Enzimi - · PDF fileenzimi) kovalentne modifikacije (fosforilacija) protein-protein...

EnzimiEnzimiEnzimiEnzimiEnzimiEnzimiEnzimiEnzimibiokatalizatoribiokatalizatoribiokatalizatoribiokatalizatoribiokatalizatoribiokatalizatoribiokatalizatoribiokatalizatori

“ Mnoga tela... imaju osobinu da prema drugim telima ispoljavaju dejstvo koje veoma različito od hemijskog afiniteta... Posredstvom ovog dejstva ona prouzrokuju razaranja u (drugim) telima i stvaraju nova jedinjenja u čiji sastav sama ne stupaju. Ova nova, do sada nepoznata sila zajednička je i za organsku i za neorgansku prirodu... Nazvaću..ovu silu katalitičkom silom. Takoñe, nazvaću katalizom razlaganje tela posredstvom ove sile.

(J.J.Berzelius, Edinburgh New Philosophical Journal, XXI, 233, 1836)

� Defininicija po UPAC-u iz 1981. :

“Katalizator je supstanca koja dovodi do ubrzanja hemijske reakcije ali tako da ukupna promena standardne Gibsove energije (ukupne reakcije) ostaje nepromenjena.”

� ENZIMI- proteini koji deluju kao katalizatori

◦ Ribozimi- RNK molekuli sa katalitičkom funkcijom

◦ ubrzavaju hemijske reakcije u bološkim sistemima -BIOKATALIZATORI-

EEnziminzimi obezbeobezbeññujuuju

• specifičnost

• brzinu (visoka efikasnost pri relativno blagim uslovima) i

• regulaciju (kontrolu)

hemijskih reakcija u organizmu

� specifičnost se ogleda u odnosu na

◦ tip reakcije koju katališu

◦ supstrat -meñu mnogim molekulima “biraju” samo odredjeni (apsolutna i široka)

◦ produkt -od suptrata nastaje samo jedanproizvod (nema sporednih proizvoda)

� Specifičnost enzimske katalize

� specifičnost i brzina reakcija katalisanihenzimima je rezultat� jedinstvene sekvence aminokiselina koja omogućava

formiranje trodimenzionalne strukture enzimskog molekula

AktivnoAktivno mestomesto

(kataliti(katalitiččko, vezujuko, vezujućće)e)

� deo enzimskog molekula (udubljenje, žljeb) gde se vezuje supstrat i tako formira enzim-supstratkompleks

� mesto vezivanja supstrata odreñuje specifičnostprema supstratu

� takoñe i deo molekula enzima gde se odvija reakcija

DvaDvaDvaDvaDvaDvaDvaDva modelamodelamodelamodelamodelamodelamodelamodela formiranjaformiranjaformiranjaformiranjaformiranjaformiranjaformiranjaformiranja enzimenzimenzimenzimenzimenzimenzimenzim--------supstratsupstratsupstratsupstratsupstratsupstratsupstratsupstratkompleksakompleksakompleksakompleksakompleksakompleksakompleksakompleksa� model “ključa i brave”

◦ aminokiselinski ostaci formiraju komplementarnutrodimenzionalnu strukturu koja “prepoznaje”supstrat

� model indukovanog podešavanja

◦ vodonične veze, hidrofobne i elektrostatičkeinterakcije povezuju supstrat i enzim i vode daljimkonformacionim promenama i enzima i supstrata

model model ““kljuključč--bravabrava””

komplementarnostkomplementarnost izmedjuizmedju supstratasupstrata i i

aktivnogaktivnog mestamesta

� model indukovanog prilagodjavanjapromena konformacije enzima i supstrata

◦ vezivanje supstrata indukuje konformacionepromene enzima koje omogućavaju nove interakcijemolekula supstrata sa funkcionalnim grupama enzima

Brzina hemijske reakcijeBrzina hemijske reakcije

AAAA BBBB

v= k [A]v= k [A]v= k [A]v= k [A]

k= Ak= Ak= Ak= Arrrreeee----Ea/RTEa/RTEa/RTEa/RT

Faktori koji utiFaktori koji utičču na brzinuu na brzinu

◦◦ kolikoliččina reaktanta (supstrataina reaktanta (supstrata))))◦◦ temperaturatemperatura

◦◦ veliveliččina Eaina Ea

◦◦ enzimienzimi ubrzavajuubrzavaju

hemijskehemijske reakcijereakcije

smanjenjemsmanjenjem kolikoliččineine

energijeenergije potrebnepotrebne za za

dostizanjedostizanje visokovisoko--

energetskogenergetskog

intermedijernogintermedijernog

stanjastanja reakcijereakcije

((komplekskompleks prelaznogprelaznog

stanjastanja) ) –– smanjenasmanjena

energijeenergije aktivacijeaktivacije

JoJoJoJoJoJoJoJošššššššš popopopopopopopo nestonestonestonestonestonestonestonesto……………………

�� enzimienzimi katalikatališšu u samosamo

mogumogućće e reakcijereakcije ččineinećći i

ihih samosamo brzimbrzim

�� ubrzanjeubrzanje enzimimaenzimima

katalisanihkatalisanih reakcijareakcija je je

101066 do 10do 1014 14 ((mnogomnogo

vevećće e odod efikasnostiefikasnosti

neorganskihneorganskih

katalizatorakatalizatora))

�� enzimimaenzimima katalisanekatalisane reakcijereakcije imajuimaju 3 3 korakakoraka

◦◦ vezivanjevezivanje supstratasupstrata E + S E + S ↔↔ ESES

◦◦ konverzijakonverzija vezanogvezanog supstratasupstrata u u vezanivezani produktprodukt

ES ES ↔↔ EPEP

◦◦ oslobaoslobaññanjeanje produktaprodukta EP EP ↔↔ PP

�� korakkorak 1.1.

�� enzimienzimi vezujuvezuju supstratsupstrat/e/e ččiju transformaciju iju transformaciju katalikatališšu i u i

dovodedovode ihih u u najpovoljnijinajpovoljniji polopoložžajaj za za efikasnuefikasnu reakcijureakciju

�� korakkorak 2.2.

�� enzimenzim uuččestvujeestvuje u u formiranjuformiranju i i raskidanjuraskidanju vezaveza neophodnihneophodnih

za za nastanaknastanak produktaprodukta

�� korakkorak 3.3.

�� produktprodukt se se oslobaoslobaññaa,, a a enzimenzim vravraćća u a u svojesvoje originalnooriginalno stanjestanje

HemijskaHemijska prirodapriroda enzimaenzima

�� proteiniproteini

�� proteiniproteini + + kofaktorkofaktor◦◦ kofaktorkofaktor

� metalnimetalni jonijoni

�� prostetiprostetiččnana grupagrupa ((najnajččeeššćće e trajnotrajno vezanavezana za za enzimenzim))

� koenzimkoenzim ((povezanpovezan sasa enzimomenzimom samosamo tokomtokom katalizekatalize))

apoenzimapoenzim ((proteinskiproteinski deodeo enzimaenzima) + ) + koenzimkoenzim = =

hholoenzimoloenzim

◦◦ U U katalizikatalizi uuččestvujuestvuju funkcionalnefunkcionalne grupegrupe

aktivnogaktivnog mestamesta kojekoje potipotičču u odod

aminokiselinskihaminokiselinskih ostatakaostataka polipeptidnog lanca polipeptidnog lanca

ili/i kofaktora (ili/i kofaktora (koenzimakoenzima, , metalnihmetalnih jonajona))

MnogiMnogi mikroelementimikroelementi (metalni joni)(metalni joni)

susu kofaktorikofaktori enzimaenzima

•• omoguomoguććavajuavaju vezivanjevezivanje supstratasupstrata iliili koenzimakoenzima za za

enzimenzim ((delujudeluju kaokao elektrofilielektrofili i i takotako stabilizujustabilizuju

anjonskuanjonsku formuformu prelaznog stanja prelaznog stanja iliili vezujuvezuju

anjonskeanjonske supstratesupstrate))

� donoridonori susu elektronaelektrona u u oksidooksido--redukcionimredukcionim

reakcijamareakcijama

KoenzimiKoenzimi

�� organskiorganski molekulmolekul ((neproteinskneproteinske prirode)e prirode) kojikoji

obezbeobezbeññujuuju funkcionalnefunkcionalne grupegrupe za za enzimskuenzimsku

katalizukatalizu

�� kkodod ččovekaoveka se se ččestoesto sintetisintetiššu u odod vitaminavitamina

DveDve osnovneosnovne klaseklase koenzimakoenzima

�� koenzimikoenzimi kojikoji

◦◦ uuččestvujuestvuju u u reakcijamareakcijama prenosaprenosa grupagrupa�� jednim delom se jednim delom se ččvrstovrsto vezujuvezuju za za supstratsupstrat ((aktivirajuaktivirajućći i

gaga za za prenosprenos nekeneke grupegrupe, , dodatakdodatak vodevode i dr.). i dr.).

�� drugimdrugim delomdelom se se ččvrstovrsto vezujuvezuju za za enzimenzim ((akoako ostajuostaju

trajnotrajno vezanivezani zovuzovu se se prostetiprostetiččnana grupagrupa))

�� biotin, biotin, tiamintiamin pirofosfatpirofosfat, , koenzimkoenzim AA

◦◦ u u oksidooksido--redukcionimredukcionim reakcijamareakcijama�� sadrsadržže e specifispecifiččne ne funkcionalnefunkcionalne grupegrupe za za prenosprenos

elektronaelektrona (u (u formiformi hidridnoghidridnog jonajona, , atomaatoma

vodonikavodonika iliili kiseonikakiseonika))

�� ne ne vezujuvezuju se se kovalentnokovalentno za za supstratsupstrat i i posebnimposebnim

delomdelom se se vezujuvezuju za za enzimenzim

�� nikotinamidnikotinamid adeninadenin dinukleotiddinukleotid (NAD+), (NAD+), flavinflavin

adeninadenin dinukleotiddinukleotid (FAD)(FAD)

KoenzimskeKoenzimske formeforme vitaminavitamina

�� kofaktorikofaktori imajuimaju, , kodkod nekihnekih enzimaenzima i i

nekatalitinekatalitiččkuku, , strukturnustrukturnu, , uloguulogu povezujupovezujućći i

udaljeneudaljene delovedelove polipeptidnogpolipeptidnog lancalanca u u

formuformu tercijalnetercijalne strukturestrukture

MMehanizmiehanizmi enzimskeenzimske katalizekatalize ukljuuključčujuuju

◦◦ acidoacido--baznubaznu katalizukatalizu

◦◦ formiranjeformiranje kovalentihkovalentih intermedijeraintermedijera

◦◦ stabilizacijustabilizaciju prelaznogprelaznog stanjastanja

◦◦ blizina i orjentacijablizina i orjentacija

Primer: katalitički mehanizmi himotripsina

OptimalniOptimalni usloviuslovi za za enzimskuenzimsku reakcijureakciju

–– temperaturatemperatura i pHi pH

KlasifikacijaKlasifikacija enenzima zima

(Enzyme Commision (Enzyme Commision ––EC)EC)

Primer: Primer: alkoholalkohol dehidrogenazadehidrogenaza

�� Trivijalno ime: alkohol dehidrogenazaTrivijalno ime: alkohol dehidrogenaza�� Sistemsko ime: alkohol:NAD+ oksidoreduktazaSistemsko ime: alkohol:NAD+ oksidoreduktaza�� EC 1.1.1.1EC 1.1.1.1..

�� Klasa: oksidoreduktazaKlasa: oksidoreduktaza

�� Poklasa: oksidacija hidroksilne grupePoklasa: oksidacija hidroksilne grupe

�� Podpodklasa: NADPodpodklasa: NAD++ kao koenzimkao koenzim

�� Redni broj u podpodklasi: prvi na listi u podpodklasiRedni broj u podpodklasi: prvi na listi u podpodklasi

RegulacijaRegulacijaRegulacijaRegulacijaRegulacijaRegulacijaRegulacijaRegulacija enzimskeenzimskeenzimskeenzimskeenzimskeenzimskeenzimskeenzimskekatalizekatalizekatalizekatalizekatalizekatalizekatalizekatalize

EnzimskaEnzimska aktivnostaktivnost je je regulisanaregulisana i i

odrazavaodrazava fiziolofiziološškokomm stanjestanje organizmaorganizma

�� KKontrolaontrola brzinebrzine reakcijareakcija je je mogumogućća a jerjer se se

enzimienzimi mogumogu regulisatiregulisati razlirazliččitimitim mehanizmimamehanizmima

�� Regulacija metaboliRegulacija metaboliččkih procesa preko kih procesa preko

regulacije enzimske aktivnostiregulacije enzimske aktivnosti

MMehanizmiehanizmi rregulacijegulacijee enzimskeenzimske

aktivnostiaktivnosti

�� brzinabrzina enzimskienzimski katalisanekatalisane reakcijereakcije zavisizavisi odod koncentracijekoncentracije

supstratasupstrata

�� matematimatematiččkiki se se predstavljapredstavlja MichaelisMichaelis--MentenMenten--ovomovom

jednajednaččinominom

�� kkovalentnaovalentna modifikacijamodifikacija aminokiselinskihaminokiselinskih ostatakaostataka proteinaproteina u u

polipeptidnom lancu enzimapolipeptidnom lancu enzima

�� iinterakcijanterakcija sasa modulator modulator proteinimaproteinima

�� vvezujuezuju se za se za enzimenzim

�� mmenjajuenjaju konformacijukonformaciju enzimaenzima i i takotako njegovunjegovu aktivnostaktivnost

�� mmehanizamehanizam povratnepovratne spregesprege (feedback)(feedback)

�� nnajajččeeššćće e prveprve reakcijereakcije metabolimetaboliččkogkog putaputa

RegulacijaRegulacija koncentracijomkoncentracijom supstratasupstrata

kkkk1111 kkkk3333

� E + S E + S E + S E + S ↔↔↔↔ ES ES ES ES →→→→ PPPPkkkk2222

� BrzinaBrzinaBrzinaBrzina ((((kolikolikolikoliččččinainainaina stvaranjastvaranjastvaranjastvaranjaproduktaproduktaproduktaprodukta u u u u jedinicijedinicijedinicijedinicivremenavremenavremenavremena) ) ) ) svihsvihsvihsvih enzimaenzimaenzimaenzimazavisizavisizavisizavisi odododod koncentracijekoncentracijekoncentracijekoncentracijesupstratasupstratasupstratasupstrata

� IzraIzraIzraIzražžžžavaavaavaava se se se se

◦ MichaelisMichaelisMichaelisMichaelis----MentenMentenMentenMentenjednajednajednajednaččččinominominominom

◦ MichaelisMichaelisMichaelisMichaelis----MentenMentenMentenMenten----ova konstantaova konstantaova konstantaova konstanta◦ Km = (kKm = (kKm = (kKm = (k2222 + k+ k+ k+ k3333)/k)/k)/k)/k1111

� [S] > Km[S] > Km[S] > Km[S] > Km Vo = Vo = Vo = Vo = VmaxVmaxVmaxVmax� [S] < Km[S] < Km[S] < Km[S] < Km Vo = Vo = Vo = Vo = VmaxVmaxVmaxVmax [S] /Km[S] /Km[S] /Km[S] /Km� [S] = Km[S] = Km[S] = Km[S] = Km Vo = Vo = Vo = Vo = VmaxVmaxVmaxVmax / 2 / 2 / 2 / 2

� LineweaverLineweaverLineweaverLineweaver----Burk (Burk (Burk (Burk (reciproreciproreciprorecipročne ne ne ne vrednostivrednostivrednostivrednosti))))

�� izoenzimiizoenzimi heksokinazeheksokinaze

◦◦ heksokinazaheksokinaza I Km 0.05 I Km 0.05 mMmM

�� u u eritrocitimaeritrocitima ((zavisnizavisni iskljuisključčivoivo odod glukozeglukoze))

◦◦ glukokinazaglukokinaza ((jetrajetra i i pankreaspankreas) 5.0 ) 5.0 –– 6.0 6.0 mMmM

�� jetrajetra preuzimapreuzima ““viviššakak”” iziz krvikrvi →→ glikogenglikogen

RegulacijaRegulacija enzimskeenzimske aktivnostiaktivnosti

inhibicijominhibicijom

�� inhibitoriinhibitori supstancesupstance kojekoje se se vezujuvezuju za za enzimenzim i i

smanjujusmanjuju brzinubrzinu katalizekatalize

�� reverzibilnareverzibilna inhibicijainhibicija◦◦ inhibitor se inhibitor se vezujevezuje za za enzimenzim nekovalentnonekovalentno

◦◦ lakolako se se odvajaodvaja odod enzimaenzima

�� dejstvodejstvo mnogihmnogih lekovalekova i i toksinatoksina je u je u

inhibicijiinhibiciji enzimaenzima◦◦ Toksini najToksini najččeeššćće ireverzibilni inhibitorie ireverzibilni inhibitori

ReverzibilniReverzibilni inhibitoriinhibitori ((ččestoesto samisami produktiprodukti

reakcijereakcije))

�� premaprema odnosuodnosu supstratasupstrata i i inhibitorainhibitora◦◦ kompetititivnakompetititivna inhibicijainhibicija

◦◦ nekompetitivnanekompetitivna inhibicijainhibicija

◦◦ akompetitivnaakompetitivna inhibicijainhibicija

�� kompetitivnakompetitivna inhibiticijainhibiticija◦◦ inhibitor inhibitor slisliččan an pravompravom supstratusupstratu

◦◦ inhibitor se inhibitor se ““takmitakmiččii”” sasa pravimpravim supstratomsupstratom za za

aktivnoaktivno mestomesto

◦◦ povepoveććavaava se Km, a se Km, a VmaxVmax ostajeostaje istaista

◦◦ povepoveććanjemanjem supstratasupstrata lakolako se se prevazilaziprevazilazi ova ova

inhibicijainhibicija

�� nekompetitivnanekompetitivna inhibicijainhibicija◦◦ sasa nekompetitivnimnekompetitivnim inhibitorominhibitorom

◦◦ inhibitor se ne inhibitor se ne vezujevezuje za za mestomesto gdegde i i supstratsupstrat

◦◦ menjamenja se se VmaxVmax, Km , Km ostajeostaje istoisto

◦◦

◦◦ akompetitivniakompetitivni inhibitor se inhibitor se vezujevezuje samo samo za za komplekskompleks

enzimenzim--supstratsupstrat

◦◦ menjamenja se i se i VmaxVmax i Kmi Km

Nekompetativna inhibicija

RegulacijaRegulacija enzimskeenzimske aktivnostiaktivnosti

konformacionimkonformacionim promenamapromenama ((brzabrza

regulacijaregulacija))

�� alosternaalosterna aktivacijaaktivacija i i inhibicijainhibicija (alosterni (alosterni

enzimi)enzimi)

�� kovalentnekovalentne modifikacijemodifikacije ((fosforilacijafosforilacija))

�� proteinprotein--protein protein interakcijainterakcija ((izmedjuizmedju

regulatorneregulatorne i i katalitikatalitiččkeke subjedinicesubjedinice))

�� proteolitiproteolitiččkoko razlaganjerazlaganje

AlosternaAlosterna aktivacijaaktivacija i i inhibicijainhibicija

�� Alosterni Alosterni enzimenzim obiobiččno no imaima dvedve iliili vivišše e

subjedinicasubjedinica

�� Nisu svi proteini sa katernernom strukturom Nisu svi proteini sa katernernom strukturom

alosterni vealosterni većć samo oni sa izrasamo oni sa izražženim enim

kooperativnim efektom, tj.kooperativnim efektom, tj.

◦◦ subjedinice subjedinice vezivanjevezivanje supstratasupstrata za za jednujednu

subjedinicusubjedinicu menjamenja konformacijukonformaciju ostalihostalih--

kooperativno vezivanje supstratakooperativno vezivanje supstrata ––sigmoidalna sigmoidalna

kinetikakinetika

◦◦ Kooperativnost modulisana efektorima (aktivatori Kooperativnost modulisana efektorima (aktivatori

i inhibitori)i inhibitori)

�� alosternialosterni efektoriefektori◦◦ alosternialosterni inhibitoriinhibitori imajuimaju jajačči i uticajuticaj odod ostalihostalih

((kompetitivnikompetitivni, , nekompetitivninekompetitivni, , akomepetitivniakomepetitivni) )

inhibitorainhibitora

◦◦ ne ne zauzimajuzauzimaju katalitikatalitiččkoko mestomesto –– mogumogu delovatidelovati kaokao

aktivatoriaktivatori

◦◦ efekatefekat alosternogalosternog efektoraefektora brzbrz

Hemoglobin Hemoglobin kaokao alosternialosterni proteinprotein

�� globularniglobularni protein (4 protein (4 subjedinicesubjedinice, 2alfa, 2 , 2alfa, 2

beta) u beta) u eritrocitimaeritrocitima

�� prenosiprenosi kiseonikkiseonik iziz pluplućća u a u tkivatkiva

�� COCO22 i Hi H++ iziz tkivatkiva u u plupluććaa

�� nosinosi i i otpuotpušštata NO (NO (vazodilatorvazodilator))

�� HbA1, 2 HbA1, 2 αα (141 (141 a.ka.k.) i 2 .) i 2 ββ

(146 (146 a.ka.k.), 98%.), 98%

�� HbA2, 2 HbA2, 2 αα, 2 , 2 δδ

�� HbFHbF, 2, 2αα, 2 , 2 γγ

�� konformacionekonformacione promenepromene u u tercijalnojtercijalnoj

strukturistrukturi nakonnakon vezivanjavezivanja kiseonikakiseonika

�� T T stanjestanje ((malimali afinitetafinitet za Oza O22) i R ) i R stanjestanje

((visokivisoki afinitetafinitet za Oza O22))

�� pozitivnapozitivna kooperativnostkooperativnost prvogprvog vezanogvezanog

OO22 ((olakolakššavaava konformacionekonformacione promenepromene u u

drugimdrugim subjedinicamasubjedinicama))

AgensiAgensi (efektori) (efektori) kojikoji utiutičču u nana vezivanjevezivanje

kiseonikakiseonika

�� vodonikovivodonikovi jonijoni

�� 2,32,3--bisfosfogliceratbisfosfoglicerat

�� kovalentnokovalentno vezivanjevezivanje COCO22

�� vezivanjevezivanje HH++ smanjujesmanjuje afinitetafinitet HbHb za Oza O2 2

((BorovBorov efekatefekat))

�� 2,32,3--bisfosfoglicerat (u bisfosfoglicerat (u eritrocitimaeritrocitima) )

otezavaotezava formiranjeformiranje stanjastanja za za vezivanjevezivanje OO22 i i

takotako smanjujesmanjuje afinitetafinitet HbHb za Oza O22

◦◦ eritrocitieritrociti promenompromenom koncentracijekoncentracije 2,32,3--

bisfosfoglicerata bisfosfoglicerata modulirajumoduliraju vezivanjevezivanje OO22

�� COCO22 se do se do pluplućća a uglavnomuglavnom transportujetransportuje

kaokao bikarbonatbikarbonat

�� deodeo se se vezujevezuje za za HbHb

◦◦ u u tkivimatkivima za za deoksideoksi konformacijukonformaciju ((stabilizujestabilizuje je)je)

��prekopreko amino amino grupagrupa ((karbamatkarbamat))

◦◦ u u plupluććimaima se se vezujevezuje OO22 i i oslobadjaoslobadja COCO22

KovalentneKovalentne modifikacijemodifikacije

�� FosforilacijomFosforilacijom

◦◦ sasa protein protein kinazamakinazama iliili protein protein fosfatazamafosfatazama

◦◦ u u fosforilacijifosforilaciji uuččestvujeestvuje ATP i ATP i --OH OH grupegrupe Ser, Ser,

ThrThr i Tyri Tyr

ProteinProtein--protein protein interakcijeinterakcije

�� receptor (protein) receptor (protein) –– G proteinG protein

�� G protein G protein –– adenilatadenilat ciklazaciklaza

ProteolitiProteolitiččkoko razlaganjerazlaganje

�� proenzimiproenzimi ((zimogenizimogeni))

◦◦ za za aktivacijuaktivaciju neophodnoneophodno proteolitiproteolitiččkoko razlaganjerazlaganje

((ireverzibilnoireverzibilno))

◦◦ himotripsinogenhimotripsinogen ((tripsinomtripsinom se se konvertujekonvertuje u u

himotripsinhimotripsin))

◦◦ kodkod koagulacijekoagulacije krvikrvi ((odrodržžavanjeavanje hemostazehemostaze --

konstantnekonstantne zapreminezapremine krvikrvi))

�� fibrinogen fibrinogen prelaziprelazi u fibrin u fibrin delovanjemdelovanjem trombinatrombina ((serinserin

proteazaproteaza))

�� aktivacijaaktivacija trombinatrombina –– koagulacionakoagulaciona kaskadakaskada