Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Dísznövények mikroszaporítása
2017.02.18.
Dr. Mosonyi István Dániel
A mikroszaporítás fogalma, jelentősége
Szelektált fajok illetve fajták vegetatív, fajtaazonos szaporítása in vitro (steril
laboratóriumi) és kontrollált körülmények között.
ELŐNYÖK HÁTRÁNYOK
Kis helyigény Fertőződés léphet fel
Hatóságilag igazolható kórokozómentes Szomaklonális variabilitás léphet fel
Nincs visszafertőződés Akklimatizációs veszteség nagy
Homogén minőség Nagy költségigényű
Évszaktól, éghajlattól független Speciális laborhátteret igényel
Folyamatos előállítást tesz lehetővé Képzett munkaerőt igényel
Nehezen szaporítható fajoknál is jó
Új genotípusok gyors felszaporítása
Gépesíthető és automatizálható
Különösen gyors módszer
A tenyészetek könnyen szállíthatók
A mikroszaporítás fogalma, jelentősége
Izrael: szegfű, krizantém,
gladiólusz
Arab országok: datolya,
banán, burgonya, szamóca,
pisztácia, rózsa
India: főleg fásszárúak,
dísznövények, banán
Kína: erdészeti fajok
Dísznövények, gyümölcsök
A világon évente 700 millió növényt állítanak elő in vitro (2003-as adat).
0
20
40
60
80
100
120
2005 2006 2007 2008 2009 2010
nö
vé
nys
zá
m (
mil
lió
db
)
Phalaenopsis
Anthurium
Kalanchoe
Rosa
Hyacinthus
Chrysanthemum
Dracaena
Ficus
Spathiphyllum
Cyclamen
Begonia
Poinsettia
Cserepes dísznövények mennyisége a holland virágtőzsdén
Dugványozás vs. mikroszaporítás afrikai ibolya esetében
Cél: 10 000 db növény
Levéldugványozás Mikroszaporítás
Szükséges
anyanövények száma
(4-5 db levél/növény)
667 db 3 db
Helyfoglalás a
növényházban
17 m2 0,08 m2
Szaporodási ráta
levelenként
3× 810×
Munkaigény 13,2 h 137,8 h
A mikroszaporítás elméleti háttere
Növényi sejtek totipotenciája – a növény testi sejtjeinek mindegyike
megtartja azokat az információkat, ami alapján egy sejtből felépülhet egy
teljes növényi szervezet (totipotens = mindenre képes)
Gottlieb HABERLANDT 1902-ben fogalmazta meg a totipotencia elvét (Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen, Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien. Math.-
Naturwiss. Kl., Abt. J. 111, 69–92.)
A bizonyításra 1958-ban került sor, STEWARD által.
Sárgarépánál már differenciálódott sejtekből kalluszt állítottak elő,
valamint megfigyelték, hogy ennek a kallusznak egyes sejtjeiből nem csak
szerveket (organogenezis), hanem embriókat is lehet fejleszteni
(embriogenezis).
NÖVÉNY – SEJT – NÖVÉNY rendszer
dedifferenciálódás - redifferenciálódás
A mikroszaporítás szakaszai
Előkészítés Steril kultúra indítása
Felszaporítás
Elongálás és gyökeresítés Akklimatizálás
0. – Előkészítő szakasz
Célja: a sterilizálás megkönnyítése, az osztódó szövettájak aktivizálása
Alkalmazott módszerek:
• a szár lelevelezése indítás előtt 1-2 héttel (sebforradás)
• átállás felszívatásos öntözésre 2-4 hónappal indítás előtt
• a hajtáscsúcs eltávolítása 2-4 héttel indítás előtt (oldalrügyek megduzzadnak)
• magasabb hőmérsékleten illetve fényen nevelés
• citokininnel való kezelés
Hemerocallis anyanövények
Az indítás előtt a virágzati
szárak megnyúlása már a
laboratórium steril
környezetében történt.
George et al., 2008
Juvenilis részek fás növények esetében:
Az előkészítő szakasz
A rejuvenizálás módszerei:
- visszavágás, sérülések okozása
- etiolálás
- hormonkezelés – citokininekkel
többnyire kapcsoltan egy fizikai kezeléssel (utána)
A dormancia megszüntetése:
- magok/rügyek esetében GA kezelés
(in vitro is lehet – alvó rügyeket könnyebb sterilizálni)
akár közvetlenül lehet őket alkoholba mártás
után lelángolni
- hőkezelések (hideg/meleg) – hagymák, évelők stb..
George et al., 2008
Fenyők rejuvenilizálása sorozatos átoltással:
1. – Indító szakasz
Explantátum (inokulum) – kiindulási növényrész kiválasztása
Szinte bármelyik rész lehet – de célszerű olyat választani, ami merisztémát
tartalmaz, vagy merisztémadifferenciálásra hajlamos.
Száraz buroklevél
Húsos buroklevél
Csúcsrügy
Hónaljrügyek
Tönk
Gyökerek
Hónaljrügy
Hajtáscsúcs
Nódusz
Levél
Bimbó
Felleveles virágzati
szár
Mag
1. – Indító szakasz
Célja: a steril körülmények létrehozása és fenntartása
Alkalmazott módszerek:
• eszközök és edények sterilizálása: hőlégsterilezés (120-180°C) vagy gáz
alkalmazása (formaldehid, etilén-oxid)
• táptalaj sterilizálása autoklávozással (15-30 min, 121°C, 0,1 MPa túlnyomás)
• explantátum fertőtlenítése:
•Csapvizes mosás
•Etanol 70%
•Na vagy Ca-hipoklorit (NaOCl, Ca(OCl)2) 2-10%
•Higany(II)-klorid (HgCl2) 0,1%
•Öblítés steril desztillált vízzel
Kombinálhatók
• táptalajra helyezés steril fülkében – lamináris box
1. – Indító szakasz
Felleveles virágzati szárdarabok –
alvórügyet tartalmaznak a fellevél
tövében
Csapvizes előmosás
1. – Indító szakasz
Áztatás a fertőtlenítőszeres oldatokban – keveréssel kombinálva
A sterilitás biztosítása
1. – Indító szakasz
Az indítási szakasz táptalajai
Az inokulum típusától függ.
Általában az ásványi elem összetétel ua., a növekedésszabályozók a különbség.
Merisztémacsúcs tenyészet: sokszor elegendő az auxin egyedül
Hajtáscsúcs tenyészet: auxinként IVS, NES, de 2,4-D nem
citokininként: BAP, KIN, 2-iP, TDZ
In vitro magvetés: nem kell növ.szabályzó, bár
a citokininek a csírázó embrióknál
hajtástöbbszöröződést tudnak indukálni
(Mimulus, Petunia, Sinningia, Citrus)
gibberellinek a magnyugalom megtöréséhez
Az indítási szakasz problémái
Barnulás: sebfelületen barnul/feketedik a növényi szövet,
később a táptalaj is elszíneződhet.
Oka: a fenolázok, mono- és polifenoloxidázok, felszabadulnak a
sejtmembránokból,
ezek szubsztrátjai (hidroxifenolok) pedig a vakuólumokból
és reakcióba lépnek egymással
polifenolok, kinonok keletkeznek, és fehérjékhez kötődnek, vagy
oxidálják őket -> toxikusak
Megelőzése: - a sérülések minimalizálása
- a fenolos vegyületek eliminálása
- öblítés, mosás, kiáztatás
- táptalaj gyakori cseréje (naponta, hetente)
- folyékony táptalaj használata (jobb diffúzió)
- aktív szén vagy PVP(P) használata lekötéshez
- a fenoláz enzimek inhibitálása kelátképzőkkel
- a fenoláz aktivitás csökkentése (alacsony pH, hőm.)
- áztatás antioxidánsban (citromsav, aszkorbinsav)
- antioxidánsok adása a táptalajhoz
Spathiphyllum torzsavirágzat,
mint explantátum
2. – Felszaporítási szakasz
Cél: a tenyészet sokszorozása
A táptalaj általában citokinin túlsúlyos, arányaiban kevesebb auxint tartalmaz.
A szaporodási ráta mutatja a szakasz hatékonyságát:
egy szubkultúrálás alatt fejlődött továbbszaporításra alkalmas új részek
(sarjhagyma, sarjhajtás) száma egy explantátumra vonatkoztatva.
A felszaporításnak több útja lehetséges.
Egy- vagy
többrügyes
hajtásdarabbal
Oldalhajtással Járulékos hajtással Járulékos szervvelSzomatikus
embrióval
HajtástenyészetbenSejt-
szuszpenzióban
A merisztémából
fejlődő hajtás
egy- vagy
többrügyes
darabjainak
átoltásával.
A merisztémából
fejlődő hajtás
oldalhajtásainak
átoltásával.
A merisztémából
fejlődött kalluszból
regenerálódott
hajtások
átoltásával.
Hajtáseredetű
szervek (gumó,
hagyma)
indukciójával.
Sejtszuszpenzióban
fejlődött szomatikus
embriókból
készített
mesterséges
magvakkal.
A mikroszaporítás lehetséges útjai
A szaporítás lehetséges útjai a sokszorosító szakaszban
George et al., 2008
A hajtáscsúcskultúra (hajtáscsúcsból és oldalhajtásból)
George et al., 2008
A hajtáscsúcskultúra (hajtáscsúcsból és oldalhajtásból)
Elsődleges explantátum: - merisztéma
- száron lévő rügyek (csúcs- vagy oldalrügyek)
- hajtás (20 mm-ig) – főleg lágyszárúaknál
előnyei: könnyebben megindul
több rügyet tartalmaz
könnyebben túlél
hátrány: vírusfertőzött lehet
nehezebb sterilizálni
Fásszárúaknál problémák: - egyes rügyekben nagy a mikrobiális szennyezettség
- sokszor fenolosodási probléma lép fel
- dormancia
előny: - a rügyeket könnyű felszínileg sterilizálni
Táptalaj: citokinin-túlsúlyos
(apikális dominancia gátlása – kivéve pl Gymnocladus spp.)
Hajtások eredete szerint válogatni, ugyanis előfordulnak járulékosan fejlődöttek is!
Kalluszosodás megelőzése: auxin-inhibitorokkal (TIBA, transz-fahéjsav)
A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal)
George et al., 2008
A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal)
Elsődleges explantátum: ua. mint a hajtáscsúcskultúránál
Nevelés:
5-10 cm-es méretig, amíg a
nóduszok jól elkülönülnek
Táptalaj:
citokininmentes általában
(nem kell elágazás!)
esetleg GA használata a
megfelelően megnyúlt
hajtásokhoz
Alkalmazás:
burgonya, Alstroemeria főleg
Szaporodási ráta általában kisebb, mint a hajtáscsúcskultúránál, de kevesebb
kallusz fejlődik, és kevesebb adventív hajtás genetikai stabilitás nagy
A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal)
Egyszikűek Fásszárú kétszikűek
Alstroemeria Carpinus betulus
Cymbopogon spp. Castanea sativa, C. mollissima
Poa pratensis Eucalyptus grandis
Asparagus officinalis Forsythia ovata
Dioscorea spp. Fraxinus pennsylvanica
Zea mays Juglans regia
Orchideák Hevea brasiliensis
Dendrobium spp. Leucaena leucocephala
Phalaenopsis spp. Ligustrum obtusifolium
Thunia alba Lonicera periclymenum
Vanilla planifolia Olea europea
Lágyszárú kétszikűek Paulownia tomentosa
Angelonia salicariefolia Poncirus trifoliata
Cucumis sativus Prosopis juliflora
Glycyrrhiza glabra Prunus armeniaca
Rosmarinus officinalis Quercus robur
Rorippa nasturtium Salix spp.
Solanum tuberosum Syringa spp.
Járulékos hajtáskultúra – direkt organogenezis
Nevezik adventív hajtáskultúrának vagy járulékos rügyindukciónak is.
Nem meglévő rügyekből fejlődik a hajtás, de nem is kalluszból.
(Kalluszfejlődés viszont előfordulhat a direkt morfogenezissel EGYIDŐBEN).
Csak erre hajlamos fajoknál, genotípusnál működik, egyes növényeknél soha.
Elsődleges explantátum: levélszövet, szárszövet, virágszirom, gyökérszövet
egyes növényeknél korlátozódik: hagymalevélre, magoncszövetre
Előnye: gyorsabb és könnyebb megindítani a szaporodást
(Saintpaulia merisztéma kioperálás virágzati szárdarab)
Alkalmazás:
levéldarabokból szárdarabok, virágzati szár Gyökerek
Achimenes Kaktuszok Cichorium
Saintpaulia Gerbera Armoracia
Sinningia Hosta Convolvulus
Streptocarpus Lilium Taraxacum
Begonia Hemerocallis
Epiphyllum
George et al., 2008
A kalluszból kiinduló hajtáskultúra (indirekt organogenezis)
Járulékos szervkultúra
Számos haszon- és dísznövényt szaporítanak hajtáseredetű raktározó szervvel.
Ezek in vitro is működő módszerek:
hagymával: amarillisz, jácint, liliom, vöröshagyma, nárcisz
hagymagumóval: kardvirág
minigumókkal: burgonya, jamszgyökér, kúszóliliom (Gloriosa)
Hajtáseredetű szervek, rügyekből és járulékosan is fejlődhetnek.
Magas citokininszint
szükséges.
Továbbszaporítás:
szervekkel
Előny: nem kell
akklimatizálni!
Szomatikus embriogenezis
Néhány elérhető technológia:
Chrysanthemum grandiflorum
Cyclamen persicum
Euphorbia pulcherrima
Rosa sp.
Saintpaulia ionantha
Kiindulás: szomatikus sejt
Fejlődés: - direkt embriogenezis
(az embrió közvetlenül a testi sejtből keletkezik)
- indirekt embriogenezis
(először több, nem embriogén mitotikus sejosztódási ciklus előzi meg a
felismerhető embriogén struktúra kialakulását)
- Az embrió csírázásához pontosan meghatározott környezeti feltételek
szükségesek
- Folyékony táptalaj szükséges a neveléshez
- Bioreaktor rendszerekhez ideális
ÜZEMILEG NEM NAGYON ALKALMAZZÁK!
Oncidium ‘Sugar Sweet’ PLB-k (protocorm like body) szuszpenziós tenyésztése
A sokszorosító szakasz problémái
- Citokininfelhalmozódás (gyökeresedésgátlás, bokros növekedés)
- Szaporodási ráta csökkenése (citokinin-hozzászokás)
- Genetikai variabilitás
- Hiperhidratáció (korábbi nevén vitrifikálódás)
Tünetek:
- rövid internódiumok
- duzzadt szövetek
- halványzöld, esetleg fehér szín
- üvegszerű, áttetsző részek
- szalagosodott szár, levél
- csavarodott, deformált habitus
Előfordulás:
- hajtáskultúrában
- nóduszkultúrában
- kalluszkultúrában
különösen hajlamosak:
- fásszárúak
- Caryophyllaceae
A hiperhidratáció
A ligninbioszintézis csökkenése miatt az edénynyalábok és tracheidák
hiányoznak, vagy abnormális alakúak a szárban és a levelekben.
A sejtekben kevesebb a cellulóz – a sejtfal kevésbé áll ellen a nyomásnak.
Sok vizet vesz fel, megduzzad, deformálódik.
Továbbá csökkent a protein- és klorofillszintézis.
Befolyásoló tényezők:
- magas hőmérséklet, alacsony fényintenzitás/sötét
- magas relatív páratartalom a növény körül
- magas hormonkoncentráció
Megelőzése:
- a páratartalom csökkentése
- szellőztetés, lezárás megváltoztatása
- lombikok aljának hűtése harmatpontig
- a táptalaj párolgásának csökkentése (lanolin, vagy ozmotikum használatával)
- a táptalaj NH4+ koncentrációjának csökkentése
- az agar vagy szacharóz koncentrációjának növelése
- áthelyezés hormonmentes táptalajra
- floroglucinol, floridzin használata (a ligninbioszintézis prekurzorai)
3. – Elongációs és gyökeresítési szakasz
Elongáció – megnyújtás
Rejuvenilizáció miatt kisméretű növények – életképtelenek a lombikon kívül
Módszerei:
-áthelyezés citokininmentes táptalajra
-a hormonok lekötése a táptalajban: folyékony táptalajt rétegeznek a szilárd,
szaporító táptalaj tetejére
Gyökeresítés – a rejuvenilizált növények általában jól gyökeresednek
Lehetőségek:
3. – Elongációs és gyökeresítési szakasz
In vitro
-jobban kontrollálható, de
költségesebb is
-talajba helyezéskor viszont
az in vitro fejlődött gyökerek
egy része elpusztulhat, a
gyökeresedés kis időre
megáll
-érzékenyebb növényeknél
Ex vitro
-a gyökértelen hajtásokat mini-
dugványként kezelik
-költségkímélő
-a gyökeresedés
beindításához auxinos oldatba
mártják a növényeket, de nem
feltétlen szükséges
George et al., 2008
4. – Akklimatizációs szakasz
Szoktatás a lombikon kívüli világhoz.
Üvegházi körülmények között – ahol lehet szabályozni a környezeti paramétereket.
Az in vitro fejlődött növények érzékenyebbek:
•az epidermiszen a kutikula vékonyabb
•sokszor hiányzik a viaszréteg
•a sztómák nem eléggé funkcióképesek, nyitva vannak folyton
•a mezofillumban az oszlopos parenchimasejtek kicsik, egyrétegűek
Fontos a magas páratartalom biztosítása, és az erős fény leárnyékolása.
A folyamat általában 4 hétig tart, ez alatt a páratartalmat fokozatosan kell
csökkenteni, az árnyékolást pedig megszüntetni.
4. – Akklimatizációs szakasz
-A táptalaj lemosása a gyökerekről
-A túl hosszú leveleket vissza kell
kurtítani
-A gyökerek megmetszése segíti azok
elágazódását
-A növénykék beültetése az
akklimatizáló közegbe:
A közeg kórokozó és
kártevőmentes legyen, jó
vízáteresztő:
pl tőzeg és perlit keveréke
4. – Akklimatizációs szakasz
Fitotron (növénynevelő kamra) -megfelelő
környezet biztosítása.
18-30°C között – fajtól függően
kezdeti 80-90% RP – majd csökkenteni
fényintenzitás alacsony – később növelni
A táptalaj
Biztosítja a tenyészet számára szükséges:
-tápanyagokat (makro- és mikroelemek)
-energiaforrásokat (a fotoszintézis csökkent üzemmódban megy!)
-növekedésszabályozó anyagokat (hormonok)
-egyéb anyagcsere termékeket, melyet a növények in vitro nem tudnak
előállítani (egyes vitaminok)
A táptalaj halmazállapota lehet szilárd és folyékony.
szilárd táptalaj - egész növényt, szervet (hajtásokat) nevelünk rajta
folyékony – sejt- és szövetkultúrákhoz alkalmazható jobban
A táptalaj összetevői
1. Makro- és mikroelemek
makro: N,P,K és Ca, Mg (szervetlen sók formájában) konc.: 15 - 2000 mg/l
mezo: Fe (szerves komplex só formájában – Na-Fe-EDTA)
mikro: Co, Cu, B, I, Mn, Mo, Zn konc.: 0,002 – 40 mg/l
2. Szénhidrátok mint energiaforrások konc.: 0,5 – 3 %
egyszerű cukrok: glükóz, fruktóz
összetett cukrok: szacharóz
cukoralkoholok: szorbitol, mannitol – csak Rosaceae hasznosítja!
szénhidrátok másik szerepe: ozmotikus regulánsok
3. Vitaminok konc.: 0,1 – 2 mg/l
Elsősorban a B csoport vitaminja fontosak:
B1 (tiamin), B3 (nikotinsav), B6 (piridoxin)
C vitamin felhasználása antioxidánsként
4. Szilárdító anyagok konc.: 5 – 10 g/l
agar (algakivonat), heteropoliszacharidok – pl Gelrite
5. Növekedésszabályozó anyagok – növényi hormonok
6. Egyéb: természetes kivonatok és pufferek (szerves savak)
Makroelemek
A növények ionos formában veszik fel a makroelemeket:
Ca2+ , Mg2+ , K+ , NH4+ , NO3
-, HPO42-, H2PO4
-, SO42-
A felvétel történhet passzív és aktív mechanizmussal.
A passzív felvétel koncentrációfüggő.
Hasonló kölcsönhatások az ionok között a táptalajban, mint in vivo a talajban:
IONANTAGONIZMUS
- magas K+, Ca2+, konc. esetén a Mg2+ felvétele gátolt (és vica versa)
- magas PO43- konc. esetén a Zn, Fe, Cu felvétele gátolt, a Ca kicsapódhat
1. Nitrogén
A növény számára felvehető forma:
- az oxidált forma (NO3-),
- a redukált formák (NH4+, R-NH2, R-CO-NH-R’)
Makroelemek - Nitrogén
NH4+
NO3- NO2
- NH4+
Nitrát
reduktáz
Nitrit
reduktáz
glutamin
glutamát
Glutamin
szintetáz
Glutamát
szintetáz
Glutamát
dehidrogenázcukor
karboxilátok
-NH2
egyéb
aminosavak
Transzamináz
szerves N források
szervetlen
N források
α-ketoglutársav
Krebs
ciklus
A növény számára az anyagcserében csak a redukált N formák használhatók!
Szukcinil-CoA
fumársav
almasav
citromsav
izo-citromsav
Az oxidált formájú nitrátion (NO3-) használata mégis elterjedt, mert:
- Az NH4+ magas koncentrációja toxikus a növénynek
- a nitrátionnak pH-kontrolláló szerepe van a táptalajban, ha nincs puffer
A nitrát felvétele csak savas közegben lehetséges.
Nitrát felvétel anion kiválasztás nő a pH
Ammónium felvétel proton kiválasztás csökken a pH
töltésegyensúly
megőrzése a
szövetekben!
Ha együtt van a táptalajban jelen NO3- és NH4
+ akkor:
1. Gyors NH4+ felvétel következtében a pH leesik 4,2 - 4,6-re (5,4-5,8-ről)
2. A további NH4+ felvétele gátolt, de a NO3
- felvétele stimulálódik.
3. A táptalaj pH-ja nőni kezd.
Ha csak NO3- van a táptalajban, a szövetekben felhalmozódhat a NO2
- a nitrit-
reduktáz gátlása esetén, és mérgezést okozhat.
Makroelemek - Nitrogén
Aminosavak
Jó forrásai a redukált N-nek, de használatuk nem általános, mert drágák.
Speciális esetek: - orchideamagvak csíráztatása nem képesek a szervetlen
- merisztématenyésztés N források felhasználására
Biológiailag aktív aminosavak: csak az α-aminosavak L-izomerjei!
Alanin, aszparagin, cisztein,
glutamin, glicin, arginin, lizin
Kazein-hidrolizátum (CH): tejfehérjék savas hidrolízissel lebontva
- olcsóbb, mint a tiszta aminosavak
- 18 féle aminosavat (is) tartalmaz
- de nem standard az összetétele
- 0,1 – 2 g/l koncentrációban
Peptonok: kevésbé vannak szétbontva (aminosavak + peptidek, fehérje-
töredékek)
2. Foszfor
Szükséges: energiatranszferhez (ATP), fehérje és nukleinsavszintézishez
Felvétele foszfát ion formában aktív transzporttal (légzési energiát használ)
A növényi szervezetben teljesen oxidált formában: ortofoszfátként (PO43-) hasznosul.
Felhasznált sók: nátrium és káliumsók 1- és 2-értékű foszfátanionokkal
Na2HPO4, NaH2PO4
K2HPO4, KH2PO4
az egyértékű H2PO4- -et jobban felveszi a növény (pH<7 alatt)
Magas koncentrációban növekedésgátló hatású
(kicsapja a Ca-ot és egyes mikroelemeket, illetve gátolja a felvételüket).
Makroelemek
Makroelemek
3. Kálium
fő szerepe a töltéskiegyenlítés – megmarad kationként a növényben
KNO3,K-foszfát sók, KCl formájában
4. Magnézium – klorofill molekulához, MgSO4 formájában
5. Kén – SO42- formában veszik fel, redukálják –SH, -S-, -S-S- csoporttá
relatíve nem érzékenyek a növények a magas S koncentrációra (50 mM-ig)
6. Kalcium – CaCl2, Ca(NO3)2
Murashige – Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt
Makroelem Konc. (mg/l) Makroelem Konc.
(mg/l)
Makroelem Konc.
(mg/l)
CaCl2.2H2O 440 CaCl2.2H2O 150 KNO3 2500
KH2PO4 170 KNO3 2500 CaCl2.2H2O 200
KNO3 1900 MgSO4.7H2O 250 MgSO4.7H2O 400
MgSO4.7H2O 370 NaH2PO4.H2O 150 NaH2PO4.H2O 300
NH4NO3 1650 (NH4)2SO4 134
Magas sókoncentráció Közepes sókoncentráció Közepes sókoncentráció
Mikroelemek
1. Mangán MnSO4.H2O 22300 13200
2. Cink ZnSO4.7H2O 8600 2000
3. Bór H3BO3 6200 3000
4. Réz CuSO4.5H2O 25 25
5. Molibdén Na2MoO4.2H2O 250 250
6. Kobalt CoCl2.6H2O 25 25
7. Jód KI 830 750
8. Vas Na-Fe-EDTA 37250 28000
9. Nikkel, Alumínium, Nátrium, Klór
Kelatizáló anyagok:
EDTA etilén-diamin-tetraecetsav
EDDHA etilén-diamin-dihidroxi-fenilecetsav
EGTA etilén-glikol-bisz(2-aminoetiléter)-tetraecetsav
DTPA dietilén-triamin-pentaecetsav
DHTPA 1,3-diamino-2-hidroxipropán-tetraecetsav
MS (µg/l) Gamborg B5
Növényben MS Hoagland Növényben MS Hoagland
(mmol/kg SZA) (mmol/l) (mmol/l) (mol%) (mol%) (mol%)
N 1000 60 16 64,4 64,4 53
K 250 20 6 16,1 21,3 19,9
Ca 125 3 4 8 3,2 13,3
Mg 80 1,5 1 5,1 1,6 3,3
P 60 1,25 2 3,9 1,3 6,6
S 30 1,5 1 1,9 1,6 3,3
Cl 3 6 0,05 0,19 6,4 0,17
Fe 2 0,1 0,05 0,13 0,11 0,17
Mn 1 0,1 0,002 0,06 0,11 0,007
B 2 0,1 0,025 0,13 0,11 0,08
Zn 0,3 0,03 0,002 0,02 0,03 0,007
Cu 0,1 0,0001 0,0005 0,006 0,0001 0,002
Mo 0,001 0,001 0,0005 0,0001 0,0011 0,002
Ni 0,001 0 0,0005 0,0001 0 0,002
Na - 0,1 0,05 - 0,11 0,17
totál 15,5 93,7 30,2 100 100 100
Vitaminok
A vitaminok a tenyészetek életbenmaradásához és növekedésük serkentéséhez kell.
Az intakt növény szintetizálja in vitro tenyészetek nem biztos.
(minél kisebb, annál kevésbé)
B1 (thiamin)
B3 (nikotinsav) eszenciálisak, de főleg a B1 (0,1 – 10 mg/l)
B6 (piridoxin)
H (biotin)
PABA (paraamino-benzoesav)
C-vitamin antioxidánsként használható (10 - 100 mg/l)
mezo-inozit 100 mg/l, cukorszerkezetű vegyület
Murashige – Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt
Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l)
mezo-inozit 100 mezo-inozit 100 mezo-inozit 1000
nikotinsav 0,5 nikotinsav 1,0 nikotinsav 5
piridoxin 0,5 piridoxin 1,0 nikotinamid 0,5
thiamin 0,1 thiamin 10,0 thiamin 5
„Cukrok” - szénhidrátok
Cukrok szerepe - szénforrás (sejtépítő anyagok váza),
- energiát szolgáltat az organogenezis folyamatához
Tenyészet típusa A légzés szubsztrátja
AUTOTRÓF a Calvin ciklusban fixált C
MIXOTRÓF és HETEROTRÓF a táptalaj cukortartalma
Felhasznált cukor típusa:
monoszacharid diszacharid bomlik triszacharid bomlik
Glükóz - Szacharóz G, F Raffinóz G, F, galaktóz
Fruktóz - Maltóz G
Galaktóz - Cellobióz G
Mannóz - Trehalóz G
Ribóz, Xilóz, Arabinóz - Laktóz G, F
Savas környezetben, autoklávozás hatására hidrolizálnak a poliszacharidok.
„Cukrok” - szénhidrátok
Alkalmazott koncentráció: - általában 0,5-3% (5-30 g/l)
- spec. esetekben magas konc. (80-100 g/l)
Hatásaik: - szabályozás? a vaszkuláris elemek képződésénél
- klorofillszintézist gátolják:
ALA szintáz blokkolva kevés a porfirinvázas molekula klorofillhiány
- fotoszintézis hatékonysága csökken:
RuBisCO blokkolódik csökken a CO2 fixálás
- megnő az antociánok képződése
(pirosas szín – cukortúladagolásra utalhat)
- ozmotikus regulánsok a táptalajban
cukoralkoholok: szorbitol, mannitol előnyösebbek erre a célra (B-hiány!)
Felvételük: részben passzív permeációval, részben aktív transzporttal
aktív transzportnál H+ felvétel, és K+ vagy H+ leadás
Táptalajszilárdító anyagok
Leggyakrabban alkalmazott zselésítő anyag: agar (tengeri vörösmoszat)
Összetétele: poliszacharidok összetett keveréke
(galaktóz egységekből álló agaróz és agaropektin láncok)
Használata: 0,5-1% koncentrációban (gyártó/tétel függő!)
Az agar előnyei: - vízzel gélt képez, ami
100°C-on olvad és ~45°C-on szilárdul meg
- az agargélt a növények nem emésztik meg
- az agar nem lép reakcióba a táptalaj összetevőivel
hátrányai: - nem standard összetételű – tételenként változik
- szennyeződéseket tartalmaz
- csökkenti a tápanyagok diffúzióját a táptalajban
- nehezíti a tápanyagok felvételét
az ozmotikus potenciál növelése miatt
Táptalajszilárdító anyagok
mmol/kg agar 1 agar 2 agar 3 agar 4 agar 5 agar 6 agar 7 agar 8 Gelrite
N 53 1 178 100 74 54 2 na na
K 2 1 16 9 6 13 2 51 718
Ca 68 41 34 137 66 1 5 2.8 123
Mg 28 24 31 29 48 3 3 2.6 64
Na 202 56 552 330 427 634 114 52 296
P 1 18 1 5 1 40 1 42 68
S 184 78 232 296 204 262 66 184 6
Cl 47 33 220 113 197 95 12 na na
Cu 0.015 0.034 0.018 0.024 0.004 0.016 nd 0.005 0.05
Mn 0.073 1.093 0.036 0.173 0.036 0.027 0.055 0.01 0.1
Fe 0.510 5.376 0.564 2.987 0.859 0.599 0.528 0.6 5
Al 0.352 12.444 1.333 4.944 0.352 0.963 0.685 0.3 6.8
Cr 0.040 0.098 0.029 0.026 0.054 0.025 0.009 0.002 0.01
Cd 0.013 0.069 0.008 0.025 0.015 nd nd 0.0002 0.002
Zn 0.092 0.107 0.054 0.933 0.046 0.038 0.015 0.02 0.3
Sn 1.896 1.542 nd 3.572 1.862 nd nd 0.003 0.003
Ni 0.037 0.045 nd 0.037 0.025 nd 0.007 0.005 0.004
B na na na na na na na 2 0.13
Co na na na na na na na 0.0005 1.0
Táptalajszilárdító anyagok
Egyéb felhasznált anyagok:
- Agaróz (az agar gélképzéséért felelős összetevője tisztán) 0,4%-ban
csak érzékeny protoplaszt és portokkultúrákhoz
hajtáskultúránál hiperhidratációt okoz 0,4%-nál
1,5-2%-nál már nem, de ott csökkenti a növekedést
- Gelrite™ - gellán gumi (heteropoliszacharid, a Pseudomonas elodea termeli)
glükuronsav, ramnóz, cellobióz egységekből álló polimer lánc
csak kationok (K+, Ca2+, Mg2+) jelenlétében gélesedik
drága, de nagyon tiszta gélt képez
nincs benne (annyi) szennyeződés, mint az agarban
kisebb koncentráció kell belőle: 0,1-0,3% elegendő egy stabil gélhez
- Keményítő (gyenge gélt képez) 5-10%
- Zselatin 10%, hátránya, hogy 30°C-on már megolvad, bacik nagyon szeretik
- Alginát (nem lehet jól autoklávozni, de jól zselésít)
Táptalajszilárdító anyagok
0,15%-os Gelrite gél
A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók
Az in vitro növekedésszabályozás legfőbb tényezői –
alapvető élettani hatásokat fejtenek ki a növényekre
Típusaik: - auxinok
- citokininek
- gibberellinek
- egyéb gátló anyagok
Hatásukat befolyásolja: - a minőségük
- koncentrációjuk
- más szabályozók jelenléte/hiánya
- a tenyésztett növényi rész
genetikai-fiziológiai tulajdonságai
Auxinok – fiziológiai hatás
• Sejtek és szervek, elsősorban a szár megnyúlásos növekedésének serkentése
• Tropizmusok létrejötte
• A sejtosztódás serkentése citokininek jelenlétében
• Vaszkuláris elemek differenciálódásának szabályozása
• Gyökér iniciáció hajtásdugványoknál, gyökérdifferenciálódás szövetkultúrában
• Meghatározó szerep az apikális dominanciában
• Levél és termésleválás szabályozása
• Terméskötés, termésnövekedés, termésérés szabályozása
• Partenokarpia indukciója
• Gibberellinekkel együttműködve a virágok nemi jellegének meghatározása
(magas auxin/gibberellin arány nővirágok képződésének kedvez)
Közös kémiai tulajdonságaik:
• Indol vagy aromás gyűrű és egy karboxil-csoport egymástól 0,55 Å távolságra
• Vízben kevésbé, szerves oldószerekben jól oldódó kristályos anyagok
• Gyengén savas kémhatásúak
Növekedésszabályozó anyagok - auxinok
Természetesen előforduló auxinok
IES (IAA) 4-klór-IES 2-fenilecetsav IVS (IBA)
Szintetikus auxinok
2,4-D NES (NAA) picloram dicamba
Növekedésszabályozó anyagok - auxinok
Auxinok alkalmazása növekedésszabályozásra in vitro
1. Kalluszindukcióegyszikűeknél 2-10 mg/l 2,4-D
kétszikűeknél 1-3 mg/l 2,4-D és valamilyen citokinin kiegészítés
indukálás után a 2,4-D-t általában NES-re, vagy IVS-re cserélik,
mert megnövelheti a szomaklonális variabilitást!
2. Morfogenezis - gyökér és szárképzésNES vagy IVS használható főként organogenezishez;
gyökérképzéshez elég magában az auxin 1-3 mg/l (0,1-10 mg/l)
szárképzéshez magas citokinin:auxin arány szükséges
3. Embriogenezismagas 2,4-D koncentrációval indukálunk embriót 1-5 mg/l
ezután csökkentjük, különben az embriók nem fejlődnek
Növekedésszabályozó anyagok - auxinok
Citokininek – fiziológiai hatás:• Szabályozzák a sejtosztódást, növekedést, fejlődést és differenciálódást
• Serkentik a sejtmegnyúlást
• Nem-induktív körülmények között is virágzást válthatnak ki (helyettesíthetik
a hidegkezelést, a virágzáshoz azt igénylő növényeknél)
• Késleltetik a levelek öregedését, serkentik a tápanyagok mobilizálását
• Apikális dominancia alakítása: az auxin antagonistája, a rügyek képződését
serkenti (in vitro körülmények között is)
• Indukálják enzimek szintézisét
• Serkentik a kloroplasztiszok érését
• Elősegítik a gumók képződését
Citokininek kémiai szerkezete:• Purinvázzal rendelkeznek, melyen 5 helyen lehet eltérő szubsztituens
- igen változatos és sokféle vegyület tartozik ide, több, mint 200 jelenleg
Növekedésszabályozó anyagok - citokininek
2-iP zeatin
Szintetikus citokininek
benziladenin (BA) kinetin (KIN) tetrahidropiranil-BA (PBA) thidiazuron (TDZ)
Növekedésszabályozó anyagok - citokininek
Természetesen előforduló citokininek
1. Járulékos hajtásképzésauxinokkal kombinációban, magas citokinin:auxin arány mellett
2. Embriogenezis
kétszikűek: alacsony, 0,1-0,5 mg/l koncentrációban auxin mellett
egyszikűeknél már 0,0002 mg/l is gátló hatású lehet!
3. Felhasználás hajtáskultúrákban
- hónaljhajtások növekedésének serkentése 0,5-10 mg/l
- járulékos hajtásrügyképzés
- gyökérképződés gátlása – magas, 0,5-10 mg/l koncentrációnál
DE: kinetin sok esetben gyökeresedést indukál!
4. Sejtosztódás serkentése kallusztenyészetbenalacsony koncentrációban, 0,1 mg/l, az auxin konc. ~tizede
Citokininek alkalmazása növekedésszabályozásra
Növekedésszabályozó anyagok - citokininek
A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók
Gibberellinek – fiziológiai hatás:
•szármegnyúlás serkentése
•apikális dominancia erősítése
•genetikai és fiziológiai törpeség normalizálása
•fény- és hidegigényes magvak csírázásának indukciója
•rügyek nyugalmi állapotának megszakítása
GA3 - gibberellin sav
Gibberellinek – felhasználás a
mikroszaporításban
•kalluszképzés és fenntartás
•morfogenezis gátlása
•hajtásmegnyúlás elősegítése
Auxin-citokinin egymásrahatás
AUXIN CITOKININ
magas együttes hatás alacsony
gyökérképződés indukálása
kalluszindukció egyszikűeknél
embriogenezis indukálása
járulékos gyökérképzés kalluszból
kalluszindukció kétszikűeknél
sarjképzés indukálás hajtáskultúránál
alacsony magas
K O
N C
E N
T R
Á C
I Ó
A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók
• Abszcizinsav:alacsony konc. 0,1-1 mg/l esetén serkentheti a kallusznövekedést,
magasabb konc. >1 mg/l esetén gátolja azt
• Etilén:gátolja a sejtosztódást és a morfogenezist, jelenléte nem kívánatos
• Anti-gibberellinek (gibberellin-antagonisták):klórmekvát (CCC), ancymidol, paclobutrazol –
növelik a szárazanyagtartalmat, erősítik a hajtásokat, törpésítenek,
csökkentik a hiperhidratációt
• Anti-auxinok:trijód-benzoesav, transz-fahéjsav –
az auxin hatását reverzibilisen gátolják (nem kívánt kallusznövekedés)
• Fenolvegyületek:phloroglucinol – antioxidáns, csökkenti a vitrifikációt, antibakteriális
Növekedésszabályozó anyagok - egyéb
Természetes eredetű kivonatok
Könnyezési nedvek:
- komplex összetétel:
aminosavak, vitaminok, cukrok, makro- és mikroelemek, hormonok
- nem standard, változó összetétel!
Acer, Juglans, Cladrastis könnyezési nedvei
Terméskivonatok:
Kókusztej(-víz), banánkivonat, paradicsomlé, burgonyapép, csicsóka
Élesztő és húskivonatok – aminosavaknál már volt róluk szó
Táptalajok elkészítése
Törzsoldatok készítése
Makroelemek Fe
nélkül, 10-20x
Makroelemek
külön 10g/100ml
Fe-EDTA
0,5g/100ml
Mikroelemek
1000x
Vitamin törzsoldat
100x
Hormonok
0,1-1 mg/ml
Törzsoldatok összemérése
desztillált vízbe
Cukor hozzáadása
Feltöltés végtérfogatra
pH beállítása
Táptalajszilárdító
hozzáadása
Környezeti tényezők a tenyésztés során - Megvilágítás
Környezeti tényezők a tenyésztés során – Hőmérséklet
A növényi szövetdarabok, explantátumok nem tudnak úgy védekezni a
hőmérsékletingadozás ellen, mint az intakt növény!
a legtöbb kultúra számára optimális az átl. 25 °C (17°-32°C)
trópusi és szubtrópusi növényeknek az átl 28 °C (24°-32°C)
(pl citrusfélék, rizs, gyapot, Bougainvillea)
sötét periódusban 4-5°C-kal alacsonyabb hőmérséklet
a hőmérséklet hatással van a citokininek aktivitására –
magas hőmérsékleten csökken majd megszűnik
- föld alatti szervek (hagymák, gumók) in vitro organogenezisére is nagy
hatással van a hőmérséklet – konstans hőm. esetén jobb ezen szervek
képződése
mérsékelt égövi fás növények in vitro kultúrája 4-5°C-on, sötétben jól
tárolható néhány hónapig (alma, körte, berkenye)
magas hőmérséklet (38°C) vírusmentesítésre alkalmas
Környezeti tényezők a tenyésztés során - Tartóedények
A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai
Nagyléptékű szaporítás – feltételek megléte Technikai feltételek – technológiai feltételek Sikeres kísérlet ≠ technológia !!! Teljesítménymutatók – a termelési folyamat jellemzése:
• kultúránként eltérő teljesítményadatok• Kioperálható merisztémák száma 30-200 db/ 8 óra• Gerbera sarjcsokrainak feldarabolása: 800-1100 db / 8 óra• Nóduszkultúrás szaporítás: 1200-1800 db / 8 óra• Fás szárú növényeknél 20-50%-kal kisebb mutatók• Több fajta – 20-30%-kal kisebb mutató
A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai
Önköltség:• Európában a 60-65%-át a bér és járulékai teszik ki• Nem tartozik a jól fizetett tevékenységek közé elvándorlás
Virológiai vagy egyéb tesztelést nem igénylő ex vitro növény önköltségének az alakulása:
Szűkített önköltség
Bér 42%
Közterhek 18%
Energiaköltség 15%
Amortizáció 5%
Anyag 10%
Kutatás-fejlesztés +
PR
10%
Összesen 100%
+ egyéb költségek
Általános költségek (15-25%)
ÁFA
Licencdíj:
szegfűnél 0,019 €/db
krizantém: 0,0067-0,012 €/db
gerbera: 0,15-0,20 €/db
A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai
Néhány ár
Betula pendula ‚Purpurea’ 1,15 €/db (72-es tálca), 2,06 € (6-os cserép)
Syringa vulgaris fajták 0,76 €/db (72-es tálca)
Rózsa, klemátisz fajták 1,07 €/db (72-es tálca)
Hosta fajták 0,76 €/db (72-es tálca)
Vírustesztelt Gerbera fajták 2,05 €/db
Spathiphyllum fajták 0,3-0,6 €/db (162 vagy 72-es tálca)
Terméktípusok:• Nem gyökeres hajtások vagy sarjcsokrok (minidugványok)• Gyökeresített, de nem akklimatizált in vitro növény• Akklimatizált, közegbe ültetett növény (lyuktálcás)• Gumók, hagymák – közvetlenül közegbe ültethető
A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai
Törzsállomány céljára előállított ex vitro növény:
• Többször tesztelik - meghatározó költségtényező
• ELISA teszt egy vírusra vásárolt diagnosztikummal:
200-400 Ft/minta
• ELISA teszt egy vírusra saját készlettel:
35-50 Ft/minta
• PCR teszt egy nagyságrenddel drágább, mint a vásárolt
készlettel végrehajtott ELISA teszt
A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai
A költségek csökkentése:• Automatizálási lehetőségek• Új(ragondolt) technikák alkalmazása
RITA tenyésztési rendszer
A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai
ForBio Vitron 501 mikroszaporító robot
Elektromos-pneumatikus és mechanikus konstrukcióGyökeres, egy hajtással rendelkező növényeket állít elő (nóduszkultúra)Éves teljesítménye: 15 millió növény (eukaliptusz, akác, tikfa)
Egyéb automatizált rendszerek: átfolyós táptalajsterilizáló és töltő
A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai
Fotoautotróf mikroszaporítás• Szénforrás a levegő szén-dioxidja• Cukormentes táptalaj – minimális a kontamináció• Erőteljesebb növekedés• Könnyebb akklimatizálhatóság
Bioreaktor rendszerek
Gerbera
mikroszaporítása
A – anyanövény
B – merisztémák
C – merisztémák
D – endogén baci
E – felszaporítási fázis
F – osztás előtt
G – osztás után
H – gyökeresedés
I – kész in vitro növény
J – akklimatizálás
K – 4 hónap múlva
MS táptalaj +
1-3 mg/l BA / KIN
0,1-0,5 mg/l IES / NES
Afrikaiibolya
mikroszaporítása
A – regeneráció
levéllemezen
B – sz. embriók
C – sz. embrió
D – fejlődő hajtások
E – tőlevélrózsa
F – -”-
G – kész növény
H – akklimatizálás
I – mutáns egyed
MS táptalaj +
0,2-0,3 mg/l BA /
NES
0,1 mg/l TDZ
Köszönöm a figyelmet!