Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional DNA-Polymerasen starten die Replikation am...

Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional

DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = “Origin“

Replikationsgabel

Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E.

coli?

DnaA(ATPase)

Erkennung

Startkomplex

OffenerKomplex

30°CDnaB = HelikaseDnaCATP

„Prä-Priming“Komplex

- Primase- DNA-PolymeraseReplikation

leichtes „Schmelzen“ der

DNA

OriC

AT CG AT

5'

A TG

AT

GA TGCC

AAAT CG ATTC A TT

5'

3'

3'

Elternstrang 1Elternstrang 2

Brechen der H-Brücken( Helicase)

entlang der Basenpaare

ori

Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung

Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?

o 5‘ > 3‘ Verknüpfung (Phospho-Diester-Brücken)

o 5‘-Ende mit Phosphat-Gruppe

o 3‘-Ende mit freier OH-Gruppe

5‘

3‘Nukleophiler Angriffder 3‘-OH Gruppeam -Phosphoatom

allgemein gilt: Desoxynukleosid-5‘-Triphosphate sind die aktivierten Vorstufen bei der DNA-Synthese:

dATP, dCTP, dGTP, dTTP

(dNMP) n + dNTP

(dNTP) n+1+ PPi

DNA-Polymerase

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Neu-eintretendes Desoxy-Nukleosid-Triphosphat

5‘

3‘

00O + 0

Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung

Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?

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(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1+ PPi

DNA-Polymerase

grundsätzlich gilt, daß DNA-Polymerasen nur synthetisieren können5‘>3‘

d. h . DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität

T3'

T

C

G AA

TAG

ATGC

AA

A5'

T GT

C

AC

GA

TTC

A TT

3‘

5‘

5‘

3‘

Bewegung

der Replikationsgabel

5‘3‘ DNA-Polymerase

DNA-Polymerase

Die Biochemie der DNA-Replikation

Das Problem der “lagging strand“ DNA-Replikation

DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität

5‘

3‘Bewegungder

ReplikationsgabelQuickTime™ and a

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DNA-Polymerase

3‘5‘

5‘3‘5‘

3‘

kontinuierlicher Strang

(“leading strand“)

dis-kontinuierlicher Strang

(“lagging strand“)

Noch ein anderes Problem bei der DNA-Replikation......

DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation

PrimerDNA-Polymerase

DNA-Polymerasen verwenden den einzelsträngigne DNA-Strang als Matritze, aber der Einzelstrang muß einen Primer gebunden haben (doppelsträngiger Abschnitt),damit die DNA-Polymerase den 2. Strang auffüllen kann

DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation

5‘

3‘

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3‘5‘5‘3‘

5‘

3‘leading strand

lagging strand

DNA-Polymerase

PrimerQuickTime™ and a

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Primer PrimerOkazaki Fragment

Die vollständige Synthese des Folgestrangs

Die Ligase-Reaktion

DNA-Ligase + ATP

+ PPi

Die einzelnen Schritte der Ligase-Reaktion

ATP

PPi

Enzym-AMPAMP

-Aminogruppe eines Lysins

Vergleich der drei DNA-Polymerasen von E. coli

Anzahl der UntereinheitenSynthese-Rate (Nukleotide/sec)

Prozessivität (eingefügte Nukleotide vor dem Abdissoziieren)

3‘>5‘ Exonuclease (Korrekturlesen)

5‘>3‘ Exonuclease

Molekulargewicht

ja ja ja

ja nein nein

103 kDa 88 kDa 900 kDa

DNA-ReparaturDNA-ReparaturDNA-Replikation

Untereinheiten und Struktur der DNA-Polymerase III von E. coli

Die DNA-Polymerase III (Holoenzym) bildet einen Dimer und kann dadurchgleichzeitig sowohl am Leitstrang wie am Folgestrang synthetisieren.

Die Synthesegeschwindigkeit beträgt: V = 1000 BP/sec

DNA-Polymerase III

-Untereinheit mit DNA-Polymerase- Aktivität (5‘>3‘)

-Untereinheit für die Bindung an die DNA

-Untereinheit3‘>5‘ Exonuclease

vermutlich Schleifenbildung

„Akzessorische Proteine“ der DNA-Polymerase

Klammer Griff

Der Griff-Klammer-Komplex (RFC-PCNA) kann armreifartig an der DNAentlanggleiten. An den Griff-Klammer-Komplex bindet die DNA-Polymerase III, die während der Replikation dadurch mit hoher Prozessivität an der DNA entlangwandern kann, ohne dabei abzufallen

DNA-Polymerase III

DNA

Kristallstruktur vonKlammer-Dimer

Komplex

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Das E. coli Replisom mit seinen verschiedenen Komponenten

Bewegungsrichtung der

Replikationsgabel

Leitstrang Folgestrang

SSB

RNA-Primer

Helicase

DNA-Polymerase I+ Ligase

Okazaki-Stücke

Pol III(DNA-Polymerase)

5‘3‘

3‘

Primase

Primosom

Damit die DNA-Replikation in der Replikationsgabel kontinuierlich voran-schreiten kann, muß die doppelsträngigeDNA in der Gabel in die Einzelstränge getrennt werden.

>> Eine DNA-Helicase windet unter ATP-Verbrauch die DNA auf.

Damit die entwundene DNA kurzzeitig einzelsträngig bleibt,bindet das SSB (“single-strandedDNA-binding protein“) an die nochnicht replizierte DNA. Damit wirddie Verknäuelung der ss-DNAverhindert.

Später wird das SSB von der vorrückendenDNA-Polymerase wieder von der Matritzeabgetrennt.

Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang

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jedoch: ein- und dieselbe DNA-Polymerase III synthetisiert gleichzeitig Leit- und Folgestrang!

PrimosomHelicase

DNA-Polymerase IIIHoloenzym-Dimer

Primer

Schleifenbildung

Leitstrang Folgestrang

Primer

Okazaki-Stück

Bewegungsrichtung der

Replikationsgabel

DNA-Polymerase IIIHoloenzym-Dimer

„Schleifenbildung“ am Folgestrang bei der DNA-Replikation

PrimosomHelicase

DNA-Polymerase IIIHoloenzym-Dimer

Primer

Schleifenbildung

Schleifenbildung bei der Synthese von Leit- und Folgestrang

5‘

DNA-Polymerase IIIHolonenzym-Dimer

Okazaki-Stück

3‘

5‘

3‘

5‘

DNA-Polymerase IIIHolonenzym-Dimer

Die Schleifenbildung an der DNA-Folgestrangmatritze ermöglicht der dimeren

DNA-Polymerase III die Synthese beider Tochterstränge in der Replikationsgabel. Dadurch wird die physikalische Richtung am Folgestrang, nicht aber die biochemische Richtung (5´>3´) umgedreht

Topoisomerase

Bewegungsrichtung der

Replikationsgabel

Leitstrang

Folgestrang

DNA-Polymerase III

Griff

RNA-Primer

SSB

RNA-Primer

Primase

Okazaki-Stücke

Helicase

Ligase

Klammer

DNA-Polymerase I

Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang

Die gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch die dimere DNA-Polymerase III

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Eine Computer-Animation: gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch das Holo-

Enzym DNA-Polymerase III

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Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

53Essentielle Grundlage des Lebens ist die Fähigkeit der identischen Reduplikation des genetischen Materials und damit letztendlich der Vererbung einer funktionsfähigen Zellstruktur.

Welche Aussage zur Replikation der DNA trifft zu?

(A) Beim Start der Replikation werden RNA-Primer synthetisiert.(B) Die Neusynthese der DNA erfolgt an beiden Strängen einer

Replikationsgabel in kürzeren Stücken, so genannten Okazaki-Fragmenten.(C) Für die Verknüpfung der DNA-Fragmente nach Entfernen der Primer

phosphoryliert die DNA-Ligase das 3’-OH-Ende eines Fragmentes.(D) Helicasen schützen intermedär gebildete einzelsträngige DNA-Bereiche

vor Schädigungen und Strangbrüchen.(E) Interkalatoren, die als Zytostatika in der Tumortherapie eingesetzt werden,

binden spezifisch die DNA-Polymerasen.

Die Entwindung des DNA-Matritzenstrangs während

der DNA-Replikation führt zu Verdrillungen

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dadurch Verdrillung der DNA

Entwinden der DNA während der Replikation durch die Helicase

Transienter Bruch des einen Strangserlaubt freie Rotation der DNA-Strängeund Entdrillung der beiden Stränge

>>katalysiert durch DNA-Topoisomerase

Replikation

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

Nukleosomen-Assemblierung nach DNA-Replikation in Eukaryonten

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Die Enden der menschlichen Chromosomen sind linear>>> Probleme bei der Replikation

Telomerasemit RNA Primer