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Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
Tatiane de Pinho Pastor
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados
para a Síndrome de Lynch
Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira
Rio de Janeiro
Setembro 2014
ii
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
Tatiane de Pinho Pastor
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados
para a Síndrome de Lynch
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Oncologia do
Instituto Nacional de Câncer José de
Alencar Gomes da Silva como parte
dos requisitos para obtenção do grau
de Mestre em Oncologia
Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira
Rio de Janeiro
Setembro 2014
iii
P293v Pastor, Tatiane de Pinho.
Variantes de seqüência no gene MSH2 em pacientes
selecionados para a Síndrome de Lynch. / Tatiane de Pinho
Pastor. – Rio de Janeiro, 2014.
xviii, 94 f.: il. color.
Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional
de Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2014.
Orientador: Miguel Ângelo Martins Moreira.
1. Neoplasias Colorretais Hereditárias sem Polipose.
2. Gene MSH2. 3. Síndrome de Lynch. I. Moreira, Miguel
Ângelo Martins. II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar
Gomes da Silva. III. Título.
CDD 616.99435
iv
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
Tatiane de Pinho Pastor
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados
para a Síndrome de Lynch
Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira
Aprovada em:
EXAMINADORES:
Dr. Marcelo Alex de Carvalho – Presidente
Drª. Tatiana de Almeida Simão
Drª. Cláudia Vitória de Moura Gallo
Drª. Cynthia Chester Cardoso – Suplente I
Dr. Fernando Regla Vargas – Suplente II
Rio de Janeiro
Setembro 2014
v
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a
Síndrome de Lynch
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Tatiane de Pinho Pastor
A Síndrome de Lynch (SL) ou Câncer Colorretal Hereditário Não-Poliposo (HNPCC) é uma doença
autossômica dominante associada a mutações na linhagem germinativa nos genes do Sistema
Mismatch Repair (MMR) de reparo do DNA e é responsável por aproximadamente 5% de todos os
casos de câncer colorretal (CCR). A maioria das mutações ocorre nos genes MSH2 (50%) e MLH1
(40%), e gera uma proteína truncada e não funcional. Mais de 513 alterações diferentes nos genes
de reparo foram relatadas, sendo que 10% das encontradas no gene MSH2 envolvem a substituição
de um aminoácido. O sistema de reparo MMR corrige erros de pareamento base\base, além de
inserções e deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo
de replicação, além de estar envolvido nos processos de recombinação, na geração da diversidade
imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA. A inativação mutacional dos genes MMR
leva a um reparo insuficiente do DNA e ao desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos
níveis MSI. Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade
precoce, além de possuírem um risco aumentado de desenvolver tumores extracolônicos. O
principal objetivo desse estudo foi identificar variantes de sequência no gene MSH2 em pacientes
selecionados para Síndrome de Lynch de acordo com os critérios de Amsterdam ou Bethesda
modificados, avaliando a sensibilidade e especificidade dos mesmos para a presença de mutação. E
para isso, foram selecionados candidatos provenientes de quatro centros clínicos e desses pacientes
foram obtidos o sangue periférico para isolamento do DNA genômico. Os éxons do gene MSH2
foram amplificados e sequenciados através dos sequenciamentos automático de Sanger e
sequenciamento de nova geração (NGS), além do sequenciamento da região promotora, para a
identificação de mutações na linhagem germinativa. A partir da análise de variações de ponto no
gene MSH2, identificamos um total de 6 variantes patogênicas ou potencialmente patogênicas (c.
388_389delCA; c.1046C>G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G>A; c.2078G>A; c.2152C>T, sendo
essa última em quatro pacientes), representando 46.1% das variantes identificadas neste estudo em
9 pacientes, sendo que 6 preenchiam os critérios de Amsterdam e 3 preenchiam os critérios de
Bethesda, mostrando que os critérios de diagnóstico clínico são mais sensíveis e específicos para
identificar a presença mutações patogênicas no gene MSH2. Além disso, identificamos também 3
variantes novas, sendo que duas delas (c.1738_1741delGAAA; c.2078G>A) foram classificadas
como sendo patogênicas e uma não pode ser classificada (c.-185 C>A). Obtivemos uma frequência
total de variantes missense de 55.5%, seguido de 22.2% de mutações frameshift, 11.1% de mutações
nonsense e 11.1% de alterações sinônimas, além de alterações na região promotora e de íntron,
mostrando que o espectro de variantes do gene MSH2 é bastante heterogêneo, englobando diferentes tipos de alterações.
vi
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a
Síndrome de Lynch
ABSTRACT
Dissertação de Mestrado
Tatiane de Pinho Pastor
Lynch syndrome (SL) or Colorectal Cancer Hereditary nonpolyposis (HNPCC) is an autosomal
dominant disease associated with germline mutations in the MMR genes of the DNA repair system
and it is responsible for approximately 5% of all cases of colorectal cancer (CCR). Most of the
mutations occur in the MSH2 (50%) and MLH1 genes (40%), and generates a truncated,
nonfunctional protein. More than 513 different changes in repair genes have been reported, and
10% of those mutations can be found in the MSH2 gene causing substitution of one amino acid. The
repair system MMR corrects mismatched nucleotides, insertions and deletions that occur during
DNA synthesis, improving the fidelity of replication mechanism and it is also involved in the
process of recombination in the generation of immune diversity and specific cellular response to
DNA damage. Mutational inactivation of MMR genes leads to insufficient DNA repair and the
development of tumors characterized by high levels of MSI. SL patients often develop colorectal
cancer at an early age, and they also have an increased risk of developing extra colonic tumors. The
main objective of this study was to identify sequence variants in the MSH2 gene in selected patients
for Lynch syndrome according to the criteria of Amsterdam or modified Bethesda, assessing the
sensitivity and specificity for the presence of the mutation. And for that, candidates from four
clinical centers were selected, and genomic DNA were obtained from peripheral blood. The MSH2
exons and promoter region were amplified by PCR and sequenced by automatic DNA Sanger-
sequencing and by Next Generation Sequencing. From the analysis of variations in the extent of
MSH2 gene, we identified a total of 6 variants pathogenic or potentially pathogenic (c.
388_389delCA; c.1046C> G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G> A, c.2078G> A; c .2152C> T, the
latter being in four patients), representing 46.1% of the variants identified in this study in 9 patients,
6 fulfilled the Amsterdam criteria and three met the criteria of Bethesda, showing that the criteria
for clinical diagnosis are more sensitive and specific for the presence of pathogenic mutations in
the MSH2 gene. In addition, we identified three new variants, two of which
(c.1738_1741delGAAA; c.2078G> A) were classified as pathogenic and one could not be classified
(C-185 C> A). In the present study, we obtained an overall frequency of 55.5% missense variants,
followed by 22.2% frameshift mutations, 11.1% nonsense mutations of and 11.1% of silent changes,
and alterations in the promoter region and intron, showing that the spectrum of variants of the MSH2
gene is very heterogeneous, encompassing different types of changes.
vii
Este trabalho foi realizado na Divisão de Genética da
Coordenação de Pesquisa do Instituto Nacional de
Câncer José de Alencar Gomes da Silva, sob
Orientação do Dr. Miguel Ângelo, e contou com apoio
Financeiro da FAPERJ, CNPq e INCT-Câncer.
viii
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todas as pessoas que de alguma forma foram importantes para
o desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu orientador Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira pelos ensinamentos e
direcionamentos que conduzem a minha formação profissional e que acrescentaram muito no
desenvolvimento deste projeto.
A toda minha família, em especial meus pais, minhas irmãs e meus sobrinhos, pelo
estímulo constante nessa jornada, sempre me incentivando a continuar os meus estudos.
Agradeço também por toda a orientação que me deram durante a vida, e por me ajudarem a
enfrentar os obstáculos e transformações que a vida impõe.
Ao Thiago, por sempre estar ao meu lado nos momentos alegres e por me incentivar nos
momentos difíceis.
A todos os centros participantes deste projeto, em especial a Dra. Patrícia Prolla, por
estar sempre disposta a ajudar e a colaborar com qualquer coisa.
Gostaria de agradecer aos companheiros do laboratório, pela grande ajuda no dia-a-dia
e, principalmente, pelos nossos momentos de descontração. Um agradecimento especial à Shay,
Ayslan, Carol, Karla e Albert por todo auxílio durante os experimentos.
As minhas amigas da faculdade, Kélvia e Bia, um muitíssimo obrigada. Mesmo nos
encontrando tão pouco, saibam que sempre serão minhas amigas e que podem contar comigo
quando quiser!
Aos pacientes participantes, sem os quais este trabalho não teria sido realizado, e aos
seus familiares, por entenderem a importância das investigações genéticas.
Por fim, um agradecimento às instituições de fomento: CNPq, FAPERJ e INCT-Cancer.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Adenina
ADP Difosfato de Adenosina
AP-1 Proteína Ativadora 1
ATP Trifosfato de Adenosina
APC Gene da Polipose Adenomatosa Familiar
APAF Polipose Adenomatosa Familiar Atenuada
ATR Gene da Ataxia Telangiectasia
BRAF V-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B
BER Reparo por excisão de bases
C Citosina
º C Grau Celsius
CIN Instabilidade Cromossômica
CIMP Fenótipo metilador de ilhas CpG
CpG Regiões do DNA onde os nucleotídeos citosina e guanina ocorrem um ao lado
do outro
CCR Câncer Colorretal
dNTP Desoxirribonucleotídeo Fosfatado
DAB Diaminobenzidina
dsSNP Banco de dados de polimorfismos de nucleotídeos únicos
EDTA Ácido Triacético Diamino Etileno
EPCAM Epithelial Cell Adhesion Molecule
EXO1 Gene da exonuclease 1
F Forward ou senso
FAP Polipose Adenomatosa Familiar
FCCTX Câncer colorretal familial tipo X
G Guanina
HCPA Hospital das Clínicas de Porto Alegre
HNPCC Câncer Colorretal Hereditário Não Poliposo
HR Reparo por recombinação homóloga
H3BO3 Ácido bórico
IHQ Imunohistoquímica
INCA Instituto Nacional de Câncer
x
InSiGHT International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumors
IDLs Loops de inserção/deleção
JPS Síndrome da Polipose Juvenil Familiar
K-ras Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
LBP-1 Proteína líder tipo B1
MLH Homólogo de MutL
MSH Homólogo de MutS
MMR Reparo de Erros de Pareamento
MLH1 Human MutL Homolog 1
MSH2 Human MutS Homolog 2
MSH3 Human MutS Homolog 3
MSH6 Human MutS Homolog 6
MSI Instabilidade de microssatélites
MSI-H Instabilidade de microssatélites de alto grau
MSI-L Instabilidade de microssatélites de baixo grau
MSS Ausência de instabilidade de microssatélitess
MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógenos
MYH MutY human homologue (E.coli)
MgCl2 Cloreto de Magnésio
NaOH Hidróxido de sódio
NGS Sequenciamento de nova geração
NER Reparo por excisão de nucleotídeos
NHEJ Reparo por recombinação não-homóloga
NF-1 Fator de transcrição, também conhecido como proteína de ligação ao
elemento TGGCA
NF-E4 Nuclear Factor Erythroid 4
pb Pares de Base
PMS2 Postmeiotic Segregation Increased 2
PMS1 Postmeiotic Segregation increased 1
PJS Síndrome de Peutz-Jeghers
PI3K Fosfatidilinositol-3-Cinase
PCNA Antígeno nuclear de células em proliferação
P Braço curto de um cromossomo
xi
q Braço longo de um cromossomo
R reverse ou anti-senso
RER Fenótipo de erro de replicação
RFC Human replication factor C
SL Síndrome de Lynch
STK11 Serine/threonine kinase 11
SP-1 Stimulating Protein 1
SUS Sistema Único de Saúde
T Timina
TP53 Proteína tumoral 53
TGF-β Transforming growth factor beta
UV Variante não classificada
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Uvr DNA Helicase II
Wnt Wingless-type
xii
LISTA DE FIGURAS
1.1. A evolução do câncer ..................................................................................................... 2
1.2. Estimativa de incidência do câncer Colorretal para o ano de 2014 ............................... 3
1.3. Modelo Adenoma – Carcinoma ..................................................................................... 4
1.4. Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI ...................................... 5
1.5. Diagnósticos diferenciais para o CCR ............................................................................8
1.6. Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR ....................... 13
1.7. Espectro mutacional dos genes MMR .......................................................................... 14
1.8. Diferentes funções das proteínas de reparo MMR ....................................................... 16
1.9. MMR em eucariotos ..................................................................................................... 18
1.10. Localização do gene MSH2 no cromossomo 2 ............................................................ 18
1.11. Modelo estrutural do heterodímero MutSα .................................................................. 19
1.12. Região promotora do gene MSH2 ................................................................................ 20
3.1. Fragmento de 571 pb amplificado .............................................................................. 29
4.1. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do
éxon 1 A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração
c.23 C>T ..................................................................................................................... 38
4.2. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do
éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração
c.573C>T...................................................................................................................... 39
4.3. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do
éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com
a alteração c.388_389del CA ....................................................................................... 40
4.4. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do
éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a
alteração c.1046 C>G .................................................................................................. 40
4.5. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR
no éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a
alteração c.965 G>A .................................................................................................... 41
4.6. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR
do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com
a alteração c.2021 G>A ............................................................................................... 42
4.7. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do
éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a
alteração c.2152 C>T .................................................................................................. 44
xiii
4.8. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR
do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com
a alteração c.2078 G>A .............................................................................................. 44
4.9. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR
do éxon 11. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com
a alteração c.1738_1741del GAAA .............................................................................. 45
4.10. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da
região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2.
B) Sequência com a alteração c.-118 T>C em heterozigose.
C) Sequência com a alteração c.-118 T>C em homozigose ........................................ 46
4.11. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da
região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2.
B) Alteração c.-185 C>A em heterozigose .................................................................. 47
4.12. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR
no íntron 1. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com
a alteração a alteração c.211+9 C>G em heterozigose. C) Sequência
com a alteração c.211+9 C>G em homozigose ........................................................... 47
xiv
LISTA DE QUADROS
I.I. Critérios de Amsterdam I ..............................................................................................10
I.II. Critérios de Amsterdam II .............................................................................................11
I.III. Critérios de Bethesda modificados .............................................................................. 11
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1. Reagentes utilizados na reação de PCR e concentração utilizada para
cada reação ....................................................................................................... 26
Tabela 3.2. Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos éxons 1 a 16 do gene
MSH2 ............................................................................................................... 27
Tabela 3.3. Oligonucleotídeos utilizados para amplificar a região promotora do gene
MSH2 ............................................................................................................... 28
Tabela 3.4. Oligonucleotídeos e condições de ciclagem utilizados no sequenciamento de
nova geração para amplificar o éxon 5 do gene MSH2, para o paciente 3........ 33
Tabela 4.1. Variantes de sequência identificadas nos 53 pacientes selecionados para
Síndrome de Lynch .......................................................................................... 37
Tabela 4.2. Classificação da patogenicidade da variante T8M por análises in sílico .......... 39
Tabela 4.3. Classificação da patogenicidade da variante P349R por análises in sílico ....... 41
Tabela 4.4. Classificação da patogenicidade da variante G322D por análises in sílico ...... 42
Tabela 4.5. Classificação da patogenicidade da variante G674D por análises in sílico ...... 43
Tabela 4.6. Classificação da patogenicidade da variante C693Y por análises in sílico ....... 45
Tabela 4.7. Classificação da variante c.-118 T>C .............................................................. 46
Tabela 4.8. Classificação da variante c211+9 C>G ............................................................. 48
Tabela 4.9. Média de cobertura base-base dos 16 amplicons para os pacientes 3 e
GGC 1108 ......................................................................................................... 48
xv
Tabela 4.10. Resumo das alterações encontradas no Paciente 3 através do
Sequenciamento de nova geração ..................................................................... 49
Tabela 4.11. Resumo das alterações encontradas no Paciente GGC 1108 através do
Sequenciamento de nova geração ..................................................................... 50
Tabela 5.1. Resumo das variantes identificadas pelo sequenciamento de Sanger
e de nova geração no gene MSH2 e suas classificações de acordo
com o grupo InSiGHT e programas in sílico .................................................... 51
Tabela 5.2. Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com alteração
na região codificante do gene MSH2 ............................................................... 60
xvi
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1
1.1 Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento ..................................................... 1
1.2 Carcinogênese Colorretal ............................................................................................. 3
1.3 Padrões de CCR ............................................................................................................ 6
1.4 Síndrome de Lynch ....................................................................................................... 8
1.4.1 Características clínicas ................................................................................................. 9
1.4.2 Critérios de diagnóstico .............................................................................................. 10
1.4.3 Testes genéticos de rastreamento ............................................................................... 12
1.4.4 Bases genéticas de SL ................................................................................................... 14
1.5 Vias de reparo de DNA ................................................................................................ 15
1.5.1 Sistema MMR .............................................................................................................. 15
1.6 MSH2 ........................................................................................................................... 18
1.7 Estudos brasileiros sobre a SL .................................................................................. 21
OBJETIVOS .......................................................................................................................... 22
2.1 Geral ............................................................................................................................ 22
2.2 Específicos .................................................................................................................. 22
METODOLOGIA .................................................................................................................. 23
3.1 Pacientes ...................................................................................................................... 23
3.2 Testes de rastreamento .............................................................................................. 24
3.2.1 Teste de Instabilidade de microssatélites (MSI) ...................................................... 24
3.2.2 Teste de Imunohistoquímica (IHQ) .......................................................................... 24
3.3 Extração de DNA a partir de sangue periférico ....................................................... 25
3.4 Estimativas da concentração e da integridade do DNA .......................................... 25
3.5 Amplificação do gene MSH2 ..................................................................................... 25
3.5.1 Regiões codificantes do gene MSH2 .......................................................................... 26
xvii
3.5.2 Região promotora do gene MSH2 ............................................................................. 28
3.6 Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados
e do rendimento da reação ........................................................................................ 29
3.7 Purificação dos produtos da PCR ............................................................................ 30
3.8 Sequenciamento Automático de Sanger .................................................................. 30
3.9 Ferramentas eletrônicas ............................................................................................ 31
3.9.1 Análise das variantes missense ................................................................................. 31
3.9.2 Análise da região promotora .................................................................................... 32
3.10 Sequenciamento de Nova Geração – por síntese .................................................... 32
3.10.1 Preparação das bibliotecas ....................................................................................... 33
3.10.2 Geração dos clusters ................................................................................................. 34
3.10.3 Sequenciamento por síntese ..................................................................................... 34
3.10.4 Análise dos dados ...................................................................................................... 34
RESULTADOS ...................................................................................................................... 35
4.1 Caracterização dos pacientes incluídos ................................................................... 35
4.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento Automático de Sanger ....... 36
4.2.1 Variantes identificadas nas regiões codificantes do gene MSH2 .......................... 36
4.2.2 Características das variantes encontradas nas regiões codificantes ..................... 38
4.2.3 Variantes identificadas na região promotora do gene MSH2 ............................... 45
4.2.4 Características das variantes encontradas na região promotora ......................... 46
4.2.5 Variante identificada no íntron 1 do gene MSH2 .................................................. 47
4.3 Resultados do Sequenciamento de Nova Geração ................................................. 48
4.3.1 Média das coberturas dos amplicons ...................................................................... 48
4.3.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento de Nova Geração ............... 49
xviii
DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 51
5.1 Variantes de sequência patogênicas ou possivelmente patogênicas ...................... 52
5.2 Variantes de sequência não patogênicas .................................................................. 54
5.3 Variantes de sequência não patogênicas ou benignas ............................................ 57
CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 63
ANEXOS ................................................................................................................................ 75
Anexo 1 ................................................................................................................................... 75
Anexo 2 ................................................................................................................................... 79
Anexo 3 ................................................................................................................................... 81
Anexo 4 .................................................................................................................................... 82
Anexo 5 .................................................................................................................................... 83
Anexo 6 .................................................................................................................................... 84
Anexo 7 .................................................................................................................................... 85
Anexo 8 .................................................................................................................................... 86
Anexo 9 .................................................................................................................................... 87
Anexo 10 .................................................................................................................................. 88
Anexo 11 .................................................................................................................................. 89
Anexo 12 .................................................................................................................................. 90
Anexo 13 .................................................................................................................................. 91
1
INTRODUÇÃO:
1.1 Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento
O câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de doenças que
têm como característica comum o crescimento desordenado de células anormais com potencial
invasivo e metastático. Sua origem se dá por condições multifatoriais, envolvendo fatores
ambientais e hereditários, que podem agir em conjunto ou em sequência para promover o
desenvolvimento e/ou a progressão tumoral (INCA, 2014).
O câncer é resultado de um processo de múltiplas etapas, nas quais ocorrem alterações
genéticas e epigenéticas que levam ao surgimento de um clone de células com vantagens
proliferativas sobre as demais (HANAHAN; WEINBERG, 2000). Trata-se de uma doença
complexa e heterogênea tanto em nível celular quanto em molecular, como resultado de
profundas alterações metabólicas em programas genéticos que controlam a proliferação,
apoptose, diferenciação, interação célula-célula e interação célula-matriz extracelular.
As células tumorais podem apresentar múltiplas alterações genéticas, tais como
deleções, inserções e translocações (SALK; FOX; LOEB, 2010), perda de heterozigosidade e
instabilidade de microssatélites (FEARON, 2011). Estas alterações permitem que células
normais escapem da sua regulação e passem a obter um fenótipo maligno, através da ativação
de oncogenes e da inativação de genes supressores de tumor e genes de reparo do DNA (LIU;
BODMER, 2005).
Diversas mudanças fisiológicas podem ocorrer no processo de tumorigênese, tais como:
(i) autossuficiência em sinais de crescimento, levando a uma proliferação descontrolada; (ii)
evasão da morte celular programada; (iii) capacidade replicativa ilimitada, uma vez que as
células cancerosas possuem a enzima telomerase ativa, o que evita o encurtamento dos
telômeros; (iv) indução da angiogênese, promovendo a vascularização tumoral; e (v)
capacidade de invasão e metástase, possibilitando a formação de tumores secundários
(Fig.,1.1). (HANAHAN; WEINBERG, 2011).
2
Figura 1.1. A evolução do câncer. Os danos no DNA que não foram reparados desencadeiam diversas
modificações que levam à formação de tumores e metástase. Adaptado de SALK et al., 2010.
O câncer representa uma das principais causas de morte no mundo e constitui, assim,
um sério problema de saúde pública para países desenvolvidos e também para os em
desenvolvimento. Em 2030, estima-se que ocorrerão 21,4 milhões de casos novos de câncer e
13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do crescimento e do envelhecimento da
população (INCA, 2014).
O câncer colorretal (CCR), segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), é o terceiro
tipo de câncer mais comum no mundo em homens e o segundo mais comum nas mulheres. Mais
da metade dos casos são provenientes de regiões mais desenvolvidas, porém mais recentemente,
a incidência de CCR tem aumentado em áreas antes consideradas de baixo risco e acredita-se
que isso se deva ao envelhecimento da população, à adoção de estilos de vida mais sedentários
e ao consumo de dietas pouco saudáveis (FRANCO; FRANCO, 2005). Essa neoplasia é
considerada de bom prognóstico se a doença for diagnosticada em estágios iniciais e apresenta
uma sobrevida de aproximadamente 55%.
No Brasil, o CCR está entre as seis neoplasias malignas mais comuns sendo o terceiro
em mortalidade no sexo masculino e o segundo no sexo feminino (desconsiderando os tumores
de pele não-melanoma). Estimam-se, para 2014, 15.070 casos novos de câncer de cólon e reto
em homens e 17.530 em mulheres (INCA, 2014) (Fig., 1.2).
DANOS NO
DNA
ANGIOGÊNES
EVASÃO DA
APOPTOSE
INVASÃOMASSA
TUMORAL METÁSTASEAUTOSSUFICIÊNCIA
EM SINAIS DE
CRESCIMENTO
CAPACIDADE
REPLICATIVA
ILIMITADA
ANGIOGÊNESE
3
Figura 1.2. Estimativa de incidência do câncer colorretal para o ano de2014 (Fonte: Instituto Nacional
de Câncer, 2014).
Entre os fatores de risco conhecidos para esta neoplasia estão a dieta (rica em gordura e
com baixa ingestão de frutas, vegetais e cereais), o estilo de vida, a predisposição genética para
doenças inflamatórias intestinais, a história familiar e a idade, visto que tanto a incidência
quanto a mortalidade aumentam de maneira proporcional à idade (VAN DEN BRANDT;
GOLDBOHM, 2006; GIL; CASALI, 2011). E os fatores protetores mais importantes são a
atividade física (SAMAD et al., 2005) e o consumo de alimentos que contêm fibra, tais como:
frutas, hortaliças (legumes e verduras) e cereais integrais (INCA, 2014).
1.2 Carcinogênese Colorretal
A carcinogênese colorretal é a melhor compreendida dentre as neoplasias humanas e se
caracteriza pelo acúmulo de mutações e alterações epigenéticas em diversos genes associados
ao câncer: supressores de tumor, oncogenes e genes de reparo de erros de pareamento do DNA
(mismatch repair – MMR), resultando em expansão clonal e acarretando a formação de lesões
neoplásicas benignas ou malignas (FUJIWARA et al., 1998). Além destas mutações, acredita-
se que um fenótipo geneticamente instável seja necessário para o desenvolvimento do tumor
(MARKOWITZ, 1999).
O desenvolvimento de tumores colorretais se dá de forma progressiva e envolve
diferentes alterações que levam a uma transformação do epitélio colônico normal em
adenomatoso intermediário e posteriormente em adenocarcinoma (modelo adenoma –
carcinoma proposto por Fearon e Vogelstein) (GRADY; PRITCHARD, 2013) (Fig., 1.3).
4
Figura 1.3. Modelo Adenoma – Carcinoma. A carcinogênese colorretal está associada a três diferentes
vias de instabilidade. A via de instabilidade cromossômica (CIN) é caracterizada pela aquisição de
mutações no gene supressor tumoral APC, levando à sua “downregulação”, frequentes mutações de
ativação do oncogene K-RAS nos estágios iniciais da progressão tumoral, perda de heterozigosidade no
cromossomo 18q nos estágios mais avançados e mutação no gene supressor de tumor TP53. Em
contraste, tumores esporádicos com instasbilidade de microssatélites (MSI) frequentemente adquirem
mutações no oncogene BRAF, associadas com a metilação do promotor do gene de reparo MLH1 e
tumores associados com a Síndrome de Lynch, a MSI se dá por mutações em um dos genes do sistema
de reparo MMR. A via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) está associada com a hipermetilação
de promotores gênicos onde se encontram a maioria das ilhas CpG. Adaptado de GRADY;
PRITCHARD, 2013.
Três vias de instabilidade genômica e epigenética têm sido associadas com a
carcinogênese colorretal: a via da instabilidade cromossômica (CIN), da instabilidade de
microssatélites (MSI) e a via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) (GRADY;
PRITCHARD, 2013).
O fenótipo CIN é a forma mais comum de instabilidade genética, sendo associada a mais
de 85% dos casos de câncer colorretal (GRADY; CARETHERS, 2008; IMAI; YAMAMOTO,
2008). É caracterizada pela presença de alterações cromossômicas numéricas, múltiplas
alterações estruturais e o acúmulo de mutações somáticas em oncogenes como K-ras e genes
supressores de tumor como APC e TP53 (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Estudos mostram que
instabilidade cromossômica promove a progressão tumoral através do aumento da diversidade
clonal (GRADY, 2004) e é um marcador de pior prognóstico em CCR (POPAT et al., 2005;
WALTHER et al., 2008).
VIA CIN/MSS
VIA MSI
VIA CIMP
INATIVAÇÃO DOS
GENES MMR
EPITÉLIO
NORMAL
EPITÉLIO
DISPLÁSICO
ADENOMA
GRANDE
ADENOMA
PEQUENO CÂNCER
CÂNCER
METASTÁTICO
APC
K-RAS/
BRAF TP53
PERDA
DE 18q
5
A MSI ocorre em aproximadamente 15% dos casos de câncer colorretal e tumores com
essa instabilidade apresentam um cariótipo normal e um melhor prognóstico quando
comparados com tumores apresentando fenótipo CIN (POPAT et al., 2005; WALTHER et al.,
2008). Esse fenótipo está associado com pequenas inserções e deleções em sequências
repetitivas do genoma, conhecidas como microssatélites (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Os
mecanismos relacionados ao desenvolvimento deste fenótipo envolvem a inativação de genes
da família MMR tanto por metilação do DNA como por mutações somáticas (GRADY, 2004)
(Fig., 1.4). Indivíduos com câncer colorretal hereditário não-poliposo (HNPCC), também
conhecido como Síndrome de Lynch (SL), desenvolvem câncer colorretal MSI+ devido a
mutações na linhagem germinativa em um dos genes do sistema MMR. Em contraste, nos
tumores colorretais esporádicos a MSI se dá pelo silenciamento do gene MLH1- um dos genes
do sistema MMR - através da metilação do promotor (KANE et al., 1997).
Figura 1.4. Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI. Adaptado de BOLAND;
GOEL, 2010.
SÍNDROME DE LYNCH CRC ESPORÁDICO
(CIMP POSITIVO)
IINATIVAÇÃO DOS GENES MMR
SEGUNDO HIT (MUTAÇÃO,
DELEÇÃO E METILAÇÃO)
HIPERMETILAÇÃO DO
GENE MLH1 DO GENE
MLH1
MUTAÇÕES GERMITATIVAS E
EPIMUTAÇÕES NOS GENES MMR
MSI
MUTAÇÃO NO GENE K-ras
MUTAÇÕES FRAMESHIFT EM
GENES COM REPETIÇÕES
MICROSSATÉLITES
OUTRAS MUTAÇÕES
CÂNCER COLORRETAL
METILAÇÃO NO DNA
MUTAÇÃO NO GENE β-
CATENINA
MUTAÇÃO NO GENE BRAF
6
Alguns estudos mostram que estas duas vias (CIN e MSI) não são mutualmente
exclusivas, pois existem casos de CCR apresentando os dois fenótipos (CIN+/MSI+) (JONES
et al., 2005).
A instabilidade epigenética em CCR ocorre com a hipermetilação de promotores
gênicos, onde se encontram a maioria das ilhas CpG e a hipometilação global do genoma.
Aproximadamente 20% dos casos de CCR apresentam uma alta proporção de CpG com padrão
de metilação aberrante. Os mecanismos associados a CIMP ainda não são bem compreendidos,
mas alguns estudos sugerem uma associação entre a ativação do oncogene BRAF e a patogênese
de CCR CIMP+ (WEISENBERGER et al., 2006; BARAULT et al., 2008).
Além das vias de instabilidade, o acúmulo de mutações em genes específicos e a
consequente desregulação de vias de sinalização que controlam o desenvolvimento e a
progressão tumoral, também são fundamentais para o entendimento da patogênese do câncer
colorretal. As principais vias de sinalização associadas com o CCR são: a via Wnt/β-catenina,
a via do TGF- β, a via MAPK e a via PI3K (SIENA et al., 2009; WALTHER et al., 2009).
1.3 Padrões de CCR
O CCR é uma doença que atinge indiscriminadamente homens e mulheres e geralmente,
apresenta três padrões distintos: esporádico, hereditário e familial (Fig., 1.5).
A forma esporádica da doença, sem nenhuma predisposição hereditária ou familial,
representa cerca de 80% dos casos de CCR (DANTAS et al., 2009), e é comum em pessoas
com mais de 60 anos de idade. Nesses casos, os danos ao DNA são causados pela interação
com fatores ambientais (exposição a substâncias carcinogênicas e radiações) ou pelos efeitos
da idade, resultando numa instabilidade genômica através do acúmulo de múltiplas mutações
somáticas em uma célula.
O CCR hereditário decorre principalmente da existência de uma mutação na linhagem
germinativa em um gene de predisposição ao câncer. Os portadores herdam de um dos pais uma
mutação deletéria, geralmente em um gene supressor de tumor. As síndromes hereditárias
representam cerca de 10% de todos os casos de CCR, e nesse grupo, a síndrome mais comum
é a SL, sendo responsável por aproximadamente 5% de todos os diagnósticos de CCR (LYNCH
et al., 2005).
7
Outras síndromes hereditárias possuem um risco aumentado de desenvolver CCR, tais
como a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) e suas variantes (a FAP atenuada, a síndrome
de Gardner e síndrome de Turcot), a síndrome de Peutz-Jeghers, a polipose associada ao gene
MYH, o CCR tipo X, entre outras.
A Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) é uma síndrome com herança autossômica
dominante causada por mutações no gene supressor tumoral APC (Adenomatous Polyposis
Coli) em linhagens germinativas, tendo como principal característica clínica o surgimento de
múltiplos pólipos adenomatosos no cólon e/ou reto ainda na adolescência (LINDOR;
GREENE,1998) além de uma variedade de lesões extracolônicas. A FAP é uma síndrome rara,
sendo responsável por menos de 1% de todos os casos de CCR. Há ainda variantes da FAP, tais
como a síndrome de Gardner, que inclui a polipose colônica e duodeno-gástrica, além do
desenvolvimento de tumores desmóides e osteomas; a síndrome de Turcot, caracterizada pelo
desenvolvimento de tumores no SNC além do fenótipo típico da FAP e a FAP atenuada
(APAF), causada por mutações no gene APC em linhagens germinativas, sendo caracterizada
pela presença de menos de 100 pólipos adenomatosos com surgimento numa idade mais tardia,
aproximadamente 40 anos (SWATI; DENNIS, 2012).
A síndrome de Peutz-Jeghers (PJS) é causada por mutações no gene STK11 em
linhagens germinativas, que apresenta múltiplas funções incluindo a regulação do ciclo celular,
apoptose e polaridade celular. É caracterizada por lesões hipercrômicas palmares, plantares e
de mucosas que coexistem com os pólipos intestinais do tipo hamartoma, além de uma alta taxa
de tumores extracolônicos, incluindo tumores gástricos, de mama, pulmão, entre outros
(BEGGS et al., 2010).
Há também a polipose associada ao gene MYH (também chamado de MutYH), que está
envolvido no reparo de danos oxidativos no DNA. É uma síndrome autossômica recessiva,
caracterizada por múltiplos pólipos adenomatosos que são os precursores mais comuns do CCR
e também por pólipos serrilhados (SWATI; DENNIS, 2012). A síndrome da Polipose Juvenil
Familiar (JPS) que é uma doença rara, caracterizada pela presença de múltiplos pólipos
hamartomatosos juvenis localizados no cólon e reto, manifestando-se na infância
(WANDERLEY et al., 2009).
O termo CCR Familial tipo X (FCCTX) foi proposto por Lindor et al em 2005 para
descrever famílias que preenchiam o critério de Amsterdam I, mas apresentavam CCR com
estabilidade de microssatélites (MSS). Os membros da família que preenchiam os critérios
8
FCCTX apresentavam um risco aumentado de desenvolver CCR, porém o risco se tornava
menor quando comparados com famílias com CCR apresentando um fenótipo de alta
instabilidade de microssatélites (MSI-H). Famílias FCCTX apresentam um padrão de
transmissão autossômico dominante mas as bases genéticas dessa síndrome ainda não foram
estabelecidas (SWATI; DENNIS, 2012).
A terceira forma de CCR é o familial, que representa cerca de 10 a 20% de todos os
casos de câncer colorretal (VETTORE; CABALLERO, 2004). Nas famílias afetadas,
observam-se agregados de câncer que impedem a classificação desses casos como esporádicos,
mas a distribuição e características desses tumores não seguem o padrão observado nas
síndromes hereditárias. Nesse subgrupo de famílias, é encontrada uma associação entre fatores
ambientais e genéticos ainda pouco conhecidos, incluindo polimorfismos específicos e
mutações em genes de risco (ROCHA, 2005).
Figura 1.5. Diagnósticos diferenciais para o CCR. Adaptado de World Gastroenterology
Organisation (WGO), 2007.
1.4 Síndrome de Lynch
A Síndrome de Lynch é uma doença genética autossômica dominante com penetrância
de 80% causada por uma deficiência do sistema de reparo de malpareamento do DNA (Sistema
MMR). Nessa síndrome, os indivíduos afetados herdam uma mutação em um dos alelos destes
genes (mutação na linhagem germinativa), e uma mutação somática leva a inativação do outro
9
alelo (SANTOS et al., 2012), com consequente acúmulo de erros na replicação do DNA,
aumento da taxa de mutações e aceleração do processo carcinogênico.
Os primeiros relatos sobre a SL ocorreram em 1913, quando Warthin reportou pela
primeira vez o caso de uma família com predisposição para desenvolver câncer gastrointestinal
e ginecológico, sendo chamada de Família G e o seu pedigree foi usado como modelo para
identificar outras famílias com fenótipo similar. Em 1966, Henry Lynch descreveu duas
famílias (Família N e Família M) que apresentavam agregados tumorais similares, e atribuiu
essa característica a uma “síndrome de câncer familial” de origem autossômica dominante. O
termo Síndrome de Lynch foi criado em 1984 e foi subdividido em SL I e II para distinguir
famílias com predisposição somente ao CCR daquelas com predisposição a tumores adicionais,
respectivamente. (BOLAND; TRONCALE, 1984). Os primeiros dados moleculares da
síndrome começaram a surgir em 1993, onde foram identificados dois loci de suscetibilidade
ao câncer no cromossomo 2p, (PELTOMÄKI et al., 1993) e 3p (LINDBLOM et al., 1993).
Inicialmente a alteração molecular observada nos pacientes com a Síndrome de Lynch foi
chamada de fenótipo de erro de replicação (RER) e atualmente essa característica é chamada
de instabilidade de microssatélites (MSI) (THIBODEAU; BREN; SCHAID, 1993; DE LA
CHAPELLE et al.,2003). A associação entre a instabilidade de microssatélites em tumores
colorretais e defeitos no sistema MMR foi feita através de estudos genéticos feitos em bactérias
e leveduras (BOLAND, 2005).
1.4.1 Características clínicas
Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade
precoce (aproximadamente 45 anos), com predominância no cólon direito (proximal) (WEI et
al., 2011), além de possuírem um risco aumentado de desenvolver múltiplos tumores
sincrônicos (18% dos casos) ou metacrônicos (50% dos casos) e tumores extracolônicos, como,
por exemplo, tumores de endométrio e, com menores ricos, carcinoma de intestino delgado,
tumores no trato biliar, tumores urinários, câncer de ovário, tumores gástricos, câncer de
estômago, tumores cerebrais e tumores de glândulas sebáceas (LYNCH; DE LA CHAPELLE,
2003).
Os tumores na SL têm como características histopatológicas o excesso de muco
(carcinomas mucinosos), são pouco diferenciados, com células em anel de sinete e diploides.
Apresentam um comportamento menos agressivo, com menor potencial metastático e melhor
resposta à quimioterapia tendo assim melhor prognóstico do que os CCRs esporádicos e,
10
possivelmente, isso se deve ao excesso de infiltrado linfocitário envolvendo a lesão
(ALEXANDER et al., 2001; SMYRK et al., 2001).
Os indivíduos afetados não apresentam os múltiplos pólipos adenomatosos vistos na
FAP, o que dificulta a identificação clínica dos portadores da doença (ROSSI, 2009).
1.4.2 Critérios de diagnóstico
A história familiar foi um dos primeiros métodos para identificar pacientes em risco
(KASTRINOS; STOFFEL, 2014), já que estudos epidemiológicos mostraram que indivíduos
com familiares de primeiro grau com CCR têm um risco maior em desenvolver a doença
(COURA; ASHTON-PROLLA; PROLLA, 2005).
Em 1990, o International Collaborative Group on HNPCC (atualmente denominado
Intenational Society of Gastrointestinal Hereditary Tumors – InSiGHT) propôs a criação de
critérios para o diagnóstico clínico da síndrome (Critérios de Amsterdã I) (VASEN et al., 1991).
Os critérios de Amsterdã I (Quadro I.I) levam em consideração a história familiar do paciente
e a idade no diagnóstico, porém não incluem tumores extracolônicos, tornando-os
extremamente restritivos. Por esses motivos, os critérios de Amsterdã I foram reformulados em
1999 para a inclusão de outros tumores (Critérios de Amsterdã II) (Quadro I.II).
Como nem todos os pacientes com mutações em linhagens germinativas nos genes
MMR preenchem os critérios de Amsterdã, foram também estabelecidos critérios de suspeição
para a síndrome (Critérios de Bethesda I e II), que são muito mais sensíveis e servem para
identificar indivíduos candidatos a testes de rastreamento (SANTOS et al., 2012) (Quadro
I.III).
Quadro I.I. Critérios de Amsterdam I.
I. Famílias com 3 casos de CCR em que 2 dos indivíduos afetados são parentes de
1º grau do terceiro;
II. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações;
III. Famílias com 1 caso de CCR <50 anos de idade;
IV. Exclusão do diagnóstico de FAP.
11
Quadro I.II. Critérios de Amsterdam II
Quadro I.III. Critérios de Bethesda Modificados
I. Três ou mais familiares com neoplasia associada à SL (CCR ou câncer de endométrio,
intestino delgado, estômago, hepatobiliar, de pelve renal e ureter), sendo um parente de
1º grau dos outros dois;
II. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações;
III. Famílias com 1 ou mais casos de CCR diagnosticados antes dos 50 anos de idade.
Pelo menos um dos seguintes critérios:
I. CCR diagnosticado antes dos 50 anos de idade;
II. Presença de CCR sincrônico ou metacrônico, ou outro tumor do espectro Lynch
independentemente da idade;
III. CCR com histologia sugestiva de alta instabilidade de microssatélites antes dos 60
anos de idade;
IV. Probando com CCR e um ou mais familiares de 1º grau com tumor do espectro
Lynch sendo um dos tumores diagnosticado antes dos 50 anos;
V. Probando com CCR e dois ou mais familiares de 1º ou 2º grau com tumores do
espectro Lynch diagnosticados em qualquer idade.
12
1.4.3 Testes genéticos de rastreamento
Quando uma família preenche os critérios de Bethesda, existe indicação para realização
de testes genéticos do tecido tumoral, como a análise de instabilidade de microssatélites (MSI)
e o teste de imunohistoquímica (IHQ) (BURT et al., 2007). Se um ou ambos os testes derem
positivo é necessária a realização de análise de mutação genética nos genes MMR.
O teste de MSI apresenta uma sensibilidade de quase 100% e é positivo mesmo nos
casos em que a mutação nos genes MMR não é conhecida. No entanto, sua especificidade é
baixa, já que a MSI não é exclusiva da SL (LIVING, 2008).
O procedimento padrão para análise e identificação da instabilidade de microssatélites
proposto pelo InSiGHT, é o uso de cinco marcadores de microssatélites comparativamente entre
o tecido normal e tumoral. Dois destes são repetições mononucleotídicas (BAT25 e BAT26) e
os demais são repetições dinucleotídicas (D2S123, D5S346 e D17S250) (BOLAND et al.,
1998). Baseado no número de marcadores apresentando instabilidade, os tumores são
classificados em três grupos: alta instabilidade (MSI-H) para os que apresentam dois ou mais
marcadores instáveis (≥30-40%); baixa instabilidade (MSI-L), para os com apenas um
marcador instável (<30%); e estável (MSS) quando não apresenta nenhum marcador instável
(KASTRINOS; STOFFEL, 2014). De forma a aumentar a sensibilidade e especificidade do
teste, foram incluídos outros marcadores mononucleotídicos para detecção de MSI-H, como
NR-21, NR-24, e MONO-27 (BACHER et al., 2004).
O teste de IHC usa anticorpos monoclonais produzidos contra as proteínas codificadas
pelos vários genes do sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). A ausência de uma destas
proteínas no tecido tumoral pode ser indicadora de uma mutação na linhagem germinativa.
Porém, este teste pode gerar falsos positivo nos casos em que se têm proteínas truncadas e
inativas, sendo reconhecidas de forma errônea pelos anticorpos (COURA; ASHTON-
PROLLA; PROLLA, 2005).
A complementação da análise de genes MMR por sequenciamento completo das regiões
codificantes para identificação de mutações pontuais é atualmente a abordagem mais completa
para identificação de mutações e diagnóstico da SL (WAGNER et al., 2003; van der KLIFT et
al., 2005). Até recentemente, o sequenciamento de Sanger, ou de terminação de cadeia, foi o
método dominante e padrão ouro para o sequenciamento de DNA. Porém, o sequenciamento
de nova geração (Next Generation Sequencing - NGS) tem ganhado espaço, pois além
13
sequenciar milhões de fragmentos de DNA ao mesmo tempo, apresenta uma redução
impressionante no custo por megabase. Portanto, as tecnologias de sequenciamento de nova
geração, incluindo o sequenciamento total do genoma e o sequenciamento das regiões exônicas,
têm permitido a introdução de novas abordagens para facilitar a identificação de novos genes
responsáveis pela predisposição de doenças humanas, incluindo o câncer (JURADO et al.,
2014).
Uma combinação de abordagens de rastreamento para identificação do defeito MMR e
diagnóstico de mutações em linhagens germinativas tem sido utilizada por muitos
investigadores por ser considerada a abordagem mais custo-efetiva (PROLLA, 2010) (Fig.,
1.6).
Figura 1.6. Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR. Adaptado de
PROLLA, 2010.
AVALIAÇÃO DO HEREDOGRAMA:
SÍNDROME DE LYNCH
CRITÉRIOS DE AMSTERDAM
DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE
HNPCC
QUAL GENE MMR MUTADO?
SEQUENCIAMENTO GENE (S)
MMR SELECIONADO (S)
IHQ
IHQ
CRITÉRIOS DE BETHESDA
AUSÊNCIA PRESENÇA
MSI
POSITIVO NEGATIVO QUAL GENE
MMR
ALTERADO?
METILAÇÃO
NÃO METILADO METILADO
ENCERRAR
INVESTIGAÇÃO
14
1.4.5 Bases genéticas da SL
Apesar de sete genes terem sido associados com a SL (MSH2, MLH1, MSH6, PMS1,
PMS2, MLH3 e EXO1), a grande maioria dos pacientes com o fenótipo clínico apresenta
mutações em apenas quatro deles: MLH1 (mutL homolog 1) (40%), MSH2 (mutS homolog 2)
(50%), MSH6 (mutS homolog 6) (7%) e PMS2 (postmeiotic increased 2) (3-5%) (GROVER et
al., 2009).
A inativação mutacional dos genes MMR leva a um reparo insuficiente do DNA e ao
desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos níveis MSI, e esta é uma característica
encontrada em mais de 95% dos CCRs associados à SL (NAGASAKA et al., 2010).
Mais de 513 alterações diferentes em genes MMR já foram descritas, entretanto, muitas
vezes essas alterações são consideradas como variantes não classificadas (UV), pois suas
consequências funcionais e clínicas são desconhecidas, não podendo ser facilmente
classificadas como patogênicas ou neutras (BRYONY et al., 2012; STEINKE et al., 2013).
(Fig., 1.7). Segundo Santos e colaboradores (2012), a maioria das mutações nos genes de reparo
em pacientes com SL, gera uma proteína truncada e não funcional.
Figura 1.7. Espectro mutacional dos genes MMR. Adaptado de STEINKE et al., 2013.
MSH2
PATOGÊNICA
15
1.5 Vias de reparo de DNA
A manutenção da integridade genômica e a adaptação a estresses genotóxicos são
elementos fundamentais para garantir a sobrevivência de um organismo. O DNA pode sofrer
alterações por diferentes agentes, tanto endógenos, causados por alterações espontâneas
decorrentes da instabilidade das ligações químicas da molécula ou por alterações causadas por
produtos do metabolismo celular, quanto exógenos, associados a fatores ambientais. Frente a
estas lesões, uma complexa resposta celular é ativada com a finalidade de se preservar a
estabilidade genômica. A resposta ao dano no DNA envolve a detecção do sítio lesionado, a
amplificação do sinal através de uma cascata de proteína cinases e a ativação de uma série de
efetores que promovem uma resposta celular específica (apoptose, parada do ciclo celular,
senescência) (MÉNDEZ-ACUÑA et al., 2010)
As vias de reparo do DNA são responsáveis pelo processamento de diferentes tipos de
dano e são essenciais para evitar o acúmulo de mutações e garantir a transmissão acurada da
informação genética. Dependendo do tipo de lesão no DNA, diferentes proteínas são recrutadas
para reconhecer e processar o dano. Existem cinco vias principais de reparo do DNA: (i) reparo
por excisão de bases (ou BER, do inglês Base-Excision Repair) (ROBERTSON et al., 2009);
(ii) reparo por excisão de nucleotídeos (ou NER, do inglês Nucleotide-Excision Repair)
(NOUSPIKEL, 2009); (iii) reparo de erros de pareamento (ou MMR, do inglês Mismatch
Repair) (HSIEH; YAMANE, 2008); (iv) reparo por recombinação homóloga (ou HR, do inglês
Homologous Recombination) (NOWOSIELSKA, 2007) e (v) reparo por recombinação não-
homóloga (ou NHEJ, do inglês Non-Homologous End Joining) (MAHANEY; MEEK; LEES-
MILLER, 2009).
1.5.1 Sistema MMR
O sistema de reparo MMR é altamente conservado ao longo da evolução e é essencial
para a estabilização do genoma tanto em procariotos quanto em eucariotos (SUNG-HOON;
KIM; BAN, 2006). Este sistema corrige erros de pareamento base\base, além de inserções e
deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo de
replicação (OLLILA et al., 2008), além de estar envolvido nos processos de recombinação, na
geração da diversidade imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA, como, por
exemplo, danos causados por agentes alquilantes. (WARREN et al., 2007) (Fig., 1.8).
16
Figura 1.8. Diferentes funções das proteínas de reparo MMR. Adaptado de SUNG-HOON et al., 2006.
O reparo de erros de pareamento consiste no reconhecimento da base mal pareada,
causando distorção na dupla fita de DNA, excisão do segmento de DNA que contém o erro
através da ação de exonucleases específicas e a síntese da região removida utilizando a fita
parental como molde, através da ação das enzimas DNA polimerase e ligase (IYER et al.,
2006).
O sistema MMR reconhece com eficiência a maioria dos erros, retirando-os do genoma
recém-replicado. É necessário que haja uma coordenação entre o MMR e a replicação do DNA,
para que seja feito o direcionamento do reparo à fita recém sintetizada (BOWERS et al., 2001).
Os primeiros estudos com os genes mismatch foram desenvolvidos na bactéria
Escherichia coli (E. coli), onde os componentes essenciais do sistema MMR – MutS, MutL,
MutH e Uvr – foram identificados pela primeira vez através de estudos genéticos de mutantes
(COX; DEGNEN; SCHEPPE, 1972; WAGNER; MESELSON, 1976). O homodímero MutS
liga-se de forma inespecífica à molécula de DNA em busca do mismatch. Quando o erro é
reconhecido, a proteína perde afinidade pela molécula de ADP, sofre uma mudança
conformacional que permite sua ligação ao homodímero MutL formando um complexo ternário
dependente de ATP. A formação deste complexo estimula a atividade endonuclease do
homodímero MutH, que se liga ao sítio GATC hemi-metilado na fita recém sintetizada e quebra
a molécula de DNA tanto na posição 5´quanto na 3´do malpareamento. Além disso, há o
DIVERSIFICAÇÃO
DE ANTICORPOS
RESPOSTA A
DANOS NO DNA
REPARO DE
ERROS NA
REPLICAÇÃO
REGULAÇÃO DA
RECOMBINAÇÃO
PROMOÇÃO DO
CROSSING OVER
MEIÓTICO
PROTEÍNAS
MMR
17
recrutamento de helicases UvrD que se ligam na fita contendo a quebra e impedem que o DNA
duplex se enrole, enquanto o reparo não é feito. Isso permite a ação de diferentes exonucleases,
que digerem o DNA nas direções 5´- 3´ e 3´- 5´. A ação exonucleolítica acaba no momento em
que o erro é removido. O reparo é corrigido pela DNA polimerase III e o processo é finalizado
pela DNA ligase (JIRICNY, 2006).
A complexidade da via MMR nos organismos eucarióticos é maior que a encontrada em
procariotos, de modo que há ainda muitas dúvidas quanto aos detalhes do processo de reparo.
As poucas informações que se têm a respeito dos mecanismos MMR em eucariotos são
derivadas, principalmente, de estudos feitos com DNA circular heteroduplex de extratos de
células de mamíferos. Estes estudos indicam que a sequência de eventos que ocorrem durante
o processo de reparo é ditada por interações entre diferentes proteínas e o DNA heteroduplex
(MODRICH, 2006).
Todos os organismos eucarióticos, apresentam componentes homólogos dos complexos
MutS (MSHs) e MutL (MLHs), porém, em contraste com os encontrados nas bactérias, os
componentes eucarióticos funcionam como heterodímeros. Estudos feitos em levedura não
encontraram similares aos complexos MutH e Uvr, indicando que provavelmente não existem
homólogos para estas duas proteínas no genoma de eucariotos (HAFE; ROBERTSON, 2000).
Em eucariotos, os componentes do sistema MMR formam três subunidades proteicas
principais: MutSα (MSH2 + MSH6), que reconhece os erros base/base e pequenos loops de
inserção/deleção (IDLs) envolvendo um ou dois nucleotídeos, MutSβ (MSH2 + MSH3), que
reconhece grandes IDLs e MutLα (MLH1 + PMS2), que age como um mediador entre o
complexo MutS e as outras proteínas que participam do processo de reparo (PELTOMÄKI,
2003; EDELBROCK; KALIYAPERUMAL; WILLIAMS, 2012;) (Fig., 1.9).
As interações protéicas já documentadas nesse sistema incluem os seguintes pares de
moléculas: MutSα – MutLα, MutSα – PCNA, MutSβ – PCNA, MutLα – PCNA, MutSα – ExoI,
MutLα – ExoI, ExoI – PCNA e PCNA – polimerase δ. Com exceção das interações MutSα -
ExoI e entre PCNA – polimerase δ, o significado destas outras interações no reparo de erros de
pareamento ainda não foi estabelecido (MODRICH, 2006).
Em contraste com a E. coli, onde o reparo é direcionado pela ausência transitória de
metilação na adenina presente no sítio GATC da fita recém-sintetizada (hemi-metilação), os
18
sinais que direcionam o processo de reparo em eucariotos ainda não foram identificados (DA
SILVA et al., 2009).
Figura 1.9. MMR em eucariotos. (A) O complexo MutSα (MSH2-MSH6) reconhece erros base/base,
além de pequenas alças de inserção e deleção durante a síntese de DNA. Esse processo necessita de
mudança de ligação do ATP para o ADP pela proteína MSH2, seguido pelo recrutamento do complexo
MutLα (MLH1-PMS2). (B) Nas etapas seguintes de excisão e ressíntese, tem sido sugerida a
participação de diferentes proteínas como PCNA, DNA polimerase δ/ε, helicase I e exonuclease I para
remover o mismatch da fita recém-sintetizada. (C) Já o complexo MutSβ (MSH2-MSH3), reconhece
grandes alças de inserção e deleção (IDLs), seguido também, pelo recrutamento do complexo MutLα
(MLH1-PMS2) para remoção do mismatch. Adapatado de BOLAND; GOEL, 2010.
1.6 MSH2
O gene MSH2 está localizado no braço curto do cromossomo 2 na posição 2p22-p21
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4436; National Center for Biotechnology Information,
2012), mais precisamente entre os pares de bases 47.630.262 – 47.710.359, e possui 16 éxons
(http://www.med.mun.ca/MMRvariants/thegenes.aspx) (Fig., 1.10).
Figura 1.10. Localização do gene MSH2 no cromossomo 2
19
A proteína MSH2 apresenta 934 aminoácidos e 5 domínios estruturais conservados:
domínio 1 ou “mismatch binding” (1 – 124 resíduos de aminoácidos); domínio 2 ou “conector”
(125 – 297 resíduos de aminoácidos); domínio 3 ou “lever” (300 – 456 e 554 – 619 resíduos
de aminoácidos); domínio 4 ou “clamp” (457 – 553 resíduos de aminoácidos) e o domínio 5
ou ATPase (620 – 855 resíduos de aminoácidos) (WARREN et al., 2007; NEGUREANU;
SALSBURY, 2012) (Fig., 1.11). Esta proteína é estabilizada através da interação com as
proteínas MSH6 e MSH3, permitindo assim, que ela atue em substratos variados e vias diversas.
Figura 1.11. Modelo estrutural do heterodímero MutSα, mostrando o DNA (azul claro), domínio de
ligação (vermelho), domínio conector (amarelo), domínio lever (verde), domínio clamp (roxo) e
domínio ATPase (azul escuro). Adapatado de NEGUREANU; SALSBURY, 2012.
O gene MSH2 é responsável por aproximadamente 50% das mutações conhecidas,
associadas à SL. Dentro do espectro de mutações que são encontradas no gene: 10% são
mutações que envolvem a substituição de um aminoácido, em alguns casos gerando uma
proteína truncada e não funcional; 20% são grandes rearranjos gênicos, como deleções e
duplicações além de alterações nos sítios de splicing e mutações sinônimas (RUMILLA et al.,
2011). Alguns estudos mostram que o gene MSH2 também pode sofrer inativação através de
alterações epigenéticas (NAGASAKA et al., 2010; RUMILLA et al., 2011) e mutações
pontuais na região promotora (IWAHASHI et al., 1988).
20
Deleções na linhagem germinativa da região 3´ do gene EPCAM (Epithelial Cell
Adhesion Molecule), também conhecido como TACSTD1, localizado aproximadamente 16-Kb
acima do gene MSH2, tem sido associadas com a hipermetilação da região promotora desse
gene de reparo, com consequente ausência da sua proteína. Esse mecanismo ocorre em
aproximadamente 20% dos casos de CCR, em que há perda da proteína MSH2 sem que uma
mutação na linhagem germinativa seja identificada (RUMILLA et al., 2011; BANSIDHAR;
SILINSKY, 2012).
Segundo Iwahashi e colaboradores (1998), a região essencial para a atividade basal do
promotor de MSH2 é composta por um fragmento contendo 282 pb, abrangendo desde o
nucleotídeo -298 até o nucleotídeo -17. Esta região apresenta elementos de ativação em cis que
servem como sítios de ligação para diferentes fatores de transcrição (Fig., 1.12).
Figura 1.12. Região promotora do gene MSH2: contendo 282 pb (-298 nt até -17 nt). As sequencias
sublinhadas representam os sítios de ligação para os diferentes tipos de fatores de transcrição. Na posição
+1 está indicado o códon de início ATG.
Estudos genéticos e bioquímicos mostram que a proteína MSH2 é necessária para todos
os tipos de reparo de malpareamento do DNA (SUNG-HOON; KIM; BAN, 2006), portanto,
estudos sobre a incidência de mutações na linhagem germinativa nesse gene contribuirão para
um melhor entendimento do impacto do diagnóstico para os pacientes e familiares com SL.
21
1.7 Estudos brasileiros sobre a SL
A SL é a síndrome hereditária mais comum na espécie humana, com incidência entre
1:2.000 e 1:660 indivíduos (DE LA CHAPELLE, 2005). Portanto, é fundamental que os
pacientes em risco e seus familiares realizem programas de rastreamento.
São poucos os estudos no Brasil que descrevem o genótipo de indivíduos brasileiros
com a SL, seja aqueles com critérios diagnósticos (Amsterdam) ou de suspeição (Bethesda)
para a síndrome. A maioria dos estudos sobre a incidência e identificação de variantes genéticas
nos genes do sistema MMR é de origem europeia, americana e asiática. O espectro mutacional
desta síndrome é bastante variado, incluindo mutações “nonsense”, “frameshift” e
predominantemente mutações “missense”. Entretanto, grandes rearranjos gênicos e variantes
de sítios de splicing constituem <10% das alterações encontradas. Mutações fundadoras,
também têm sido identificadas em diferentes populações, contribuindo significantemente para
a predisposição da doença e direcionando os testes genéticos (DOMINGUEZ-VALENTIN et
al., 2013).
O primeiro estudo realizado no Brasil (ROSSI et al., 2002) com pacientes do Hospital
AC Camargo, descreveu a frequência de mutações na linhagem germinativa nos genes de reparo
MLH1 e MSH2 em 25 famílias brasileiras preenchendo os critérios de Amsterdam e de
Bethesda. O mesmo grupo publicou em 2004 um estudo que relatava que os tumores
extracolônicos mais frequentes em famílias brasileiras com SL eram o de endométrio em
mulheres e o câncer gástrico em homens.
Outros estudos foram publicados a partir de outras Instituições brasileiras (COSSIO et
al., 2010; DA SILVA et al., 2010), também relacionando genótipo – fenótipo em pacientes
brasileiros com SL. Porém, os dados disponíveis se limitam ao estudo de mutações e
características fenotípicas em pequenas séries de famílias com SL. A exata frequência de
deficiência do sistema MMR e a prevalência de mutações na linhagem germinativa nos genes
MMR não são conhecidas para famílias de diferentes regiões brasileiras (PROLLA, 2010).
22
OBJETIVOS
2.1 GERAL
Identificar variantes de sequência no gene MSH2 em pacientes selecionados para
Síndrome de Lynch de acordo com os critérios de Amsterdam ou Bethesda modificados,
avaliando a sensibilidade e especificidade dos mesmos para a presença de mutação.
2.2 ESPECÍFICOS
Relacionar as alterações do gene MSH2 encontradas na população brasileira com as
alterações já descritas na literatura para o gene;
Descrever o perfil de variações em MSH2 com respeito a sua associação com a
Síndrome de Lynch: mutações nonsense, mutações missense, mutações sinônimas,
polimorfismos e variações de valor diagnóstico desconhecido. Avaliar se as alterações
encontradas no gene MSH2 são polimorfismos comuns na população, comparando
com dados da literatura;
Avaliar a presença de diferentes mutações em diferentes centros de tratamento de
câncer: INCA, HCPA, AC.Camargo e HUJJB.
Avaliar a utilização de sequenciamento de nova geração (NGS) como estratégia para
identificação de variações em MSH2.
23
METODOLOGIA
3.1 Pacientes
Neste estudo foram incluídos 53 pacientes diagnosticados com câncer colorretal, sendo
31 (58,5%) do sexo feminino e 22 (41,5%) do sexo masculino. Os candidatos ao estudo foram
selecionados a partir de quatro centros clínicos pertencentes a quatro regiões Brasileiras - todos
hospitais públicos universitários e/ou centros de atendimento de pacientes do SUS: Instituto
Nacional de Câncer (INCA) (Rio de Janeiro), Hospital AC Camargo (São Paulo), Hospital de
Clínicas de Porto Alegre (HCPA) (Rio Grande do Sul) e Hospital Universitário João de Barros
Barreto (HUJJB) (Belém do Pará).
Foram recrutados 25 pacientes preenchendo critérios de Amsterdam e 28 pacientes
preenchendo critérios de Bethesda modificados, todos não relacionados, e preenchendo os
seguintes critérios de inclusão: indivíduos de ambos os sexos, que tenham sido diagnosticados
com câncer colorretal, com história familial compatível com os critérios de Amsterdam I ou II
ou com os critérios de Bethesda modificados, com idade superior a 18 anos, e aceitaram
voluntariamente a participação no estudo e que assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE) específico de participação no estudo (Anexo 1). De cada paciente incluído
foram obtidos os seguintes materiais: (a) bloco de parafina contendo tumor colorretal – a partir
de peça cirúrgica e, se possível tecido colônico normal adjacente; (b) DNA genômico extraído
de sangue periférico; (c) dados clínicos e (d) heredograma de no mínimo três gerações.
Todos os participantes da pesquisa foram recrutados a partir de consultas de
aconselhamento genético e foram identificados mediante análise do heredograma. As amostras
biológicas e cópia dos formulários foram remetidos ao centro coordenador do projeto
(Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS) para posterior distribuição das
informações aos demais centros participantes. O centro coordenador ficou responsável pela
organização dos dados clínicos e pelos testes genéticos de instabilidade de microssatélites e de
imunohistoquímica.
Este projeto faz parte de um projeto maior titulado: “Diagnóstico clínico e laboratorial
da Síndrome de Lynch: um estudo de custo-efetividade e de viabilidade de implantação no
SUS”, coordenado pela Drª Patrícia Ashton-Prolla da UFRGS.
24
3.2 Testes de Rastreamento
Os testes de MSI e IHQ foram realizados no centro organizador do projeto:
Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, coordenado pela Drª Patrícia Ashton-
Prolla.
3.2.1 Teste de Instabilidade de microssatélites (MSI):
O estudo de MSI foi feito pela análise comparativa de tecido normal e tumoral (obtido
por microdissecção) utilizando a técnica de PCR multiplex com oligonucleotídeos específicos
para um painel de cinco marcadores mononucleotídicos (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-
21, NR-24) contidos no kit MSI Analysis System, versão 1.1 (Promega, Madison, WI, USA),
segundo o protocolo de Suraweera et al (2002) e Bacher et al (2004). Os produtos de PCR fita-
simples (desnaturados) foram submetidos à eletroforese capilar no sequenciador ABI PRISM
3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems), e os resultados foram analisados com o
software GeneMapper ID 3.2 Analysis Sofware. Cada locus foi classificado como MSI (+)
(MSI-H) quando 2 ou mais marcadores demonstraram instabilidade/alteração; MSI-L quando
apenas 1 marcador demonstrar instabilidade e MSI (-) (MSS) quando nenhum marcador
demonstrar instabilidade.
3.2.2 Teste de Imunohistoquímica (IHQ)
A detecção dos produtos protéicos dos genes MSH2, MSH6, MLH1 e PMS2 pela
técnica de imunohistoquímica foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Kim et al
(2003), utilizando os anticorpos monoclonais contra as proteínas MLH1(Mouse Anti-MLH1
Clone 14, Zymed), MSH2 (Mouse Anti-MSH2 Clone FE11, Zymed), MSH6 (MOUSE Anti-
MSH6 Clone 44, Zymed) e PMS2 (Mouse Anti-PMS2 Clone A16-4, BD Pharmingen). A
detecção dos produtos gênicos foi realizada pelo método indireto de avidina-biotina-peroxidase,
e a visualização da reação antígeno-anticorpo foi feita com o cromógeno PicTureTM –MAX
Polymer Detection Kit (Zymed) e DAB (diaminobenzidina), contra-colorado com hematoxilina.
O tecido normal adjacente ao tumor foi utilizado como controle positivo. Coloração nuclear
positiva foi definida como: (i) Padrão 1: <5% de coloração nuclear; (ii) Padrão 2: ≥5% ≤10%
de coloração nuclear; (iii) Padrão 3: >10% de coloração nuclear. Expressão negativa da proteína
foi definida pela completa ausência de coloração nuclear no tecido tumoral (Padrão 4,
denominado de “lost”). As lâminas de IHQ foram analisadas independentemente por dois
médicos patologistas, e sem conhecimento prévio dos resultados da técnica de MSI.
25
3.3 Extração de DNA a partir de sangue periférico:
A extração de DNA genômico a partir de uma amostra de 5 ml de sangue periférico de
cada paciente, coletado em EDTA foi realizada utilizando o kit Puregene – Blood Core Kit B,
de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (Qiagen).
3.4 Estimativas da concentração e da integridade do DNA
Após a extração, o DNA genômico total extraído foi submetido à eletroforese em gel de
agarose 0,8% (Invitrogen) em tampão de corrida NaOH 1X (NaOH 10mM; H3BO3 42,5mM)
para verificar a eficiência da extração e a integridade do DNA. No preparo das amostras, 3µl
da alíquota de DNA foi acrescentado a 1µl de corante de corrida “blue green” (LGC
Biotecnologia). A eletroforese foi realizada a 4 volts/cm durante 40 minutos em uma cuba
horizontal. Após a corrida, o gel foi visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta para
confirmação da integridade de cada amostra de DNA.
Posteriormente, a concentração e a pureza do DNA das amostras foram verificadas com
o auxílio do espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific). As amostras foram ajustadas
para uma concentração final em torno de 50ng/μL e armazenadas a -20C até a sua utilização.
3.5 Amplificação do gene MSH2
A análise de mutações no gene MSH2 foi realizada pela técnica de PCR (Polymerase
Chain Reaction) utilizando aproximadamente 100ng de DNA genômico das amostras
selecionadas. E as reações de amplificação foram feitas utilizando Taq Platinum Buffer®
(Tabela 3.1).
26
Tabela 3.1: Reagentes utilizados na reação de PCR e concentração utilizada para cada reação.
3.5.1 Regiões codificantes do gene MSH2
Para amplificar os fragmentos gênicos correspondentes aos éxons 1 a 16 foram
utilizados 16 pares de oligonucleotídeos (primers) descritos por Beck et al (1997) e por Zahary
et al (2012) (Tabela 3.2).
REAGENTES
Tampão de reação 10X(Taq Platinum Buffer®) 1X
dNTPs 250M
MgCl2 1,5 a 2,5 mM (específico para cada primer)
PRIMER Foward 20pmol/reação
PRIMER Reverso 20pmol/reação
Taq platinum DNA polimerase 1U
DNA 100ng
27
Tabela 3.2: Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos éxons 1 a 16 do gene MSH2. Os primers
dos éxons 2 e 5 foram descritos por Zahary e colaboradores (2012) e os demais por Beck e colaboradores
(1997).
ÉXONS OLIGONUCLEOTÍDEOS (PRIMERS)
TAMANHO DO
FRAGMENTO
(Pares de base – pb)
TEMPERATURA
DE
PAREMANTO
(ºC)
1 (FOWARD) 5` CTTCAACCAGGAGGTGAGGAGGT 3`
(REVERSO) 5` GAAAGGAGCCGCGCCACAAG 3` 301 pb 61
2 (FOWARD) 5` GTGGAACTATAACTGTACAGTAAGC3`
(REVERSO) 5` CAGCCAAACTGCAACTTTT 3` 457 pb 50
3 (FOWARD) 5` TGTTCAAGAGTTTGTTAAATTTTT 3`
(REVERSO) 5` TGGAATCTCCTCTATGACTAGACT 3` 359 pb 52
4 (FOWARD) 5`TCTTATTCCTTTTCTCATAGTAG 3`
(REVERSO) 5`TATTGTAATTCACATTTATAATCC 3` 224 pb 47
5 (FOWARD) 5`GAAGGAACACCAAGGAAAAT 3`
(REVERSO) 5` CTGAAAAAGGTTAAGGGCTCTG 3` 273 pb 50
6 (FOWARD) 5`ATTGAGCTTGCCATTCTTTCTA 3`
(REVERSO) 5` TGCAGGTTACATAAAACTAAC 3` 220 pb 52
7 (FOWARD) 5` AATATTTTACATTAATTCAAGTTAA 3`
(REVERSO) 5` ATATATTGTATGAGTTGAAGGAA 3` 284 pb 47
8 (FOWARD) 5` AATGAGATCTTTTTATTTGTTTGTT 3`
(REVERSO) 5` ACTGCTTAAATTAAAAAGTATATTG3` 182 pb 47
9 (FOWARD) 5` GGATTTTGTCAGTTTGTTCTGTTTG 3`
(REVERSO) 5` TTCCAACCTCCAATGACCCATTC 3` 179 pb 50
10 (FOWARD) 5` ATACTTTTTCTTTTCTTCTTGATTA 3`
(REVERSO) 5` GGTTAAAAATATAATAACGACTTG 3` 210 pb 47
11 (FOWARD) 5` TTAATAAAACTGTTATTTCGATTTG 3`
(REVERSO) 5`AGCCAGGTGACATTCAGAACATTAT3` 169 pb 47
12 (FOWARD) 5` TTTCTGTTTTTATTTTTATACACG 3`
(REVERSO) 5` AAACGTTACCCCCACAAAG 3` 309 pb 50
13 (FOWARD) 5` AAACTTGCTTTCTGATATAATTTGT 3`
(REVERSO) 5`CATTTCTATCTTCAAGGGACTAGGA 3` 273 pb 52
14 (FOWARD) 5` TTCAGGTAATTATGTGCTTCA 3`
(REVERSO) 5` TACTGAATTTAGAGTACTCCAATA 3` 302 pb 50
15 (FOWARD) 5` TCTCATGCTGCTCCCTCACG 3`
(REVERSO) 5` TAAGTTAAACTATGAAAACAAACTG 3` 247 pb 50
16 (FOWARD) 5` ATTTTAATTACTAATGGGACATT 3`
(REVERSO) 5` GCTTATCAATATTACCTTCATTC 3` 246 pb 47
28
Todas as reações de amplificação foram feitas em tubos 0,2mL no volume de 50µL e as
condições de ciclagem utilizadas foram as seguintes para todos os éxons, com exceção do éxon
2: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguindo-se de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC
por 30 segundos, temperatura de pareamento entre 47ºC a 61ºC (variando para cada par de
primers) por 30 segundos, extensão a 72ºC por 30 segundos; e extensão final de 72ºC por 15
minutos. As condições para o éxon 2 foram: desnaturação inicial a 96ºC por 5 minutos; 40
ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 minuto, temperatura de pareamento de 50ºC por 1 minuto,
extensão a 72ºC por 1 minuto; e extensão final de 72ºC por 7 minutos.
As reações de PCR foram conduzidas em um termociclador Veriti® Thermal Cycler
(Applied Biosystems) e após a amplificação, os produtos finais foram armazenados a -20ºC.
3.5.2 Região promotora do gene MSH2
Para amplificar o fragmento de 282pb correspondente a região promotora do gene
MSH2 foi utilizado um par de oligonucleotídeos (primers) descritos por Beck et al (1997) e por
Iwahashi et al(1998) (Tabela 3.3). Este par de primers amplifica não só a região promotora
mas também o éxon 1 e uma parte do íntron 1, gerando um fragmento de 571pb (Fig., 3.1).
Tabela 3.3: Oligonucleotídeos utilizados para amplificar a região promotora do gene MSH2. Primer
foward descrito por Iwahashi e colaboradores (1998) e primer reverso descrito por Beck e colaboradores
(1997)
OLIGONUCLEOTÍDEOS (PRIMERS)
TAMANHO DO
FRAGMENTO
(Pares de base – pb)
PROMOTOR (FOWARD) 5` GCTGAGTAAACACAGAAA 3`
(REVERSO) 5` GAAAGGAGCCGCGCCACAAG 3` 282 pb
29
GCTGAGTAAACACAGAAAGGAGCTCTACTAAGGATGCGCGTCTGCGGGTTTCCG
CGCGACCTAGGCGCAGGCATGCGCAGTAGCTAAAGTCACCAGCGTGCGCGGGAA
GCTGGGCCGCGTCTGCTTATGATTGGTTGCCGCGGCAGACTCCCACCCACCGAAA
CGCAGCCCTGGAAGCTGATTGGGTGTGGTCGCCGTGGCCGGACGCCGCTCGGGG
GACGTGGGAGGGGAGGCGGGAAACAGCTTAGTGGGTGTGGGGTCGCGCATTTTC
TTCAACCAGGAGGTGAGGAGGTTTCGACATGGCGGTGCAGCCGAAGGAGACGCT
GCAGTTGGAGAGCGCGGCCGAGGTCGGCTTCGTGCGCTTCTTTCAGGGCATGCCG
GAGAAGCCGACCACCACAGTGCGCCTTTTCGACCGGGGCGACTTCTATACGGCGC
ACGGCGAGGACGCGCTGCTGGCCGCCCGGGAGGTGTTCAAGACCCAGGGGGTGA
TCAAGTACATGGGGCCGGCAGGTGAGGGCCGGGACGGCGCGTGCTGGGGAGGGA
CCCGGGGCCTTGTGGCGCGGCTCCTTTC
Figura 3.1. Fragmento de 571 pb amplificado. Em negrito os primers senso e antisenso; em azul a
região correspondente ao promotor do gene MSH2 (282 pb); em amarelo a região correspondente ao
éxon 1 e em cinza o fragmento correspondente a uma parte do íntron 1; em vermelho o start codon
(ATG).
As condições de ciclagem utilizadas para amplificar a região promotora foram as
seguintes: desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos, seguindo-se de 5 ciclos a 94ºC por 1
minuto, 60ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e 25 ciclos a 94ºC por 1 minuto, 58ºC por 1
minuto e 72ºC por 1 minuto; e extensão final de 72ºC por 10 minutos.
As reações de PCR foram conduzidas em um termociclador Veriti® Thermal Cycler
(Applied Biosystems) e após a amplificação, os produtos finais foram armazenados a -20ºC.
3.6 Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do rendimento da reação
Para verificar a eficiência da reação de PCR, 5L dos produtos amplificados foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% (Invitrogen), diluída em 100 ml de tampão
NaOH 1X (NaOH 10Mm; H3BO3 42,5mM) e corado com 1L do corante de corrida “blue
green” (LGC Biotecnologia). A eletroforese foi realizada a 4 volts/cm, por 40 minutos em cuba
horizontal, utilizando-se como tampão de corrida NaOH 1X. Após a corrida, o gel foi
visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta e para confirmação do tamanho do
“amplicon” foi utilizado o padrão de peso molecular de 100pb (Invitrogen).
30
3.7 Purificação dos produtos da PCR
Após a amplificação, aproximadamente 45L dos produtos amplificados foram
purificados utilizando-se os kits de purificação GFXTMPCR DNA e Gel Band Purifications Kit®
(GE – Healthcare), ou o kit da HiYieldTM GEL/PCR DNA Minikit® (RBC) de acordo com o
protocolo recomendado pelos fabricantes.
Uma alíquota de 3L de produto amplificado foi posteriormente corrida em gel de
agarose 1,5% (Invitrogen) em tampão NaOH 1X (NaOH 10Mm; H3BO3 42,5Mm) a 4 volts/cm
por 40 minutos para confirmar a presença do produto.
3.8 Sequenciamento Automático de Sanger
As reações de sequenciamento foram preparadas em um volume final de 10L,
utilizando-se o kit Big DyeTerminator version 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems),
contendo: 3,2 pmol de cada oligonucleotídeo (senso e antisenso), 4,0L do DNA purificado,
2,5L de tampão/big dye (Applied Biosystems) e 2,5L de água ultra pura. As reações foram
feitas em uma placa de 96 poços (Applied Biosystems) e conduzidas no termociclador Veriti®
Thermal Cycler (Applied Biosystems). A ciclagem da reação de sequenciamento compreendeu
40 ciclos de desnaturação a 94ºC por 10 segundos, anelamento a 50ºC por 5 segundos e extensão
a 60ºC por 4 minutos.
Após a reação de sequenciamento foi feita a precipitação das amostras para a retirada
de ddNTPs livres que podem interferir na leitura da sequência de DNA. A precipitação dos
produtos foi feita com a adição de 30µL de isopropanol 75% (MERCK), seguida de incubação
em temperatura ambiente por 15 minutos. Foi realizada uma centrifugação a 4.000 rpm por 45
minutos, e o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se mais 50µL de etanol 75% (MERCK)
em cada poço da placa e foi realizada outra centrifugação a 4.000 rpm por 15 minutos. O
sobrenadante foi novamente descartado, a placa foi colocada em um bloco aquecido
(termociclador) à 60C, por cerca de 10 minutos, para secagem do produto e posteriormente
mantida à -20ºC.
Após o processo de precipitação, os produtos de sequenciamento foram preparados para
serem submetidos à eletroforese no sequenciador. Para tal procedimento foi adicionado 10µL
de formamida (MERCK) em cada poço da placa, seguida de uma breve centrifugação.
Posteriormente a placa foi aquecida em um termociclador à 95ºC durante 3 minutos e,
imediatamente, incubada em gelo por aproximadamente 5 minutos. As amostras foram
31
sequenciadas com a plataforma de sequenciamento automático ABI Prism 3130XL (Applied
Biosystem).
As sequências obtidas foram analisadas utilizando o software Chromas Pro versão 1.41
e comparadas com as sequências de referência NM_000251.1 (sequência do mRNA) e
NG_007110.1 (sequência genômica), para identificação das mutações e polimorfismos
encontrados nas regiões codificantes e região promotora. A descrição das alterações foi feita de
acordo com a Human Genome Variation Society (http://www.hgvs.org/).
Para confirmação das alterações encontradas, dois bancos de dados foram acessados:
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4436) e o LOVD
(http://chromium.liacs.nl/LOVD2/colon_cancer). Os indivíduos que apresentaram variação nas
sequências tiveram uma nova alíquota do DNA analisada para confirmação da variante
encontrada.
3.9 Ferramentas eletrônicas
3.9.1 Análise das variantes missense
A análise de predições dos efeitos das alterações que causam substituição de
aminoácidos na proteína foi realizada utilizando-se as ferramentas eletrônicas PolyPhen-2
(ADZHUBEI et al., 2010), Pmut (FERRER-COSTA et al., 2005) e SIFT (NG; HENIKOFF,
2003). Esses programas consideram determinados parâmetros (como a conservação do
aminoácido em proteínas ortólogas e as propriedades físico-químicas dos aminoácidos) para
classificarem uma substituição como patogênica ou neutra.
O programa PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) classifica a alteração
como provavelmente danosa (quando se supõem com alta probabilidade que a alteração afete a
estrutura e/ou a função da proteína), possivelmente danosa (quando se supõem que a alteração
afete a estrutura e/ou a função da proteína), benigna (quando a alteração provavelmente não
causa nenhum efeito na proteína) e não conhecida (quando a falta de dados não permite ao
programa fazer uma predição. O programa oferece dois modelos para predição: o HumDiv, que
é utilizado, preferencialmente, para a avaliação de alelos raros em loci potencialmente
envolvidos em fenótipos complexos, mapeamento de regiões identificadas por estudos de
associação de genomas completos e análise de seleção natural a partir de dados de sequência e
o HumVar, que é utilizado para o diagnóstico de doenças Mendelianas, em que se é necessário
a distinção entre mutações com efeito drástico das variações humanas restantes, incluindo alelos
32
levemente deletérios. O valor de score para classificação das alterações varia de 0 a 1. Quanto
mais próximo de 0 maior a chance da variante ser benigna e quanto mais próximo de 1 maior a
probabilidade de ser patogênica.
A ferramenta eletrônica Pmut (http://mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/) possui uma taxa de
sucesso de 80% e classifica uma alteração como patogênica ou neutra. Para tal classificação, o
programa fornece valores de NN output (neural networks) e de confiança. Se o valor de NN
output for maior que 0,5, a alteração é predita como patogênica. O valor de confiança permite
verificar se a predição é muito ou pouco confiável, variando de 0 (pouco confiável) a 9 (muito
confiável).
O programa SIFT (http://sift.jcvi.org/www/SIFT_enst_submit.html) fornece um score
que prediz se a alteração é deletéria ou tolerável. A substituição de aminoácidos é predita como
danosa se o valor de score for ≤ 0,05 e considerada tolerável para valores > 0,05.
Além disso, a classificação das variantes foi acessada de acordo com grupo Intenational Society
of Gastrointestinal Hereditary Tumors (InSiGHT), o qual criou diferentes critérios para
classificar as alterações encontradas nos genes do sistema MMR (www.insight-
group.org/variants/classifications/). De acordo com o grupo, as variantes são divididas em cinco
diferentes categorias: classe 5, que se refere as variantes patogênicas; classe 4, que engloba as
possivelmente patogênicas (likely pathogenic); classe 3, que inclui as variantes com
patogenicidade incerta (variantes não classificadas); classe 2, são variantes possivelmente não
patogênicas ou com pouca significância clínica (likely not pathogenic/little clinical
significance) e a classe 1, que inclui as variantes não patogênicas. O grupo InSiGHT utiliza o
banco de dados LOVD como referência para classificar as variantes.
3.9.2 Análise da região promotora
A identificação de possíveis sítios de ligação para fatores de transcrição na região
regulatória do gene MSH2 foi feita utilizando o banco de dados TRANSFAC (http://www.gene-
regulation.com/pub/databases.html), através dos parâmetros default do algoritmo.
3.10 Sequenciamento de Nova Geração – por síntese
O sequenciamento em larga escala utilizando a plataforma HiSeq™ 2500 (Illumina) foi
feito em apenas dois pacientes, escolhidos de forma aleatória, identificados como "3" e " GGC
1108". Para o sequenciamento foram utilizados todos os 16 éxons amplificados (utilizando os
primers da Tabela 3.2, sessão 3.5.1) e purificados (sessão 3.7) de cada paciente, com exceção
33
do éxon 5 para o paciente 3, em que foi utilizado o par de primers e as condições da reação
descritos na Tabela 3.4. Posteriormente, as amostras foram quantificadas e misturadas e, deste
“pool” de amostras, foram utilizados 50ng para a preparação de biblioteca para clusterização
emflow Cells e sequenciamento na plataforma Illumina (3,5ng de cada éxon totalizando, 56ng).
Tabela 3.4: Oligonucleotídeos e condições de ciclagem utilizados no sequenciamento de nova geração para
amplificar o éxon 5 do gene MSH2, para o paciente 3.
O sequenciamento por síntese foi feito em 4 etapas principais: (i) Preparação da
biblioteca; (ii) Geração dos clusters; (iii) Sequenciamento e (iv) Análise.
3.10.1 Preparação das bibliotecas
O kit utilizado para a preparação das bibliotecas de DNA foi o Nextera DNA Sample
Preparation, que envolveas seguintes etapas: (i) fragmentação do DNA alvo em pontos
aleatórios, utilizando uma transposase; (ii) a adição de adaptadores nos pontos de clivagem do
DNA e (iii) a amplificação dos fragmentos na presença de primers com caudas contendo
sequências identificadoras (indexes).
Após sua preparação, as bibliotecas foram validadas utilizando-se o chip High
Sensitivity DNA e o equipamento Bioanalyzer (Agilent), seguindo o protocolo do fabricante,
para verificar o tamanho e a qualidade da biblioteca gerada. Posteriormente, foi feita uma PCR
em Tempo Real (Illumina) utilizando o kit “KAPA Library Quantification Kits” para
quantificar a biblioteca através da construção de uma curva padrão com amostras de
concentração conhecida.
Após a quantificação, as bibliotecas foram diluídas a uma mesma concentração (2nM),
misturadas e adicionadas de maneira equimolar a outras 30 bibliotecas. Posteriormente, foram
desnaturadas com 0,1M de NaOH e diluídas a uma concentração de 12 pM, para a geração dos
clusters.
OLIGONUCLEOTÍDESOS (PRIMERS)
TAMANHO DO
FRAGMENTO (PARES
DE BASE – pb)
CONDIÇÕES DE
CICLAGEM
ÉXON 5 (FOWARD) 5` CAGTGGTATAGAAATCTTCG 3`
(REVERSO) 5` ACCATTCAACATTTTTAACCC 3` 242 pb
94ºC – 5 minutos
94ºC – 30 segundos
50ºC – 30segundos 35x
72ºC – 30 segundos
72ºC – 15 minutos
34
3.10.2 Geração dos clusters
A geração dos clusters ocorreu no equipamento cBot (Illumina), utilizando o TruSeq PE
Cluster kit v3-cBot-HS (Illumina). Este processo ocorre, de forma simplificada, em 4 etapas:
(i) hibridização dos fragmentos contendo os adaptadores a superfície sólida (flow cell); (ii)
amplificação das amostras (amplificação por ponte); (iii) linearização dos fragmentos e (iv)
hibridização dos fragmentos amplificados com os primers de sequenciamento.
3.10.3 Sequenciamento por síntese
O sequenciamento das bibliotecas clusterizadas na flow Cell foi feito no sequenciador
HiSeq 2500 (Illumina), utilizando o TruSeq SBS kit v3-HS (Illumina), no modo paired end,
com a leitura de 2 reads de 99 bases para cada extremidade e 16 leituras para os indexes.
3.10.4 Análise dos dados
Os dados obtidos foram convertidos de BCL (base calling) para a formato FastQ
utilizando o programa Casava (Illumina). Posteriormente, a qualidade das “reads” foi filtrada
utilizando o programa PrinSeq, de acordo com os seguintes critérios: (i) filtrar sequências com
tamanho inferior a 30 nucleotídeos; (ii) selecionar “reads” com uma média de qualidade de no
mínimo 20 e (iii) filtrar sequências com mais de 60 bases ambíguas. A seguir, utilizando o
programa Bowtie-2, as “reads” selecionadas foram alinhadas com a sequência de referência do
gene MSH2 (NG_007110.1), utilizando parâmetros padrão do programa. Com o auxílio dos
programas GATK e Samtools, os índices de cobertura para cada posição de base foram
avaliados e, por fim, foram estimadas as variantes e frequências correspondentes de cada região
amplificada do gene com o programa CLC Genomics Workbench 7 (Qiagen).
35
RESULTADOS
4.1 Caracterização dos pacientes incluídos
As informações clínicas dos 53 pacientes estudados, incluindo os resultados dos testes
de instabilidade de microssatélites e imunohistoquímica, estão resumidos e apresentados em
forma de tabela, no Anexo 2.
A idade ao diagnóstico variou de 19 a 81 anos. A média de idade foi 40,6 anos (±11,9)
e a mediana foi de 39 anos. A histologia do adenocarcinoma de 48 pacientes foi avaliada e 4
pacientes apresentaram histologia bem diferenciada, 29 moderadamente diferenciada, 4 pouco
diferenciada e os 11 restantes tiveram sua histologia inconclusiva.
Dos cinquenta e três pacientes avaliados, 36 apresentam histórico familial de câncer,
com número de familiares de 1º grau afetados variando de 1 a 10 indivíduos. Os demais 17
pacientes não possuem casos de câncer nos familiares de primeiro grau.
Dos 49 pacientes avaliados para o teste de imunohistoquímica, 39 apresentaram
imunohistoquímica positiva para MSH2 e 10 apresentaram perda da proteína. Para o teste de
instabilidade de microssatélites, 20 pacientes foram avaliados e, destes, 10 apresentaram alta
instabilidade de microssatélites (MSI-H), 8 apresentaram microssatélites estáveis (MSS) e 2
apresentaram resultado inconclusivo, devido à má qualidade do material.
A localização tumoral foi predominantemente do cólon (39/53), seguida do reto (7/53),
retossigmóide (5/53) e outras localizações (2/53). Três pacientes apresentaram tumor primário
em mais de uma localização.
36
4.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento Automático de Sanger
4.2.1 Variantes identificadas nas regiões codificantes do gene MSH2
Conduzimos a triagem de alterações nas regiões codificantes do gene MSH2 através do
sequenciamento automático, nos 53 pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch. Em 52
pacientes foram analisadas as sequências dos 16 éxons e em apenas um paciente (MRV) foram
analisadas as sequências referentes aos éxons 3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 15, devido à falta de
material disponível para análise.
Nesses pacientes foram identificadas 9 variantes de sequência: (i) 5 variantes missense,
em que há troca de aminoácido; (ii) 1 variante sinônima, que mantém o mesmo aminoácido;
(iii) 1 variante nonsense, que gera um stop códon prematuro e (iv) 2 variantes frameshift, que
alteram a sequência de leitura do RNAm. Na Tabela 4.1 estão listadas as variantes identificadas
e sua localização nos domínios protéicos.
37
Tabela 4.1: Variantes de sequência identificadas nos 53 pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch.
Variação no
cDNA
Variação na
Proteína
Éxon do
Gene Pacientes
Tipo de
variante
Domínio
protéico
c.23C>T
p.T8M
ÉXON 1
GGC 1094 / SL009
Missense
Mismatch
Binding
c.573C>T
p.L191L
ÉXON 3
SL001
Sinônima
Conector
c. 388_389del CA
p.Q130Vfs
ÉXON 3
SL009
Frameshift
Conector
c.1046C>G
p.P349R
ÉXON 6
GGC 1109
Missense
Lever
c.965G>A
p.G322D
ÉXON 6
3 / 10 / GGC 1107
Missense
Lever
c.1738_1741del
GAAA
-
ÉXON 11
GGC 2114
Frameshift
Lever
c.2021G>A
p.G674D
ÉXON 13
8
Missense
ATPase
c.2078G>A
p.C693Y
ÉXON 13
GGC 1108
Missense
ATPase
c.2152C>T
p.Q718X
ÉXON 13
GGC 1112 /
GGC 2106/ GGC 871/
GGC 874
Nonsense
ATPase
38
4.2.2 Características das variantes encontradas nas regiões codificantes
A alteração c.23C>T (Fig., 4.1) resulta na troca de uma treonina por uma metionina na
posição 8 da proteína MSH2, no domínio “mismatch binding”. As análises in sílico relativas
ao efeito da substituição do aminoácido na função da proteína, utilizando–se os programas SIFT
e Pmut, mostraram que essa alteração é benigna, porém de acordo com o programa PolyPhen-
2 esta alteração pode ser benigna (modelo HumVar) ou possivelmente danosa (modelo
HumDiv). E de acordo com o grupo InSiGHT esta variante também é benigna (Tabela 4.2).
Esta alteração foi identificada em dois pacientes em heterozigose (GGC 1094 e SL009).
O paciente GGC 1094 foi diagnosticado com adenocarcinoma retal aos 31 anos de idade,
preenche os critérios de Bethesda, apresenta perda das proteínas MSH2 e MSH6 e não possui
instabilidade de microssatélites. Já o paciente SL009 apresenta história familiar de SL (critérios
de Amsterdam – Anexo 3), com quatro parentes de 1º grau afetados (2 com CCR, 1 com câncer
de ovário e 1 com câncer de endométrio) e uma manifestação precoce da doença – aos 46 anos
de idade. Apresenta adenocarcinoma de cólon ascendente diferenciado e perda, somente, da
proteína MSH6. O status de instabilidade de microssatélites para este paciente não foi avaliado.
Figura 4.1. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 1. A) Sequência
selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.23C>T.
A B
39
Tabela 4.2: Classificação da patogenicidade da variante T8M por análises in sílico.
A variante c.573C>T no éxon 3 (Fig., 4.2) resulta em uma mutação sinônima, p.L191L,
no domínio “conector” da proteína MSH2. Isso sugere que se trata de uma variante não
patogênica e foi encontrada em apenas um paciente em heterozigose (SL001). Este paciente foi
diagnosticado com adenocarcinoma de cólon aos 30 anos de idade e não possui história familiar
de SL. Ainda não foram realizados os testes de imunohistoquímica e instabilidade de
microssatélites para este paciente.
Figura 4.2. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 3. A) Sequência
selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.573C>T.
ALTERAÇÃO PROGRAMA SCORE CLASSIFICAÇÃO
C.23 C>T
(T8M)
PolyPhen-2 HumVar = 0,226
HumDiv = 0,832
Benigna/
Possivelmente danosa
SIFT 0,1 Tolerável
Pmut NN output = 0,1301
Confiança = 7 Neutra
InSiGHT Classe 1 Não Patogênica
A B
40
A variante c.388_389delCA (Fig., 4.3), localizada no éxon 3, resulta em uma mutação
frameshift. Esta alteração é considerada patogênica pois altera a sequência de leitura do RNAm.
Foi encontrada em apenas um paciente – SL009, que também é portador da alteração p.T8M
no éxon 1.
Figura 4.3. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 3.
A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.388_389delCA.
A alteração c.1046C>G (Fig., 4.4) foi identificada em um paciente (GGC 1109) e resulta
na troca de uma prolina por uma arginina na posição 349 da proteína. Segundo as análises in
sílico através dos programas SIFT e PolyPhen-2, esta alteração foi classificada como
patogênica, porém de acordo com o programa Pmut, esta variante é neutra. E, de acordo com a
classificação proposta pelo grupo InSiGHT, é considerada uma variante possivelmente
patogênica (Tabela 4.3). O paciente GGC 1109 foi diagnosticado com adenocarcinoma
retossigmóide aos 30 anos de idade, apresenta história familiar de SL (Anexo 4) com três
parentes de 1º grau afetados (2 com CCR e 1 com câncer de estômago) e possui
imunohistoquímica positiva para todas as proteína estudadas. O status de instabilidade de
microssatélite não foi avaliado.
Figura 4.4. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 6. A) Sequência
selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.1046C>G.
A B
A B
41
Tabela 4.3: Classificação da patogenicidade da variante P349R por análises in sílico.
A variante c.965G>A (p.G322D) (Fig., 4.5) no éxon 6, resulta na troca de uma glicina
por um ácido aspártico na posição 322 no domínio “lever” da proteína MSH2. Ela foi
identificada em três pacientes em heterozigose. De acordo com os programas de predição
PolyPhen-2 e Pmut, esta variante é considerada benigna, porém de acordo com o programa
SIFT, esta alteração é predita como danosa. E de acordo com o InSiGHT, é uma variante não
patogênica (Tabela 4.4). Os pacientes 3 e 10 não possuem história familiar de SL e foram
diagnosticados aos 60 e 35 anos de idade, respectivamente. Apresentam adenocarcinoma de
cólon moderadamente diferenciado e imunohistoquímica positiva para todas as proteínas
estudadas. O status de instabilidade de microssatélites para estes pacientes não foi avaliado. Já
o paciente GGC 1107, apresenta história familiar para SL com 3 parentes de 1º grau afetados –
todos com CCR. Foi diagnosticado com adenocarcinoma de cólon transverso moderadamente
diferenciado aos 38 anos de idade e apresenta imunohistoquímica positiva para todas as
proteínas e alta instabilidade de microssatélites, com 5 marcadores apresentando alteração.
Figura 4.5. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR no éxon 6. A) Sequência
selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.965G>A.
ALTERAÇÃO PROGRAMA SCORE CLASSIFICAÇÃO
C.1046 C>G
(P349R)
PolyPhen-2 HumVar = 1.000
HumDiv = 1.000 Possivelmente danosa
SIFT 0 Danosa
Pmut NN output = 0,4382
Confiança = 1 Neutra
InSiGHT Classe 4 Possivelmente
Patogênica
A B
42
Tabela 4.4: Classificação da patogenicidade da variante G322D por análises in sílico.
A variante c.2021G>A (p.G674D), localizada no éxon 13 (Fig., 4.6), resulta na troca de
uma glicina por um ácido aspártico na posição 674 no domínio ATPase da proteína. Esta
alteração foi identificada em apenas um paciente (paciente 8), preenchendo os critérios de
Bethesda (Anexo 5), que manifestou a doença precocemente – aos 44 anos de idade. Apresenta
adenocarcinoma de cólon sigmóide moderadamente diferenciado, com perda, somente, da
proteína MSH2 e o status de instabilidade de microssatélites não foi avaliado. As análises in
sílico relativas ao efeito da substituição do aminoácido na função e/ou estrutura da proteína e
de acordo com o grupo InSiGHT, mostraram que esta alteração é patogênica (Tabela 4.5).
Figura 4.6. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13.
A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2021G>A.
ALTERAÇÃO PROGRAMA SCORE CLASSIFICAÇÃO
C.965 G>A
(G322D)
PolyPhen-2 HumVar = 0.296
HumDiv = 0,434 Benigna
SIFT 0,05 Danosa
Pmut NN output = 0,3284
Confiança = 3 Neutra
InSiGHT Classe 1 Não Patogênica
A B
43
Tabela 4.5: Classificação da patogenicidade da variante G674D por análises in sílico.
A alteração c.2152C>T (Fig., 4.7) resulta na troca de uma glutamina por um stop códon
(p.Q718X) no domínio ATPase da proteína. Esta foi identificada em quatro pacientes em
heterozigose e é considerada uma variante patogênica, uma vez que gera uma proteína truncada
e não funcional. O paciente GGC 1112 foi diagnosticado com adenocarcinoma retal pouco
diferenciado aos 34 anos de idade e preenche os critérios de Amsterdam (Anexo 6) com um
parente de 1º grau afetado (com CCR). Apresenta perda das proteínas MLH1, MSH2 e MSH6,
e alta instabilidade de microssatélites com 5 marcadores alterados. O paciente GGC 2106 foi
diagnosticado aos 50 anos de idade com adenocarcinoma retossigmóide moderadamente
diferenciado. Também possui história familiar para SL (Anexo 7) com cinco parentes de 1º
grau afetados (CCR, língua, renal, fígado e bexiga) e apresenta perda das proteínas MSH2 e
MSH6 por imunohistoquímica. O status de instabilidade de microssatélites, para este paciente,
não foi avaliado. Já o paciente GGC 871 foi diagnosticado com adenocarcinoma de cólon
ascendente aos 30 anos e possui história familiar para SL (Anexo 8) com dois parentes de 1º
grau afetados com CCR. Apresenta perda das proteínas MSH2 e MSH6 e o resultado do teste
de instabilidade de microssatélites foi inconclusivo. E o paciente GGC 874 foi diagnosticado
com adenocarcinoma de cólon sigmóide em idade precoce aos 29 anos de idade e preenche os
critérios de Amsterdam (Anexo 9) com um parente de 1º grau apresentando dois tumores CCR
e um tumor de próstata. Possui alta instabilidade de microssatélites com 4 marcadores
apresentando alteração e o teste de imunohistoquímica foi positiva para todas as proteínas
avaliadas.
ALTERAÇÃO PROGRAMA SCORE CLASSIFICAÇÃO
C.2021 G>A
(G674D)
PolyPhen-2 HumVar = 1.000
HumDiv = 1.000 Possivelmente danosa
SIFT 0 Danosa
Pmut NN output = 0,8280
Confiança = 6 Patogênica
InSiGHT Classe 4 Possivelmente
Patogênica
44
Figura 4.7. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A)
Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2152C>T.
Duas alterações identificadas neste estudo, e apresentadas a seguir, nunca foram
descritas: c.2078G>A (p.C693Y) e c.1738_1741delGAAA.
A variante nova c.2078G>A (Fig., 4.8) foi encontrada em apenas um paciente (GGC
1108), que preenche os critérios de Bethesda (Anexo 10) e manifestou a doença aos 42 anos de
idade. Este paciente apresenta adenocarcinoma de cólon ascendente moderadamente
diferenciado, com perda da proteína MSH6 e com alta instabilidade de microssatélites, com 4
marcadores alterados. Esta substituição leva à troca de uma cisteína por uma tirosina na posição
693 no domínio ATPase da proteína MSH2. Com o objetivo de verificar se a alteração C693Y
afeta a estrutura e/ou função protéica, os programas de predição PolyPhen-2, SIFT e Pmut
foram utilizados e todos a classificaram como sendo provavelmente patogênica (Tabela 4.6).
Figura 4.8. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A)
Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2078G>A.
A B
A B
45
Tabela 4.6: Classificação da patogenicidade da variante C693Y por análises in sílico.
A alteração c.1738_1741delGAAA (Fig., 4.9), localizada no éxon 11, resulta em uma
mutação frameshift, sendo considerada patogênica, pois altera a sequência de leitura do RNAm.
Esta variante foi encontrada em heterozigose em apenas um paciente (GGC 2114) sem parentes
de 1º grau afetados (Anexo 11) e que manifestou a doença precocemente – aos 29 anos de idade.
Apresenta adenocarcinoma de cólon diferenciado e perda da proteína MSH2. O status de
instabilidade de microssatélites ainda não foi avaliado.
Figura 4.9. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 11.
A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.1738_1741delGAAA.
4.2.3 Variantes identificadas na região promotora do gene MSH2
Conduzimos a triagem de alterações na região promotora do gene MSH2 através do
sequenciamento automático, em 52 pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch. O
paciente MRV não teve sua sequência promotora analisada por falta de material disponível para
a análise.
Nesses pacientes foram identificadas 2 variantes de sequência: (i) 1 variante na posição
c.-118T>C e (ii) 1 variante na posição c.-185C>A.
ALTERAÇÃO PROGRAMA SCORE CLASSIFICAÇÃO
C.2078 G>A
(C693Y)
PolyPhen-2 HumVar = 0,994
HumDiv = 0,980 Possivelmente danosa
SIFT 0 Danosa
Pmut NN output = 0,9319
Confiança = 8 Danosa
A B
46
4.2.4 Características das variantes encontradas na região promotora
A alteração na região c.-118T>C (Fig., 4.10) foi identificada em 7 pacientes em
heterozigose e em 1 paciente em homozigose (Tabela 4.7). De acordo com a classificação
proposta pelo grupo InSiGHT esta variante é considerada não patogênica. De acordo com o
banco de dados TRANSFAC, a sequência contendo o alelo selvagem T é um possível sítio de
ligação para diferentes fatores de transcrição, como por exemplo: CCAAT-binding protein. Já
a sequência contendo o alelo variante C também é um possível sítio de ligação para os fatores
de transcrição NF-1 e LBP-1.
Figura 4.10. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da região promotora
de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.-118T>C em
heterozigose. C) Sequência com a alteração c.-118T>C em homozigose.
Tabela 4.7: Classificação da variante c.-118 T>C.
A variante c.-185C>A foi identificada em apenas um paciente em heterozigose (GGC
865) (Fig., 4.11), que preenche os critérios de Amsterdam (Anexo 12), com dois parentes de
primeiro grau afetados (1 CCR e 1 Adenocarcinoma de reto e mama) e manifestou a doença
aos 52 anos de idade. Este paciente apresenta adenocarcinoma de cólon ascendente
moderadamente diferenciado, com imunohistoquímica positiva para todas as proteínas
avaliadas e microssatélites estáveis. Esta alteração não foi classificada pelo grupo InSiGHT,
portanto, sua relação com a carcinogênese colorretal permanece desconhecida. De acordo com
o banco de dados TRANSFAC, a sequência contendo o alelo selvagem C é um possível sítio
ALTERAÇÃO PACIENTES EM
HETEROZIGOSE
PACIENTES EM
HOMOZIGOSE
CLASSIFICAÇÃO
INSIGHT
C.-118 T>C
GGC 1107/ GGC 2113/ AP/
GGC 1109/ GGC 872/
GGC 874/ GGC 896
GGC 864 Não Patogênica
(Classe 1)
A B
C
47
de ligação para os fatores de transcrição SP1 e NF-E4. Já a sequência contendo o alelo variante
A não é sítio de ligação para nenhum fator de transcrição conhecido.
Figura 4.11. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da região promotora
de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Alteração c.-185C>A em heterozigose.
4.2.5 Variante identificada no íntron 1 do gene MSH2
Foi identificada uma variante de sequência no íntron 1 (c.211+9C>G ou IVS1+9C>G)
do gene MSH2 (Fig., 4.12). Esta alteração foi encontrada em 21 pacientes em heterozigose e
em 9 pacientes em homozigose. De acordo com a classificação dada pelo grupo InSiGHT esta
variante é considerada não patogênica (Tabela 4.8).
Figura 4.12.Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR no íntron 1. A)
Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração a alteração c.211+9C>G em
heterozigose. C) Sequência com a alteração c.211+9C>G em homozigose.
A B
A B
B
B
B
C
48
Tabela 4.8: Classificação da variante c211+9C>G.
4.3 Resultados do Sequenciamento de Nova Geração
4.3.1 Média das coberturas dos amplicons
A média de cobertura base-base de cada amplicon para os pacientes 3 e GGC 1108 está
resumida na Tabela 4.9.
Tabela 4.9: Média de cobertura base-base dos 16 amplicons para os pacientes 3 e GGC 1108.
AMPLICON MÉDIA (Nº DE READS)
PACIENTE 3
MÉDIA (Nº DE READS)
PACIENTE GGC 1108
1 152527 347848
2 28506 65360
3 93183 70338
4 19813 4725
5 20616 83930
6 46703 39199
7 17426 21205
8 10235 82567
9 29348 72368
10 25487 54935
11 1898 24345
12 35617 56057
13 384100 11819
14 59888 306216
15 52963 11152
16 20664 46630
ALTERAÇÃO PACIENTES EM
HETEROZIGOSE
PACIENTES EM
HOMOZIGOSE
CLASSIFICAÇÃO
INSIGHT
C.211+9 C>G
GGC 865/ GGC 1094/ AP/ UCC/
GGC 1108/ GGC 872/ GGC 874/
GGC 896/ GGC 867/ GGC 871/
GGC 893/ GGC 1083/ GGC 1085/
SL001/ SL009/ 1/ 4/ 8/ 9/ 16/ SDL
GGC 1107/ GGC 2113/
GGC 864/ GGC 1109/
SL005/ JPR/ 3/ 10/ 13
Não Patogênica
(Classe 1)
49
Os gráficos de cobertura para cada um dos 16 amplicons de cada paciente estão no
Anexo 13.
4.3.2 Variantes identificadas através do Sequenciamento de Nova Geração
No paciente 3 foram identificadas 3 variantes de sequência: (i) na posição 345 (ii) na
posição 5319 e (iii) na posição 13252 (Tabela 4.10).
A variante na posição genômica 345 foi a mesma encontrada pelo sequenciamento
automático de Sanger e resulta na troca do nucleotídeo citosina (C) para o nucleotídeo guanina
(G) (c.211+9 C>G) em homozigose com frequência de 98,03% e uma alta cobertura (82491
reads). Esta alteração ocorre no amplicon 1, correspondente a região do intron 1 sendo,
portanto, confirmada para este paciente.
A variante na posição 5319 do gene MSH2 ocorre no amplicon 2, na região
correspondente ao intron 1 e resulta na deleção do nucleotídeo timina (T) (c.212-16delT ou
IVS1-16delT) em heterozigose, com frequência de 36,43% e alta cobertura (13071 reads). Esta
alteração não foi classificada pelo grupo InSiGHT, portanto, sua relação com a carcinogênese
colorretal permanece desconhecida. Esta alteração não foi identificada pelo sequenciamento de
Sanger.
A variante na posição 13252 do gene MSH2 ocorre no amplicon 6, dentro da região
codificante e resulta na troca de uma guanina (G) por uma adenina (A) em heterozigose, com
uma frequência de 54,31% e alta cobertura (18369 reads). Esta alteração foi a mesma
encontrada pelo sequenciamento de Sanger (c.965G>A) sendo, portando, confirmada para este
paciente.
Tabela 4.10: Resumo das alterações encontradas no paciente 3 através do sequenciamento de nova geração.
Posição Tipo Referência Alelo Zigose
Cobertura da
variante
(Nº de reads)
Cobertura total
da região
(Nº de reads)
Frequência
da Variante
345 SNV C G Homozigoto 82491 84145 98.03%
5319 Deleção T - Heterozigoto 13071 35875 36.43%
13252 SNV G A Heterozigoto 18369 33823 54.31%
50
No paciente GGC 1108 também foram identificadas 3 variantes de sequência: (i) na
posição 345, (ii) na posição 5319 e (iii) na posição 73373 (Tabela 4.11).
A variante na posição 345 do gene MSH2 foi a mesma encontrada pelo sequenciamento
automático de Sanger e resulta na troca do nucleotídeo citosina (C) para o nucleotídeo guanina
(G) (c.211+9C>G) em heterozigose com frequência de 53,37% e uma alta cobertura de 118511
reads. Esta alteração ocorre no amplicon 1, correspondente a região do intron 1 sendo, portanto,
confirmada para este paciente.
A variante na posição 5319 do gene MSH2 ocorre no amplicon 2, na região
correspondente ao intron e resulta na deleção do nucleotídeo timina (T) (c.212-16delT ou IVS1-
16delT) em heterozigose, com frequência de 29,52% e alta cobertura (23464 reads). Esta
alteração não foi classificada pelo grupo InSiGHT, portanto, sua relação com a carcinogênese
colorretal permanece desconhecida. Esta alteração não foi identificada pelo sequenciamento de
Sanger.
A alteração na posição genômica 73373 ocorre no amplicon 13, dentro da região
codificante e resulta na troca do nucleotídeo guanina (G) pelo nucleotídeo adenina (A) em
heterozigose, com uma frequência de 46,79% e uma alta cobertura (4818 reads). Esta alteração
foi a mesma encontrada pelo sequenciamento de Sanger (c.2078G>A) sendo, portando,
confirmada para este paciente.
Tabela 4.11: Resumo das alterações encontradas no paciente GGC1108 através do sequenciamento de nova
geração.
Posição Tipo Referência Alelo Zigose
Cobertura da
variante
(Nº de reads)
Cobertura total da
região
(Nº de reads)
Frequência
da Variante
345 SNV C G Heterozigoto 118511 222068 53.37%
5319 Deleção T - Heterozigoto 23464 79498 29.52%
73373 SNV G A Heterozigoto 4818 10298 46.79%
51
DISCUSSÃO
A partir da análise de variações de ponto, através do sequenciamento automático de
Sanger e do sequenciamento de nova geração no gene MSH2, foram identificadas13 variantes
em uma amostra de 53 pacientes brasileiros com Síndrome de Lynch (Tabela 5.1). Deste total,
9 variantes já haviam sido publicadas anteriormente e 4 são variantes novas, sendo que duas
delas (c.-185C>A; c.212-16delT) foram reportadas no banco de dados dbSNP Short Genetic
Variations (NCBI) porém não foram publicadas e nem validadas quanto á sua associação com
a síndrome.
Utilizando a classificação proposta pelo grupo InSiGHT (banco de dados LOVD) e
pelos programas de predição in sílico, identificamos um total de 6 variantes patogênicas ou
potencialmente patogênicas e 5 variantes benignas. Duas variantes não foram classificadas.
Além disso, 9 alterações foram encontradas em regiões codificantes, 2 em regiões intrônicas e
2 alterações na região promotora do gene MSH2.
Tabela 5.1: Resumo das variantes identificadas pelo sequenciamento de Sanger e de nova geração no
gene MSH2 e suas classificações de acordo com o grupo InSiGHT e programas in sílico.
Variação Posição Classificação
c.-185 C>A Promotor Não classificada (Variante nova)
c.-118T>C Promotor Benigna
c.23C>T Éxon 1 Benigna
c.573C>T Éxon 3 Benigna
c. 388_389del CA Éxon 3 Patogênica
c.1046C>G Éxon 6 Patogênica
c. 965G>A Éxon 6 Benigna
c.1738_1741delGAAA Éxon 11 Patogênica (Variante nova)
c.2021G>A Éxon 13 Patogênica
c.2078G>A Éxon 13 Patogênica (Variante nova)
c.2152C>T Éxon 13 Patogênica
c.212-16delT Íntron1 Não classificada (Variante nova)
c.211+9C>G Íntron 1 Benigna
52
5.1 Variantes de sequência patogênicas ou possivelmente patogênicas
Identificamos a mutação c.388_389delCA em heterozigose no éxon 3 do gene MSH2
em um paciente. Trata-se de uma variante patogênica conhecida, anteriormente descrita em
outros estudos em diferentes populações mundiais (MANGOLD et al., 2005; BARNETSON et
al., 2006; PINHEIRO et al., 2012). Pinheiro e colaboradores (2012) identificaram esta variante
em 16 famílias portuguesas não relacionadas (16/103) e todas compartilhavam de um mesmo
haplótipo de microssatélites e concluíram que esta variante apresenta um efeito fundador em
Portugal, com origem relativamente recente. Por outro lado, esta mutação na linhagem
germinativa ocorre com diferentes haplótipos, sugerindo sua origem de novo, em diferentes
populações como a Alemanha, Escócia, Inglaterra, Argentina, França, América do Norte e
Austrália, sugerindo que esta região genômica pode ser um hot-spot mutacional dentro do gene
MSH2 (PINHEIRO et al., 2012). Esta mutação está localizada no domínio conector, que é
responsável pelas interações intramoleculares e sinalização alostérica entre os diferentes
domínios da proteína (WARREN et al., 2007), conecta a subunidade DNA-binding ao resto do
heterodímero MutSα, além de ser essencial para mediar a interação entre os heterodímeros
MutS e MutL, sendo, portanto, fundamental para o reparo in vivo (MENDILLO et al., 2009).
Devido a isso, mutações patogênicas pontuais neste domínio são responsáveis pela instabilidade
da proteína MSH2 e perda da atividade de reparo. Esta variante é uma mutação frameshift, que
altera a sequência de aminoácidos, gerando um stop códon prematuro e uma proteína truncada
e não funcional. O paciente portador desta variante identificado nesse estudo – SL009, não
apresenta perda da proteína MSH2 por imunohistoquímica, porém a proteína é inativa e não
funcional. Apresenta, no entanto, perda da proteína MSH6, mostrando que não há formação do
heterodímero MutSα, impedindo o reconhecimento do mismatch e consequentemente, a
atividade de reparo do sistema MMR.
A variante c.1046C>G (p.P349R) foi identificada em apenas um paciente (GGC 1109)
com história familiar para SL (critérios de Amsterdam). As análises in sílico para esta variante
foram contraditórias, pois apenas um programa (Pmut) a classificou como sendo neutra, todos
os outros a classificaram como sendo possivelmente patogênica. Esta variante já havia sido
descrita por Thompson e colaboradores (2012) e Chao e colaboradores (2008), porém ambos
os autores só fizeram testes in sílico e não confirmaram sua patogenicidade através de ensaios
funcionais e/ou em amostras controle, com indivíduos não afetados e sem história familiar para
SL. Um estudo caso-controle (PASTRELLO et al., 2011) identificou esta variante em dois
indivíduos não relacionados, todos preenchendo os critérios de Amsterdam, e não encontrou
em nenhum individuo controle (0/100). Esta variante está localizada no domínio lever da
53
proteína, que é responsável por conectar a subunidade ATP-binding ao domínio clamp e fazer
contatos inespecíficos com o DNA. Portanto mutações patogênicas neste domínio causam
diminuição da estabilidade protéica e defeitos no reparo MMR (OLLILA et al., 2008). Estudos
funcionais são necessários para avaliar o real impacto desta variante na função da proteína, uma
vez que, apesar da maioria dos programas in sílico a classificarem como patogênica, o paciente
portador desta variante identificado nesse estudo não apresentou perda das proteínas que
formam o heterodímero MutSα (MSH2 e MSH6).
Outra mutação patogênica no gene MSH2, c.1738_1741delGAAA, foi identificada em
apenas um paciente – GGC 2114. Esta variante é uma mutação frameshift, que altera a
sequência de leitura do RNAm e foi identificada pela primeira vez nesse estudo. Ela ocorre no
domínio lever da proteína, gerando instabilidade da mesma e isso se confirma no resultado de
imunohistoquímica, onde houve a perda da proteína MSH2 neste paciente.
A variante c.2021G>A (p.G674D) foi identificada em um paciente em heterozigose
(paciente 8) no éxon 13 do gene MSH2. Trata-se de uma variante patogênica conhecida, descrita
em outros estudos (GAMMIE et al., 2007; BRIEGER et al., 2011). Em um estudo descritivo,
Brieger e colaboradores (2011) identificaram esta variante em uma família da Alemanha (1/23),
que preenchia os critérios de Amsterdam, mas que desenvolveram tumores não associados a SL
– tumor de pâncreas e mama. Os autores não discutiram a patogenicidade da variante. Em um
outro estudo, Gammie e colaboradores (2007) introduziram 54 mutações missense, incluindo a
variante G674D, no gene MSH2 de levedura através do ensaio de mutagênese sítio-dirigida.
Eles observaram através de ensaios qualitativos e quantitativos de reparo de mismatch que a
variante não afetava a estabilidade da proteína, porém causava perda da atividade de reparo.
Este dado é contraditório aos nossos resultados, já que o paciente portador da variante apresenta
perda da proteína MSH2, mostrando que provavelmente, esta alteração gera instabilidade na
mesma. A variante G674D está localizada no domínio ATPase da proteína, que é crucial para a
funcionalidade do heterodímero MutSα. Este domínio modula a conformação da proteína pela
ligação das moléculas de ADP e ATP. Estudos funcionais mostram que o heterodímero MutSα
se liga ao ADP quando está interagindo com o mismatch na molécula de DNA, e perde afinidade
pelo mismatch quando se liga ao ATP (OLLILA et al., 2008). Portanto, mutações patogênicas
neste domínio influenciam na atividade do complexo ATPase de reconhecimento do mismatch.
54
A transição c.2078G>A é uma alteração nova identificada pela primeira vez por nós em
apenas um paciente – GGC 1108, através dos sequenciamentos de Sanger e de nova geração.
Esta substituição leva à troca de uma cisteína por uma tirosina na posição 693 no domínio
ATPase da proteína MSH2, que é fundamental para a ativação do complexo MutSα e
consequentemente, um regulador essencial do reparo MMR (OLLILA et al., 2008). O paciente
GGC 1108 não apresenta história familiar para a SL (preenche os critérios de Bethesda),
apresenta perda da proteína MSH6, além de alta instabilidade de microssatélites, mostrando que
a atividade de reparo foi perdida. Embora todas as predições in sílico tenham classificado esta
variante como patogênica, estudos funcionais e de caso-controle ajudariam a esclarecer se esta
variante é causal ou um fator de risco para o desenvolvimento da SL.
Outra mutação patogênica no gene MSH2, c.2152C>T, foi identificada em quatro (GGC
1112, GGC 2106, GGC 871 e GGC 874) pacientes, ambos com história familiar para SL e
apenas três com perda da proteína MSH2. Esta mutação resulta na troca de uma glutamina por
um stop códon (p.Q718X) no domínio ATPase, fundamental para a atividade de reparo do
complexo MutSα, e já havia sido descrita na literatura como um hot-spot, devido a sua alta
frequência de ocorrência de novo em diferentes populações mundiais. (ISIDRO et al., 1999;
LAGE et al., 2004; SANTOS et al., 2012; DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2013). Em dois
estudos desenvolvido no Brasil (SANTOS et al., 2012; DOMINGUEZ-VALENTIN et
al.,2013), esta variante foi considerada a mais frequente dentre as alterações encontradas no
gene MSH2, e isto pode ser explicado pela influência da ancestralidade portuguesa na população
brasileira, uma vez que esta variante foi identificada pela primeira vez em famílias portuguesas
associadas à SL e apresenta uma frequência de ocorrência muito alta, podendo sugerir um efeito
fundador desta variante em Portugal.
5.2 Variantes de sequência não patogênicas
De acordo com as análises in sílico e com a classificação proposta pelo grupo InSiGHT,
das variantes de ponto encontradas no gene MSH2, verificamos que 5 são alterações não
patogênicas, uma vez que não comprometem a função de reparo da proteína.
Identificamos a variante c.23C>T (p.T8M) em heterozigose em dois pacientes – GGC
1094 e SL009. Esta variante já foi previamente descrita por diversos estudos em diferentes
populações mundiais (MANGOLD et al., 2005; WANG et al., 2005; SPAEPEN et al., 2006),
porém não foram realizados estudos funcionais e nem a utilização de amostras controles para
definir a patogenicidade da variante. As análises in sílico relativas ao efeito da substituição do
55
aminoácido na função da proteína, utilizando-se os programas SIFT e Pmut, e de acordo com o
grupo InSiGHT classificaram esta variante como sendo benigna. Porém, de acordo com o
programa PolyPhen-2, os resultados foram contraditórios: o modelo de predição HumDiv a
classificou como sendo possivelmente danosa, enquanto o modelo HumVar a classificou como
benigna. Sabendo-se que o modelo de predição HumVar é utilizado preferencialmente para o
diagnóstico de doenças Mendelianas, utilizamos a classificação proposta por este modelo, uma
vez que a Síndrome de Lynch se encaixa nesta descrição de doença. Embora as predições in
sílico tenham classificado esta variante como benigna, esta avaliação deve ser realizada com
cautela, uma vez que a alteração encontra-se em um domínio importante da proteína (mismatch
binding), que é responsável pela interação inespecífica da proteína MSH2 com a fita de DNA
(WARREN et al., 2007). Além disso, o paciente GGC 1094 apresenta perda das proteínas
MSH2 e MSH6 e o paciente SL009 apresenta perda de MSH6, mostrando que algum fenômeno
está regulando a estabilidade destas proteínas e consequentemente, afetando a atividade de
reparo das mesmas. Portanto, análises funcionais, estudos de caso-controle e de co-segragação
ajudariam a esclarecer se a variante p.T8M é realmente benigna ou um fator causal para a
Síndrome de Lynch.
A variante sinônima (p.L191L) foi identificada no éxon 3 do gene MSH2 em apenas um
paciente – SL001. Esta alteração ocorre no domínio conector da proteína MSH2 e foi descrita
anteriormente na literatura como polimorfismo não patogênico (FERRINGTON et al., 1998).
A transição c.965G>A (G322D) foi identificada em três pacientes em heterozigose (3,
10, GGC 1107), através dos sequenciamentos de Sanger e de nova geração, e é um
polimorfismo não patogênico já conhecido, descrito em diversos estudos (SPAEPEN et al.,
2006; OLLILA et al., 2008; DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2011; PASTRELLO et al.,
2011; THOMPSON et al., 2012). Em um estudo funcional desenvolvido na Suíça (OLLILA et
al.,2008), os autores demonstraram que a variante G322D consegue se coexpressar com a
proteína MSH6 e mantem sua afinidade de ligação pelo mismatch de forma similar à proteína
MSH2 selvagem (WT), porém apresenta uma pequena redução na liberação do mismatch após
interação com a molécula de ATP. As análises in sílico realizadas foram contraditórias, pois o
programa SIFT a classificou como patogênica e todos os outros, inclusive o InSiGHT, a
classificaram como benigna. Mesmo assim, esta variante é considerada benigna, uma vez que
mantém sua atividade de reparo intacta e sozinha não é suficiente para causar defeitos no
sistema de reparo MMR (OLLILA et al., 2008). Em todos os três pacientes portadores da
variante, as quatro proteínas estudadas estavam presentes.
56
A alteração c.-118T>C foi identificada na região promotora do gene MSH2 em 7
pacientes em heterozigose e em 1 paciente em homozigose. É um polimorfismo conhecido, já
descrito na literatura e considerado não patogênico por vários autores (SHIN et al., 2002; JUNG
et al., 2006; CHRISTENSEN et al., 2008). De acordo com o banco de dados TRANSFAC, as
sequências contendo os alelos selvagem (T) e variante (C) são possíveis sítios de ligação para
diversos fatores de transcrição em diferentes organismos vertebrados. A sequência contendo o
alelo T serve como sítio de ligação para diferentes fatores, como por exemplo, o mais estudado
- CCAAT-binding, já a sequência contendo o alelo variante C é possível sítio de ligação para
os fatores NF-1 e LBP-1. Em um estudo realizado no Canadá (MRKONJIC et al.,2007), os
autores observaram que esta variante está associada com uma forte história familiar de CCR
em pacientes mulheres, e isto pode ser explicado pelo fato de esse polimorfismo estar localizado
em um sítio de ligação ao fator de transcrição CAAT- binding (também conhecido como NF-Y
ou CBF), que é um conhecido elemento responsivo ao estrogênio, que além de regular
positivamente a transcrição do gene MSH2 e aumentar a atividade de reparo do sistema MMR
em células endometriais (MIYAMOTO et al., 2006), apresenta um efeito protetivo em CCR,
uma vez reduz o risco de desenvolvimento de tumores MSI-H (SLATTERY et al., 2001). Além
disso, a substituição T>C leva a mudança de um sítio de NF-Y para um sítio de ligação ao fator
de transcrição AP-1. Iwahashi e colaboradores (1998) observaram através do ensaio do gene
repórter da luciferase que existe uma pequena diferença na atividade transcricional entre estes
dois alelos, sugerindo que os elementos AP-1 e CCAAT-binding, não estão associados com a
regulação da expressão do gene MSH2. Porém, um estudo realizado por Humbert e
colaboradores (2003) mostrou que o fator AP-1 regula positivamente a expressão de MSH2, e
desempenha um papel crucial na resposta celular à agentes genotóxicos. Em relação aos outros
fatores de transcrição, não há nenhum dado na literatura mostrando a associação destes com a
expressão do gene MSH2.
Outra variante identificada nesse estudo foi c.211+9C>G no íntron 1 do gene MSH2.
Ela foi encontrada em 21 pacientes em heterozigose e em 9 pacientes em homozigose. Trata-se
de um polimorfismo já descrito na literatura (KIM et al., 2004; WANG et al., 2005), porém sua
patogenicidade é contraditória, pois, apesar de o grupo InSiGHT (banco de dado LOVD)
classifica-la como benigna, em alguns estudos, ela foi associada ao risco de desenvolvimento
de várias neoplasias (SANGUANSIN et al., 2006). Em um estudo realizado na Índia
(SRIVASTAVA et al., 2010), os autores observaram que indivíduos homozigotos para o alelo
IVS1+9C apresentavam um risco maior em desenvolver carcinoma de vesícula biliar. Já em
outro estudo desenvolvido por Marra e colaboradores (2001), demonstrou que células
57
linfoblásticas carregando a variante MSH2 IVS1+9C>G eram significantemente mais tolerantes
a agentes metilantes em comparação com células MSH2 selvagens e, consequentemente,
apresentavam uma diminuição na eficiência de reparo. Por ser um polimorfismo que ocorre no
íntron e não altera a estrutura da proteína, acreditamos se tratar de uma variante que
possivelmente pode contribuir para a pré-disposição de apenas alguns tipos tumorais, porém,
mais estudos de associação devem ser realizados em diferentes populações para confirmar a
classificação desta variante.
5.3 Variantes de sequência não patogênicas ou benignas
Duas variantes identificadas nesse estudos não foram classificadas (c.-185C>A e c.212-
16delT), pois além de serem variantes novas, ou seja, não identificadas nos bancos de dados
utilizados no presente trabalho (NCBI e LOVD), também não puderam ser classificadas
utilizando os programas in sílico, uma vez que estes programas predizem alterações que
ocorrem nas regiões codificantes do gene e não alterações que ocorrem no íntron ou no
promotor.
A alteração encontrada no promotor, c.-185C>A, foi identificada em apenas um
paciente em heterozigose – GGC 865, que não apresenta perda de nenhuma das quatro proteínas
estudadas e possui microssatélites estáveis. Esta variante foi identificada pela primeira vez em
nosso estudo e de acordo com o banco de dados TRANSFAC, a sequência contendo o alelo
variante (A) não é sítio de ligação para nenhum fator de transcrição, indicando que esta
alteração não apresenta nenhum efeito funcional. Portanto, sua relação com a carcinogênese
colorretal permanece desconhecida, sendo necessário fazer ensaios funcionais e estudos de
caso-controle para confirmar sua patogenicidade e frequência alélica na população.
A variante não classificada c.212-16delT foi identificada nesse estudo através da técnica
de sequenciamento de nova geração nos dois pacientes avaliados (3 e GGC 1118). Esta
alteração se encontra na região de íntron 1 do gene MSH2, e em ambos os pacientes, ela ocorreu
em heterozigose. No paciente 3, a variante c.212-16delT ocorreu com uma frequência de
36,43% e uma alta cobertura com 13071 reads contendo essa variante. Já no paciente GGC
1108, a variante ocorreu com uma frequência de 29,52% e alta cobertura com 23464 reads
contendo o alelo variante. Esta variante não foi identificada pelo sequenciamento automático
de Sanger, pois os eletroferogramas não apresentavam boa qualidade de leitura na região, uma
vez que esta alteração ocorreu em uma região repetitiva, impossibilitando determinar se a
alteração estava ou não presente, portanto, a variante só poderia ser detectada pelo
58
sequenciamento de nova geração. Porém, a alteração ocorreu com uma baixa frequência
(29.52% e 36.43%, referente a heterozigose) em ambos os pacientes, dificultando sua
interpretação como variante de sequência ou artefato. Portanto, por ser uma deleção que ocorre
em região repetitiva, acreditamos tratar-se de um artefato da técnica PCR, uma vez que a Taq
polimerase não possui sistema de correção, porém são necessárias análises adicionais para
confirmação de sua classificação.
Desde que dados iniciais sobre mutações com predisposição a doenças nos genes de
reparo MLH1, MSH2 MSH6 e PMS2 foram reportadas, um grande número de estudos tem
contribuído para estabelecer o espectro mutacional da Síndrome de Lynch, com mais de 3.072
variantes genéticas únicas identificadas. Porém, estes dados, são predominantemente baseados
em estudos realizados na América do Norte, Europa e Ásia (DOMINGUEZ-VALENTIN et al.,
2013). Mutações nonsense, frameshift e missense são as mais frequentes, enquanto que grandes
rearranjos gênicos e variantes de sítios de splincing constituem menos de 10% das alterações
(DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2013; PLAZZER et al., 2013). Estudos recentes mostram
que a epimutação constitucional (metilação do promotor) e mutações na região promotora, que
resultam no silenciamento transcricional dos genes MMR, também contribuem para a
inativação do sistema de reparo em alguns casos de SL (IWAHASHI et al., 1998; LIU et al.,
2014).
Enquanto que grandes deleções, stop códons prematuros e mutações frameshift afetam
a função gênica e são consideradas patológicas, mutações missense que afetam um único
aminoácido são mais difíceis de interpretar. Dada a frequência com que estas mutações ocorrem
nos genes MMR, são necessários métodos para determinar as implicações funcionais destas
variantes no gene e consequentemente na proteína (WIELDERS et al., 2011). Estudos de caso-
controle e ensaios funcionais são ferramentas importantes para se identificar possíveis variantes
candidatas, confirmando assim, qual efeito que esta apresenta na proteína e qual seu
envolvimento na doença (JURADO-ESTEBAN et al., 2014). Além disso, em casos de famílias
pequenas e com penetrância incompleta, a análise de co-segregação do alelo variante com a
doença é dificultada, e por isso, muitas vezes essas alterações são consideradas como variantes
não classificadas (UV) (WIELDERS et al., 2011). Devido à isto, ensaios funcionais, análise da
frequência da variante, história familiar e programas de predição têm sido utilizados para
determinar a patogenicidade destas variantes.
Observamos nesse estudo uma frequência total de variantes patogênicas ou
potencialmente patogênicas, ou seja que altera a estrutura ou função da proteína, de 46.1%
59
(6/13) e uma frequência de 38.4% (5/13) de alterações classificadas como benignas. Estes
resultados estão de acordo com os dados da literatura (SANTOS et al., 2012), que mostram que
a maioria das mutações nos genes MMR em pacientes com SL causa perda de função da
proteína afetada. As variantes patogênicas encontradas neste estudo foram identificadas em 9
pacientes, porém apenas 5 apresentaram perda da proteína MSH2 por imunohistoquímica, e isto
pode ser explicado devido a três possíveis hipóteses: (i) problema funcional do anticorpo
utilizado na técnica; (ii) o segundo “hit” mutacional inativou a proteína, porém a manteve
estável; (iii) alteração em outro gene MMR, sendo esta a responsável pelo desenvolvimento
tumoral. Duas variantes não puderam ser classificadas, portanto estudos funcionais e também
de caso-controle são fundamentais para avaliar o impacto destas alterações no desenvolvimento
tumoral, avaliar suas frequências alélicas na população e determinar os padrões de co-
segregação do alelo variante com a doença. Além disso, a maioria das alterações encontradas
nas regiões codificantes do gene MSH2 são variantes missense (55.5%), seguida por mutações
frameshift (22.2%), nonsense (11.1%) e alterações sinônimas (11.1%), e estes resultados são
contraditórios ao de outros estudos (PELTOMÄKI; VASEN, 1997; APESSOS et al., 2005;
SPAEPEN et al., 2005; DOMINGUEZ-VALENTIN et al., 2011; SANTOS et al., 2012), em
que mutações nonsense e frameshif foram observadas como as mais frequentes. Dentre as
alterações encontradas, a mais frequente foi a variante c.2152C>T (p.Q718X) no éxon 13 do
gene MSH2, identificada em 4 pacientes, todos de Porto Alegre. Este resultado está de acordo
com outros estudos feitos no Brasil (SANTOS et al., 2012; DOMINGUEZ-VALENTIN et al.,
2013), em que esta variante também foi considerada a alteração mais frequente, confirmando-
a como um hot-spot.
Observamos também a presença de uma mutação com efeito fundador em Portugal no
gene MSH2: c.388_389delCA, identificada em apenas 1 paciente (SL009), e isto pode ser
explicado pela influência da migração portuguesa no Brasil (ISIDRO et al., 1999; PINHEIRO
et al., 2012). A variante c.388_389delCA não foi identificada na população brasileira, apenas
em outras populações mundiais.
Foram identificadas variantes nas regiões codificantes do gene MSH2 em 14 pacientes,
sendo que, a maioria ocorreu em pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
(HCPA) no Rio Grande do Sul (9/14), seguido do Hospital AC Camargo em São Paulo (3/14)
e Hospital Universitário João de Barros Barreto (Belém do Pará) (2/14). Nenhum paciente do
Instituto Nacional de Câncer (INCA) do Rio de Janeiro apresentou mutações na linhagem
germinativa em regiões exônicas. Na Tabela 5.2 estão resumidas as características clínico-
epidemiológicas dos 14 pacientes com mutações nas regiões codificantes do gene MSH2.
60
Tabela 5.2: Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com alteração na região codificante do gene
MSH2.
Legenda: N = normal; L = perda (lost); MSS = microssatélite estável; MSI-H = alta instabilidade de microssatélite;
F = feminino; M = masculino; NA = não avaliado; I = incolclusivo.
A ausência de variantes de sequência no gene MSH2 em nossa coorte é consistente com
a de outros estudos (FARRINGTON et al., 1998; KÁMORY et al., 2003, ROMERO et al.,
2013) uma vez que este gene é responsável por aproximadamente 50% das mutações
identificadas em famílias com SL. Portanto, a identificação de mutações na linhagem
germinativa nos outros genes MMR (MLH1, MSH6 e PMS2) é de grande relevância para
estabelecer as bases genéticas da síndrome e assim, determinar com precisão quem são os
pacientes e familiares que estão ou não em risco para a doença, possibilitando uma maior
eficiência no diagnóstico e tratamento de indivíduos em risco. Além disso, é fundamental a
busca por grandes rearranjos gênicos e também por alterações epigenéticas e na região
promotora, embora estas representem apenas uma pequena parcela do espectro mutacional da
SL.
Paciente Local de
origem
Critério de
inclusão Sexo
Idade ao
diagnóstico
Diferenciação
tumoral Alteração
IHQ
MSH2 MSI
GGC 1094 Porto Alegre Bethesda M 31 Não indicado c.23C>T L MSS
SL009 Belém Amsterdam F 46 Diferenciado c.23C>T/
c.388_389delCA N NA
SL001 Belém Bethesda F 30 Não indicado c.573C>T NA NA
GGC 1109 PortoAlegre Amsterdam F 30 NA c.1046C>G N NA
3 Ac.Camargo Bethesda F 60 Moderadamente c.965G>A N NA
10 Ac.Camargo Bethesda M 35 Moderadamente c.965G>A N NA
GGC 1107 Porto Alegre Amsterdam M 38 Moderadamente c.965G>A N MSI-H
GGC 2114 Porto Alegre Bethesda M 29 Diferenciado c.1738_1741del
GAAA L NA
8 Belém Bethesda M 44 Moderadamente c.2021G>A L NA
GGC 1108 Porto Alegre Bethesda F 42 Moderadamente c.2078G>A N MSI-H
GGC 1112 Porto Alegre Amsterdam F 34 Pouco c.2152C>T L MSI-H
GGC 2106 Porto Alegre Amsterdam F 50 Moderadamente c.2152C>T L NA
GGC 871 Porto Alegre Amsterdam F 30 NA c.2152C>T L I
GGC 874 Porto Alegre Amsterdam M 29 Não indicado c.2152C>T N MSI-H
61
CONCLUSÕES
A partir da investigação de mutações pontuais no gene MSH2 em 53 pacientes com
Síndrome de Lynch, identificamos 6 variantes patogênicas ou potencialmente
patogênicas (c. 388_389delCA; c.1046C>G; c.1738_1741delGAAA; c.2021G>A;
c.2078G>A; c.2152C>T), representando 46.1% das variantes identificadas neste estudo.
Identificamos 9 pacientes apresentando mutações patogênicas ou possivelmente
patogênicas nas regiões codificantes do gene MSH2, sendo que 6 preenchiam os
critérios de Amsterdam e 3 preenchiam os critérios de Bethesda, mostrando que os
critérios de diagnóstico clínico são mais sensíveis e específicos para identificar a
presença de mutações patogênicas no gene MSH2.
Obtivemos uma frequência total de variantes missense de 55.5%, seguido de 22.2% de
mutações frameshift, 11.1% de mutações nonsense e 11.1% de alterações sinônimas,
além de alterações na região promotora e de íntron, mostrando que o espectro
mutacional do gene MSH2 é bastante heterogêneo, englobando diferentes tipos de
alterações.
Identificamos 4 variantes novas, sendo que duas delas (c.1738_1741delGAAA;
c.2078G>A) foram classificadas como sendo patogênicas, através de programas de
predição in sílico, e duas não puderam ser classificadas (c.-185 C>A; c.212-16delT),
mostrando a importância da utilização métodos como: análise funcional, estudo de caso-
controle e de co-segregação para determinar as implicações funcionais destas variantes
no gene e na proteína.
Identificamos quatro polimorfismos comuns na população (c.965G>A; c.-118T>C;
c.211+9C>G; c.573C>T).
Obtivemos como a variante mais frequente a alteração p.Q718X, identificada em 4
pacientes de Porto Alegre, sugerindo um possível efeito fundador da variante, porém,
são necessárias análises de haplótipos para confirmação.
62
Identificamos uma mutação com efeito fundador em Portugal (c.388_389delCA) no
gene MSH2 em um paciente. Esta variante não foi relatada previamente na população
brasileira, apenas em outras populações mundiais.
Observamos uma frequência maior de mutações nas regiões codificantes do gene MSH2
em pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) no Rio Grande
do Sul (64.2%). E nenhum paciente do Instituto Nacional de Câncer do Rio de Janeiro
apresentou variantes nestas regiões.
A metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) utilizada nesse estudo
apresentou mesma eficiência que o método tradicional de Sanger na identificação de
variantes no gene MSH2, confirmando os resultados encontrados pelo último. Porém,
a técnica NGS têm sua importância, pois além de fornecer dados quantitativos, sendo
portanto mais precisa, permite o sequenciamento de milhões de fragmentos de DNA ao
mesmo tempo (aumentando o número de pacientes e genes sequenciados na mesma
corrida) e apresenta uma redução no custo por megabase.
Esse estudo contribuiu para uma melhor caracterização da SL no Brasil, através da
identificação de regiões genéticas de hot-spot, mutações fundadoras reconhecidas
internacionalmente e mutações de pré-disposição à SL, o que é de grande relevância
para o aconselhamento genético, diagnóstico e prevenção do câncer em diversas
famílias com a síndrome.
63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADZHUBEI, I et al., A method and server for predicting damaging missense mutations.
Nat Methods 7: 248-249, 2010.
ALEXANDER, J et al., Histopathological identification of colon cancer with microsatellite
instability. Am J Pathol 158: 527-35, 2001.
APESSOS, A et al., hMSH2 is the most commonly mutated MMR gene in a cohort of
Greek HNPCC patients. Br J Cancer 92: 396-404, 2005.
BACHER, J.W et al., Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-
High tumors. Dis Markers 20: 237-50, 2004.
BANSIDHAR, B; SILINSKY, J. History and pathogenesis of Lynch Syndrome. Clin Colon
Rectal Surg 25: 63-66, 2012.
BARAULT, L et al., Hypermethylator phenotype in sporadic colon cancer: Study on a
population-based series of 582 cases. Cancer Res 68: 8541-46, 2008.
BARNETSON, R et al., Identification and survival of carriers of mutations in DNA
mismatch-repair genes in colon cancer. N Engl J Med 354: 2751-63, 2006.
BECK, E et al., Use of SSCP analysis to identify germline mutations in HNPCC families
fulfilling the Amsterdam criteria. Hum Genet 99 (2): 219-24, 1997.
BEGGS, A.D et al., Peutz-Jeghers syndrome: a systematic review and recommendations
for management. Gut 59 (7): 975–986, 2010.
BOLAND, C.R; TRONCALE, F.J. Familial colonic cancer without antecedent polyposis.
Ann Intern Med 100 (5): 700–70, 1984.
BOLAND, C et al., A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for
cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the
determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 58: 5248-5257,
1998.
64
BOLAND, C.R. Evolution of the nomenclature for the hereditary colorectal cancer
syndromes. Fam Cancer 4 (3): 211–218, 2005.
BOLAND, C.R; GOEL, A. Microsatellite instability in Colorectal Cancer. Gastroenterology
138 (6): 2073-2087, 2010.
BOWERS, J et al., MSH-MLH complexes formed at a DNA mismatch are disrupted by
the PCNA sliding clamp. J Mol Biol 306 (5): 957-68, 2001.
BRIEGER, A et al., Malignant fibrous histiocytoma is a rare Lynch Syndrome-associated
tumor in two German families. Familial Cancer 10: 591-595, 2011.
BRYONY, T et al., Calibration of multiple in sílico tools for predicting pathogenicity of
mismatch repair gene missense substitutions. Human Mutation 34: 255-265, 2012.
BURT, R.W et al., Colorectal cancer screening. Hereditary predisposition. National
Comprehensive Cancer Network; version 1, 2007.
CHAO, E et al., Accurate classification of MLH1/MSH2 missense variants with
multivariate analysis of protein polymorphisms- mismatch repair (MAPP-MMR). Human
Mutation 29 (6): 852-860, 2008.
CHRISTENSEN, L et al., The association between genetic variants in hMLH1and hMSH2
and the development of sporadic colorectal cancer in the Danish population. BMC Medical
Genetics 9 (52): 1-13, 2008.
COSSIO, S.L et al., Clinical and histomolecular endometrial tumor characterization of
patients at-risk for Lynch Syndrome in South of Brazil. Fam Cancer (2): 131-139, 2010.
COURA, R.S; ASHTON-PROLLA, P; PROLLA, J.C. Hereditary non-polipomatous
colorectal cancer: hereditary predisposition, diagnosis and prevention. Arq Gastroenterol;
42 Suppl 2: 99-106, 2005.
COX, E.C; DEGNEN, G.E; SCHEPPE, M.L. Mutator gene studies in Escherichia coli: the
mutS gene. Genetics 72: 4135-4139, 1972.
DA SILVA, F.C et al., Mismatch repair genes in Lynch Syndrome: a review. São Paulo
Med J 127 (1): 46-51, 2009.
65
DA SILVA, F.C et al., Frequency of extracolonic tumors in Brazilian families with Lynch
Syndrome: analysis of a hereditary colorectal cancer institutional registry. Fam Cancer,
2010.
DANTAS, E et al., Genetics of hereditary cancer. Rev Bras de Cancerologia 55 (3): 263-269,
2009.
DE LA CHAPELLE, A et al., Microsatellite instability. N Engl J Med 349: 209–210, 2003.
DE LA CHAPELLE, A. The incidence of Lynch Syndrome. Fam Cancer 4 (3): 233-7, 2005.
DOMINGUEZ-VALENTIN, M et al., Mutation spectrum in South American Lynch
Syndrome families. Hereditary Cancer in Clinical Practice 11(18): 1-9, 2013.
EDELBROCK, M; KALIYAPERUMAL, S; WILLIAMS, K. Structural, molecular and
cellular functions of MSH2 and MSH6 during DNA mismatch repair, damage signaling
and other noncanonical activities. Mutation Research, 2012.
FARRINGTON, S et al., Systematic analysis of hMSH2 and hMLH1 in young colon cancer
patients and controls. Am J Hum Genet 63: 749-759, 1998.
FEARON, E.R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology:
Mechanisms of disease, 6: 479-507, 2011.
FERRER-COSTA, C et al., PMUT: a web-based tool for the annotation of pathological
mutations on proteins. Bioinformatics 21: 3176-3178, 2005.
FRANCO, E.D; FRANCO, E.L. Epidemiologia e fatores de risco em câncer colorretal. In
ROSSI, B.M et al., Câncer de cólon, reto e ânus. São Paulo: Lemar/Tecmmed, 2005.
FUJIWARA, T et al., Accumulated clonal genetic alterations in familial and sporadic
colorectal carcinomas with widespread instability in microsatellite sequences. Am J Pathol,
153 (4): 1063-1078, 1998
GAMMIE, A et al., Functional characterization of pathogenic human MSH2 missense
mutations in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 177: 707-721, 2007.
GIL, C; CASALI, J.C. Livro Oncologia Molecular. 2ª edição (2011).
66
GRADY, W.M. Genomic instability and colon cancer. Cancer Metastasis Rev 23: 11-27,
2004.
GRADY, W.M; CARETHERS, J.M. Genomic and epigenetic instability in colorectal cancer
pathogenesis. Gastroenterology 135: 1079-99, 2008.
GRADY, W.M; PRITCHARD, C. Molecular alterations and biomarkers in colorectal
câncer. Toxicologic Pathology, 00:1-16, 2013.
GROVER, S et al., Colorectal câncer risk perception on the basis of genetic test results in
individuals at risk for Lynch Syndrome. J Clin Oncol 20: 27 (24): 3981-6, 2009.
HAFE, B; ROBERTSON, S. DNA mismatch repair and genetic instability. Annu Rev Genet
34: 359-399, 2000.
HANAHAN, D; WEINBERG, R.A. The hallmarks of cancer. Cell, 100: 57-70, 2000.
HANAHAN, D; WEINBERG, R.A. The hallmarks of cancer: The next generation. Cell 144:
646-674, 2011.
HSIEH, P; YAMANE, K. DNA mismatch repair: molecular mechanism, cancer, and
ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8): 391-407, 2008.
HUMBERT, O et al., hMSH2 expression is driven by AP1-dependent regulation through
phorbol-ester exposure. Nucleic Acids Research 31 (19): 5627-5634, 2003.
IMAI, K; YAMAMOTO, H. Carcinogenesis and microsatellite instability: the interrelation
between genetics an epigenetics. Carcinogenesis 29: 673-680, 2008.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ DE ALENCAR. Incidência de câncer no
Brasil: Estimativa 2014.
ISIDRO, G et al., Four novel MSH2/MLH1 gene mutations in Portuguese HNPCC
families. Human Mutation 283: 1-4, 1999.
IWAHASHI, Y et al., Promoter analysis of the human mismatch repair gene hMSH2. Gene
213: 141-147, 1998.
67
IYER, R et al., DNA mismatch repair: functions and mechanisms. Chemical Reviews 106:
302-323, 2006.
JIRICNY, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews/Molecular Cell
Biology, 2006.
JONES, A.M et al., Array-CGH analysis of microsatellite-stable, near-diploid bowel
cancers and comparison with other types of colorectal carcinoma. Oncogene 24: 118-129,
2005.
JUNG, C et al., Polymorphisms in the hMSH2 gene and the risk of primary lung cancer.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15: 762-768, 2006.
JURADO-ESTEBAN, C et al., New genes emerging for colorectal cancer predisposition.
World Journal of Gastroenterology 20 (8): 1961-1971, 2014.
KÁMORY, E et al., hMLH1and hMSH2 somatic inactivation mechanisms in Sporadic
colorectal cancer patients. Pathology Oncology Research 9 (4): 236-241, 2003.
KÁMORY, E et al., Two germline alterations in mismatch repair genes found in a HNPCC
patient with poor family history. Pathol Oncol Res 12: 228-233, 2006.
KANE, M et al., Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression
of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell
lines. Cancer Res 57: 808-11, 1997.
KASTRINOS, F; STOFFEL, E.M. History, Genetics, and Strategies for Cancer Prevention
in Lynch Syndrome. Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2014.
KIM, C et al., Methylation of the hMLH1 and hMSH2 promoter in early-onset sporadic
colorectal carcinomas with microsatellite instability. Int J Colorectal Dis 18: 196-202, 2003.
KIM, J et al., Characterization of mutator phenotype in familial colorectal cancer patients
not fulfilling Amsterdam criteria. Clinical Cancer Research 10: 6159-6168, 2004.
LAGE, P et al., Association of colonic and endometrial carcinomas in Portuguese families
with hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma significantly increases the probability
68
of detecting a pathogenic mutation in mismatch repair genes, primarily the MSH2 gene.
Cancer 101 (1): 172-177, 2004.
LINDBLOM, A et al., Genetic mapping of a second locus predisposing to hereditary non-
polyposis colon cancer. Nat Genet 5 (3): 279–282, 1993.
LINDOR, N.M; GREENE, M.H. The concise handbook of Family cancer syndromes. Mayo
Familial Cancer Program. Journal of the National Cancer Institute 14: 1039-71, 1998.
LINDOR, N.M et al., Lower cancer incidence in Amsterdam-I criteria families without
mismatch repair deficiency: familial colorectal cancer type X. JAMA 293(16): 1979–1985,
2005.
LIU, Y; BODMER, W.F. Carcinogênese colorretal. In ROSSI, B.M et al., Câncer de cólon,
reto e ânus. São Paulo: Lemar/Tecmmed, 2005.
LIU, Y et al., Systematic study on genetic and epimutational profile of a cohort of
Amsterdam criteria-defined Lynch Syndrome in Singapore. PLOS One 9 (4): 1-10, 2014.
LIVING, Z. Immunohistochemistry versus Microsatellite Instability Testing for Screening
Colorectal Cancer Patients at Risk for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer
Syndrome Part II. The Utility of Microsatellite Instability Testing. J Mol Diagn, 10: 301–
307, 2008.
LYNCH, H.T et al., Hereditary factors in cancer. Study of two large Midwestern kindreds.
Arch Intern Med 117 (2): 206–212, 1966.
LYNCH, H; DE LA CHAPELLE, A. Hereditary Colorectal Cancer. N Engl J Med 348: 919-
32, 2003.
LYNCH, J.F et al., Histórico do câncer colorretal hereditário sem polipose. In ROSSI, B.M
et al., Câncer de cólon, reto e ânus. São Paulo: Lemar/Tecmmed, 2005.
MAHANEY, B.L; MEEK, K; LEES-MILLER, S.P. Repair of ionizing radiation-induced
DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochem J 417 (3): 639-50,
2009.
69
MANGOLD, E et al., Spectrum and frequencies of mutations in MSH2 and MLH1
identified in 1,721 German families suspected of hereditary nonpolyposis colorectal
cancer. Int J. Cancer 116: 692-702, 2005.
MARKOWITZ, S. DNA repair defects inactivate tumor suppressor genes and induce
hereditary and sporadic colon cancers. J Clin Oncol 56-61, 1999.
MARRA, G et al., Tolerance of human MSH2+/- lymphoblastoid cells to the methylating
agent temozolomide. Proc Natl Acad Sci 98: 7164-7169, 2001.
MARTINEZ, S.L; KOLODNER, R.D. Functional analysis of human mismatch repair gene
mutations identifies weak alleles and polymorphisms capable of polygenic interactions.
PNAS 107: 5070-5075, 2010.
MÉNDEZ-ACUÑA, L et al., Histone post-translational modifications in DNA damage
response. Cytogenetic and Genome Research 128: 28-36, 2010.
MENDILLO, M et al., A conserved MutS homolog connector domain interface interacts
with MutL homologs. PNAS 106 (52): 22223-22228, 2009.
MIYAMOTO, T et al., Estrogen up-regulates mismatch repair activity in normal and
malignant endometrial glandular cells. Endocrinology, 147: 4863-4870, 2006.
MODRICH, P. Mechanisms in eukaryotic repair. J Biol Chem 281 (41): 30305-30309, 2006.
MRKONJIC, M et al., MSH2 -118T>C and MSH6 -159C>T promoter polymorphisms and
the risk of colorectal cancer. Carcinogenesis 28 (12): 2575-2580, 2007.
NAGASAKA, T et al., Somatic hipermethylation of MSH2 is a frequent event in Lynch
Syndrome colorectal cancers. Cancer Research, 2010.
NEGUREANU, L; SALSBURY, F. The Molecular Origin of the MMR-dependent
Apoptosis Pathway from Dynamics Analysis of MutSα-DNA Complexes. Biomol Struct
Dyn 30 (3): 347–361, 2012.
NG, P; HENIKOFF, S. SIFT: predicting amino acid changes that affect protein function.
Nucleic Acids Res 31: 3812-3814, 2003.
70
NOUSPIKEL T. DNA repair in mammalian cells: Nucleotide excision repair: variations
on versatility. Cell Mol Life Sci. 66 (6): 994-1009, 2009.
NOWOSIELSKA, N. A. Bacterial DNA repair genes and their eukaryotic homologues: 5.
The role of recombination in DNA repair and genome stability. Acta Biochim Pol 54 (3):
483-94, 2007.
OLLILA, S et al., Pathogenicity in human MSH2 missense mutants. Human Mutation 29
(11): 1355-1363, 2008.
PASTRELLO, C et al., Integrate analysis of unclassified variants in mismatch repair genes.
Genetics in Medicine 13 (2): 115-124, 2011.
PELTOMÄKI, P et al., Genetic mapping of a locus predisposing to human colorectal
cancer. Science 260 (5109): 810–812, 1993.
PELTOMÄKI, P; VASEN, HFA. The international collaborative group on hereditary
nonpolyposis colorectal cancer. Mutations predisposing to hereditary nonpolyposis
colorectal cancer: database and results of a collaborative study. Gastroenterology 113:
1146-1158, 1997.
PELTOMÄKI, P. Role of DNA mismatch repair defects in the pathogenesis of human
cancer. Journal of Clinical Oncology 21 (6): 1174-1179, 2003.
PINHEIRO, M et al., The MSH2 c.388_389del mutation shows a founder effect in
Portuguese Lynch Syndrome families. Clin Genet 84: 244-250, 2012.
PLAZZER, J.P et al., The InSiGHT database: utilizing 100 years of insights into Lynch
Syndrome. Fam Cancer 12: 175-180, 2013.
POPAT, S; HUBNER, R; HOULSTON, R.S. Systematic review of microsatellite instability
and colorectal cancer prognosis. J Clin Oncol 23: 609-18, 2005.
PROLLA, P. Projeto de pesquisa: Diagnóstico clínico e laboratorial da Síndrome de
Lynch: um estudo de custo-efetividade e de viabilidade de implantação no SUS, 2010.
ROBERTSON A.B et al., DNA repair in mammalian cells: Base excision repair: the long
and short of it. Cell Mol Life Sci. 66 (6): 981-93, 2009.
71
ROCHA, J. Agregação familial de câncer colorretal. In ROSSI, B.M et al., Câncer de cólon,
reto e ânus. São Paulo: Lemar/Tecmmed, 2005.
ROMERO, A et al., Frequency and variability of genomic rearrangements on MSH2 in
Spanish Lynch Syndrome families. PLOS one 8 (9): 1-8, 2013.
ROSSI, B.M et al., hMLH1and hMSH2 gene mutation in Brazilian families with suspected
hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Ann Surg Oncol 9 (6): 555:61, 2002.
ROSSI, B.M. Síndrome de Lynch: Rede Nacional de Câncer Familial: Manual Operacional,
2009.
RUMILLA, K et al., Frequency of deletions of EPCAM (TACSTD1) in MSH2 – associated
Lynch Syndrome cases. J Mol Diagn 13 (1), 2011.
SALK, J.J; FOX, E.J; LOEB, L.A. Mutational heterogeneity in human cancers: origin and
consequences. Annual Review of Pathology: Mechanisms of disease, 5: 51-75, 2010.
SAMAD, A. K et al., A meta-analysis of the association of physical activity with reduced
risk of colorectal cancer. Colorectal Disease, 7 (3): 204-13, 2005.
SANTOS, E et al., Predictive models for mutations in mismatch repair genes: implication
for genetic counseling in developing countries. BMC Cancer, 12 (64): 1-9, 2012.
SANGUANSIN, S et al., hMSH2 gene alterations associated with recurrence of oral
squamous cell carcinoma. J Exp Clin Cancer Res 25: 251-257, 2006.
SHIN, KH et al., Mutational analysis of promoters of mismatch repair genes hMSH2 and
hMLH1 in hereditary nonpolyposis colorectal cancer and early onset colorectal cancer
patients: identification of three novel germ-line mutations in promoter of the hMSH2
gene. Cancer Research 62: 38-42, 2002.
SIENA, S et al., Biomarkers predicting clinical outcome of epidermal growth factor
receptor-targeted therapy in metastatic colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 101: 1308-24,
2009.
SLATTERY, M.L et al., Estrogens reduce and withdrawal of estrogens increase risk of
microsatellite instability-positive colon cancer. Cancer Res, 61: 126-130, 2001.
72
SMYRK, T.C et al., Tumor-infiltrating lymphocytes are a marker for microsatellite
instability in colorectal carcinoma. Cancer 91: 2417-22, 2001.
SPAEPEN, M et al., Germline mutations of the hMLH1 and hMSH2 mismatch repair
genes in Belgian hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC) patients. Familial Cancer
5: 179-189, 2006.
SRIVASTAVA, K; SRIVASTAVA, A; MITTAL, B. Polymorphisms in ERCC2, MSH2 and
OGG1 DNA repair genes and gallbladder cancer risk in a population of Northern India.
Cancer 3160-3169, 2010.
STEINKE, V et al., Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC)/Lynch
Syndrome. Dtsch Arztebl Int 110 (3), 2013.
SUNG-HOON, J; KIM, T.G; BAN, C. DNA mismatch repair system classical and fresh
roles. FEBS Journal 273: 1609-1619, 2006.
SURAWEERA, N et al., Evaluation of tumor microsatellite instability using five
quasimonomorphic mononucleotide repeats and pentaplex PCR. Gastroenterology 123:
1804-1811, 2002.
SWATI, G.P; DENNIS, J.A. Familial colon cancer syndromes: an update of a rapidly
evolving field. Curr Gastroenterol Rep 14 (5): 428-438, 2012.
TANG, R et al., Germ line MLH1 and MSH2 mutations in Taiwanese Lynch Syndrome
families: characterization of a founder genomic mutation in the MLH1 gene. Clin Genet
75: 334-345, 2009.
THIBODEAU, S.N; BREN, G; SCHAID, D. Microsatellite instability in cancer of the
proximal colon. Science 260 (5109): 816–819, 1993.
THOMPSON, B et al., Calibration of multiple in sílico tools for predicting pathogenicity
of mismatch repair genes missense substitutions. Human Mutation 34: 255-265, 2012.
VAN DEN BRANDT, P; GOLDBOHM, R. Nutrition in the prevention of gastrointestinal
cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 20 (3):589-603, 2006.
73
van der KLIFT, H et al., Molecular characterization of the spectrum of genomic deletions
in the mismatch repair genes MSH2, MLH1, MSH6 and PMS2 responsible for hereditary
nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC). Genes Chromosomes Cancer 44 (2): 123-38, 2005.
VASEN, H.F et al., The international Collaborative Group on hereditary nonpolyposis
colorectal cancer (ICG-HNPCC). Dis Col Rectum; 34: 424-5, 1991.
VETTORE, A.L; CABALLERO, O.L. Câncer colorretal. In: FERREIRA, C.G; ROCHA, J.C.
Oncologia Molecular. São Paulo: Editora Atheneu, 2004.
WAGNER, R; MESELSON, M. Repair tracts in mismatched DNA heteroduplexes. Proc
Natl Acad Sci USA 73: 4135-4139, 1976.
WAGNER, A et al., Molecular analysis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer in the
United States: high mutation detection rate among clinically selected families and
characterization of an American founder genomic deletion of the MSH2 gene. Am J Hum
Genet 72 (5): 1088-100, 2003.
WALTHER, A; HOULSTON, R; TOMLINSON, I. Association between chromosomal
instability and prognosis in colorectal cancer: A meta-analysis. Gut 57: 941-50, 2008.
WALTHER, A et al., Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat
Rev Cancer 9: 489-99, 2009.
WANDERLEY, H et al., Síndrome da Polopose Juvenil Familiar. Rede Nacional de Câncer
Familial: Manual Operacional, 2009.
WANG, X.L et al., Clinical and genetic characteristics of Chinese hereditary nonpolyposis
colorectal cancer families. World J Gastroenterol 12 (25): 4074-4077, 2005.
WARREN, J et al., Structure of the human MutSα DNA lesion recognition complex.
Molecular Cell 26: 579-592, 2007.
WARTHIN, A.S. Heredity with reference to carcinoma as shown by the study of the cases
examined in the Pathological Laboratory of the University of Michigan, 1895–1912. Arch
Int Med 12: 546–555, 1913.
74
WEI, W et al., Distinct mutations in MLH1 and MSH2 genes in hereditary non-polyposis
colorectal cancer (HNPCC) families from China. BMB Rep, 2011.
WEISENBERGER, D.J et al., CpG island methylator phenotype with BRAF mutation in
colorectal cancer. Nat Genet 38: 787-93, 2006.
WIELDERS, E et al., Characterization of MSH2 variants by endogenous gene modification
in mouse embryonic stem cells. Human Mutation 32: 389-396, 2011.
WORLD GASTROENTEROLOGY ORGANISATION. Colorectal cancer screening, 2007.
ZAHARY, M et al., Germline mutation analysis of MLH1 and MSH2 in Malaysian Lynch
syndrome patients. World Journal of Gatroenterology 18 (8): 814-820, 2012.
75
ANEXOS
ANEXO 1: Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) específico de participação no
estudo.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PROJETO: DIAGNÓSTICO CLÍNICO E LABORATORIAL DA SÍNDROME DE
LYNCH: UM PROJETO DE CUSTO-EFETIVIDADE E DE VIABILIDADE DE
IMPLANTAÇÃO NO SUS
Nome do Voluntário: ________________________________________________
Você está sendo convidado(a) a participar de um projeto para avaliar o custo de execução de testes
genéticos que permitem detectar alterações no DNA associadas ao desenvolvimento de câncer
colorretal. Para realização desse projeto estruturou-se um consórcio de pesquisadores e Hospitais
brasileiros para avaliar a eficácia, o custo e o impacto do diagnóstico de câncer de cólon (intestino) em
indivíduos brasileiros. Serão convidados a participar alguns pacientes com câncer colorretal atendidos
nos seguintes hospitais: Hospital de Clínicas de Porto Alegre, INCA no Rio de Janeiro, Hospital
AC Camargo em São Paulo, Hospital Universitário João de Barros Barreto em Belém do Pará, e
Hospital do Câncer de Barretos. O projeto pretende também avaliar as características pessoais e
familiares da pessoa e sua relação com as alterações observadas em diferentes testes laboratoriais, que
poderão indicar se o câncer de intestino em uma determinada pessoa tem origem hereditária, ou seja, a
predisposição para o desenvolvimento desse tumor é transmitida de uma geração anterior para a
geração seguinte em uma família.
Serão estudadas algumas características genéticas dos tumores de intestino (a partir de um
pequeno pedaço do tumor que foi retirado na sua cirurgia e conservado em um bloco de parafina)
que incluem os assim chamados exames de rastreamento do câncer genético de intestino. Além disso,
serão realizados testes para verificar se há alterações genéticas (mutações) que podem causar o câncer
de intestino (rearranjos genômicos, mutações em genes de reparo e mutações em outros genes que
causam o câncer de intestino) a partir do DNA retirado das células do sangue de cada paciente. Os
resultados deste projeto poderão trazer mais informações sobre a influência de fatores
hereditários no tratamento de tumores de intestino.
Para que você possa decidir se quer participar ou não deste projeto, precisa conhecer seus
benefícios, riscos e implicações.
76
OBJETIVO DO PROJETO
Avaliar o impacto e a viabilidade do diagnóstico de síndrome de Lynch, a forma mais comum de
câncer colorretal hereditário, no Sistema Único de Saúde mediante investigação clínica e laboratorial de
indivíduos com a doença e provenientes de quatro regiões brasileiras.
PROCEDIMENTOS DO PROJETO
Se você concordar em participar desse projeto serão coletados cerca de 10 mL (o equivalente a
uma colher de chá) de seu sangue para isolamento e análise de DNA (seu material genético), você
também responderá a alguns questionários. Uma parte de seu DNA será utilizada no Instituto
Nacional de Câncer e outras alíquotas serão enviadas a outras instituições que participam desse
projeto (Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Hospital AC Camargo em São Paulo, Hospital
Universitário João de Barros Barreto em Belém do Pará, e Hospital do Câncer de Barretos) onde
serão utilizadas para diferentes análises, e onde ficarão armazenadas até a conclusão do projeto.
Além disso, você autorizará estudar uma amostra de seu tumor de intestino, que será retirada de blocos
de parafina contendo amostras do tumor retiradas durante a cirurgia. Esses blocos também serão
utilizados no Instituto Nacional de Câncer (INCA) e também serão enviados às instituições que
participam do projeto exclusivamente para o presente projeto, e a seguir serão devolvidos ao
INCA. Se porventura os resultados deste projeto mostrarem um risco maior para câncer hereditário de
intestino, você e seus familiares serão convidados para uma nova consulta de aconselhamento genético
em que os resultados da pesquisa lhe serão fornecidos e lhe serão transmitidas informações sobre
recomendações de cuidados médicos e de prevenção. Você terá a sua disposição uma equipe de vários
profissionais que estarão disponíveis para esclarecer suas dúvidas em qualquer fase do estudo.
O seu tratamento será exatamente o mesmo caso você participe ou não deste projeto. A
coleta de sangue para o projeto será uma punção venosa adicional que não é necessária para o seu
tratamento.
MÉTODOS ALTERNATIVOS
Sua participação nesse projeto é voluntária. Caso você não deseje participar deste projeto de
pesquisa, basta que você não assine este Termo de Consentimento, e nenhuma amostra de sangue ou de
seu tumor será coletada. Não existem métodos alternativos para sua participação nesse projeto de
pesquisa, se você não concordar com os procedimentos que serão realizados para a execução desse
projeto você é totalmente livre para não participar do mesmo.
RISCOS
O seu tratamento será exatamente o mesmo caso você participe ou não deste projeto. A coleta de
sangue para o projeto será uma punção venosa adicional que não é necessária para o seu tratamento.
Essa retirada de sangue pode resultar em dor no local da punção e/ou manchas roxas transitórias,
chamadas de equimoses, que irão logo desaparecer.
77
BENEFÍCIOS
Os resultados desse projeto de pesquisa não trarão benefícios para o seu tratamento. Mas os
resultados obtidos poderão informar se você tem ou não maior risco de desenvolver outros tumores e se
esse risco pode ser compartilhado por outros familiares seus.
Os resultados desse projeto também serão importantes para que possamos entender melhor
como se comportam os tumores de intestino hereditários. Essas informações poderão nos ajudar
acompanhar e tratar melhor as pessoas em risco para este tipo de câncer.
CARÁTER CONFIDENCIAL DOS REGISTROS
Além da equipe de saúde que cuidará de você, seus registros médicos poderão ser consultados
pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer (CEP-INCA) e equipe de
pesquisadores envolvidos. Seu nome não será revelado ainda que informações de seu registro médico
sejam utilizadas para propósitos educativos ou de publicação, que ocorrerão independentemente dos
resultados obtidos.
TRATAMENTO MÉDICO EM CASO DE DANOS
Todo e qualquer dano decorrente do desenvolvimento deste projeto de pesquisa, e que necessite
de atendimento médico, ficará a cargo da instituição. Seu tratamento e acompanhamento médico
independem de sua participação neste projeto.
CUSTOS
Não haverá qualquer custo ou forma de pagamento para o paciente pela sua participação no
projeto.
BASES DA PARTICIPAÇÃO
É importante que você saiba que a sua participação neste projeto é totalmente voluntária e que
você pode recusar-se a participar ou interromper sua participação a qualquer momento sem
penalidades ou perda de benefícios aos quais você tem direito. Caso você decida interromper sua
participação no projeto, a equipe assistente deve ser comunicada e a coleta de amostras para os
exames relativos ao projeto será imediatamente interrompida, e os resultados obtidos não serão
utilizados na execução desse projeto.
O médico responsável por sua internação pode interromper sua participação no projeto a
qualquer momento, mesmo sem a sua autorização. Nesse caso o motivo dessa interrupção será
discutido com você.
GARANTIA DE ESCLARECIMENTOS
Nós estimulamos a você ou seus familiares a fazerem perguntas a qualquer momento do projeto.
Neste caso, por favor, ligue para o Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira no telefone 21-3207 6586, ou
para o Doutor Fernando Regla Vargas no telefone 21 3207 6584. Se você tiver perguntas com relação a
seus direitos como participante do projeto clínico, também pode contar com um terceiro contato
78
imparcial, o Comitê de Ética em Pesquisa do INCA, Rua André Cavalcanti, N° 37, telefones 21 – 3207-
6551 ou 21-3207-6565. ou também pelo e-mail: cep@inca.gov.br .
CONSENTIMENTO E ASSINATURA
Li as informações acima e entendi o propósito deste projeto assim como os benefícios e riscos
potenciais da participação no mesmo. Tive a oportunidade de fazer perguntas e todas foram respondidas.
Eu, por intermédio deste, dou livremente meu consentimento para participar neste projeto.
Entendo que poderei ser submetido a exames adicionais aos necessários a meu tratamento e não
receberei compensação monetária por minha participação neste projeto.
Eu recebi uma cópia assinada deste formulário de consentimento.
__________________________________ ____ / _____ / _____
(Assinatura do Paciente) dia mês ano
_______________________________________________________
(Nome do Paciente – letra de forma )
__________________________________ ____ / ____ / _____
(Assinatura de Testemunha, se necessário) dia mês ano
Eu, abaixo assinado, expliquei completamente os detalhes relevantes deste projeto ao paciente
indicado acima e/ou pessoa autorizada para consentir pelo paciente.
__________________________________________ ____ / ____ / ____
(Assinatura da pessoa que obteve o consentimento) dia mês ano
79
ANEXO 2: Informações clínico-epidemiológicas dos 53 pacientes analisados para alterações no gene MSH2.
Legenda: L = perda; N = normal; NA = não avaliado; F = feminino; M = masculino; MSI-H = alta instabilidade de microssatélites; MSS = microssatélites estáveis;
( ) = quantidade de marcador alterado
Centro Paciente Idade ao
Diagnóstico Sexo Critério
Diferenciação
Tumoral
Localização
Tumoral
IHQ
MLH1
IHQ
MSH2
IHQ
MSH6
IHQ
PMS2 MSI
HCPA GGC 864 51 F Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente e
íleo N N N N MSI-H (5)
HCPA GGC 865 52 M Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N N MSS
HCPA GGC 867 48 M Amsterdam Pouco Cólon transverso L N L L MSI-H (5)
HCPA GGC 1085 42 F Amsterdam Moderadamente Cólon transverso N N N N MSI-H (5)
HCPA GGC 875 37 M Amsterdam Não indicado Cólon ascendente N N N L Inconclusivo
HCPA GGC 874 29 M Amsterdam Não indicado Cólon sigmóide N N N N MSI-H (4)
HCPA GGC 885 52 M Bethesda Não indicado Reto N N N N MSS
HCPA GGC 896 44 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N N L MSI-H (5)
HCPA GGC 1108 42 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N L N MSI-H (4)
HCPA GGC 903 48 F Bethesda Moderadamente Retossigmóide L N N N MSS
HCPA GGC 1094 31 M Bethesda Não indicado Reto N L L N MSS
HCPA GGC 893 35 F Bethesda Moderadamente Cólon sigmóide N N N N MSS
HCPA GGC 1107 38 M Amsterdam Moderadamente Cólon transverso N N N N MSI-H (5)
HCPA GGC 1985 30 F Amsterdam Moderadamente Cólon transverso e
descendente N N N N NA
HCPA GGC 872 46 F Amsterdam Moderadamente Ceco N N N L MSI-H (5)
HCPA GGC 1112 34 F Amsterdam Pouco Reto L L L N MSI-H (5)
HCPA GGC 2113 36 F Amsterdam Moderadamente Retossigmóide L N N N NA
HCPA GGC 2106 50 F Amsterdam Moderadamente Retossigmóide N L L N NA
HCPA GGC 1109 30 F Amsterdam NA Retossigmóide N N N N NA
HCPA GGC 871 30 F Amsterdam NA Cólon ascendente N L L N Inconclusivo
HCPA GGC 898 42 F Bethesda NA Intestino N L N N MSS
HCPA GGC 1083 33 F Bethesda NA Retossigmóide N L N N MSS
HCPA GGC 2114 29 M Bethesda Diferenciado Cólon N L N N NA
HCPA GGC 891 40 M Bethesda NA Cólon descendente L L L L MSI-H(5)
INCA SDL 28 F Bethesda Moderadamente Cólon sigmóide N N N NA NA
INCA ADR 42 F Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA
80
ANEXO 2: Informações clínico-epidemiológicas dos 53 pacientes analisados para alterações no gene MSH2 (continuação).
Legenda: L = perda; N = normal; NA = não avaliado; F = feminino; M = masculino; MSI-H = alta instabilidade de microssatélites; MSS = microssatélites estáveis;
( ) = quantidade de marcador alterado
Centro Paciente Idade ao
Diagnóstico Sexo Critério
Diferenciação
Tumoral
Localização
Tumoral
IHQ
MLH1
IHQ
MSH2
IHQ
MSH6
IHQ
PMS2 MSI
INCA FCG 39 M Bethesda Moderadamente Cólon transverso N N N N NA
INCA CPB 46 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA
INCA MOG 39 M Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N L NA
INCA UCC 19 M Bethesda Pouco Reto N N N N NA
INCA AP 70 M Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N NA N N NA
INCA S 32 M Amsterdam Moderadamente Cólon transverso NA NA NA NA NA
Ac.Cam 1 24 F Bethesda Moderadamente Reto N N N N NA
Ac.Cam 3 60 F Bethesda Moderadamente Cólon N N N N NA
Ac.Cam 4 56 F Bethesda Moderadamente Cólon ascendente L N N L NA
Ac.Cam 5 46 M Bethesda Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA
Ac.Cam 6 29 F Bethesda Não indicado Cólon ascendente N N N N MSS
Ac.Cam 7 45 M Amsterdam Não indicado Cólon ascendente L N N L NA
Ac.Cam 8 44 M Bethesda Moderadamente Cólon sigmóide N L N N NA
Ac.Cam 9 34 F Amsterdam Moderadamente Cólon direito NA N N N NA
Ac.Cam 10 35 M Bethesda Moderadamente Cólon N N N N NA
Ac.Cam 14 61 M Amsterdam Não indicado Cólon N N L N NA
Ac.Cam 16 53 F Amsterdam Moderadamente Cólon ascendente N N N N NA
Ac.Cam MT-4A 39 M Amsterdam Diferenciado Cólon e intestino
delgado N L L N NA
Ac.Cam 13 81 F Bethesda Pouco Cólon ascendente L N N N NA
Ac.Cam MRV 21 M Amsterdam Moderadamente Cólon esquerdo N N N N NA
HUJBB SL009 46 F Amsterdam Diferenciado Cólon ascendente N N L N NA
HUJBB SL007 35 F Bethesda Moderadamente Sigmoide Inconclusivo N Inconclusivo N NA
HUJBB SL004 34 M Bethesda Diferenciado Reto N N N Inconclusivo NA
HUJBB SL005 28 F Bethesda Não indicado Cólon ascendente N N N N NA
HUJBB SL001 30 F Bethesda Não indicado Cólon NA NA NA NA NA
HUJBB SL006 52 F Bethesda Não indicado Cólon NA NA NA NA NA
HUJBB SL003 38 F Bethesda Não indicado Reto N N N N NA
81
ANEXO 3: Heredograma da família do paciente SL009.
Ca Gástrico
dx ~ 50
CCR
dx 54 CCR
dx 50 CCR
dx 46/51
(52)
Ca Ovário
dx 36 CCR
dx 32
(48)
Ca Útero
dx 35
(44)
Ca Fígado dx ~ 72
CCR
dx 40/62 CCR dx 40
+ Garganta
CCR
dx ? CCR
dx 45 Ca mama
dx 42
CCR dx ?
+ Útero
CCR
dx 70
+ Leucemia
CCR dx 65
Ca Ossos
dx ~ 75
7 4
I
II
III
IV
Legenda:
Indivíduo afetado
Indivíduo falecido
Indivíduo sem sexo
Casamento
Gêmeos dizigóticos
Probando
4 3 Número de filhos do sexo indicado
Ausência de progênie
Acasalamento consanguíneo
dx Idade ao diagnóstico
82
ANEXO 4: Heredograma da família do paciente GGC 1109.
Câncer Mama dx 48
Câncer Estômago
ou Intestino dx ?
Câncer
Estômago dx 43
Câncer Intestino + Endométrio
dx ?
Câncer
Intestino dx 30
CCR dx 30 Endométrio
dx 45
Carcinoma
Gástrico dx 40
Câncer
Mama dx ?
Câncer
Intestino dx 30
Câncer Intestino
dx ?
Ca ? dx 60
Leucemia dx 13
Ca ? dx ~ 50
Ca ? dx ?
Ca ? dx 38
I
III
II
V
IV
VI
83
ANEXO 5: Heredograma da família do paciente 8.
Adenoma dx 70 (71)
Adenoma dx 46 (46)
Colon dx 44 (45)
Adenoma dx 37 (45)
Linfoma dx 35
Leucemia dx 18
3 3
2
I
II
III
IV
84
ANEXO 6: Heredograma da família do paciente GGC 1112.
Ca
Pulmão dx ?
CCR dx 58
Óbito 63
CCR dx ~50
CCR Óbito < 50
CCR dx 34 (34)
Carcinossarcoma de corpo uterino
dx 45
Tumor Renal dx 52
CCR dx 30
Óbito 60 Ca ?
CCR dx 57
Óbito 60
II
III
IV
V
I
85
ANEXO 7: Heredograma da família do paciente GGC 2106.
CCR dx < 40 Óbito 80
CCR dx 50
Câncer Útero dx 75
Câncer base
língua dx 45
Câncer
Mama dx 46
Câncer Renal dx 60 Câncer
Fígado dx 40
Câncer Bexiga
dx ?
Ca ? dx 40
Ca ? dx ?
I
II
III
IV
86
ANEXO 8: Heredograma da família do paciente GGC 871.
Ca ? dx 35
CCR (39)
Ca Útero? dx ~ 47
CCR Óbito 39
CCR dx ~ 60
Ca ? dx ?
CCR dx 30 (38)
I
II
III
IV
V
87
ANEXO 9: Heredograma da família do paciente GGC 874.
I
II
III
IV
V
CCR dx > 50
13 CCR dx 54
CCR dx 41/55
+ Próstata dx ~ 60
(60)
CCR dx 29 (30)
88
ANEXO 10: Heredograma da família do paciente GGC 1108.
Adenoma dx 73
Adenoma
Estômago dx 50
Estômago Óbito 62
Estômago dx 55
Estômago dx 50
Estômago dx 40
Estômago dx 50
CCR dx 42 (46)
Pólipo dx 40
13
I
III
II
89
ANEXO 11: Heredograma da família do paciente GGC 2114.
CCR dx 62
Óbito 92 90 anos
AVC Óbito 92
Óbito 52
Óbito 98 AVC
3
14
CCR dx 29
I
II
III
IV
V
90
ANEXO 12: Heredograma da família do paciente GGC 865.
CCR
dx 52
CCR
dx ?
CCR
dx 61
(62)
CCR
dx 60
CCR
dx 15 (22)
CCR
dx 57
+ Mama
Ca Esôfago
dx 65
SNC
dx 43
(47)
3
I
II
III
IV
IV
91
ANEXO 13: Gráficos da média de cobertura base-base dos 16 amplicons, gerados pelo
Sequenciamento de Nova Geração.
PACIENTE 3
0
50000
100000
150000
200000
250000
1
14
27
40
53
66
79
92
10
5
11
8
13
1
14
4
15
7
17
0
18
3
19
6
20
9
22
2
23
5
24
8
Cobertura base-base AMPLICON 1
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
123
45
67
89
11
113
315
517
719
922
124
326
528
730
933
135
337
539
7
Cobertura base-base AMPLICON 2
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
1
17
33
49
65
81
97
11
3
12
9
14
5
16
1
17
7
19
3
20
9
22
5
24
1
25
7
27
3
28
9
30
5Cobertura base-base AMPLICON 3
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
1
12
23
34
45
56
67
78
89
10
0
11
1
12
2
13
3
14
4
15
5
16
6
17
7
18
8
19
9
Cobertura base-base AMPLICON 5
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
10
1
11
1
12
1
13
1
14
1
15
1
16
1
17
1
Cobertura base-base AMPLICON 6
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
1
13
25
37
49
61
73
85
97
10
9
12
1
13
3
14
5
15
7
16
9
18
1
19
3
20
5
21
7
22
9
Cobertura base-base AMPLICON 7
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
1 815
22
29
36
43
50
57
64
71
78
85
92
99
10
611
312
012
7
Cobertura base-base AMPLICON 8
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
10
1
11
1
12
1
13
1
14
1
15
1
16
1
17
1
Cobertura base-base AMPLICON 4
92
ANEXO 13: Gráficos da média de cobertura base-base dos 16 amplicons, gerados pelo
Sequenciamento de Nova Geração.
PACIENTE 3 (continuação)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
1 8
15
22
29
36
43
50
57
64
71
78
85
92
99
10
6
11
3
12
0
12
7
Cobertura base-base AMPLICON 9
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
1
10
19
28
37
46
55
64
73
82
91
10
0
10
9
11
8
12
7
13
6
14
5
15
4
Cobertura base-base AMPLICON 10
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1 7
13
19
25
31
37
43
49
55
61
67
73
79
85
91
97
10
3
10
9
11
5Cobertura base-base AMPLICON 11
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
1
16
31
46
61
76
91
10
6
12
1
13
6
15
1
16
6
18
1
19
6
21
1
22
6
24
1
25
6
Cobertura base-base AMPLICON 12
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
1
13
25
37
49
61
73
85
97
10
9
12
1
13
3
14
5
15
7
16
9
18
1
19
3
20
5
21
7
Cobertua base-base AMPLICON 13
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
1
16
31
46
61
76
91
10
6
12
1
13
6
15
1
16
6
18
1
19
6
21
1
22
6
24
1
Cobertura base-base AMPLICON 14
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
1
12
23
34
45
56
67
78
89
10
0
11
1
12
2
13
3
14
4
15
5
16
6
17
7
18
8
19
9
Cobertura bse-base AMPLICON 15
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
1
12
23
34
45
56
67
78
89
10
0
11
1
12
2
13
3
14
4
15
5
16
6
17
7
18
8
19
9
Cobertura base-base AMPLICON 16
93
ANEXO 13: Gráficos da média de cobertura base-base dos 16 amplicons, gerados pelo
Sequenciamento de Nova Geração.
PACIENTE GGC 1108
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
1
15
29
43
57
71
85
99
11
3
12
7
14
1
15
5
16
9
18
3
19
7
21
1
22
5
23
9
Cobertura base-base AMPLICON 1
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
1
24
47
70
93
11
6
13
9
16
2
18
5
20
8
23
1
25
4
27
7
30
0
32
3
34
6
36
9
39
2
Cobertura base-base AMPLICON 2
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
1
18
35
52
69
86
10
3
12
0
13
7
15
4
17
1
18
8
20
5
22
2
23
9
25
6
27
3
29
0
30
7Cobertura base-base AMPLICON 3
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
10
1
11
1
12
1
13
1
14
1
15
1
16
1
17
1
Cobertura base-base AMPLICON 4
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
112
23
34
45
56
67
78
89
10
011
112
213
314
415
516
617
718
819
921
022
1
Cobertura base-base AMPLICON 5
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
1
11
21
31
41
51
61
71
81
91
10
1
11
1
12
1
13
1
14
1
15
1
16
1
17
1
Cobertura base-base AMPLICON 6
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
1
13
25
37
49
61
73
85
97
10
9
12
1
13
3
14
5
15
7
16
9
18
1
19
3
20
5
21
7
22
9
Cobertura base-base AMPLICON 7
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
1 9
17
25
33
41
49
57
65
73
81
89
97
10
5
11
3
12
1
12
9
Cobertura base-base AMPLICON 8
94
ANEXO 13: Gráficos da média de cobertura base-base dos 16 amplicons, gerados pelo
Sequenciamento de Nova Geração.
PACIENTE GGC 1108 (continuação)
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
1 8
15
22
29
36
43
50
57
64
71
78
85
92
99
10
6
11
3
12
0
12
7
Cobertura base-base AMPLICON 9
0
20000
40000
60000
80000
100000
110
19
28
37
46
55
64
73
82
91
10
010
911
812
713
614
515
4
Cobertura base-base AMPLICON 10
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
1 7
13
19
25
31
37
43
49
55
61
67
73
79
85
91
97
10
3
10
9
11
5Cobertura base-base AMPLICON 11
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
1
16
31
46
61
76
91
10
6
12
1
13
6
15
1
16
6
18
1
19
6
21
1
22
6
24
1
25
6
Cobertura base-base AMPLICON 12
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
1
13
25
37
49
61
73
85
97
10
9
12
1
13
3
14
5
15
7
16
9
18
1
19
3
20
5
21
7
Cobertura base-base AMPLICON 13
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
1
16
31
46
61
76
91
10
6
12
1
13
6
15
1
16
6
18
1
19
6
21
1
22
6
24
1
Cobertura base-base AMPLICON 14
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
1
12
23
34
45
56
67
78
89
10
0
11
1
12
2
13
3
14
4
15
5
16
6
17
7
18
8
19
9
Cobertura base-base AMPLICON 15
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
1
13
25
37
49
61
73
85
97
10
9
12
1
13
3
14
5
15
7
16
9
18
1
19
3
Cobertura base-base AMPLICON 16
1
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