme
environ la moitié des bactéries séquencées à ce jour contiennent a minima un prophage
(Touchon et al. 2016), il serait possible que des mécanismes phagiques de recombinaison
illégitimes, ou des mécanismes ne nécessitant qu'une courte région d'homologie portée par la
même molécule d'ADN, comme le SSA, soient détournés par l’hôte bactérien à son profit pour
survivre.
L'étude récente de Battacharyya et al. tend à conforter cette hypothèse. En effet, la protéine
orthologue de Ku, Mu-Gam, du phage Mu, stimule in vitro spécifiquement l'activité de ligature
de la ligase réplicative LigA et de la ligase LigB de E. coli (Bhattacharyya et al. 2018). In vivo,
l'expression de mu-gam chez E. coli augmente la fréquence de réparation de plasmides linéaires
après leur transformation dans les cellules, ce qui est caractéristique d'un mécanisme de NHEJ.
De manière remarquable, une souche lysogène pour Mu présente, dans des conditions de
laboratoire, une meilleure viabilité en phase stationnaire, en milieu minimum ou en présence
d'un radiomimétique par rapport à une souche lysogénéisée avec un Mu dépourvu du gène mu-
gam (Bhattacharyya et al. 2018). Cette étude tend donc à montrer que Mu est capable d'induire
des évènements de recombinaison illégitime et que ceux-ci peuvent améliorer la survie de son
hôte bactérien dans des conditions de laboratoire où la RH serait limitée ou saturée. Cette
hypothèse peut-elle être étendue à d'autres homologues de Mu-Gam ? A d'autres protéines de
réparation des CDB comme les SSAP ? Dans des conditions plus proches des conditions
naturelles de vie de la bactérie ?
Pour répondre à ces questions, j'ai entrepris une collaboration avec le Dr. Olivier Espéli
(Collège de France, Paris). Ce dernier travaille sur la survie et la persistance induite en
macrophage de la souche entéropathogène E. coli LF82 impliquée dans la maladie de Crohn
(MC). Cette maladie provoque une inflammation chronique généralisée de l’appareil gastro-
73
intestinal humain dont les causes sont clairement multifactorielles, à la fois génétiques et
environnementales (Torres et al. 2017a). Une perturbation importante du microbiote intestinal
est observée chez ces malades, avec notamment une augmentation de la quantité
d’entérobactéries, dont les AIEC (Adherent-Invasive E. coli) ((Gevers et al. 2014, Nadalian et
al. 2020) et pour revues (Rolhion et al. 2007, Palmela et al. 2018)). Les AIEC, dont fait partie
LF82, sont suspectées de jouer un rôle actif dans la maladie. En effet, LF82 est capable de
survivre et de se multiplier dans les phagolysosomes des macrophages, malgré le pH acide, le
stress oxidant, la présence de protéases et de différents composés antibactériens. Dans cet
environnement, LF82 provoque la sécrétion de la cytokine TNF-α, marqueur principal de
l’inflammation des malades atteints de MC (Boudeau et al. 1999, Glasser et al. 2001, Carvalho
et al. 2009).
La survie de LF82 dans les macrophages dépend d'une capacité élevée de la bactérie à
surmonter les différents stresses rencontrés dans les macrophages (Palmela et al. 2018). Cette
survie dépend notamment de la réponse stringente et de la réponse SOS (Demarre et al. 2019),
cette dernière impliquant que LF82 subit des stresses génotoxiques dans les macrophages. Une
autre propriété de LF82 est sa capacité à entrer dans un état de persistance au cours de l'infection
en macrophage, un état au cours duquel une fraction d’une population bactérienne est apte à
résister à des antibiotiques, sans acquisition de gènes de résistance (Harms et al. 2016, Demarre
et al. 2019). Cette propriété pourrait être à la base des échecs thérapeutiques de la MC malgré
l’utilisation d’une antibiothérapie.
De manière remarquable, des données préliminaires, obtenues par l'équipe d'O. Espéli et la
nôtre, suggèrent que des gènes portés par un prophage de LF82, que nous avons nommé par la
suite Gally, sont impliqués dans la physiologie de la souche LF82 en macrophage. En effet, une
région du génome de Gally est moins propice à l’intégration d’un transposon dans des LF82
infectant des macrophages, par comparaison à des LF82 en croissance en milieu liquide. Cette
région contient trois gènes (encadré rouge dans la Figure 18A). Ceux-ci sont de plus surexprimés
lorsque LF82 infecte un macrophage en comparaison d'une croissance en milieu liquide et sont
également parmi les gènes les plus exprimés du prophage dans cette condition (Figure 18B).
L'ensemble de ces résultats préliminaires suggèrent un rôle de ces trois gènes dans la viabilité
de LF82 en macrophage. De manière inattendue, le profil des ratios d'expression des gènes de
ce prophage en macrophage suggère que le cycle lytique du prophage Gally n'est pas induit (les
gènes codant les répresseurs C2 (homologue au C1 de λ) et Mnt (également impliqué dans le
maintien de la lysogénie chez P22) sont sur-exprimés alors qu'une majorité des gènes de capside
sont sous-exprimés.
74
Figure 18. Le prophage Gally et l'expression de ces gènes dans la souche LF82 en macrophages. A. Génome du prophage Gally intégré dans la souche AIEC E. coli LF82. La couleur des gènes est
associée à leur fonction prédite (en jaune : régulation transcriptionnelle, en rouge : intégrase/excisionase,
en orange : métabolisme de l'ADN, en vert : capside et système d'empaquetage de l'ADN, en bleu sombre
: queue, en bleu clair : fibre de queue, en rose : lyse bactérienne, en gris : fonction inconnue). B. Ratio
de l'expression des gènes de Gally lorsque LF82 est internalisée en macrophages (6h post-infection)
comparée à celle des mêmes gènes lorsque LF82 est en culture liquide en milieu minimum. Chaque
histogramme correspond au ratio pour un gène phagique. Les trois gènes encadrés en rouge sont
potentiellement impliqués dans la survie de LF82 en macrophage (voir texte).
L'expression des 3 gènes d'intérêt semble donc, au moins en partie, échapper au système de
régulation transcriptionnelle du phage. Enfin, une souche LF82 curée du prophage Gally
(construite au laboratoire, Mr Jeffrey Cornuault, non publié) forme environ cinq fois moins de
persisteurs (bactéries persistantes) que la souche sauvage après infection en macrophages. Ce
dernier résultat corrobore d'ailleurs une étude du groupe du Dr. Kenn Gerdes qui a mis en
évidence un rôle des prophages portés par la souche E. coli K12 dans sa capacité à induire in
vitro la formation de persisteurs résistants à la ciprofloxacine (Harms et al. 2017).
Une analyse in silico de la région d'intérêt sur le génome de Gally montre qu'elle contient un
gène codant un homologue potentiel de Mu-Gam, un gène codant un homologue de la RecT du
phage Rac d’E.coli, une SSAP de la famille des RAD52-like (Hall et al. 1993, Lopes et al. 2010),
et un gène codant un homologue d'Abc1 du phage P22, potentiellement impliqué dans la
régulation de RecBCD (Murphy et al. 1987) (Figure 18A). Les fonctions prédites et la
modularité des phages, i.e. le regroupement de gènes dans le génome assurant une fonction
commune, suggèrent que les produits des trois gènes renommés mu-gam, recT et abc1 de Gally
Ab
c1
A
B
75
sont impliqués dans un mécanisme de recombinaison commun. Ce mécanisme serait inédit (si
les fonctions étaient conservées) car il ferait intervenir une protéine de NHEJ (Mu-Gam) et une
SSAP (RecT).
L’ensemble de ces données met en lumière un rôle inédit d’un prophage, et de ses gènes de
recombinaison, dans la viabilité de son hôte bactérien en macrophages et dans l’induction ou le
maintien de la persistance bactérienne induite dans cet environnement. La caractérisation i) du
mécanisme original de recombinaison impliquant des homologues potentiels de Mu-Gam, RecT
et Abc1, ainsi que ii) du lien existant entre recombinaison phagique et viabilité/persistance de
la bactérie en macrophage, ont défini les objectifs du projet de recherche de Mlle Pauline Misson,
l’étudiante dont je dirige la thèse depuis novembre 2018. Ce travail est intégré dans le projet
Persist3R financé par l’ANR (2019-2021; coordinateur : M.A Petit) dont le but est de
caractériser i) la réponse transcriptionnelle d'E. coli LF82 à l'établissement et à la sortie de la
persistance dans différentes conditions de croissance, ii) les dommages à l'ADN subits dans ces
conditions et les voies de réparation nécessaires au redémarrage de la réplication des persisteurs
et iii) l'effet des prophages hébergés par LF82 sur la viabilité et la persistance induite en
macrophages. Ce dernier aspect implique plus particulièrement notre équipe et notamment le
travail de thèse de P. Misson dont les premiers résultats sont résumés ci-dessous.
2.1) Caractérisation du mécanisme de recombinaison impliquant les produits des
trois gènes recT, mu-gam et abc1
Sur la base de leurs similarités lointaines avec des protéines de recombinaison de phages
connues, P. Misson a étudié les capacités de recombineering (voir précédemment) d’une souche
de E. coli exprimant les gènes recT, mu-gam et/ou abc1 de Gally. Elle a montré i) que
l'expression de recT est nécessaire et suffisante pour réaliser du recombineering in vivo à partir
d'un oligonucléotide et ii) que la co-expression de recT et mu-gam est requise pour le
recombineering à partir d'ADNdb (Figure 19). Ce résultat suggère un rôle de Mu-Gam de Gally
dans la formation de molécules d’ADNsb à partir d’ADNdb dans un contexte cellulaire, et un
rôle inattendu de cette protéine dans la recombinaison homologue par SSA catalysée par RecT.
De manière également inattendue, P. Misson a montré que l'expression du gène mu-gam de
Gally n'influe pas sur le taux de ligature de plasmides linéaires aux extrémités cohésives (5' ou
3') et transformés chez E. coli, contrairement à ce qui a été montré pour son homologue potentiel
Mu-Gam du phage Mu (Bhattacharyya et al. 2018).
76
Figure 19. Mu-Gam de Gally est
impliquée dans la recombinaison
dépendante de RecT. Activité de
recombineering (taux de SSA, in vivo)
de RecT sur de l'ADNsb ou de
l'ADNdb utilisés comme source
d'édition du génome bactérien. Les
différents gènes de Gally exprimés (+)
ou non (-) de façon ectopique dans
notre souche test de recombineering
sont indiqués. Le module de
recombinaison de λ est utilisé comme
témoin. Les * indiquent la
significativité des résultats selon un
test de Student.
Parallèlement à ce travail, P. Misson a entamé la caractérisation biochimique des protéines
RecT et Mu-Gam. Pour ce faire, elle a développé les protocoles de purification de ces deux
protéines. RecT de Gally est une protéine multimérique et son degré d'oligomérisation (penta à
décamérique voire plus) dépend du milieux réactionnel (la présence de NaCl et MgCl2 tendant
à diminuer la multimérisation). Cette protéine se fixe à l'ADNsb et db en absence de MgCl2, la
présence de ce dernier inhibant préférentiellement son interaction avec l'ADNdb. Enfin, RecT
présente une activité SSA, similaire en efficacité à celle de Redβ dans nos conditions, stimulant
l'appariement de deux ADNsb complémentaires, faisant de RecT de Gally un homologue de
RecT du phage Rac.
Malgré de multiples essais d'expression dans diverses conditions de purification ou de co-
expression avec RecT, la Mu-Gam de Gally a toujours été produite sous forme de corps
d'inclusion, contrairement à son homologue chez Mu. P. Misson a donc développé un protocole
de purification en conditions dénaturantes, puis procédé à la renaturation de la Mu-Gam purifiée.
Le rendement très faible de purification de Mu-Gam sous forme soluble nous a quand même
permis de montrer que Mu-Gam de Gally est un tétramère en solution (Mu-Gam de Mu est un
dimère) qui se fixe préférentiellement à l'ADNdb plutôt qu'à l'ADNsb et qui stimule légèrement
l'activité SSA in vitro de RecT. Ce dernier résultat, non reflété dans les tests de recombineering
in vivo, démontre que ces deux protéines peuvent agir de concert dans un mécanisme de
recombinaison de type SSA lorsque le substrat initial est double brin, avec une Mu-Gam
strictement requise, mais aussi lorsqu'il est simple brin. Dans ce dernier cas, Mu-Gam
77
n'interviendrait que de façon modérée selon un mécanisme restant à identifier. Nous travaillons
à améliorer le rendement de renaturation de Mu-Gam afin de valider ces résultats préliminaires.
Aucune activité nucléase ou hélicase n'a pu être mise en évidence ni pour la Mu-Gam
renaturée ni pour RecT, suggérant que l'une ou l'autre de ces activités, selon le modèle actuel du
recombineering, est apportée par une troisième protéine avec laquelle Mu-Gam interagirait.
L'expression du gène abc1 n'affecte aucune des activités révélées par nos tests génétiques,
montrant qu'Abc1 de Gally n'est pas impliquée dans le SSA dépendant de RecT. Pour identifier
un éventuel troisième partenaire, nous avons adapté la méthodologie de TAP à LF82 et
caractérisé les complexes protéiques impliquant Mu-Gam ou RecT après induction du phage à
la ciprofloxacine (induction vérifiée via qPCR, voir ci-dessous). Les premiers résultats obtenus
récemment montrent que la purification d'une Mu-Gam étiquetée avec l'étiquette SPA entraîne
la co-purification d'une seule autre protéine phagique, RecT. Ainsi, ces deux protéines
pourraient interagir et cette interaction pourrait être nécessaire à l’activité de recombinaison de
RecT. P. Misson cherchera, une fois les conditions de purification de Mu-Gam optimales
identifiées, à confirmer cette interaction physique entre les deux protéines. De plus, elle
cherchera à expliquer la stimulation de l'activité SSA de RecT par Mu-Gam en comparant les
affinités relatives de RecT pour l'ADNsb et l'ADNdb en présence ou en absence de Mu-Gam.
Ceci nous permettra de proposer un premier modèle mécanistique pour la recombinaison par
SSA dépendante de ces protéines chez Gally dans une publication que P. Misson signera en
premier auteur.
Nous travaillons aussi à l'optimisation de la procédure TAP afin d'identifier une liste
exhaustive des contaminants classiques générés par cette méthodologie chez LF82, ce qui est un
pré-requis à l'identification des autres protéines interagissant avec Mu-Gam potentiellement
intéressantes pour l'activité de recombineeering de RecT. C'est à ma connaissance la première
étude de caractérisation de complexes protéiques impliquant des protéines phagiques au cours
de l'induction du cycle lytique in vivo. La faisabilité de la méthode sur des protéines de Gally
ouvre également de nouvelles perspectives pour la caractérisation de complexes impliquant des
recombinases d'autres familles (ou toute autre protéine de phage) et la compréhension des
mécanismes de recombinaison associés (ou d'autres processus phagiques).
2.2) Caractérisation des prophages de E. coli LF82
Pour comprendre le rôle éventuel des trois gènes recT, mu-gam et abc1 sur la physiologie
de leur hôte bactérien, une caractérisation préalable du prophage Gally et des autres prophages
78
de la LF82 est nécessaire. En effet, cinq prophages ont été identifiés au cours du séquençage du
génome de la souche LF82, dont un sous forme épisomale (tout d’abord appelé plasmide
pLF82) (Miquel et al. 2010). Cependant, aucune donnée n'a été publiée sur l'éventuelle
induction de ces prophages, ni sur leur capacité à infecter des bactéries, des activités qu'il est
important de connaitre si l'on veut comprendre la physiologie de LF82 en conditions de stresses
génotoxiques et sous l'effet de mutations.
P. Misson a caractérisé ces prophages en annotant leurs gènes (voir Figure 18A pour
l'exemple de Gally) et en les observant, après isolement ou non et amplification, par MET. Ainsi
Gally est un podovirus de la famille des P22-like, alors que Perceval et Tritos sont des
siphovirus proches de λ. Cartapus, un P2-like, n'a pu être isolé. Enfin le phage Cyrano,
extrachromosomique, est un autre siphovirus de la famille des SSU5-like (Figure 20).
Figure 20 : Photographies des phages de la souche E. coli LF82 par MET. *: vésicules.
Le séquençage du virome de la souche LF82, obtenu après croissance en milieu riche, nous
a permis de montrer que Gally réalise de la transduction latéralisée. Ce processus serait lié à la
réplication du génome du phage avant son excision du chromosome bactérien et aboutirait soit
à l'encapsidation du phage, soit à des portions de chromosome bactérien, présents à une seule
des extrémités du prophage et de longueur similaire à celle du génome phagique (Chen et al.
2018). De manière remarquable, le prophage Perceval, à environ 140kb de Gally sur le
chromosome bactérien, est dans une région génomique amplifiée par la transduction latéralisée
dépendante de Gally. Son génome est ainsi internalisé dans des capsides produites par le phage
Gally. La quantité de virions contenant de l'ADN de Perceval est environ deux fois plus faible
dans une souche dépourvue de Gally que dans une souche sauvage, suggérant que près de la
moitié des génomes de Perceval identifiés par séquençage proviennent de transduction
latéralisée ! Le mécanisme moléculaire à la base de l'encapsidation du génome de Gally complet
dans ce processus transductionnel reste inconnu, mais P. Misson a pu montrer qu'il ne requiert
79
pas ses gènes de recombinaison (recT, mu-gam et abc1), même si leur inactivation affecte la
quantité de virions Gally produits (environ 4 fois moins).
La transduction latéralisée, comme les autres types de transduction, permettrait
théoriquement d’assurer le transfert de gènes de LF82 vers d'autres souches bactériennes
sensibles à Gally. Cependant, pour le moment, nous n'avons pas été en mesure de trouver une
souche bactérienne sensible à ce phage. Même une souche LF82 dans laquelle Gally a été
supprimé, et une souche d'E. coli TD2158, sensible au phage HK620 phylogénétiquement
proche de Gally et appartenant à la famille des P22, sont insensibles à Gally, soulevant la
question de l'activité de ce phage. Les multiples tentatives d'isolement de Gally ont toutefois
permis d'isoler des phages hybrides résultant d'évènements de recombinaison entre les génomes
de Gally et de Perceval (Figure 20). Ces hybrides constitués des modules de structure,
d'assemblage et de lyse de Perceval ont les mêmes capacité d'infection que le phage Perceval.
Ces résultats soulèvent la question de savoir si Gally est un phage en cours de domestication
par son hôte. La souche LF82 aurait-elle un intérêt particulier à garder Gally dans son génome
? La question se pose également pour Cartapus (dont nous n'avons pas trouvé les conditions
d'induction) et Cyrano (qui n’a pas d'hôte bactérien identifié). A l'inverse, P. Misson a montré
que Perceval et Tritos sont des phages infectieux, capables d'infecter une souche d'E. coli
MG1655.
Gally est le prophage le plus induit (au moins 100 fois plus que les autres phages de LF82)
lors d'une croissance en milieu riche sans ajout d'inducteurs particuliers (5.108 phages /mL de
milieu de culture ayant contenu des LF82 en phase exponentielle de croissance). L'ajout de
ciprofloxacine augmente d'un log environ cette induction, montrant que Gally est probablement
inductible par le SOS. La même observation a été réalisée pour Perceval et Cyrano, même si la
concentration en phages obtenue après induction à la ciprofloxacine reste encore environ 100
fois plus faible que celle de Gally. Tritos et Cartapus ne semblent pas être induits en présence
de cette drogue. Comme il a été mentionné précédemment, la viabilité de LF82 en macrophage
dépend en partie de la réponse SOS (Demarre et al. 2019) et le profil d'expression des gènes de
Gally dans cet environnement suggère qu'il n’est pas induit (Figure 18B). Ces résultats sont à
première vue contradictoires avec nos résultats indiquant que la réponse SOS induit le cycle
lytique de Gally, de Perceval et de Cyrano in vitro et soulève la question de l'induction de ces
phages dans la LF82 en macrophage. Pour y répondre, une approche de quantification par qPCR
des phages produits dans les macrophages est en cours de développement par P. Misson. Cette
approche sera complétée par la visualisation des bactéries induisant les phages dans les
macrophages. Cette visualisation est rendue possible grâce à l'utilisation de souches LF82 dont
80
les gènes codant pour les protéines de capside majeures des différents phages ont été fusionnés
à la GFP. Nous avons montré qu'en culture en milieu riche et 30 minutes après l'ajout de
ciprofloxacine, environ 50% des bactéries induisent le cycle lytique de Gally et de Perceval, ce
chiffre étant au moins 100 fois plus faible en absence de l'inducteur. Ces résultats indiquent que
ces souches sont utilisables pour estimer la fréquence d'induction de ces deux phages dans les
macrophages.
L'ensemble des résultats générés au cours cette étude fera l'objet d'une prochaine publication
que P. Misson signera en premier auteur.
2.3) Etude du rôle potentiel joué par les protéines phagiques RecT, Gam et Abc1 sur la
survie et la persistance aux antibiotiques induite en macrophages de E. coli LF82
Les résultats préliminaires obtenus par P. Misson au cours de son stage de M2 indiquaient
que les gènes recT, mu-gam et abc1 pourraient être impliqués dans la persistance aux
antibiotiques induite en macrophage de la souche LF82. En effet, après 1h en macrophage, bien
que la viabilité d’une souche inactivée pour ces trois gènes ne soit pas affectée par rapport à la
souche sauvage, la persistance du mutant à la céfotaxime (céphalosporine de troisième
génération utilisée dans le traitement des abcès pouvant survenir chez des patients atteints de la
maladie de Crohn) est trois fois moins importante que celle d’une souche sauvage. Ce résultat
est similaire à celui obtenu avec une souche LF82 curée du phage Gally et suggère que le défaut
de persistance dans cette dernière souche est lié à l'absence des gènes de recombinaison de
Gally plutôt qu'à d'autres gènes phagiques. P. Misson a de plus montré que la céfotaxime
n’influe pas sur l’induction des prophages de E. coli LF82, et que l’effet observé est donc
directement dépendant de l’expression de ces trois gènes.
Cependant, à la lumière de la publication récente de l'équipe d'O. Espéli montrant i)
l'impact positif de la réponse SOS et de RecA sur la survie de LF82 sur les phases tardives de
l'infection (après 6 heures) et ii) l'augmentation de la persistance à la céfotaxime d’un facteur
dix entre 1h et 24h post-infection (Demarre et al. 2019), nous devons confirmer nos résultats
en étudiant l’impact des gènes recT-gam-abc1 de Gally sur l’évolution de la survie et de la
persitance de E. coli LF82 au cours du temps. Pour savoir si l’expression de recT, mu-gam et
abc1 est suffisante à l’établissement d’une augmentation de la survie et/ou de la persistance
induite en macrophage, nous effectuerons également des infections, selon le même protocole,
avec une souche E. coli MG1655 sauvage et une E. coli MG1655 exprimant les trois gènes
d'intérêt en ectopique. La MG1655 ne possédant aucun prophage actif et ne produisant que très
81
peu de persisteurs résistants à la céfotaxime, les effets observés sur sa physiologie seront
directement dépendants de l’expression des gènes recT, mu-gam et abc1. Enfin, nous
évaluerons par microscopie la fréquence d’expression de protéines RecT et Gam fusionnées à
des marqueurs fluorescents parmi les E. coli LF82 en macrophage. Nous localiserons les
cellules les exprimant dans les macrophages et nous comparerons ce profil de localisation à
celui de l'expression du gène de capside de Gally fusionné au gène gfp. Cette analyse nous
permettra de confirmer, ou non, que l'induction des gènes de recombinaison de Gally est bien
dissociable de l'induction des gènes de structure de ce phage dans une population de bactéries
infectant le macrophage, comme suggéré par l'analyse transcriptomique réalisée par O. Espéli
(Figure 18B). Ce travail sera réalisé par P. Misson sous réserve de l'obtention d'une bourse de
4ème année de thèse et nous permettra de démontrer pour la première fois que i) des phages
d’AIEC peuvent jouer un rôle dans le processus de virulence de leur hôte bactérien E. coli LF82
et ii) que des gènes phagiques peuvent être impliqués dans la persistance bactérienne aux
antibiotiques.
82
V- Conclusion
Alors que les recombinases Redβ (de type RAD52) et UvsX (RAD51) ont fait l'objet de
nombreuses études ayant permis, tout du moins en partie, de comprendre le mécanisme
moléculaire dans lequel elles interviennent, beaucoup de travail reste à faire pour élucider les
mécanismes faisant intervenir Sak4 mais également Gp2.5. Pour Sak4, tel qu'indiqué, je
poursuis sa caractérisation biochimique et m'intéresse désormais aux étapes synaptiques et post-
synaptiques impliquant l'hydrolyse de l'ATP. Pour Gp2.5, nous venons d'initier une
collaboration avec le laboratoire du Dr. Laurent Debarbieux (Institut Pasteur, Paris), afin de
caractériser un homologue lointain de Gp2.5 de T7, potentiellement impliqué dans un
mécanisme de recombinaison à l'origine d'un évènement de changement d'hôte, donc d'un
intérêt primordial pour la phagothérapie.
A côté de ces recombinases, il a été récemment identifié un autre moyen de faire de la
recombinaison chez les phages via le NHEJ et la protéine Mu-Gam. Nous travaillons à la
caractérisation de l'une de ces protéines.
Pour complexifier encore un peu plus les choses, nous avons vu que Mu-Gam de Gally
coopère avec une recombinase RecT (de type RAD52) dans un mécanisme de recombinaison
par SSA. Ainsi, il apparait que les machines moléculaires déjà décrites par le passé ne sont pas
"figées" et que les briques les constituant peuvent être interchangeables, au moins dans une
certaine mesure. Ceci permet d'avoir à disposition un arsenal de protéines de réparation de
l'ADN dont les différentes combinaisons opérationnelles aboutissent à leur sélection dans les
phages contemporains. Ceci laisse aux chercheurs, intéressés par la compréhension de ces
mécanismes, une liste de sujets de recherche quasi inépuisable, sans compter les mécanismes
de recombinaison encore à découvrir étant donnée l'énorme quantité de phages restant à
caractériser.
83
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