Dísznövények mikroszaporítása

Dísznövények mikroszaporítása

2017.02.18.

Dr. Mosonyi István Dániel

A mikroszaporítás fogalma, jelentősége

Szelektált fajok illetve fajták vegetatív, fajtaazonos szaporítása in vitro (steril

laboratóriumi) és kontrollált körülmények között.

ELŐNYÖK HÁTRÁNYOK

Kis helyigény Fertőződés léphet fel

Hatóságilag igazolható kórokozómentes Szomaklonális variabilitás léphet fel

Nincs visszafertőződés Akklimatizációs veszteség nagy

Homogén minőség Nagy költségigényű

Évszaktól, éghajlattól független Speciális laborhátteret igényel

Folyamatos előállítást tesz lehetővé Képzett munkaerőt igényel

Nehezen szaporítható fajoknál is jó

Új genotípusok gyors felszaporítása

Gépesíthető és automatizálható

Különösen gyors módszer

A tenyészetek könnyen szállíthatók

A mikroszaporítás fogalma, jelentősége

Izrael: szegfű, krizantém,

gladiólusz

Arab országok: datolya,

banán, burgonya, szamóca,

pisztácia, rózsa

India: főleg fásszárúak,

dísznövények, banán

Kína: erdészeti fajok

Dísznövények, gyümölcsök

A világon évente 700 millió növényt állítanak elő in vitro (2003-as adat).

0

20

40

60

80

100

120

2005 2006 2007 2008 2009 2010

nö

vé

nys

zá

m (

mil

lió

db

)

Phalaenopsis

Anthurium

Kalanchoe

Rosa

Hyacinthus

Chrysanthemum

Dracaena

Ficus

Spathiphyllum

Cyclamen

Begonia

Poinsettia

Cserepes dísznövények mennyisége a holland virágtőzsdén

Dugványozás vs. mikroszaporítás afrikai ibolya esetében

Cél: 10 000 db növény

Levéldugványozás Mikroszaporítás

Szükséges

anyanövények száma

(4-5 db levél/növény)

667 db 3 db

Helyfoglalás a

növényházban

17 m2 0,08 m2

Szaporodási ráta

levelenként

3× 810×

Munkaigény 13,2 h 137,8 h

A mikroszaporítás elméleti háttere

Növényi sejtek totipotenciája – a növény testi sejtjeinek mindegyike

megtartja azokat az információkat, ami alapján egy sejtből felépülhet egy

teljes növényi szervezet (totipotens = mindenre képes)

Gottlieb HABERLANDT 1902-ben fogalmazta meg a totipotencia elvét (Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen, Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien. Math.-

Naturwiss. Kl., Abt. J. 111, 69–92.)

A bizonyításra 1958-ban került sor, STEWARD által.

Sárgarépánál már differenciálódott sejtekből kalluszt állítottak elő,

valamint megfigyelték, hogy ennek a kallusznak egyes sejtjeiből nem csak

szerveket (organogenezis), hanem embriókat is lehet fejleszteni

(embriogenezis).

NÖVÉNY – SEJT – NÖVÉNY rendszer

dedifferenciálódás - redifferenciálódás

A mikroszaporítás szakaszai

Előkészítés Steril kultúra indítása

Felszaporítás

Elongálás és gyökeresítés Akklimatizálás

0. – Előkészítő szakasz

Célja: a sterilizálás megkönnyítése, az osztódó szövettájak aktivizálása

Alkalmazott módszerek:

• a szár lelevelezése indítás előtt 1-2 héttel (sebforradás)

• átállás felszívatásos öntözésre 2-4 hónappal indítás előtt

• a hajtáscsúcs eltávolítása 2-4 héttel indítás előtt (oldalrügyek megduzzadnak)

• magasabb hőmérsékleten illetve fényen nevelés

• citokininnel való kezelés

Hemerocallis anyanövények

Az indítás előtt a virágzati

szárak megnyúlása már a

laboratórium steril

környezetében történt.

George et al., 2008

Juvenilis részek fás növények esetében:

Az előkészítő szakasz

A rejuvenizálás módszerei:

- visszavágás, sérülések okozása

- etiolálás

- hormonkezelés – citokininekkel

többnyire kapcsoltan egy fizikai kezeléssel (utána)

A dormancia megszüntetése:

- magok/rügyek esetében GA kezelés

(in vitro is lehet – alvó rügyeket könnyebb sterilizálni)

akár közvetlenül lehet őket alkoholba mártás

után lelángolni

- hőkezelések (hideg/meleg) – hagymák, évelők stb..

George et al., 2008

Fenyők rejuvenilizálása sorozatos átoltással:

1. – Indító szakasz

Explantátum (inokulum) – kiindulási növényrész kiválasztása

Szinte bármelyik rész lehet – de célszerű olyat választani, ami merisztémát

tartalmaz, vagy merisztémadifferenciálásra hajlamos.

Száraz buroklevél

Húsos buroklevél

Csúcsrügy

Hónaljrügyek

Tönk

Gyökerek

Hónaljrügy

Hajtáscsúcs

Nódusz

Levél

Bimbó

Felleveles virágzati

szár

Mag

1. – Indító szakasz

Célja: a steril körülmények létrehozása és fenntartása

Alkalmazott módszerek:

• eszközök és edények sterilizálása: hőlégsterilezés (120-180°C) vagy gáz

alkalmazása (formaldehid, etilén-oxid)

• táptalaj sterilizálása autoklávozással (15-30 min, 121°C, 0,1 MPa túlnyomás)

• explantátum fertőtlenítése:

•Csapvizes mosás

•Etanol 70%

•Na vagy Ca-hipoklorit (NaOCl, Ca(OCl)2) 2-10%

•Higany(II)-klorid (HgCl2) 0,1%

•Öblítés steril desztillált vízzel

Kombinálhatók

• táptalajra helyezés steril fülkében – lamináris box

1. – Indító szakasz

Felleveles virágzati szárdarabok –

alvórügyet tartalmaznak a fellevél

tövében

Csapvizes előmosás

1. – Indító szakasz

Áztatás a fertőtlenítőszeres oldatokban – keveréssel kombinálva

A sterilitás biztosítása

1. – Indító szakasz

Az indítási szakasz táptalajai

Az inokulum típusától függ.

Általában az ásványi elem összetétel ua., a növekedésszabályozók a különbség.

Merisztémacsúcs tenyészet: sokszor elegendő az auxin egyedül

Hajtáscsúcs tenyészet: auxinként IVS, NES, de 2,4-D nem

citokininként: BAP, KIN, 2-iP, TDZ

In vitro magvetés: nem kell növ.szabályzó, bár

a citokininek a csírázó embrióknál

hajtástöbbszöröződést tudnak indukálni

(Mimulus, Petunia, Sinningia, Citrus)

gibberellinek a magnyugalom megtöréséhez

Az indítási szakasz problémái

Barnulás: sebfelületen barnul/feketedik a növényi szövet,

később a táptalaj is elszíneződhet.

Oka: a fenolázok, mono- és polifenoloxidázok, felszabadulnak a

sejtmembránokból,

ezek szubsztrátjai (hidroxifenolok) pedig a vakuólumokból

és reakcióba lépnek egymással

polifenolok, kinonok keletkeznek, és fehérjékhez kötődnek, vagy

oxidálják őket -> toxikusak

Megelőzése: - a sérülések minimalizálása

- a fenolos vegyületek eliminálása

- öblítés, mosás, kiáztatás

- táptalaj gyakori cseréje (naponta, hetente)

- folyékony táptalaj használata (jobb diffúzió)

- aktív szén vagy PVP(P) használata lekötéshez

- a fenoláz enzimek inhibitálása kelátképzőkkel

- a fenoláz aktivitás csökkentése (alacsony pH, hőm.)

- áztatás antioxidánsban (citromsav, aszkorbinsav)

- antioxidánsok adása a táptalajhoz

Spathiphyllum torzsavirágzat,

mint explantátum

2. – Felszaporítási szakasz

Cél: a tenyészet sokszorozása

A táptalaj általában citokinin túlsúlyos, arányaiban kevesebb auxint tartalmaz.

A szaporodási ráta mutatja a szakasz hatékonyságát:

egy szubkultúrálás alatt fejlődött továbbszaporításra alkalmas új részek

(sarjhagyma, sarjhajtás) száma egy explantátumra vonatkoztatva.

A felszaporításnak több útja lehetséges.

Egy- vagy

többrügyes

hajtásdarabbal

Oldalhajtással Járulékos hajtással Járulékos szervvelSzomatikus

embrióval

HajtástenyészetbenSejt-

szuszpenzióban

A merisztémából

fejlődő hajtás

egy- vagy

többrügyes

darabjainak

átoltásával.

A merisztémából

fejlődő hajtás

oldalhajtásainak

átoltásával.

A merisztémából

fejlődött kalluszból

regenerálódott

hajtások

átoltásával.

Hajtáseredetű

szervek (gumó,

hagyma)

indukciójával.

Sejtszuszpenzióban

fejlődött szomatikus

embriókból

készített

mesterséges

magvakkal.

A mikroszaporítás lehetséges útjai

A szaporítás lehetséges útjai a sokszorosító szakaszban

George et al., 2008

A hajtáscsúcskultúra (hajtáscsúcsból és oldalhajtásból)

George et al., 2008

A hajtáscsúcskultúra (hajtáscsúcsból és oldalhajtásból)

Elsődleges explantátum: - merisztéma

- száron lévő rügyek (csúcs- vagy oldalrügyek)

- hajtás (20 mm-ig) – főleg lágyszárúaknál

előnyei: könnyebben megindul

több rügyet tartalmaz

könnyebben túlél

hátrány: vírusfertőzött lehet

nehezebb sterilizálni

Fásszárúaknál problémák: - egyes rügyekben nagy a mikrobiális szennyezettség

- sokszor fenolosodási probléma lép fel

- dormancia

előny: - a rügyeket könnyű felszínileg sterilizálni

Táptalaj: citokinin-túlsúlyos

(apikális dominancia gátlása – kivéve pl Gymnocladus spp.)

Hajtások eredete szerint válogatni, ugyanis előfordulnak járulékosan fejlődöttek is!

Kalluszosodás megelőzése: auxin-inhibitorokkal (TIBA, transz-fahéjsav)

A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal)

George et al., 2008

A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal)

Elsődleges explantátum: ua. mint a hajtáscsúcskultúránál

Nevelés:

5-10 cm-es méretig, amíg a

nóduszok jól elkülönülnek

Táptalaj:

citokininmentes általában

(nem kell elágazás!)

esetleg GA használata a

megfelelően megnyúlt

hajtásokhoz

Alkalmazás:

burgonya, Alstroemeria főleg

Szaporodási ráta általában kisebb, mint a hajtáscsúcskultúránál, de kevesebb

kallusz fejlődik, és kevesebb adventív hajtás genetikai stabilitás nagy

A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal)

Egyszikűek Fásszárú kétszikűek

Alstroemeria Carpinus betulus

Cymbopogon spp. Castanea sativa, C. mollissima

Poa pratensis Eucalyptus grandis

Asparagus officinalis Forsythia ovata

Dioscorea spp. Fraxinus pennsylvanica

Zea mays Juglans regia

Orchideák Hevea brasiliensis

Dendrobium spp. Leucaena leucocephala

Phalaenopsis spp. Ligustrum obtusifolium

Thunia alba Lonicera periclymenum

Vanilla planifolia Olea europea

Lágyszárú kétszikűek Paulownia tomentosa

Angelonia salicariefolia Poncirus trifoliata

Cucumis sativus Prosopis juliflora

Glycyrrhiza glabra Prunus armeniaca

Rosmarinus officinalis Quercus robur

Rorippa nasturtium Salix spp.

Solanum tuberosum Syringa spp.

Járulékos hajtáskultúra – direkt organogenezis

Nevezik adventív hajtáskultúrának vagy járulékos rügyindukciónak is.

Nem meglévő rügyekből fejlődik a hajtás, de nem is kalluszból.

(Kalluszfejlődés viszont előfordulhat a direkt morfogenezissel EGYIDŐBEN).

Csak erre hajlamos fajoknál, genotípusnál működik, egyes növényeknél soha.

Elsődleges explantátum: levélszövet, szárszövet, virágszirom, gyökérszövet

egyes növényeknél korlátozódik: hagymalevélre, magoncszövetre

Előnye: gyorsabb és könnyebb megindítani a szaporodást

(Saintpaulia merisztéma kioperálás virágzati szárdarab)

Alkalmazás:

levéldarabokból szárdarabok, virágzati szár Gyökerek

Achimenes Kaktuszok Cichorium

Saintpaulia Gerbera Armoracia

Sinningia Hosta Convolvulus

Streptocarpus Lilium Taraxacum

Begonia Hemerocallis

Epiphyllum

George et al., 2008

A kalluszból kiinduló hajtáskultúra (indirekt organogenezis)

Járulékos szervkultúra

Számos haszon- és dísznövényt szaporítanak hajtáseredetű raktározó szervvel.

Ezek in vitro is működő módszerek:

hagymával: amarillisz, jácint, liliom, vöröshagyma, nárcisz

hagymagumóval: kardvirág

minigumókkal: burgonya, jamszgyökér, kúszóliliom (Gloriosa)

Hajtáseredetű szervek, rügyekből és járulékosan is fejlődhetnek.

Magas citokininszint

szükséges.

Továbbszaporítás:

szervekkel

Előny: nem kell

akklimatizálni!

Szomatikus embriogenezis

Néhány elérhető technológia:

Chrysanthemum grandiflorum

Cyclamen persicum

Euphorbia pulcherrima

Rosa sp.

Saintpaulia ionantha

Kiindulás: szomatikus sejt

Fejlődés: - direkt embriogenezis

(az embrió közvetlenül a testi sejtből keletkezik)

- indirekt embriogenezis

(először több, nem embriogén mitotikus sejosztódási ciklus előzi meg a

felismerhető embriogén struktúra kialakulását)

- Az embrió csírázásához pontosan meghatározott környezeti feltételek

szükségesek

- Folyékony táptalaj szükséges a neveléshez

- Bioreaktor rendszerekhez ideális

ÜZEMILEG NEM NAGYON ALKALMAZZÁK!

Oncidium ‘Sugar Sweet’ PLB-k (protocorm like body) szuszpenziós tenyésztése

A sokszorosító szakasz problémái

- Citokininfelhalmozódás (gyökeresedésgátlás, bokros növekedés)

- Szaporodási ráta csökkenése (citokinin-hozzászokás)

- Genetikai variabilitás

- Hiperhidratáció (korábbi nevén vitrifikálódás)

Tünetek:

- rövid internódiumok

- duzzadt szövetek

- halványzöld, esetleg fehér szín

- üvegszerű, áttetsző részek

- szalagosodott szár, levél

- csavarodott, deformált habitus

Előfordulás:

- hajtáskultúrában

- nóduszkultúrában

- kalluszkultúrában

különösen hajlamosak:

- fásszárúak

- Caryophyllaceae

A hiperhidratáció

A ligninbioszintézis csökkenése miatt az edénynyalábok és tracheidák

hiányoznak, vagy abnormális alakúak a szárban és a levelekben.

A sejtekben kevesebb a cellulóz – a sejtfal kevésbé áll ellen a nyomásnak.

Sok vizet vesz fel, megduzzad, deformálódik.

Továbbá csökkent a protein- és klorofillszintézis.

Befolyásoló tényezők:

- magas hőmérséklet, alacsony fényintenzitás/sötét

- magas relatív páratartalom a növény körül

- magas hormonkoncentráció

Megelőzése:

- a páratartalom csökkentése

- szellőztetés, lezárás megváltoztatása

- lombikok aljának hűtése harmatpontig

- a táptalaj párolgásának csökkentése (lanolin, vagy ozmotikum használatával)

- a táptalaj NH4+ koncentrációjának csökkentése

- az agar vagy szacharóz koncentrációjának növelése

- áthelyezés hormonmentes táptalajra

- floroglucinol, floridzin használata (a ligninbioszintézis prekurzorai)

3. – Elongációs és gyökeresítési szakasz

Elongáció – megnyújtás

Rejuvenilizáció miatt kisméretű növények – életképtelenek a lombikon kívül

Módszerei:

-áthelyezés citokininmentes táptalajra

-a hormonok lekötése a táptalajban: folyékony táptalajt rétegeznek a szilárd,

szaporító táptalaj tetejére

Gyökeresítés – a rejuvenilizált növények általában jól gyökeresednek

Lehetőségek:

3. – Elongációs és gyökeresítési szakasz

In vitro

-jobban kontrollálható, de

költségesebb is

-talajba helyezéskor viszont

az in vitro fejlődött gyökerek

egy része elpusztulhat, a

gyökeresedés kis időre

megáll

-érzékenyebb növényeknél

Ex vitro

-a gyökértelen hajtásokat mini-

dugványként kezelik

-költségkímélő

-a gyökeresedés

beindításához auxinos oldatba

mártják a növényeket, de nem

feltétlen szükséges

George et al., 2008

4. – Akklimatizációs szakasz

Szoktatás a lombikon kívüli világhoz.

Üvegházi körülmények között – ahol lehet szabályozni a környezeti paramétereket.

Az in vitro fejlődött növények érzékenyebbek:

•az epidermiszen a kutikula vékonyabb

•sokszor hiányzik a viaszréteg

•a sztómák nem eléggé funkcióképesek, nyitva vannak folyton

•a mezofillumban az oszlopos parenchimasejtek kicsik, egyrétegűek

Fontos a magas páratartalom biztosítása, és az erős fény leárnyékolása.

A folyamat általában 4 hétig tart, ez alatt a páratartalmat fokozatosan kell

csökkenteni, az árnyékolást pedig megszüntetni.

4. – Akklimatizációs szakasz

-A táptalaj lemosása a gyökerekről

-A túl hosszú leveleket vissza kell

kurtítani

-A gyökerek megmetszése segíti azok

elágazódását

-A növénykék beültetése az

akklimatizáló közegbe:

A közeg kórokozó és

kártevőmentes legyen, jó

vízáteresztő:

pl tőzeg és perlit keveréke

4. – Akklimatizációs szakasz

Fitotron (növénynevelő kamra) -megfelelő

környezet biztosítása.

18-30°C között – fajtól függően

kezdeti 80-90% RP – majd csökkenteni

fényintenzitás alacsony – később növelni

A táptalaj

Biztosítja a tenyészet számára szükséges:

-tápanyagokat (makro- és mikroelemek)

-energiaforrásokat (a fotoszintézis csökkent üzemmódban megy!)

-növekedésszabályozó anyagokat (hormonok)

-egyéb anyagcsere termékeket, melyet a növények in vitro nem tudnak

előállítani (egyes vitaminok)

A táptalaj halmazállapota lehet szilárd és folyékony.

szilárd táptalaj - egész növényt, szervet (hajtásokat) nevelünk rajta

folyékony – sejt- és szövetkultúrákhoz alkalmazható jobban

A táptalaj összetevői

1. Makro- és mikroelemek

makro: N,P,K és Ca, Mg (szervetlen sók formájában) konc.: 15 - 2000 mg/l

mezo: Fe (szerves komplex só formájában – Na-Fe-EDTA)

mikro: Co, Cu, B, I, Mn, Mo, Zn konc.: 0,002 – 40 mg/l

2. Szénhidrátok mint energiaforrások konc.: 0,5 – 3 %

egyszerű cukrok: glükóz, fruktóz

összetett cukrok: szacharóz

cukoralkoholok: szorbitol, mannitol – csak Rosaceae hasznosítja!

szénhidrátok másik szerepe: ozmotikus regulánsok

3. Vitaminok konc.: 0,1 – 2 mg/l

Elsősorban a B csoport vitaminja fontosak:

B1 (tiamin), B3 (nikotinsav), B6 (piridoxin)

C vitamin felhasználása antioxidánsként

4. Szilárdító anyagok konc.: 5 – 10 g/l

agar (algakivonat), heteropoliszacharidok – pl Gelrite

5. Növekedésszabályozó anyagok – növényi hormonok

6. Egyéb: természetes kivonatok és pufferek (szerves savak)

Makroelemek

A növények ionos formában veszik fel a makroelemeket:

Ca2+ , Mg2+ , K+ , NH4+ , NO3

-, HPO42-, H2PO4

-, SO42-

A felvétel történhet passzív és aktív mechanizmussal.

A passzív felvétel koncentrációfüggő.

Hasonló kölcsönhatások az ionok között a táptalajban, mint in vivo a talajban:

IONANTAGONIZMUS

- magas K+, Ca2+, konc. esetén a Mg2+ felvétele gátolt (és vica versa)

- magas PO43- konc. esetén a Zn, Fe, Cu felvétele gátolt, a Ca kicsapódhat

1. Nitrogén

A növény számára felvehető forma:

- az oxidált forma (NO3-),

- a redukált formák (NH4+, R-NH2, R-CO-NH-R’)

Makroelemek - Nitrogén

NH4+

NO3- NO2

- NH4+

Nitrát

reduktáz

Nitrit

reduktáz

glutamin

glutamát

Glutamin

szintetáz

Glutamát

szintetáz

Glutamát

dehidrogenázcukor

karboxilátok

-NH2

egyéb

aminosavak

Transzamináz

szerves N források

szervetlen

N források

α-ketoglutársav

Krebs

ciklus

A növény számára az anyagcserében csak a redukált N formák használhatók!

Szukcinil-CoA

fumársav

almasav

citromsav

izo-citromsav

Az oxidált formájú nitrátion (NO3-) használata mégis elterjedt, mert:

- Az NH4+ magas koncentrációja toxikus a növénynek

- a nitrátionnak pH-kontrolláló szerepe van a táptalajban, ha nincs puffer

A nitrát felvétele csak savas közegben lehetséges.

Nitrát felvétel anion kiválasztás nő a pH

Ammónium felvétel proton kiválasztás csökken a pH

töltésegyensúly

megőrzése a

szövetekben!

Ha együtt van a táptalajban jelen NO3- és NH4

+ akkor:

1. Gyors NH4+ felvétel következtében a pH leesik 4,2 - 4,6-re (5,4-5,8-ről)

2. A további NH4+ felvétele gátolt, de a NO3

- felvétele stimulálódik.

3. A táptalaj pH-ja nőni kezd.

Ha csak NO3- van a táptalajban, a szövetekben felhalmozódhat a NO2

- a nitrit-

reduktáz gátlása esetén, és mérgezést okozhat.

Makroelemek - Nitrogén

Aminosavak

Jó forrásai a redukált N-nek, de használatuk nem általános, mert drágák.

Speciális esetek: - orchideamagvak csíráztatása nem képesek a szervetlen

- merisztématenyésztés N források felhasználására

Biológiailag aktív aminosavak: csak az α-aminosavak L-izomerjei!

Alanin, aszparagin, cisztein,

glutamin, glicin, arginin, lizin

Kazein-hidrolizátum (CH): tejfehérjék savas hidrolízissel lebontva

- olcsóbb, mint a tiszta aminosavak

- 18 féle aminosavat (is) tartalmaz

- de nem standard az összetétele

- 0,1 – 2 g/l koncentrációban

Peptonok: kevésbé vannak szétbontva (aminosavak + peptidek, fehérje-

töredékek)

2. Foszfor

Szükséges: energiatranszferhez (ATP), fehérje és nukleinsavszintézishez

Felvétele foszfát ion formában aktív transzporttal (légzési energiát használ)

A növényi szervezetben teljesen oxidált formában: ortofoszfátként (PO43-) hasznosul.

Felhasznált sók: nátrium és káliumsók 1- és 2-értékű foszfátanionokkal

Na2HPO4, NaH2PO4

K2HPO4, KH2PO4

az egyértékű H2PO4- -et jobban felveszi a növény (pH<7 alatt)

Magas koncentrációban növekedésgátló hatású

(kicsapja a Ca-ot és egyes mikroelemeket, illetve gátolja a felvételüket).

Makroelemek

Makroelemek

3. Kálium

fő szerepe a töltéskiegyenlítés – megmarad kationként a növényben

KNO3,K-foszfát sók, KCl formájában

4. Magnézium – klorofill molekulához, MgSO4 formájában

5. Kén – SO42- formában veszik fel, redukálják –SH, -S-, -S-S- csoporttá

relatíve nem érzékenyek a növények a magas S koncentrációra (50 mM-ig)

6. Kalcium – CaCl2, Ca(NO3)2

Murashige – Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt

Makroelem Konc. (mg/l) Makroelem Konc.

(mg/l)

Makroelem Konc.

(mg/l)

CaCl2.2H2O 440 CaCl2.2H2O 150 KNO3 2500

KH2PO4 170 KNO3 2500 CaCl2.2H2O 200

KNO3 1900 MgSO4.7H2O 250 MgSO4.7H2O 400

MgSO4.7H2O 370 NaH2PO4.H2O 150 NaH2PO4.H2O 300

NH4NO3 1650 (NH4)2SO4 134

Magas sókoncentráció Közepes sókoncentráció Közepes sókoncentráció

Mikroelemek

1. Mangán MnSO4.H2O 22300 13200

2. Cink ZnSO4.7H2O 8600 2000

3. Bór H3BO3 6200 3000

4. Réz CuSO4.5H2O 25 25

5. Molibdén Na2MoO4.2H2O 250 250

6. Kobalt CoCl2.6H2O 25 25

7. Jód KI 830 750

8. Vas Na-Fe-EDTA 37250 28000

9. Nikkel, Alumínium, Nátrium, Klór

Kelatizáló anyagok:

EDTA etilén-diamin-tetraecetsav

EDDHA etilén-diamin-dihidroxi-fenilecetsav

EGTA etilén-glikol-bisz(2-aminoetiléter)-tetraecetsav

DTPA dietilén-triamin-pentaecetsav

DHTPA 1,3-diamino-2-hidroxipropán-tetraecetsav

MS (µg/l) Gamborg B5

Növényben MS Hoagland Növényben MS Hoagland

(mmol/kg SZA) (mmol/l) (mmol/l) (mol%) (mol%) (mol%)

N 1000 60 16 64,4 64,4 53

K 250 20 6 16,1 21,3 19,9

Ca 125 3 4 8 3,2 13,3

Mg 80 1,5 1 5,1 1,6 3,3

P 60 1,25 2 3,9 1,3 6,6

S 30 1,5 1 1,9 1,6 3,3

Cl 3 6 0,05 0,19 6,4 0,17

Fe 2 0,1 0,05 0,13 0,11 0,17

Mn 1 0,1 0,002 0,06 0,11 0,007

B 2 0,1 0,025 0,13 0,11 0,08

Zn 0,3 0,03 0,002 0,02 0,03 0,007

Cu 0,1 0,0001 0,0005 0,006 0,0001 0,002

Mo 0,001 0,001 0,0005 0,0001 0,0011 0,002

Ni 0,001 0 0,0005 0,0001 0 0,002

Na - 0,1 0,05 - 0,11 0,17

totál 15,5 93,7 30,2 100 100 100

Vitaminok

A vitaminok a tenyészetek életbenmaradásához és növekedésük serkentéséhez kell.

Az intakt növény szintetizálja in vitro tenyészetek nem biztos.

(minél kisebb, annál kevésbé)

B1 (thiamin)

B3 (nikotinsav) eszenciálisak, de főleg a B1 (0,1 – 10 mg/l)

B6 (piridoxin)

H (biotin)

PABA (paraamino-benzoesav)

C-vitamin antioxidánsként használható (10 - 100 mg/l)

mezo-inozit 100 mg/l, cukorszerkezetű vegyület

Murashige – Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt

Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l)

mezo-inozit 100 mezo-inozit 100 mezo-inozit 1000

nikotinsav 0,5 nikotinsav 1,0 nikotinsav 5

piridoxin 0,5 piridoxin 1,0 nikotinamid 0,5

thiamin 0,1 thiamin 10,0 thiamin 5

„Cukrok” - szénhidrátok

Cukrok szerepe - szénforrás (sejtépítő anyagok váza),

- energiát szolgáltat az organogenezis folyamatához

Tenyészet típusa A légzés szubsztrátja

AUTOTRÓF a Calvin ciklusban fixált C

MIXOTRÓF és HETEROTRÓF a táptalaj cukortartalma

Felhasznált cukor típusa:

monoszacharid diszacharid bomlik triszacharid bomlik

Glükóz - Szacharóz G, F Raffinóz G, F, galaktóz

Fruktóz - Maltóz G

Galaktóz - Cellobióz G

Mannóz - Trehalóz G

Ribóz, Xilóz, Arabinóz - Laktóz G, F

Savas környezetben, autoklávozás hatására hidrolizálnak a poliszacharidok.

„Cukrok” - szénhidrátok

Alkalmazott koncentráció: - általában 0,5-3% (5-30 g/l)

- spec. esetekben magas konc. (80-100 g/l)

Hatásaik: - szabályozás? a vaszkuláris elemek képződésénél

- klorofillszintézist gátolják:

ALA szintáz blokkolva kevés a porfirinvázas molekula klorofillhiány

- fotoszintézis hatékonysága csökken:

RuBisCO blokkolódik csökken a CO2 fixálás

- megnő az antociánok képződése

(pirosas szín – cukortúladagolásra utalhat)

- ozmotikus regulánsok a táptalajban

cukoralkoholok: szorbitol, mannitol előnyösebbek erre a célra (B-hiány!)

Felvételük: részben passzív permeációval, részben aktív transzporttal

aktív transzportnál H+ felvétel, és K+ vagy H+ leadás

Táptalajszilárdító anyagok

Leggyakrabban alkalmazott zselésítő anyag: agar (tengeri vörösmoszat)

Összetétele: poliszacharidok összetett keveréke

(galaktóz egységekből álló agaróz és agaropektin láncok)

Használata: 0,5-1% koncentrációban (gyártó/tétel függő!)

Az agar előnyei: - vízzel gélt képez, ami

100°C-on olvad és ~45°C-on szilárdul meg

- az agargélt a növények nem emésztik meg

- az agar nem lép reakcióba a táptalaj összetevőivel

hátrányai: - nem standard összetételű – tételenként változik

- szennyeződéseket tartalmaz

- csökkenti a tápanyagok diffúzióját a táptalajban

- nehezíti a tápanyagok felvételét

az ozmotikus potenciál növelése miatt

Táptalajszilárdító anyagok

mmol/kg agar 1 agar 2 agar 3 agar 4 agar 5 agar 6 agar 7 agar 8 Gelrite

N 53 1 178 100 74 54 2 na na

K 2 1 16 9 6 13 2 51 718

Ca 68 41 34 137 66 1 5 2.8 123

Mg 28 24 31 29 48 3 3 2.6 64

Na 202 56 552 330 427 634 114 52 296

P 1 18 1 5 1 40 1 42 68

S 184 78 232 296 204 262 66 184 6

Cl 47 33 220 113 197 95 12 na na

Cu 0.015 0.034 0.018 0.024 0.004 0.016 nd 0.005 0.05

Mn 0.073 1.093 0.036 0.173 0.036 0.027 0.055 0.01 0.1

Fe 0.510 5.376 0.564 2.987 0.859 0.599 0.528 0.6 5

Al 0.352 12.444 1.333 4.944 0.352 0.963 0.685 0.3 6.8

Cr 0.040 0.098 0.029 0.026 0.054 0.025 0.009 0.002 0.01

Cd 0.013 0.069 0.008 0.025 0.015 nd nd 0.0002 0.002

Zn 0.092 0.107 0.054 0.933 0.046 0.038 0.015 0.02 0.3

Sn 1.896 1.542 nd 3.572 1.862 nd nd 0.003 0.003

Ni 0.037 0.045 nd 0.037 0.025 nd 0.007 0.005 0.004

B na na na na na na na 2 0.13

Co na na na na na na na 0.0005 1.0

Táptalajszilárdító anyagok

Egyéb felhasznált anyagok:

- Agaróz (az agar gélképzéséért felelős összetevője tisztán) 0,4%-ban

csak érzékeny protoplaszt és portokkultúrákhoz

hajtáskultúránál hiperhidratációt okoz 0,4%-nál

1,5-2%-nál már nem, de ott csökkenti a növekedést

- Gelrite™ - gellán gumi (heteropoliszacharid, a Pseudomonas elodea termeli)

glükuronsav, ramnóz, cellobióz egységekből álló polimer lánc

csak kationok (K+, Ca2+, Mg2+) jelenlétében gélesedik

drága, de nagyon tiszta gélt képez

nincs benne (annyi) szennyeződés, mint az agarban

kisebb koncentráció kell belőle: 0,1-0,3% elegendő egy stabil gélhez

- Keményítő (gyenge gélt képez) 5-10%

- Zselatin 10%, hátránya, hogy 30°C-on már megolvad, bacik nagyon szeretik

- Alginát (nem lehet jól autoklávozni, de jól zselésít)

Táptalajszilárdító anyagok

0,15%-os Gelrite gél

A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók

Az in vitro növekedésszabályozás legfőbb tényezői –

alapvető élettani hatásokat fejtenek ki a növényekre

Típusaik: - auxinok

- citokininek

- gibberellinek

- egyéb gátló anyagok

Hatásukat befolyásolja: - a minőségük

- koncentrációjuk

- más szabályozók jelenléte/hiánya

- a tenyésztett növényi rész

genetikai-fiziológiai tulajdonságai

Auxinok – fiziológiai hatás

• Sejtek és szervek, elsősorban a szár megnyúlásos növekedésének serkentése

• Tropizmusok létrejötte

• A sejtosztódás serkentése citokininek jelenlétében

• Vaszkuláris elemek differenciálódásának szabályozása

• Gyökér iniciáció hajtásdugványoknál, gyökérdifferenciálódás szövetkultúrában

• Meghatározó szerep az apikális dominanciában

• Levél és termésleválás szabályozása

• Terméskötés, termésnövekedés, termésérés szabályozása

• Partenokarpia indukciója

• Gibberellinekkel együttműködve a virágok nemi jellegének meghatározása

(magas auxin/gibberellin arány nővirágok képződésének kedvez)

Közös kémiai tulajdonságaik:

• Indol vagy aromás gyűrű és egy karboxil-csoport egymástól 0,55 Å távolságra

• Vízben kevésbé, szerves oldószerekben jól oldódó kristályos anyagok

• Gyengén savas kémhatásúak

Növekedésszabályozó anyagok - auxinok

Természetesen előforduló auxinok

IES (IAA) 4-klór-IES 2-fenilecetsav IVS (IBA)

Szintetikus auxinok

2,4-D NES (NAA) picloram dicamba

Növekedésszabályozó anyagok - auxinok

Auxinok alkalmazása növekedésszabályozásra in vitro

1. Kalluszindukcióegyszikűeknél 2-10 mg/l 2,4-D

kétszikűeknél 1-3 mg/l 2,4-D és valamilyen citokinin kiegészítés

indukálás után a 2,4-D-t általában NES-re, vagy IVS-re cserélik,

mert megnövelheti a szomaklonális variabilitást!

2. Morfogenezis - gyökér és szárképzésNES vagy IVS használható főként organogenezishez;

gyökérképzéshez elég magában az auxin 1-3 mg/l (0,1-10 mg/l)

szárképzéshez magas citokinin:auxin arány szükséges

3. Embriogenezismagas 2,4-D koncentrációval indukálunk embriót 1-5 mg/l

ezután csökkentjük, különben az embriók nem fejlődnek

Növekedésszabályozó anyagok - auxinok

Citokininek – fiziológiai hatás:• Szabályozzák a sejtosztódást, növekedést, fejlődést és differenciálódást

• Serkentik a sejtmegnyúlást

• Nem-induktív körülmények között is virágzást válthatnak ki (helyettesíthetik

a hidegkezelést, a virágzáshoz azt igénylő növényeknél)

• Késleltetik a levelek öregedését, serkentik a tápanyagok mobilizálását

• Apikális dominancia alakítása: az auxin antagonistája, a rügyek képződését

serkenti (in vitro körülmények között is)

• Indukálják enzimek szintézisét

• Serkentik a kloroplasztiszok érését

• Elősegítik a gumók képződését

Citokininek kémiai szerkezete:• Purinvázzal rendelkeznek, melyen 5 helyen lehet eltérő szubsztituens

- igen változatos és sokféle vegyület tartozik ide, több, mint 200 jelenleg

Növekedésszabályozó anyagok - citokininek

2-iP zeatin

Szintetikus citokininek

benziladenin (BA) kinetin (KIN) tetrahidropiranil-BA (PBA) thidiazuron (TDZ)

Növekedésszabályozó anyagok - citokininek

Természetesen előforduló citokininek

1. Járulékos hajtásképzésauxinokkal kombinációban, magas citokinin:auxin arány mellett

2. Embriogenezis

kétszikűek: alacsony, 0,1-0,5 mg/l koncentrációban auxin mellett

egyszikűeknél már 0,0002 mg/l is gátló hatású lehet!

3. Felhasználás hajtáskultúrákban

- hónaljhajtások növekedésének serkentése 0,5-10 mg/l

- járulékos hajtásrügyképzés

- gyökérképződés gátlása – magas, 0,5-10 mg/l koncentrációnál

DE: kinetin sok esetben gyökeresedést indukál!

4. Sejtosztódás serkentése kallusztenyészetbenalacsony koncentrációban, 0,1 mg/l, az auxin konc. ~tizede

Citokininek alkalmazása növekedésszabályozásra

Növekedésszabályozó anyagok - citokininek

A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók

Gibberellinek – fiziológiai hatás:

•szármegnyúlás serkentése

•apikális dominancia erősítése

•genetikai és fiziológiai törpeség normalizálása

•fény- és hidegigényes magvak csírázásának indukciója

•rügyek nyugalmi állapotának megszakítása

GA3 - gibberellin sav

Gibberellinek – felhasználás a

mikroszaporításban

•kalluszképzés és fenntartás

•morfogenezis gátlása

•hajtásmegnyúlás elősegítése

Auxin-citokinin egymásrahatás

AUXIN CITOKININ

magas együttes hatás alacsony

gyökérképződés indukálása

kalluszindukció egyszikűeknél

embriogenezis indukálása

járulékos gyökérképzés kalluszból

kalluszindukció kétszikűeknél

sarjképzés indukálás hajtáskultúránál

alacsony magas

K O

N C

E N

T R

Á C

I Ó

A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók

• Abszcizinsav:alacsony konc. 0,1-1 mg/l esetén serkentheti a kallusznövekedést,

magasabb konc. >1 mg/l esetén gátolja azt

• Etilén:gátolja a sejtosztódást és a morfogenezist, jelenléte nem kívánatos

• Anti-gibberellinek (gibberellin-antagonisták):klórmekvát (CCC), ancymidol, paclobutrazol –

növelik a szárazanyagtartalmat, erősítik a hajtásokat, törpésítenek,

csökkentik a hiperhidratációt

• Anti-auxinok:trijód-benzoesav, transz-fahéjsav –

az auxin hatását reverzibilisen gátolják (nem kívánt kallusznövekedés)

• Fenolvegyületek:phloroglucinol – antioxidáns, csökkenti a vitrifikációt, antibakteriális

Növekedésszabályozó anyagok - egyéb

Természetes eredetű kivonatok

Könnyezési nedvek:

- komplex összetétel:

aminosavak, vitaminok, cukrok, makro- és mikroelemek, hormonok

- nem standard, változó összetétel!

Acer, Juglans, Cladrastis könnyezési nedvei

Terméskivonatok:

Kókusztej(-víz), banánkivonat, paradicsomlé, burgonyapép, csicsóka

Élesztő és húskivonatok – aminosavaknál már volt róluk szó

Táptalajok elkészítése

Törzsoldatok készítése

Makroelemek Fe

nélkül, 10-20x

Makroelemek

külön 10g/100ml

Fe-EDTA

0,5g/100ml

Mikroelemek

1000x

Vitamin törzsoldat

100x

Hormonok

0,1-1 mg/ml

Törzsoldatok összemérése

desztillált vízbe

Cukor hozzáadása

Feltöltés végtérfogatra

pH beállítása

Táptalajszilárdító

hozzáadása

Környezeti tényezők a tenyésztés során - Megvilágítás

Környezeti tényezők a tenyésztés során – Hőmérséklet

A növényi szövetdarabok, explantátumok nem tudnak úgy védekezni a

hőmérsékletingadozás ellen, mint az intakt növény!

a legtöbb kultúra számára optimális az átl. 25 °C (17°-32°C)

trópusi és szubtrópusi növényeknek az átl 28 °C (24°-32°C)

(pl citrusfélék, rizs, gyapot, Bougainvillea)

sötét periódusban 4-5°C-kal alacsonyabb hőmérséklet

a hőmérséklet hatással van a citokininek aktivitására –

magas hőmérsékleten csökken majd megszűnik

- föld alatti szervek (hagymák, gumók) in vitro organogenezisére is nagy

hatással van a hőmérséklet – konstans hőm. esetén jobb ezen szervek

képződése

mérsékelt égövi fás növények in vitro kultúrája 4-5°C-on, sötétben jól

tárolható néhány hónapig (alma, körte, berkenye)

magas hőmérséklet (38°C) vírusmentesítésre alkalmas

Környezeti tényezők a tenyésztés során - Tartóedények

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai

Nagyléptékű szaporítás – feltételek megléte Technikai feltételek – technológiai feltételek Sikeres kísérlet ≠ technológia !!! Teljesítménymutatók – a termelési folyamat jellemzése:

• kultúránként eltérő teljesítményadatok• Kioperálható merisztémák száma 30-200 db/ 8 óra• Gerbera sarjcsokrainak feldarabolása: 800-1100 db / 8 óra• Nóduszkultúrás szaporítás: 1200-1800 db / 8 óra• Fás szárú növényeknél 20-50%-kal kisebb mutatók• Több fajta – 20-30%-kal kisebb mutató

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai

Önköltség:• Európában a 60-65%-át a bér és járulékai teszik ki• Nem tartozik a jól fizetett tevékenységek közé elvándorlás

Virológiai vagy egyéb tesztelést nem igénylő ex vitro növény önköltségének az alakulása:

Szűkített önköltség

Bér 42%

Közterhek 18%

Energiaköltség 15%

Amortizáció 5%

Anyag 10%

Kutatás-fejlesztés +

PR

10%

Összesen 100%

+ egyéb költségek

Általános költségek (15-25%)

ÁFA

Licencdíj:

szegfűnél 0,019 €/db

krizantém: 0,0067-0,012 €/db

gerbera: 0,15-0,20 €/db

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai

Néhány ár

Betula pendula ‚Purpurea’ 1,15 €/db (72-es tálca), 2,06 € (6-os cserép)

Syringa vulgaris fajták 0,76 €/db (72-es tálca)

Rózsa, klemátisz fajták 1,07 €/db (72-es tálca)

Hosta fajták 0,76 €/db (72-es tálca)

Vírustesztelt Gerbera fajták 2,05 €/db

Spathiphyllum fajták 0,3-0,6 €/db (162 vagy 72-es tálca)

Terméktípusok:• Nem gyökeres hajtások vagy sarjcsokrok (minidugványok)• Gyökeresített, de nem akklimatizált in vitro növény• Akklimatizált, közegbe ültetett növény (lyuktálcás)• Gumók, hagymák – közvetlenül közegbe ültethető

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai

Törzsállomány céljára előállított ex vitro növény:

• Többször tesztelik - meghatározó költségtényező

• ELISA teszt egy vírusra vásárolt diagnosztikummal:

200-400 Ft/minta

• ELISA teszt egy vírusra saját készlettel:

35-50 Ft/minta

• PCR teszt egy nagyságrenddel drágább, mint a vásárolt

készlettel végrehajtott ELISA teszt

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai

A költségek csökkentése:• Automatizálási lehetőségek• Új(ragondolt) technikák alkalmazása

RITA tenyésztési rendszer

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai

ForBio Vitron 501 mikroszaporító robot

Elektromos-pneumatikus és mechanikus konstrukcióGyökeres, egy hajtással rendelkező növényeket állít elő (nóduszkultúra)Éves teljesítménye: 15 millió növény (eukaliptusz, akác, tikfa)

Egyéb automatizált rendszerek: átfolyós táptalajsterilizáló és töltő

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai

Fotoautotróf mikroszaporítás• Szénforrás a levegő szén-dioxidja• Cukormentes táptalaj – minimális a kontamináció• Erőteljesebb növekedés• Könnyebb akklimatizálhatóság

Bioreaktor rendszerek

Gerbera

mikroszaporítása

A – anyanövény

B – merisztémák

C – merisztémák

D – endogén baci

E – felszaporítási fázis

F – osztás előtt

G – osztás után

H – gyökeresedés

I – kész in vitro növény

J – akklimatizálás

K – 4 hónap múlva

MS táptalaj +

1-3 mg/l BA / KIN

0,1-0,5 mg/l IES / NES

Afrikaiibolya

mikroszaporítása

A – regeneráció

levéllemezen

B – sz. embriók

C – sz. embrió

D – fejlődő hajtások

E – tőlevélrózsa

F – -”-

G – kész növény

H – akklimatizálás

I – mutáns egyed

MS táptalaj +

0,2-0,3 mg/l BA /

NES

0,1 mg/l TDZ

Köszönöm a figyelmet!