View
78
Download
20
Category
Tags:
Preview:
DESCRIPTION
mikro
Citation preview
IMUNOLOGIIMUNOLOGIIMUNOLOGI SEROLOGIIMUNOLOGI SEROLOGISEROLOGISEROLOGI
REAKSI ANTIGEN‐ANTIBODI REAKSI ANTIGEN‐ANTIBODI IN VITROIN VITRO
- the in vitro study of antigen-antibody reaction
laboratory study of the activities of the components of-laboratory study of the activities of the components of blood serum that contributes to immunity
PENDAHULUANPENDAHULUANPENDAHULUANPENDAHULUAN
• Ikatan antara Ag dan Ab bersifat spesifik• Ikatan antara Ag dan Ab bersifat spesifik
• Ikatan Ag dan Ab in vitro dipakai dalam diagnosis →pemeriksaan serologi
• Tujuan pemeriksaan serologi:
• Ikatan Ag dan Ab in vitro dipakai dalam diagnosis →pemeriksaan serologi
• Tujuan pemeriksaan serologi:j p g
Deteksi Ag (suatu patogen) dengan memakai Ab yg telahdiketahui
Deteksi Ab dengan memakai Ag yg telah diketahui
j p g
Deteksi Ag (suatu patogen) dengan memakai Ab yg telahdiketahui
Deteksi Ab dengan memakai Ag yg telah diketahuiDeteksi Ab dengan memakai Ag yg telah diketahui
Aplikasi: diagnosis penyakit infeksi krn bakteri, virus,parasit dan jamur
Contoh: diagnosis penyakit typhoid demam dengue
Deteksi Ab dengan memakai Ag yg telah diketahui
Aplikasi: diagnosis penyakit infeksi krn bakteri, virus,parasit dan jamur
Contoh: diagnosis penyakit typhoid demam dengueContoh: diagnosis penyakit typhoid, demam dengue, rubella,toksoplasmosis,dllContoh: diagnosis penyakit typhoid, demam dengue, rubella,toksoplasmosis,dll
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 3
PRAKTIKUMPRAKTIKUMPRAKTIKUMPRAKTIKUM
• REAKSI HEMAGLUTINASI (HA)• REAKSI HEMAGLUTINASI (HA)( )
• HAMBATAN AGGLUTINASI/HEMAGGLUTINASI INHIBITION (HI)
( )
• HAMBATAN AGGLUTINASI/HEMAGGLUTINASI INHIBITION (HI)
• TES FIKSASI KOMPLEMEN/COMPLEMENT FIXATION TEST/CFT
• RAPID SLIDE TEST
• TES FIKSASI KOMPLEMEN/COMPLEMENT FIXATION TEST/CFT
• RAPID SLIDE TEST• RAPID SLIDE TEST
• ELISA NS‐1
• IMUNOASSAY
• RAPID SLIDE TEST
• ELISA NS‐1
• IMUNOASSAY
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 4
Serological TestsSerological Tests• Precipitation: Soluble antigens
A l i i P i l i
• Precipitation: Soluble antigens
A l i i P i l i• Agglutination: Particulate antigens
• Hemagglutination: Agglutination of RBCs
• Agglutination: Particulate antigens
• Hemagglutination: Agglutination of RBCs
• Neutralization: Inactivates toxin or virus
• Fluorescent‐antibody technique: Antibodies linked to fl d
• Neutralization: Inactivates toxin or virus
• Fluorescent‐antibody technique: Antibodies linked to fl dfluorescent dye
• Complement fixation: RBCs are indicator
fluorescent dye
• Complement fixation: RBCs are indicator
• ELISA: Peroxidase enzyme is the indicator• ELISA: Peroxidase enzyme is the indicator
MACAM REAKSI SEROLOGIMACAM REAKSI SEROLOGIMACAM REAKSI SEROLOGIMACAM REAKSI SEROLOGI
Presipitasi: soluble AgAglutinasi→Widal TPHAAglutinasi→Widal,TPHAIkatan komplemen→uji wasserman
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 6
Antigen and antibody ti i th l b
Antigen and antibody ti i th l breactions in the labreactions in the lab
• Precipitation tests• Precipitation tests• Precipitation tests• Agglutination• Precipitation tests• Agglutination• ELISA• Radioimmunoassay• ELISA• Radioimmunoassay• Immunofluorescence• Complement Fixation• Immunofluorescence• Complement Fixation• Complement Fixation• Complement Fixation
ANTIBODI ANTIGEN HASIL REAKSIANTIBODI ANTIGEN HASIL REAKSI
PRESIPITIN SOLUSI / LARUTAN PRESIPITASI / ENDAPAN/ /
AGLUTININ SEL / PARTIKEL AGLUTINASI / GUMPALAN
LISIN SEL LISISLISIN SEL LISIS
OPSONIN SEL / PARTIKEL FAGOSITOSIS
ANTITOKSIN TOKSIN NETRALISASI
ANTIBODI KUMAN / VIRUS NETRALISASINETRALISASI INFEKTIFNETRALISASI INFEKTIF
Faktor Yang MempengaruhiR k i A Ab
Faktor Yang MempengaruhiR k i A AbReaksi Ag‐AbReaksi Ag‐Ab
AfinitasAviditasRatio Ag:Ab
Ab excess Ag excessg
Physical form of Ag
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 9Equivalence – Lattice formation
AFFINITY VS. AVIDITYAFFINITY VS. AVIDITYAFFINITY VS. AVIDITYAFFINITY VS. AVIDITY
AFFINITY ‐ the strength of the attraction between gan epitope and the antigen combining site of the antibody
AVIDITY ‐ refers to the strength of interaction between complex antigens
SyaratSyarat reaksireaksi AgAg‐‐AbAb in vitro in vitro dd dilihdilih
SyaratSyarat reaksireaksi AgAg‐‐AbAb in vitro in vitro dd dilihdilihdapatdapat dilihatdilihatdapatdapat dilihatdilihat
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 11
FenomenaFenomenaFenomenaFenomenaProzoneProzone‐‐postzonepostzoneProzoneProzone‐‐postzonepostzone
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 13
AGLUTINASIAGLUTINASIAGLUTINASIAGLUTINASI
Reaksi Ab dengan Ag berupa partikelReaksi Ab dengan Ag berupa partikelReaksi Ab dengan Ag berupa partikelatau yang diikatkan pada partikel
Partikel yg dapat dipakai:
Reaksi Ab dengan Ag berupa partikelatau yang diikatkan pada partikel
Partikel yg dapat dipakai:yg p p
Sel darah merah→ hemaglutinasi
Latex→ Latex agglutination
yg p p
Sel darah merah→ hemaglutinasi
Latex→ Latex agglutinationLatex→ Latex agglutination
Bakteri→ koaglutinasiPemeriksaan semikuantitatif
Latex→ Latex agglutination
Bakteri→ koaglutinasiPemeriksaan semikuantitatifPemeriksaan semikuantitatif
Dapat menilai titer
Pemeriksaan semikuantitatif
Dapat menilai titer
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 14
Aplikasi Reaksi AglutinasiAplikasi Reaksi AglutinasiAplikasi Reaksi AglutinasiAplikasi Reaksi Aglutinasi
• Tes widal penentuan golongan• Tes widal penentuan golongan• Tes widal,penentuan golongandarah.
• Tes widal,penentuan golongandarah.
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 16
HEMAGLUTINASIHEMAGLUTINASIHEMAGLUTINASIHEMAGLUTINASI
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
1/25
6
1/51
2
Positif aglutinasiaglutinasi
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 17
Negatif aglutinasi
HEMAGLUTINASIHEMAGLUTINASIHEMAGLUTINASIHEMAGLUTINASIUntuk menentukan titer virus
yang akan digunakan pada tes Hemaglutinasi inhibisi (HI)
• Sample duplo• Misal titer virus
:1/160,maka untuk tes HI, dimulai dgn 4x titer jadi 1/40
• Titer: pengenceran terkecildari virus yang masihmampu menimbulkanhemaglutinasi/hasil (+) (tampak sebagai anyaman
h h )
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 18
merah homogen)
TREPONEMA PALLIDUM TREPONEMA PALLIDUM HEMAGLUTINATION/TPHAHEMAGLUTINATION/TPHATREPONEMA PALLIDUM TREPONEMA PALLIDUM
HEMAGLUTINATION/TPHAHEMAGLUTINATION/TPHA////
• Tes spesifik untuk deteksi antibodi terhadap T. Pallidum (TP)Pallidum (TP)
• SDM sbg carrier Ag TP
• Ag T. pallidum diikatkan pada permukaan SDM
• Jika ada Ab yg ada dlm serum yg berikatan dg Ag TP,maka akan tjd hemagglutinasi
i b i i di ih jd• Titer Ab: pengenceran tertinggi dimana masih tjd hemaglutinasi
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 19
TPHATPHATPHATPHA• Deteksi antibodi
ifik T llidspesifik T. pallidum
• Antigen T. pallidumdiik tk t
Titer 1/320
diikatkan ataudilekatkan padapermukaan SDM Kontrol sdmpermukaan SDM
• Sample adalah serum penderita yg diduga
Kontrol serum ‐
Kontrol serum +penderita yg diduga terinfeksi TP
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 20
TES AGLUTINASI WIDAL TES AGLUTINASI WIDAL RAPID SLIDE TEST WIDALRAPID SLIDE TEST WIDAL
• Untuk deteksi antibodi terhadap
Titer O 1/640
Salmonella enterica
• Prinsip reaksi antara antibodi aglutinin dlm serum yg telah mengalami pengenceran berbeda‐beda thdp Ag O /H dlm ∑ sama shg tjd agglutinasi
• Sample: serum penderita yg diduga terinfeksi S.enterica
• Titer :pengenceran serum terbesaryang masih menimbulkan aglutinasi
Titer H 1/320
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 21
INTEPRTASI WIDALINTEPRTASI WIDALINTEPRTASI WIDALINTEPRTASI WIDAL
• Titer O yang tinggi (> 160) atau kenaikan• Titer O yang tinggi (> 160) atau kenaikanTiter O yang tinggi (> 160) atau kenaikantiter ≥ 4x menunjukkan infeksi aktif
• Titer H yang tinggi (> 160) menunjukkan
Titer O yang tinggi (> 160) atau kenaikantiter ≥ 4x menunjukkan infeksi aktif
• Titer H yang tinggi (> 160) menunjukkany g gg ( ) jpernah divaksinasi atau pernah terinfeksi
y g gg ( ) jpernah divaksinasi atau pernah terinfeksi
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 22
HambatanHambatan AglutinasiAglutinasiH l ti tiH l ti ti I hibiti T tI hibiti T t
HambatanHambatan AglutinasiAglutinasiH l ti tiH l ti ti I hibiti T tI hibiti T tHemaglutinationHemaglutination Inhibition TestInhibition TestHemaglutinationHemaglutination Inhibition TestInhibition Test
• Antigen/hemaglutinin virus tertentu mampu• Antigen/hemaglutinin virus tertentu mampug / g pmengaglutinasi SDM unggas
• Sehingga apabila kita ingin mendeteksi adanyatib di d t t li i i k
g / g pmengaglutinasi SDM unggas
• Sehingga apabila kita ingin mendeteksi adanyatib di d t t li i i kantibodi yg dpt menetralisir virus, maka
digunakan teknik hambatan aglutinasi SDM Tes Hambatan Hemaglutinasi/Hemagglutinasi
antibodi yg dpt menetralisir virus, maka digunakan teknik hambatan aglutinasi SDM Tes Hambatan Hemaglutinasi/Hemagglutinasi inhibition/HI
• Sebelum dilakukan Hi test, maka virus yg akandigunakan dititrasi terlebih dahulu
inhibition/HI
• Sebelum dilakukan Hi test, maka virus yg akandigunakan dititrasi terlebih dahuludigunakan dititrasi terlebih dahulu
• Titer virus (dgn HA): pengenceran tertinggi dimana msh memberikan reaksi HA
digunakan dititrasi terlebih dahulu
• Titer virus (dgn HA): pengenceran tertinggi dimana msh memberikan reaksi HA
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 23
HI TESTHI TEST Kontrol sdm+ Ag‐‐‐hemaglutinasi
Kontrol SDM tanpa AgHI TESTHI TESTGold Standart WHO
SAMPEL : serum penderita yang diduga terinfeksi virus Dengue
hemaglutinasi
diduga terinfeksi virus Dengue
Pemeriksaan serum akut dankonvalesens (duplo) .Titer: Pengenceran terkecil dari Ab
ih i b lkyang masih mampu menimbulkanhambatan aglutinasi (hasil (+))
(button)/dot)
Jika tidak terjadi HI tampak sebagaij p g
anyaman merah homogen pada
dasar mikroplateTiter HI fase akut :1/160
Tit HI f k l 1/1280Titer HI fase konvalesen : 1/1280
Terjadi kenaikan titer lebih dari 4xinfeksi dengue
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 26
PRESIPITASI TABUNGPRESIPITASI TABUNGPRESIPITASI TABUNGPRESIPITASI TABUNG
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 27
TES ELEK OUHTERLOUNYTES ELEK OUHTERLOUNYTES ELEK OUHTERLOUNYTES ELEK OUHTERLOUNY
5/23/2011 copyright (your organization) 2003 28
REAKSI PRESIPITASI
CONTOH PERCOBAAN ELEK OUCHTERLONYCONTOH. PERCOBAAN ELEK - OUCHTERLONY
KUMAN DIFTERI
ANTITOKSINDIFTERI
PRESIPITAT
ImmunoelectrophoresisImmunoelectrophoresis• Method
– Ags are separated by electrophoresis
• Method
– Ags are separated by electrophoresis
-+
– Ab is placed in trough cut in the agar
Ag Ag
Ab
Ag
Ab
precipitin are represent individual antigens
COMPLEMENT FIXATION TEST (CFT)
COMPLEMENT FIXATION TEST (CFT)(CFT)(CFT)
• Prinsip Kompleks Ag‐Ab sifat spesifik &harusp p g pbisa dilihat kasat mata
• mengaktifkan komplemen
• Untuk melihat adanya ikatan Ag‐Ab dipakaiindikator Sistem hemolitik/ amboseptorterdiri dari SDM dan hemolisin
• Ab (serum pos) +Ag + C’ Tidak hemolisis(dot)
• serum neg (tdk ada Ab) +Ag+ C’ Hemolisis(blur)
COMPLEMENT FIXATION TEST (CFT)
COMPLEMENT FIXATION TEST (CFT)TEST (CFT)TEST (CFT)
• SAMPEL: SERUM PENDERITA FASE AKUT DAN KONVALESCEN• KARENA PADA CFT Ag YANG DIUJI MERUPAKAN Ag YANG LARUT (TIDAK• KARENA PADA CFT, Ag YANG DIUJI MERUPAKAN Ag YANG LARUT (TIDAK
SEPERTI HEMAGLUTINASI YG BERUPA PARTIKEL) MAKA UNTUK MELIHATNYA DIGUNAKAN SISTEM AMBOSEPTOR
• APA SISTEM AMBOSEPTOR?• AMBOSEPTOR = HEMOLISIN • DENGAN PENAMBAHAN KOMPLEMEN MAKA AKAN TERIKAT PADA KOMPLEKS
Ag‐Ab SHG TIDAK AKAN TERJADI HEMOLISIS SEHINGGA PADA WELL TAMPAK SEBAGAI BUTTON/DOT
• KALO TIDAK ADA IK Ag‐Ab MAKA KOMPLEMEN TERTARIK KE SISTEM AMBOSEPTOR SHG HEMOLISIS
• SEDANG PADA TABUNG TAMPAK MERAH KERUH• SBLM DILAKUKAN CFT,DILAKUKAN TITRASI KOMPLEMEN DAN TITRASI
AMBOSEPTOR• TITER AMBOSEPTOR/HEMOLISIN: PENGENCERAN/TITRASI HEMOLISIN
TERKECILL YANG MASIH MAMPU MENYEBABKAN LISIS SEMPURNA→DISEBUT I UNIT AMBOSEPTOR
• TITER Ab ADALAH: PENGENCERAN/TITRASI SERUM TERKECIL SHG TIDAK MENIMBULKAN HEMOLISIS
• TITER FASE AKUT 8 DAN FASE KONVALESCENT 640 JADI ADA KENAIKAN >4X• TITER FASE AKUT 8 DAN FASE KONVALESCENT 640 JADI ADA KENAIKAN >4X
keteranganketeranganketeranganketerangan
• CFT (‐)~terjadi hemolisis sistem• CFT (‐)~terjadi hemolisis sistem• CFT ( ) terjadi hemolisis sistemhemolisin oleh complemen (artinyadlm serum pasien tidak ada Ab)
• CFT ( ) terjadi hemolisis sistemhemolisin oleh complemen (artinyadlm serum pasien tidak ada Ab)dlm serum pasien tidak ada Ab) dlm serum pasien tidak ada Ab)
HASIL REAKSI PENGIKATAN KOMPLEMEN
POSITIF NEGATIF
lisis lisis lisistidak
P K P K
lisis lisis lisislisis
P: Percobaan
REMMING
tidaktidak
P: Percobaan
(tes)
l
P K
tidaklisis
tidaklisisK: Kontrol
PENGIKATAN KOMPLEMENPENGIKATAN KOMPLEMEN• Contoh CFT: utk diagnosis
infeksi virus dengue• Contoh CFT: utk diagnosis
infeksi virus dengue
Kontrol sdm tanpa hemolising
• Sample :serum penderita(duplo) fase akut dank l
g
• Sample :serum penderita(duplo) fase akut dank lkonvalesen
• Sebelum CFT dilakukantitrasi komplemen dan
konvalesen
• Sebelum CFT dilakukantitrasi komplemen danptitrasi amboseptor/sistemhemolitik
Tit f k t 80
ptitrasi amboseptor/sistemhemolitik
Tit f k t 80• Titer fase akut 80
• Konvalesen 640
• Kenaikan titer > 4 kali
• Titer fase akut 80
• Konvalesen 640
• Kenaikan titer > 4 kali• Kenaikan titer > 4 kali• Kenaikan titer > 4 kali
FIKSASI KOMPLEMEN PADA TABUNG
FIKSASI KOMPLEMEN PADA TABUNGTABUNGTABUNG
• Tabung 1 menunjukkanhemolisis (jernih)
• Tabung 1 menunjukkanhemolisis (jernih)hemolisis (jernih)
• Tabung 2 menunjukkan tidakh li i
hemolisis (jernih)
• Tabung 2 menunjukkan tidakh li ihemolisis
(keruh)
(ada ikatan Ag‐Ab‐C)
hemolisis
(keruh)
(ada ikatan Ag‐Ab‐C)
1 2
ImmunoassayImmunoassayImmunoassayImmunoassay
• Untuk melihat adanya ikatan Ag‐Ab,• Untuk melihat adanya ikatan Ag‐Ab,Untuk melihat adanya ikatan Ag Ab, salah satu komponen dilabel.
• Label bisa berupa:
Untuk melihat adanya ikatan Ag Ab, salah satu komponen dilabel.
• Label bisa berupa:p
– Radioaktif Radioimmunoassay
– Enzim Enzyme‐immunoassay;
p
– Radioaktif Radioimmunoassay
– Enzim Enzyme‐immunoassay;Enzim Enzyme immunoassay; Immunohistochemistry
– Fluorescein Immunoflurescens
Enzim Enzyme immunoassay; Immunohistochemistry
– Fluorescein Immunoflurescens
P i i d 2P i i d 2• Prinsip ada 2 macam:
– Direct label langsung diikatkan pada Ag
• Prinsip ada 2 macam:
– Direct label langsung diikatkan pada Ag atau Ab
– Indirect kompleks Ag‐Ab diikatkan
atau Ab
– Indirect kompleks Ag‐Ab diikatkandengan Ab yang dilabel
• Metode indirect dipakai untuk meningkatkan
dengan Ab yang dilabel
• Metode indirect dipakai untuk meningkatkanMetode indirect dipakai untuk meningkatkansensitivitas pemeriksaanMetode indirect dipakai untuk meningkatkansensitivitas pemeriksaan
ELISAELISAELISA(Enzyme‐Linked Imunosorbent Assay)
ELISA(Enzyme‐Linked Imunosorbent Assay)
• Ag (Ab) difiksasi pada permukaan microtiterplate
• Ag (Ab) difiksasi pada permukaan microtiterplate
• Enzim yang dipakai
– horseradish peroksidase
• Enzim yang dipakai
– horseradish peroksidasehorseradish peroksidase
– Alkaline phosphatase
horseradish peroksidase
– Alkaline phosphatase
Positive Negative Patient A Patient B Patient C Assay Control Control Patient A Patient B Patient C Control1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123
•Angka menyatakan optical density at 450 nm. •Angka batas (cut off) dinyatakan positive adalah 0.500. •Optical densities of 0 300 to 0 499 dinyatakan indeterminate•Optical densities of 0.300 to 0.499 dinyatakan indeterminate
tes diulang•Angka di bawah 0.300 dinyatakan negative.
ELISA for HIV antibody (contoh)ELISA for HIV antibody (contoh)ELISA for HIV antibody (contoh)ELISA for HIV antibody (contoh)
Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivityMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivityMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivityMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity
ELISA NS‐1ELISA NS‐1ELISA NS 1ELISA NS 1• NS‐1 merupakan non
struktural protein pada virusstruktural protein pada virus Dengue
• NS‐1 berperan pada replikasi
Di k ik d• Diekpresikan padapermukaan sel host
• NS‐1 tidak imunogenik
• Sehingga tidak memunculkanantibodi
• Gradasi warna bisa dibacadengan menggunakanelisareader
ELISAELISA• Contoh deteksi IgG dan IgM
terhadap Ag virus dengue • Contoh deteksi IgG dan IgM
terhadap Ag virus dengue p g g
• Prinsip : imunno assay denganmenggunakan enzym
p g g
• Prinsip : imunno assay denganmenggunakan enzym
• C : Kontrol positif
• M : IgM
• G : IgG
• C : Kontrol positif
• M : IgM
• G : IgG• G : IgG
• Positif : ada warna yang samadengan kontrol
• G : IgG
• Positif : ada warna yang samadengan kontrolg
• Negatif : tidak ada warna
• Hasil : IgM positif
g
• Negatif : tidak ada warna
• Hasil : IgM positif
Serological TestsSerological Tests
• Precipitation: Soluble antigens • Precipitation: Soluble antigens • Agglutination: Particulate antigens• Hemagglutination: Agglutination of RBCs• Agglutination: Particulate antigens• Hemagglutination: Agglutination of RBCsgg gg• Neutralization: Inactivates toxin or virus• Fluorescent antibody technique: Antibodies
gg gg• Neutralization: Inactivates toxin or virus• Fluorescent antibody technique: Antibodies• Fluorescentantibody technique: Antibodies linked to fluorescent dyeC l t fi ti RBC i di t
• Fluorescentantibody technique: Antibodies linked to fluorescent dyeC l t fi ti RBC i di t• Complement fixation: RBCs are indicator
• ELISA: Peroxidase enzyme is the indicator• Complement fixation: RBCs are indicator• ELISA: Peroxidase enzyme is the indicator
Recommended