Mekanisme Pemisahan Secara Exklusi ( Exclusion Chromatography )

Mekanisme Pemisahan Secara Exklusi (Exclusion Chromatography)

Prinsip : Pemisahan komponen oleh gel didasarkan ukuran besar atau kecil molekul-molekul komponen.

Molekul-molekul (larut), komponen kecil masuk ke dalam jaringan polimer (gel), sehingga gerakan dihambat. Sedangkan molekul besar tak dapat memasuki jaringan polimer dan akan keluar kolom lebih cepat dibawa fase gerak.

Fase diam (dalam kolom)

- Gel non ionik, berpori banyak dan sama rata ukuran bentuk.

- misalnya : Sephadex

- Dibedakan dua gel : 1. Gel Filtrasi adalah polimer sukrosa atau

dextran yang membengkak dalam air.

2. Gel Permeasi adalah polimer membengkak di

dalam pelarut organik.

O OO

O

O

O

CH

2

OOH CH

2

OH

OH

O

O CH

2

CH2

CH

CH2

O

CH2O

O

OH

OH

OOH

CH

2

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

OH

CH

2O

O

O

CH2 CH

CONH2

CH2 CH

CO NH

) H2C

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CONH

CH

CONHCONH

CONH2

CH2CH2

CONH

CH

CH2

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CONH

CH2

CH

CONH2

CONH2

Sephadex(dextran cross linkdengan glycerine)

(2

acrylamide N,N'-methylbisacryllamide

Polyacrylamide

Mekanisme Pemisahan Secara Penukar Ion (Ion Exchange)

- Setelah dikembangkan resina polistiren (1940)

- Pemisahan unsur tanah jarang

- Senyawa-senyawa pada Biokimia.

Dasar Pemisahan :

Perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan resina

Senyawa terlarut (linarut) yang berinteraksi lemah akan keluar lebih cepat, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat akan ditahan kolom lebih lama, maka akan keluar kemudian.

X - + R+ Y - Y - + R+ X -

X+ + R - Y+ Y+ + R - X+

Senyawa sampel

Bag. ion resin

ion fase gerak

Fase Diam : resin buatan organik atau anorganik

Contoh : Polistirena kation

Polistirena anion

Polidextran pemisahan protein

Fase Gerak :

Contoh : air + anion

air + Kation (KH2PO4 NaH2PO4 ) pH 4

CH CH2

CH CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH2

CH

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2N(CH3)3

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH2

CH

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH

CH

2

SO3-

SO3-

SO3-

Styren divinylbenzen

H+

H+

H+

+

Cl-

Resin penukar anion

Resin penukar kation

Mekanisme Pemisahan Secara Afinitas (Affinity Chromatography)

Prinsip : Interaksi yang sangat spesifik antara solute dengan molekul yang terikat secara kovalen (immobilized) pada fase diam.

Contoh : Molekul antibody terikat secara kovalen dengan fase diam. Jika campuran berisi 1000 protein dilewatkan kolom, hanya satu protein bereaksi dengan antibody yang terikat pada kolom.

Setelah pencucian semua solute (1000-1) protein keluar dari kolom. Protein yang diinginkan dilepaskan dari antibody dengan perubahan: pH fase gerak atau kekuatan mengionkan fase gerak.

Contoh : Mol coplanar mempunyai ggs Cis-diol dapat dipisahkan dari campuran komplek (nukleotida) dengan cara melewatkan pada kolom dengan asam fenil boronat terikat

AFFI GEL 601 yang dijual dipasaran adalah bentuk dari Biogel P-6 yang mengikat asam fenil boronat yang dapat mengikat coplanar Cis-diol.

Nukleotida yg tak ada ggs cis diol akan keluar.

Sedangkan Nukleotida dg ggs cis diol

Akan ditahan. Setelah dielusi buffer sitrat Nukleotida cis diol akan keluar.

Bio Gel P-6-C-N-C-C-N-C-C-C-C-N-

B

HO OH

O

H

Teori Pelat dan Teori Kecepatan

Teori Pelat (Plate theory) (Martin dan Synge, 1941)

: pada fase diam dan fase gerak terjadi kesetimbangan senyawa (analit),

terjadi pada satu plat.

Teori Kecepatan / Rate theory (van Deemter, 1956)

: terjadinya pelebaran puncak tergantung pada proses transfer massa

Teori distilasi Teori Kromatografi

Teori Pelat (Plate theory) (Martin dan Synge, 1941)

HETP = -----------L

N

N = 16 (-------)tR

Wb

2 atau N = 5,54 (--------)tR

W1/2

2

Menentukan kecepatan alir optimum

Teori Kecepatan / Rate theory (van Deemter, 1956)

HETP = A + B/ + C

A = difusi eddy B/ = difusi longitudinal C = pemindahan massa

Column

Diffusion

Difusi Eddy(efek jalur ganda)

Difusi longitudinal

Efek perpindahan massa

R = -------------- = ----------------- tR2-tR1

2 (tR2-tR1)

1/2 (Wb1 + Wb2) (Wb1 + Wb2)

Resolusi : Derajat pemisahan dua komponen pada proses kromatografi

Jarak antar dua puncak dibagi lebar alas puncak

Faktor pemisah ( : = -----------------tR2 - to

tR1 - to

R = ---------------------------------

2 ( tR2 - tR1)

1,699 ( W 1/2 1 + W 1/2 2)

R = 1,5 Base Line Resolution Puncak overlap 0,3%