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Identificazione dei microrganismi: dalle
tecniche tradizionali alle tecnologie
molecolari più avanzate
Nicoletta Corbo
Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Azienda Ospedaliera della Provincia di Lecco
Verona, 01/10/2015
Alexander Fleming 1929 scopre la penicillina, il capostipite dei
moderni antibiotici
Robert Koch 1881 mette a punto un sistema scientifico
per studiare i batteri, basato sui terreni di coltura batterici e sviluppa
il concetto di coltura pura
Hans Christian Gram 1884 mette a punto il metodo della
colorazione di Gram, che permette di colorare i batteri per renderli più facilmente visibili e distinguibili al
microscopio ottico
Louis Pasteur 1864 dimostra scientificamente che i microrganismi sono incapaci di generarsi spontaneamente in un
ambiente precedentemente sterilizzato e riparato da contaminazioni esterne
Verona, 01/10/2015
http://www.google.it/url?url=http://chrismielost.blogspot.com/2011_05_01_archive.html&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=DxekU6XRHornygOavYDYBQ&ved=0CBgQ9QEwAQ&sig2=xYSBC7zZugVXr35lNo1cLA&usg=AFQjCNFd3jT3uw0Sjo2TfKBkjE-7TX2Ldwhttp://www.google.it/url?url=http://www.ulss.tv.it/Minisiti/microbiologia/Storia-della-microbiologia.html&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=OiakU5qgIKHpywPDl4CwDw&ved=0CBYQ9QEwAA&sig2=YGfMqCBC7rJLbMPtU2pOoQ&usg=AFQjCNEtc8jO42xeH72IKuETye6AgZHZ2w
Dal Fenotipo
al Genotipo
Verona, 01/10/2015
Fenotipo
l'insieme di tutte le caratteristiche osservabili di un organismo vivente, quindi la sua morfologia, il suo sviluppo, le sue proprietà biochimiche e fisiologiche comprensive del
comportamento
Genotipo la costituzione genetica di un
organismo vivente
Verona, 01/10/2015
Valutazione delle caratteristiche
fenotipiche dei batteri mediante osservazione della morfologia delle
colonie
Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
L’utilizzo di test biochimici costituisce, insieme all’ analisi delle caratteristiche
Morfologiche: • forma • colorazione di Gram • aspetto delle colonie
Fisiologiche: • pH • temperatura di crescita • atmosfera
parametri importanti per giungere a riconoscere e distinguere una
specie microbica Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
Identificazione batterica
Valutazione delle caratteristiche fenotipiche dei batteri
mediante test biochimici effettuati direttamente sulle colonie
batteriche isolate
Verona, 01/10/2015
Saggio della catalasi Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti.
Depositare sul vetrino una goccia di H2O2 al 3%.
Stemperare il materiale microbico nella goccia di H2O2.
Positività del saggio: formazione di effervescenza dovuta alla liberazione di
ossigeno che indica la presenza della catalasi nella coltura saggiata.
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Saggio dell’ossidasi Prelevare una colonia in esame cresciuta su substrato nutritivo agarizzato e
stemperarla su carta da filtro (Whatman n°1).
Aggiungere alcune gocce di reattivo
Positività del saggio: la coltura microbica assume, al massimo entro 10 minuti una colorazione violacea a contatto con il reattivo. La reazione è
dovuta all’enzima citocromo a3 ossidasi (componente del sistema di trasporto degli elettroni) che riduce il Tetrametil-p-fenilendiammina
idrocloride a un composto di colore viola.
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In passato veniva studiato il metabolismo batterico attraverso l’utilizzo di “macro-
metodi”
verifica dell’avvenuta reazione biochimica in provetta,
facendo crescere il microrganismo a contatto con
il substrato
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Identificazione Batterica
l’inoculo della coltura da saggiare viene inoculato in substrati che
contengono composti su cui agiscono gli enzimi implicati nello specifico
processo metabolico. In genere, il risultato dell’attività
enzimatica, è accompagnato da modificazioni cromatiche del
substrato
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Successivamente si sono sviluppati sistemi basati sul “micro-metodo” rappresentato dalle
gallerie biochimiche
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Identificazione delle specie batteriche: probabilità di una corretta identificazione
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Analisi dei profili metabolici
dei ceppi batterici isolati
Trasformazione in un codice numerico
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Profilo metabolico Profilo numerico
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Le gallerie biochimiche API sono dei sistemi semiautomatici che permettono
l’identificazione dei batteri
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Il sistema si basa su gallerie costituite da differenti cupole, ognuna delle quali viene inoculata con la
sospensione batterica, permettendo di studiare più attività enzimatiche in poco spazio.
Dopo un periodo di incubazione, la cui durata varia a seconda delle diverse gallerie, è possibile procedere all’identificazione per mezzo di un lettore automatico
che misura la crescita in ogni cupola
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Tra i sistemi automatici in uso, il sistema automatico VITEK (bioMérieux), è uno
degli strumenti più comunemente usati per l’identificazione batterica
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Il sistema evidenzia la crescita batterica e le alterazioni metaboliche dei micro-pozzetti di una card di plastica
sottile, utilizzando una tecnologia basata sulla
fluorescenza
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Durante questo processo, il software compara la serie di reazioni del test alla
serie di reazioni previste per ciascun microrganismo
viene così calcolata la probabilità percentuale che si riferisce al grado di concordanza tra i due gruppi di
reazioni Verona, 01/10/2015
• Identificazione in 2-18 ore, con riduzione dei tempi di lavoro
VANTAGGI DELL’AUTOMAZIONE
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• Identificazione più accurara a livello di specie (prove
biochimiche più numerose)
VANTAGGI DELL’AUTOMAZIONE
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• Refertazione automatizzata
• Archivio dati
• Elaborazione dati: epidemiologia
VANTAGGI DELL’AUTOMAZIONE
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Spettrometro di massa, permette
l’identificazione rapida di
microrganismi, basato sulla
tecnologia MALDI-TOF
(Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization – Time of Flight)
La spettrometria di massa MALDI-TOF MS è una tecnica analitica che consente di misurare in maniera estremamente accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinare
la loro identità in base al rapporto massa/carica (m/z)
Verona, 01/10/2015
Si basa sull’analisi delle proteine ribosomiali contenute nel campione. Nello spettro di massa, diagramma che riporta l’abbondanza degli ioni rilevati
in funzione del rapporto massa/carica, ogni picco
corrisponde ad una proteina ribosomiale e ciascuno spettro è tipico di un microrganismo
Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
MALDI-TOF Il sistema è costituito da •Sorgente (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) •Analizzatore (Time Of Flight) •PC
Fornisce accurate informazioni su struttura e peso molecolare di biomolecole: • peptidi • proteine • oligonucleotidi • carboidrati • polimeri sintetici
ID microbica rapida (pochi minuti)
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MALDI-TOF MS at a glance
Desorbimento
Ionizzazione
Accelerazione
Separazione
Rilevamento
m
z =
2eU
L² t²
m: massa z: carica U: accelerazione L: durata t: tempo e: carica elementare
Rilevatore di ioni
+
+ +
+
+ +
Bersaglio
Matrice & analita
Zona di accelerazione
Campo libero
elettrodo
La pulsazione laser
colpisce la matrice e
le molecole del composto:
ionizzazione per
trasferimento di carica
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I picchi di questi spettri vengono confrontati con il profilo tipico di una specie, genere o famiglia di microrganismo, per dare una
identificazione microbica
L’identificazione microbica viene raggiunta tramite l’ottenimento di spettri,
analizzati con l’ausilio del database presente nello strumento che utilizziamo,
VITEK®MS
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IDENTIFICAZIONE RAPIDA
Trasferimento del campione in
provetta
Centrifugazione (3500 rpm per 10
min)
Semina su piastra
Incubazione (3 ore)
Identificazione VITEK MS
Verona, 01/10/2015
Il “gold standard” per l’identificazione batterica è il sequenziamento dell’rRNA 16S
L’analisi della sequenza dell’rRNA 16S, tramite il confronto con i database di sequenze disponibili
on-line, permette di assegnare una precisa identificazione al microrganismo in esame: se
due organismi hanno 16S rRNA con più del 97% delle basi omologhe, appartengono alla stessa
specie Verona, 01/10/2015
Il sequenziamento, tuttavia, è un metodo non applicabile alla routine nei laboratori di
Microbiologia Clinica sia per la quantità di campioni da analizzare, sia per i costi di
esecuzione Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
Verona, 01/10/2015
MRSA Surveillance
SA Nasal Complete
C. diff & C. diff/Epi
vanA for VRE
MRSA/SA SSTI
MRSA/SA Blood Culture
EV
Flu
MTB/RIF
CT/NG
GBS & GBS Lim Broth
Factor II&V
The Most Compelling Test Menu Offering….
MRSA Surveillance
SA Nasal Complete
C. diff/Epi
vanA/vanB for VRE
MRSA/SA SSTI
MRSA/SA Blood Culture
Norovirus (NEW!)
EV
Flu
MTB/RIF
CT & CT/NG
GBS
Factor II&V
BCR-ABL Monitor
HPV (Cervical CA) (NEW!)
Carba-R
Trichomonas
MRSA Gen 3
Flu/RSV
HIV Quant
HIV Qualitative
HCV Quant
BCR-ABL Ultra
Bladder CA Monitor/Symptom
Norovirus
Carba-R
MRSA Surveillance-Next Gen
Flu/RSV
CW Flu/RSV
Trichomonas
Notes: Targeted Test Menu Subject to Revision; CW = CLIA-Waived
Tests in Italics Represent Product Improvements and are Excluded from Total Test Counts
SA Nasal Complete-Next Gen
Group A/C Strep
Meningitis/Encephalitis
Pertussis
Gastro Panel
HSV 1/2 Typing
Vaginitis
GBS Ultra
HBV Quant
Breast CA Stratifier
Breast CA Signature
Pancreatic CA Monitor
EBV / NPC Screen
EBV / NPC Monitor
= US Tests
= International Tests
33 Tests
33 Tests
39 Tests
36 Tests
19 Tests
24 Tests
14 Tests
16 Tests
SA Nasal Complete-Next Gen
Pertussis
Gastro Panel
HSV 1/2 Typing
Vaginitis
CW Vaginitis
CW CT/NG
HPV (Cervical CA)
HIV Quant
HCV Quant
HBV Quant
BCR-ABL Ultra
Breast CA Stratifier
Bladder CA Monitor
Bladder CA Symptomatic
Available Now 2014-2015 2016-17 2018-19
Group A/C Strep
Meningitis/Encephalitis
GBS Ultra
CW GBS Ultra
CW Group A/C Strep
CW HPV (Cervical CA)
Breast CA Signature
Verona, 01/10/2015
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