ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y OTRAS ENZIMAS UTILIZADAS EN...

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Y OTRAS ENZIMAS

UTILIZADAS EN

INGENIERÍA GENÉTICA

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Importancia en el desarrollo de la ingeniería genética

EcoRI GAATTC

CTTAAG

Restricción-modificación

m

G-A-A-T-T-C

C-T-T-A-A-G

m

Metilasa

EcoRI

mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

m

mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

m

Nucleasa

EcoRI

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

Nucleasa

EcoRI

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G

G A-A-T-T-CC-T-T-A-A G

Sistemas de modificación- restricción:

mecanismo de defensa de las bacterias

contra DNA invasor

Par

endonucleasa + metilasa

misma especificidad

(reconocen la misma

secuencia)

Tipos de enzimas de restricción

Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrómicas, 4-7 pb. Sitio de

corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

- Desoxirribonucleasas, con actividad endonucleolítica, que

reconocen secuncias específicas en el DNA

- Estas secuencias tienen a menudo estructura palindrómica

(simetría), y una longitud de 4, 6, 8 nucleótidos

GTCGAC

CAGCTG

GTAC

CATG

GTCCGGAC

CAGGCCTG

44 46 48

256 4096 65536

Sitios de corte de las endonucleasas de restricción del tipo II

Tipo IIs: MboII

Extremos protuberantes o cohesivos

GAATTC

CTTAAG

G-3’

CTTAA-5’

5’-AATTC

3’-G

EcoRI

5’ protuberantes

Extremos protuberantes o cohesivos

CTGCAG

GACGTC

CTGCA-3’

G-5’

5’-G

3’-ACGTC

PstI

3’ protuberantes

Extremos romos

CCCGGG

GGGCCC

CCC-3’

GGG-5’

5’-GGG

3’-CCC

SmaI

Extremos compatibles (I)

GAATTC

CTTAAG

GAATTC

CTTAAG

EcoRI

GAATTC

CTTAAG

EcoRI

Extremos compatibles (II)

GTCGAG

CAGCTC

GTCGAC

CAGCTG

SalI

CTCGAG

GAGCTC

XhoI

Extremos romos

(siempre compatibles)

CCCATC

GGGTAG

CCCGGG

GGGCCC

SmaI

GATATC

CTATAG

EcoRV

Extremos 5’ protuberantes no compatibles. Rellenados, se transforman en romos

(siempre compatibles)

GAATTC

CTTAAG

EcoRI

CTCGAG

GAGCTC

XhoI

G-3’

CTTAA-5’

AA T-3’T

5’-TCGAG

3’-CTCG3’-A

GAATT

CTTAA

TCGAG

AGCTC

Klenow + dNTPs

Extremos 3’ protuberantes no compatibles. Degradado de cadena sencilla para

convertirlos en extremos romos

CTGCAG

GACGTC

PstI

C

G-5’

• Nucleasa S1: endonucleasa específica de cadena sencilla

• Mung Bean: endonucleasa específica de cadena sencilla

• T4 DNA polimerasa: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la

actividad exonucleasa 3’→5’

• Klenow: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la actividad

exonucleasa 3’→5’

TGCA-3’-3’-3’-3’-3’

Plantas: metilación m5CG y m5CNG.

Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilación:

McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA

sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354

Vertebrados: metilación de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-

metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulación de la

transcripción.

HpaII, MspI: isosquizómeros, reconocen C/CGG

La metilación del ADN en eucariotas superiores está relacionada con la

regulación de la transcripción. El uso de algunas enzimas de restricción

específicas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado,

obteniéndose de esta manera información sobre la posible regulación

de la expresión de un gen por metilación del ADN

Aspectos prácticos

Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 mg de ADN en 1 hora a la

temperatura y condiciones óptimas.

Inhibición: Adición de 20 mM EDTA

Inactivación: Por calor o tratamiento con fenol-CIA

Dos enzimas de restricción pueden utilizarse simultáneamente siempre

que compartan las mismas condiciones de digestión (temperatura, pH,

concentración de sales)

POLIMERASAS Y ENZIMAS

MODIFICADORAS DEL ADN

DNA polimerasas: actividades y propiedades

DNA polimerasas: actividades y propiedades

5’ 3’OH

5’3’DNA molde con primer

dsDNA con huecos

Extremos 5’ protuberantes

dsDNA con “nicks” (nick translation)

5’P3’OH 5’P3’OH

Hairpin5’

3’OH

Nick Translation

DNasa I

DNA polimerasa I

DNA polimerasas: utilidades

DNA Polimerasa I

- Marcaje por “nick translation”

Klenow

- Rellenado de extremos 5’ protuberantes

- Síntesis de la segunda hebra de cDNA

T4 polimerasa

- Eliminación de extremos 3’ protuberantes

Taq DNA polimerasa (Vent, Pfu)

- PCR

Transcriptasa reversa (AMV: avian myeloblastosis virus) (MMLV: Moloney murine leukemia virus) (Tth: Thermus thermophylus)

- Síntesis de cDNA a partir de RNA

Enzimas modificadoras: actividades y utilidades

DNA ligasa (del bacteriófago T4)

- Forma enlaces fosfodiester entre un extremo 5’ P y otro 3’OH. Requiere ATP

- Usos: Unir dos moléculas de DNA: vector - inserto

Fosfatasa alcalina (BAP: bacterial alcaline phosphatase) (CIP: calf intestinal alkaline phosphatase) (SAP: shrimp alkaline phosphatase)

- Eliminan el grupo fosfato del extremo 5’ de DNA, RNA y dNTPs

- Usos: desfosforilación de extremos en experimentos de ligación vector-inserto

5’P3’OH 5’P3’OHNNG GATCCNNNNCCTAG GNN

NNGGATCCNNNNCCTAGGNN

Ligasa

NNGGA TCCNNNNCCT AGGNN

LigasaNNGGATCCNNNNCCTAGGNN5’P3’OH

5’P 3’OH

Acción de la DNA ligasa

Enzimas modificadoras: actividades y utilidades

Fosfatasa alcalina

Enzimas modificadoras: actividades y utilidades

Polinucleótido kinasa

- Transfiere el grupo fosfato g desde una molécula de ATP a un extremo 5’ de DNA o RNA

- Usos: Marcaje 5’ terminal de una molécula de DNA

Fosforilación de fragmentos de DNA que carecen de P en 5’ para ligación

Ribonucleasa H (RNasa H)

- Degradación endonucleolítica del RNA en híbridos DNA-RNA

Nucleasas

DNasa I (de páncreas bovino)

- Corta ambas hebras del DNA en presencia de Mn2+. En presencia de Mg2+

corta una sóla hebra (nick)

- Usos: Eliminación de DNA en muestras de RNA (Mn2+)DNA footprinting (Mn2+)Nick translation: generación de nicks para acción de DNA pol. I (Mg2+)