View
8
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Explorations des réponses Immunitaires
2012
L3 Médecine
Rappel sur les réponses Immunitaires
DIFFERENTS TYPES DE REPONSES IMMUNITAIRES
Naturelle = innée AdaptativeNon spécifique Spécifique
Barrière cutanéo-muqueuseSubstances bactéricides
pHEquilibre de la flore
InterféronsSyst. Complément
Phagocytes (PN, mono/mρ)Cellules NK
Cellules dendritiques
Récepteurs spécifiques (TCR BCR)Qlqs jours
Mémoire Immunitaire+efficace lors du 2ème contact
base des vaccinations
Lymphos TLymphos BAnticorps
Immédiate
Défenses Immunitaires innées et adaptatives dansla défense anti-infectieuse
1) Bactéries à multiplication extracellulaire + certains champignons+ certains virus et parasites• Système du complément
Voie alterneVoie des lectinesVoie classique (Ag/Ac)
• Polynucléaires neutrophiles•Anticorps
Neutralisation des toxines bactériennesInhibition de l’adhérence des bactéries aux épithéliumsOpsonisation
Coopération entre ces différents acteurs
2) Bactéries à x intracellulaire + cellules infectées par Virus +parasite à x intracellulaire
Cellules T (CD4-CD8)MacrophagesNK
Agent Pathogène: Inflammation tissulaireComplément Interactions PAMP/PRR (TLR)C3a C5a
PN Macrophage
Monocyte
NK C. Dendritique
CytokinesPro-inflammatoires (TNF, IL1, IL6…)
IFNγ
Ag
Organes lymphoïdes
1) Immunité Innée
Exploration du Complément:
Lyse du GRMesure de l’hémoglobine libérée
GR de mouton + Ac anti GR de mouton
Sérum du sujet contenant le complément
Voie classique
Activation du complexe terminal
GR de lapinVoie Alterne
DO
[C]
50%
Mesure fonctionnelleCH50
Mesure des protéinesdu complément
C3- C4..:NéphélémétrieDosage fonctionnelle
Résultats: Augmentation : processus inflammatoire Diminution : consommation, déficit
Reconnaissance et destruction de la cible par les phagocytes: Ex: PN
CIBLE IgG 1 et 3
C3biC3b
PAMPS et TLR
Etude numérique : NFSEtude fonctionnelle : Mesure de l’expression des molécules d’adhérence
Mesure du mouvement (chimiotactisme)Mesure de la production des formes réactives de l’O2Exploration de la voie des Toll Like Récepteurs
Cellule NK
CD2 CD16CD56
RécepteursInhibiteurs
Récepteursactivateurs+<
Cellule NK
CMH I
NK activée
CMH II
CD25
CelluleTumorale
Ouinfectée
CMH I
Cellule modifiée
tuée
Exploration numérique (cytométrie en flux à l’aide d’Ac spécifiques des molécules distribuées sélectivement sur les NK).
Exploration fonctionnelle (cytolyse).
Processus de maturation
Gram- Gram+ Fungi
Agents pathogènes = NON SOI
cytokines
Virus
C. Dendritique mature:C. Présentatrice de l’Ag
Activation des Lymphos T
CD4CD8C.dendritique immature:phagocytaire
Réponses innées Réponses adaptatives
cytokines
Motifs conservés au cours de l’évolution qui sont reconnus par les récepteurs des cellules de l’I° innée
Tissus Organes lymphoides périphériques
Cellule Dendritique= lien entre Immunité innée et Immunité adaptative
± détruits
I. innée
T CD4Naïf
GATA-3STAT-6
T-betSTAT-4
RORgTSTAT-3
FoxP3
IFNγ
IL4
IL17
TGFβ1
Cellulaire(pathogènes à xIntracellulaire
Humorale(pathogènes à xExtracellulaire
Neutrophile(pathogènes à xExtracellulaire
Régulation Négative
TH1
TH2
TH17
Treg
IL12
IL4
TGFβ1
TGFβ1IL6
2) Immunité adaptativePolarisation de la réponse T
Thymocyte
CD4: TH1 / TH2
APC Naive T cell
Th1
Th2
Co-stimuli IL-2
IL-12
IL-4
IL-2IFNγ
IL-4IL-5IL-10IL-13
Immunité Humorale(pathogènes à xExtracellulaire)
Immunité cellulaire (pathogènes à xIntracellulaire)(virus, bacteria, Leishmania major)
Th0
CD4
2) Immunité adaptativeTH1/TH2
IFN-γ
Th1
IL-2
Th1Th1
IL-2
CTL
IFN-γ
Pré-CTL
IL-12
CD28
TCR Th1
CD80/86
CMH II
CD4
CPA
cible
CD8
TCR CMH I
FasFas- LApoptose
PerforineGranzymes
Lyse
Th1 Th1
Th1
Th1 Th1
Macrophage
IFN-γ
NKIFNγIL-22-1 Immunité cellulaire
CD4
CD8
TCD4 reconnait peptideassocié aux MHC classe II
T CD8 reconnaît peptideassocié aux MHC classe I
CD4
2
B mémoires
Anticorps Plasmocytes
2-2 Réponse anticorps: activation des LymphosB1) Pontage de l’IgM mb par l’Ag signal 1
expression MHC Classe IIB7 (costimulation)
2) LTH2 CD4 reconnaît peptide + MHC IIprésenté par le LB
+ signal de costimulation B7/CD28 Activation LTH2 qui exprime CD40L
Interaction CD40/CD40L signal 2 dans LB3) LTH2 produit des cytokines
LB exprime récepteurs de cytokinesActivation, prolifération et différenciation
des LB
Explorations de l’Immunité adaptative
In VitroNFS= Nombre de lymphocytes circulantsCytométrie en Flux:- Phénotypage lymphocytaire T et B - Marqueurs d’activation lymphocytaire- Marqueurs cellule naïve/cellule mémoireTests fonctionnels:- Prolifération- Production de cytokines- production d’Acs (B) /Tests de cytotoxicité (T)
In VivoProduction d’Acs (B)
Tests d’Hypersensibilité retardé (T)
Numération lymphocytaire dans le sang circulant
Nombre de lymphocytes total dans le sang circulant chez l’adulte : 1000-4000/mm3
Population CD3+= lymphos T: 50 - 80%900-3000 /mm3
Population CD3+/CD4+: 32 - 52%450-1500 /mm3
Population CD3+/CD8+: 20 – 40%300 - 1000 /mm3
Rapport CD4/CD8 : 1-3Population CD19+= lymphos B: 5-20%
100- 450 /mm3
Résultats à interpréter en fonction de l’âge chez l’enfant.
Centrifugation sur unmilieu de séparation de densité d = 1.077
Ficoll-Hypaque
C. Mononucléées
polynucléairesGR
centrifuger
Exploration des Fonctions lymphocytaires
ISOLEMENT DES LYMPHOCYTES-Principe/méthode : - gradient de densité
- récupération d’un anneau cellulaire contenantlymphocytes et monocytes
Proliferation lymphocytaire : principe
Prolifération = reflet global de la capacité de réponse événement tardif
Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS NON SPECIFIQUES
1) Lectines d’origine végétale :liaison à des sucres spécifiques sur la membrane des cellulesT Phytohémagglutinine (PHA)
Concanavaline A (Con A)B/T Pokeweed mitogène (PWM)
2) Ac monoclonaux dirigés contre: des récepteurs membranaires :
capacité d’entraîner l’agrégation de récepteurs membranairesdoivent être préalablement fixés sur un support pour mimer lescontacts intercellulaires
T anti TCRB anti IgM
3) Activation de voies métaboliques impliquées dans la transmissiondes signaux intracellulaires
court-circuitent les signaux membranaires
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)activateur de PKC
ionomycine = ionophore calciqueactivateur d’enzyme Ca2+ dépendante
Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS NON SPECIFIQUES (suite)
Prolifération polyclonale: capacité générale de réponse selon les voies transductionnelles engagées
Diagnostic d’un déficit Immunitaire sévère
1) Antigènes de rappel :antigènes de vaccination
tuberculineanatoxine tétanique …
antigènes de l’environnementcandidinestreptocoqueCMV…
Mesure la capacité à développer une réponse mémoire spécifique
2) Alloantigènes :d’histocompatibilité (MLR)
Etude de la prolifération lymphocytaire : ACTIVATEURS SPECIFIQUES
Exploration de l’Immunité Humorale
In Vitro : Dosage des classes d’Igs: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD•Néphélémétrie•ELISA
In Vivo : Production d’Acs spécifiques en réponse à un rappel d’Ag vaccinal.
Numération des Lymphos B (cytométrie) CD19-CD20-Ig de Mb
Etude de leur Production d’Anticorps in vitro
Après une activation par un agent stimulant des lymphocytes B :Récolte des cellulesaprès 6 à 7 jours de culture: ELISPOT
YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y
Y YPAL PAL
substratjaune
violet
YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y
Ac
Marqueurs lymphocytes B
Marqueur fidèle (toutes les populations quelque soit leur niveau d’activation/differenciation : CD19)
Marqueurs de différenciation : CD27-/IgM+/IgD+ naifsCD27+/IgM+/IgD+ mémoire avant commutationCD27+/IgM-/IgD- mémoire après commutation
Explorations de l’Immunité cellulaireIn Vitro
NFS= Nombre de lymphocytes circulantsCytométrie en Flux:- Phénotypage lymphocytaire T: CD3+ CD4+/- CD8+/-- Marqueurs d’activation lymphocytaire (HLA-DR)- Marqueur cellule naïve/cellule mémoire CD45RA+/CD62L+
CD45RA- ou RO+/CD62L+ central mémoireCD45RA- ou RO+/CD62L-effecteur mémoireCD45RA+ ou RO-/CD62L-revertant
Tests fonctionnels:- Prolifération- Production de cytokines- Tests de cytotoxicité
In VivoTests d’Hypersensibilité retardé
2) Mesure de la prolifération lymphocytaire T par2-1-Incorporation de thymidine tritiée 3TH
Expression en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif) par rapport à des normes chez des sujets sains
In Vitro
Activation des cellules en culturenon spécifique / spécifique
Récolte du surnageant de culture après 24 à 48 h
Récolte du culot cellulaire après 18 à 24 h
- Dosage Immunoenzymatique- Dosage Cytométrie en flux
- Quantification des ARNm
Quantification des cellulesCD4+/CD8+ productrices
- Cytométrie en flux- ELISPOT
3)Mesure de la production de cytokines par les cellules immunitaires
In Vitro
3-1- Mesure de la production extracellulaire par technique ELISAIn Vitro
Différents types d’ELISA
Production de cytokines : Méthodes
3-2- Mesure de production intracellulaire :par cytofluorométrie en intracytoplasmique
Activation des cellulesnon spécifique/spécifique
Blocage de la sécrétion
Marquage de membraneAg de surface
Marquage intracellulairecytokine
Lecture en cytométrie de flux
In Vitro
Cellules T activées traitées parun inhibiteur qui bloque letransport des protéines
⇒ blocage des Cytokines dans le RE
Fixation et perméabilisation
des cellules
Pénétration des Acanti Cytokine et liaison aux
Cytokines intracytoplasmiques
d ’après Immunobiology 5, C. A. Janeway
3-2-Quantification des cellules T productrices d’IFNγ après stimulation- par des peptides de 9 aa ⌦ réponse des LT CD8+ spécifiques- par des Ag ou peptides 20 aa ⌦ réponse des LT CD4+ spécifiques
In Vitro
3-3-Numération des cellules secrétrices :par ELISpot (Enzyme Linked Immuno Spot)
Quantification des cellules T productrices d’IFNγ après stimulationpar des peptides de 9 aa ⌦ réponse des LT CD8+ spécifiquespar des Ag ou des peptides de 20 aa ⌦ réponse des LT CD4+ spécifiques
Expression des résultatsen nb de spots/106 cellules mononucléées
YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y
IFNγ
Peptidesou antigène
YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y
Y Y
PAL PAL
substratjaune
violet
In Vitro
4) Test de cytotoxicité :Mesure de la cytotoxicité par relargage de Cr radioactif
1er temps : développement in vitro des cellules effectrices cytotoxiques
coculture- de cellules mononucléées du sang périphérique
- avec des cellules dites stimulantes, irradiées qui possèdent lesantigènes contre lesquels on veut développer des CTL(infection virus recombinant, chargement peptides, transfection gène)
Obtention après 5 jours de cellules cytotoxiques spécifiquesde l’antigène choisi
In Vitro
Cellules cibles marquéesavec du Na2
51CrO4
Addition des cellules Tcytotoxiques
pendant au moins 4H
Cellules cibles tuées larguentLe chrome radioactif
Immunobiology 5, C. A. Janeway
2ème temps : mesure de la cytotoxicité par relargage du 51Crpar des lignées cellulaires exprimant les molécules du CMH identiques aux CTL et l’antigène étudié
Radioactivité libérée proportionnelle au nombre de cellules détruites
In Vitro
IFN-γ
Th1
IL-2
Th1Th1
IL-2
IL-12
CD28
TCR Th1
CD80/86
CMH II
CD4
CPA
Th1 Th1
Th1
Th1 Th1
Macrophage
IFN-γIL-2
Nbs autres cytokines et chimiokines
Après un 1er contact avec l’Ag CD4 TH1 mémoiresSensibilisées à l’Ag:Ex: tuberculine aprèsInfection tuberculeuseVaccination BCG
Hypersensibilité retardéeIn Vivo
Retardé: délai nécessaire à la rencontre de l’Ag avec T spécifiques,proliférationet migration mono/macrophages
Hypersensiblité retardée : Etude in vivo
Injection intra-dermique de tuberculineLecture 48 h et 72 h après l’injection :indurationmesurer le diamètre de l’induration< 5mm = Réaction négative:
Pas de contact antérieur avec BK ou BCGDéficit de la réponse Immunitaire si contact antérieur
> 5mm = Réaction positive: contact antérieureParfois phlycténulaire ou nécrotique: suspicion d’infection
Histologie montre la présence de lymphocytes T et de nombreux monocytes/macrophages
•Hypersensiblité retardée à la tuberculine
•Hypersensibilité à différents Ags présents dans la nature:Candidine etc…
In Vivo
Recommended