FORELESNINGSPLAN DNA replikasjon Prokaryot: 2t, 16/2 Eukaryot: 2t, 25/2

FORELESNINGSPLAN

DNA replikasjonProkaryot: 2t, 16/2Eukaryot: 2t, 25/2

DNA reparasjon 2t, 1/3

Erik BoyeAvdeling for CellebiologiDet norske Radiumhospital HF22934256eboye@labmed.uio.no

Det sentrale problemet med cellesyklusDet sentrale problemet med cellesyklus

VEKST CELLEDELING

Hver dattercelle må få tildelt alle essensielle komponenter, som mitokondrier, ribosomer, organeller, etc. Disse er til stede i flere kopier, og da er det tilstrekkelig med en tilfeldig fordeling mellom dattercellene

Hver dattercelle må få et fullstendig sett av alt kromosomalt DNA. Kromosomene må derfor bli duplisert, og de to kopiene må segregeres til hver datter. Denne prosessen må være helt nøyaktig og presist regulert.

How does DNA replicate?How does DNA replicate?

Parent DNANew DNA

KEY

Parent double helix

Possible modes ofDNA replication

(a) dispersive

(b) semi-conservative

(c) conservative

Watson & Crick (1953) Nature 171: 737-738.“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.”

Parent DNA strand(15N)

New DNA strand (14N)

HH

HL

LL

HH

HL

LL

HH

HL

LL

The Meselson-Stahl experiment (1958)Meselson and Stahl (1958) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44: 671-682.

The Meselson-Stahl experiment (1958)Meselson and Stahl (1958) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44: 671-682.

E. coli cells were grown for many generations in ‘heavy’ medium (containing 15N, a heavy isotope of nitrogen). Cells were then transferred to ‘light’ medium (containing 14N). DNA samples were analysed by density gradient centrifugation.

Heavy medium Light medium,1 generation

Light medium,2 generations

Inter-pretation:

Hvilke oppgaver må løses under DNA replikasjon?

- Kopiering av alle DNA-sekvenser- Kopiering kun EN gang pr celledeling, hverken mer eller mindre.- Nøyaktig kopiering gir genetisk stabilitet.

Hvordan oppnå dette?

- Definerte startpunkter (origins)- Finregulering av initiering- Nøyaktige polymeraser- Reparasjonsmekanismer- Presis segregering

Mechanism of DNA synthesisMechanism of DNA synthesis

hydrolysis

deoxyribose

phosphate

Bases

adenine

thymine

cytosine

guanine

hydrogen bond

release ofpyrophosphate

OH3’

3’5’

5’ OH

5’

3’

triphosphate

Replikasjonsgaffel

?

DNA polymeraser kan bare syntetisere 5’-3’.Hvordan går det med to antiparallelle tråder?

Hvordan replikere en DNA-dupleks med enzymer som bare virker i én retning?

Vist eksperimentelt av Reiji Okazaki i 1968

Syntese av Okazaki-fragment og ny priming

Semidiskontinuerlig replikasjon

Elektronmikroskopisk bilde av replikerende D. melanogaster-DNA som bekrefter Okazaki-modellen (Kreigstein & Hogness 1974)

Sammensetning av primosomet

DNA polymerase III: En komplisert maskin

DNA polymerase III: En komplisert maskin

Andre proteiner som deltar i replikasjonen• DNA ligase - Covalently closes nicks in double-stranded DNA.

• Primase - the enzyme responsible for catalyzing synthesis of RNA primers.

• Clamps and clamp loaders - Protein from the DNA polymerase III holoenzyme complex holds the polymerase to the DNA. A multisubunit entity called the complex functions as the "clamp loader".

• Single-strand DNA-binding (SSB) proteins – stabilizes ssDNA in the replication fork

• Helicases – unwinds DNA by catalyzing the ATP-dependent unwinding of double-strand DNA. E. coli contains at least 6 different helicases--some involved in DNA repair and others in conjugation. The principal helicase in DNA replication is DnaB, which interacts with DnaG and other proteins to form the primosome.

• Topoisomerases - Bidirectional replication of the circular E. coli chromosome unwinds about 100,000 base pairs per minute. Relief of this torsional stress is essential for DNA replication to occur. Topoisomerases are enzymes with a "swivel" mechanism that can relieve this stress.

Opptvinning av DNA med DnaB og SSB

The DnaB helicase

”Clamp loader”-komplekset monterer β-subenheten på DNA

Clamp og Clamp loader

Replikasjonsgaffel hos E. coli

DNA-replikasjon i E. coli: Trombonemodellen

DNA topoisomeraser endrer linking number (supercoiling)

Hvordan oppnås høy nøyaktighet?

• Balansert nivå av de fire dNTP• Polymerasereaksjonen har høy nøyaktighet• 3’-5’-ekonukleaseaktiviteten til Pol I og Pol

III fjerner feil som polymeraseaktiviteten innfører

• En rekke reparasjonssystemer tar seg av gjenværende feil

Korrekturlesning: DNA polymerase I fjerner et feilinkorporert nukleotid

5’-3’-eksonukleasedomenet i DNA polymerase I fjerner nukleotider i 5’ –enden av et nick

Krav til initiering:

-Aktivt initiator-protein (DnaA)

-Supercoilet substrat

- AT-rikt område

Replikasjonsorigo: oriC

E. coli:

Genome, 4 Mb = 4 x 106 bpFork rate approx. 800 bp / secReplication time approx. 40 minutes = 2,400 secs

Amount replicated by 2 forks in 40 mins = 2 x 2400 x 800 = 3,840,000 bp (~4 Mb)

The rate of DNA replication

Terminering av replikasjonen

TerG

DNA metylering

I E. coli kan både cytosiner og adeniner bli enzymatisk metylert.

Dcm metylasen lager 5-metylcytosinDam metylasen lager 6-metyladenin

Begge virker etter replikasjon.Cytosin metylering: Funksjon ukjent/restriksjonAdenin metylering er viktig for

- Kontroll av DNA replikasjon- Reparasjon av DNA-skader- Genregulering- Beskyttelse mot fremmed DNA (?)

Identifikasjon av SeqA

oriC på et plasmid kan drive replikasjon

Metylert oriC Dam+ : +++

Metylert oriC Dam- : ---

Altså: Hemimetylert oriC blir ikke initiert.En mutant som mangler den negative regulator,vil tillate initiering av hemimetylert oriC, slik at

Metylert oriC Dam- SeqA+: +++

Umetylert oriC Dam- : +++

Fullt metylert oriC

Replikasjon gir hemimetylert oriC

Elongering og separasjon

Sekvestrering med SeqA (membran?)

Remetylering

Frigjøring

DnaA regulerer initieringstidspunktet.

Økende DnaA-konsentrasjon

Tidligere initiering og ved lavere cellemasse

(Løbner-Olesen et al, Cell 1989)

Men er DnaA nødvendigvis REGULATOREN in vivo?

Three levels ofnegative controlof DNA replication in E. coli:

1. Inactivation of the DnaA initiator

2. Sequestration ofthe origin of replication

3. Titration of DnaAto other chromosomal sites

FLOW CYTOMETRY

Initiering av DNA replikasjon er avhengig av

- Proteinsyntese- RNA syntese

Hemming av disse prosessene vil derfor gjøre at initiering stopper, mens elongering fortsetter.

Sluttresultat: Antall hele kromosomer = antall oriC

Asynkroni:

Når IKKE alle origins i en celle blir initiert samtidig

Antall kromosomer8 8

88

44A

ntal

l cel

ler

50 min

30 min

20 min

Mangel på initieringskontroll i en seqA mutant

seqA+ seqA-

(Lu et al, Cell 1994)

Del

ing

Del

ing

Del

ing

B C40 min

D20 min

En generell cellesyklus i E. coli

C og D er konstante.Hvordan går det når doblingstiden blir under 60 min?