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Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
rDNA is NOT Whole Animal Cloning
Recombinant DNA is a tool in understanding the structure,
function, and regulation of genes and their products
Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
• The objectives of Recombinant DNA technology include: – Identifying genes – Isolating genes – Modifying genes – Re-expressing genes in other hosts or
organisms
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• These steps permit scientists and clinicians to: – Identify new genes and the proteins they
encode – To correct endogenous genetic defects – To manufacture large quantities of specific
gene products such as hormones, vaccines, and other biological agents of medical interest
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Sebbene esistano enzimi di restrizione con siti di riconoscimento degenerati (per es. BsiEI riconosce la sequenza 5'-CGPuPyCG-3' dove Pu e Py rappresentano "qualunque purina" e "qualunque pirimidina“), la maggior parte degli enzimi di restrizione utilizzati nell'ingegneria genetica riconoscono sequenze specifiche che tagliano in tre modi diversi:
5'-CCC-3' 5'-GGG-3' 3'-GGG-5' 3'-CCC-5'
5'-G-3' 5'-AATTC-3' 3'-CTTAA-5' 3'-G-5'
5'-CTGCA-3' 5'-G-3' 3'-G-5' 3'-ACGTC-5'
• Generando estremità piatte (blunt) Es. SmaI
5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5'
• Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protuding)
Es. EcoRI 5'-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5' • Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 3' (3' protuding) Es. PstI 5'-CTGCAG-3'
3'-GACGTC-5'
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Estrazione di frammenti di DNA da gel Dopo aver digerito un DNA con enzimi di restrizione ed averne separato i frammenti risultanti su gel di agarosio, il passo seguente di solito consiste nell’excidere dal gel, con un bisturi, specifiche bande corrispondenti a geni o porzioni di DNA di nostro interesse e purificarle da gel.
Esistono molti sistemi per purificare bande da gel, tra cui:
• elettroeluizione • colonne a scambio ionico • gel-filtration • ultrafiltrazioni • agarosio a basso punto di fusione • ecc. ecc.
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VETTORI DI CLONAGGIO Dai plasmidi batterici naturali sono derivati i vettori di clonaggio, le cui caratteristiche essenziali sono • Origine di replicazione
• Marcatore selezionabile • Siti di restrizione unici
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vettore inserto
CCCCCC3'OH
5'-P HO-3'CCCCCCCC
5'-P inserto
Terminal transferasi + dGTP
Terminal transferasi + dCTP
Sottoponendo il vettore e l’inserto a trattamento con terminal transferasi con due deossiribonucleotidi diversi le due molecole diventano complementari tra loro e possono essere ligate.
GGGGGG3'OH
5'-P HO-3'GGGGGG
5'-P vettore
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Nel corso dei clonaggi può capitare di dover trasformare estremità coesive sporgenti al 5' o al 3‘ in estremità piatte, sintetizzando le basi mancanti nel filamento incompleto al 5' (filling in), oppure eliminando quelle sporgenti al 3' (trimming)
Filling in
Esempio 1: estremità “sticky” 5' protuding (es.EcoRI) In questo caso la tecnica d’elezione consiste nel cosiddetto “ filling in” che consiste nel “riempire” una estremità sporgente al 5' con la Klenow
G C AATTC
5'P
5'P 3'OH
3'OH
dTTP dATP dGTP G TTAAG
C AATTC 5'P
5'P 3'OH
3'OH
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T/A cloning di prodotti di PCR La maggior parte delle polimerasi termostabili utilizzate nella PCR, possiedono una debole attività di tipo terminal trasferasico e aggiungono un residuo di adenosina alla estremità 3' dei propri prodotti di amplificazione
5'-P HO-3 A 5'-P A-3'OH
Sebbene questa caratteristica ostacoli il clonaggio dei prodotti di amplificazione, è stata vantaggiosamente sfruttata in una serie di vettori commerciali, i cosiddetti vettori T/A, che vengono forniti già linearizzati e che possiedono un residuo di timidina alle loro estremità 3'. I residui 3' terminali di T del vettore si appaiano con le A dei prodotti di amplificazione rendendo così possibile il clonaggio dei prodotti di PCR.
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Vettori di clonaggio. Gran parte degli straordinari progressi ottenuti dalla biotecnologia e dalla biologia molecolare, dipendono dall'acquisizione della capacità di amplificare e propagare indefinitivamente i geni. Clonare un gene significa isolarlo da un genoma ed inserirlo in un vettore capace di replicarsi in un certo ospite (di solito E.coli o lievito). Esistono diversi tipi di vettori di clonaggio, ciascuno con vantaggi e svantaggi. La principale considerazione da fare é relativa alle dimensioni dell'inserto di DNA che ogni vettore può accettare.
PLASMIDI da 0,1 a 10 Kb
FAGI da 8 a 22 kb
COSMIDI da 32 a 45 kb
BAC da 75 a 300 kb
YAC da 100 a 2000 kb
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Batteri Elettroporazione trasformazione chimica con CaCl2 coniugazione batterica Piante elettroporazione trasferimento mediato da Agrobacterium cannoncino balistico fusione di protoplasti
Lieviti PEG Elettroporazione DEAE-destrano
Tavola riassuntiva dei principali metodi di trasferimento genico
Protoplasti Elettroporazione fusione di protoplasti
Celule animali PEG Elettroporazione DEAE-destrano CaPO4
Endoderm
Mesoderm
Ectoderm
Progenitor cells
Totipotent cell Neuron
Hepatocyte
Myoblast
Pancreatic cell
B cell
Epithelial cell Pluristratified
ES cell
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