Diagnóstico Laboratorial da Síndrome dos Anticorpos...

Diagnóstico Laboratorial da Síndrome dos Anticorpos Antifosfolípides

Silmara MontalvãoFarmacêutica Bioquímica-Supervisão técnica

Laboratório de Hemostasia-Hemocentro Universidade Estadual de Campinas-Unicamp

silmara@unicamp.br

Declaração de Conflito de Interesse

Não possuo conflito de interesse

Sumário

Características dos anticorpos antifosfolípides

Quais testes devem ser realizados ?

Como interpretar os resultados ?

Novos testes X presença de anticorpos antifosfolípides

Considerações finais

A síndrome do anticorpo antifosfolípides (SAF) é uma doença autoimune caracterizadapela presença de anticorpos antifosfolípides e, no mínimo, uma manifestação clínica

Trombose arterial e venosa Perda fetal recorrente

A SAF pode ocorre de maneira isolada, SAF primária, ou associada a doenças do tecidoconectivo (lúpus eritematoso sistémico), quando classificada de SAF secundária

Os anticorpos correspondem a uma família heterogenia de imunoglobulinas, que sedirigem a:

Proteínas plasmáticas (β2-glicoproteína ou protrombina) ligadas a fosfolipídios Complexos (proteína e fosfolípides) : células endoteliais, plaquetas ou monócitos

Introdução

Groot, Blood 2012;120c:266-274V. Pengo et al. Autoimmunity Reviews.2016,1031–1033

Adapted from Philip G. de Groot, and Rolf T. Urbanus Blood 2012;120c:266-274

β2GPI is negatively charged, phospholipids become exposed,

and β2GPI will bind to this surface and change conformation

Antibody–β2GPI complex can subsequently interact with several

surface receptors

Introdução

Critérios laboratoriais para classificação da SAF

Anticorpos anticardiolipina isotipos IgG e ou IgM no soro ou plasma, presente emtítulos médio ou alto (> 40GPL ou MPL, ou > 99th), em duas ocasiões com intervalo depelo menos 12 semanas;

Anticorpos anti-β2 glicoproteina I, isotipos IgG e ou IgM no soro ou plasma (títulos >99th), em duas ocasiões com intervalo de pelo menos 12 semanas;

Anticoagulante lúpico presente no plasma em duas ocasiões com intervalo de pelomenos 12 semanas;

Miyakis et al, J Thromb Haemost 2006; 4: 295-306Wilson et al, Arthritis Rheum 1999; 42: 1309-11

Brandt et al, Thromb Haemost 1995; 74: 1185-90

Testes funcionais: (fase líquida) (A) Anticoagulante lúpico: avalia um grupo heterogêneo de anticorpos

Testes imunológicos : (fase sólida) (B)Anticorpos anticardiolipina; (C) Anticorpos anti-β2 glicoproteina I

Favaloro J, Semin Thromb Hemost 2012;38:353-359

±50 laboratórios12 amostras (1999-2011)

Anticorpos antifosfolípides: Precisão?

Jennings et al, J Thromb Haemost 2004; 2: 2178-84

245 laboratórios

Anticorpos antifosfolípides: Exatidão?

Condições pré-analíticas da amostra Escolha do teste Valores para cálculo de cut-off Interpretação de resultados

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico

2012: British Commitee for Standard in haematology (BCSH)

2014: The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)

2009

Pengo V et al, J Thromb Haemost 2009; 7: 1737-40Keeling D, Br J Haematol 2012;157:47-58

Ledford-kraemer, CLSI document H60, 2014

(1) O Plasma utilizado para esta análise deverá ser pobre em plaquetas, para evitarresultados falso-negativos (ISTH, BCSH, CLSI)

(2) Coleta em plasma citratado 0.109 M citrato trissódico, com dupla centrifugação paraatingir o número de plaquetas < 10 x 109/L (ISTH, BCSH, CLSI)

(3) Não utilizar filtros 0.22 µm para produzir PPP, o que pode reduzir a qualidade daamostras teste (ISTH, BCSH, CLSI)

(4) Rotinas de TTPA, deverá utilizar reagentes não sensíveis ao anticoagulante lúpico eeste deverá ser avaliado em rotina e reagentes específicos. O objetivo é reduzir achance de encontrar AL em pacientes assintomáticos (CLSI)

Pengo V et al, J Thromb Haemost 2009; 7: 1737-40Keeling D, Br J Haematol 2012;157:47-58

Ledford-kraemer, CLSI document H60, 2014

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Condição pré-analítica

Dois testes de coagulação dependentes de fosfolipídios Atividade funcional com metodologias e princípios diferentes Múltiplas etapas (triagem/ mistura /confirmação) Um destes testes deverá ser positivo para caracterização de anticorpos

anticoagulante lúpico

Pengo V et al, J Thromb Haemost 2009; 7: 1737-40

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Qual teste de triagem utilizar ?

Triagem Mistura Confirmação

Presença de anticorpo anti-fosfolípide

Presença de um inibidor e exclusão de deficiência de

fator

Demonstrar adependência de

fosfolípide

Baixa concentração de fosfolipídio

Mistura PP e POOL 1:1 não incubar; Pool ou controle comercial (PPP, 100% dos

fatores da coagulação)

Alta concentração de fosfolipídio: excesso de

bilayer ou fosfolipídio de fase hexagonal

TTPASCTHZ

dRVVT

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Qual teste de triagem utilizar ?

Restrição de testes (ISTH) dRVVT (BCSH, CLSI) Prática automatizada (CLSI) Pengo V et al, J Thromb Haemost 2009; 7: 1737-40

Keeling D, Br J Haematol 2012;157:47-58Ledford-kraemer, CLSI document H60, 2014

TP diluído

Devreese et al, J Thromb Haemost 2014; 12: 792-15

Guidelines de orientação para anticorpos antifosfolípides de fase sólida:

Critérios para SAF inclui IgG e IgM, a presença de anticorpos do mesmo isotipo reforça a probabilidade clínica de SAF;

Avaliação de anticoagulante lúpico, aCL e aβ2GPI na mesma amostra para a utilidade diagnóstica

Triagem Mistura Confirmatório

-Espressar resultados em ratio normalizado--Usar valores de cut–off local

--> Percentil 99th da população normal

Ratio Normalizado ICA% (Índice circulante de anticorpo)

% de Correção (Teste de triagem-

confirmatorio; triagem x 100)

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: valores de referência?

Pengo V et al, J Thromb Haemost 2009; 7: 1737-40Keeling D, Br J Haematol 2012;157:47-58

Ledford-kraemer, CLSI document H60, 2014

* CLSI recomenda normalização do pool contra um intervalo de referência

Para o diagnóstico de SAF o antagonista de vitamina K ou heparina nãofracionada devem ser descontinuados em momento apropriado parainvestigação da SAF (ISTH, BCSH, CLSI)

Para RNI < 1.5 avaliação em plasma não diluído, RNI 1.5 e 3.0 diluir com pool1:1 e considerar o efeito da diluição para a interpretação (ISTH)

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Anticoagulados?

Pengo V et al, J Thromb Haemost 2009; 7: 1737-40Keeling D, Br J Haematol 2012;157:47-58

Ledford-kraemer, CLSI document H60, 2014

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Anticoagulados?

Quando possível TP deverá ser avaliado com tromboplastina local antes de iniciar a anticoagulação com AVK

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Novos anticoagulantes?

Inibidores direto de trombina interfere em todos os testes de anticoagulante lúpico e introduz um potencial de resultados falso-

positivo (ISTH, BCSH, CLSI)

Diferente dos antagonistas de vitamina K o teste de mistura não corrige em alguns casos

(CLSI)

Ledford-kraemer, CLSI document H60, 2014

Dabigatran

Rivaroxaban

Heparina

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Perfil de positividade dos testes?

Pengo V, Thromb Haemost 2005; 93: 1147-52

Perfil de anticorpo antifosfolípide como fator de risco para evento tromboembólico (ISTH 2009)

Guidelines de orientação para anticoagulante lúpico: Perfil de positividade dos testes?

LAC+;aCL-; aβ2 GPI - Menor associação com manifestações clínicas da SAFPengo V, Thromb Haemost 2005; 93: 1147-52

De Groot PGJ Thromb Haemost 2005; 3: 1993-7Pengo V, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007; 27: 309-10

LAC-;aCL+; aβ2 GPI – Menor associação com manifestações clínicas da SAFRuffatti A J Thromb Haemost 2008; 6: 1693-6

Runchey SS Br J Haematol 2002; 119: 1005-10Proven A Mayo Clin Proc 2004; 79: 467-75

Pengo V, Blood 2011

LAC+;aCL+; aβ2 GPI + está fortemente altamente associado com risco trombótico

Novos testes para o diagnóstico de SAF

Anticorpos anti-Domínio I da β2 glicoproteína I (D1-β2GPI)

Anticorpos ligados ao complexo fosfatidilserina e protrombina (aPS/aPT)

Isotipo IgA para avaliação de anticorpos anticardiolipina e anti- β2 glicoproteína I

A β2 glicoproteína I apresenta 5 domínios homólogos

O domínio N-terminal e designado como domínio I

Anticorpos que reconhecem o epitopo GLy40-Arg43 no domínio I da β2 glicoproteína I apresenta maior correlação com testes de anticoagulante lúpico e tem sido associado

com maior risco de trombose

Bas de Laat et al., Blood 2004

Anticorpos anti- Domínio I da β2 GPI

Anticorpos anti- Domínio I da β2 GPI

Pengo et al, J Thromb Haemost 2015

1125 pacientes/106 positivos 65 foram para β2GPI e D1-β2GPI (Sperman 0.76 95%IC 0.6.0.85 p< 0.0001)

ACL+, IgG aCL+, β2GPI+: 32 ACL-, IgG aCL+, β2GPI+: 23 ACL-, IgG aCL-, β2GPI+: 10

Pengo et al, Thrombosis Research, 2015,161-163

30% positivos para β2GPI e negativos

para D1-β2GPI

Anticorpos antifosfatidilserina e antiprotrombina (anti-PS/PT)

Revisão sistemática, Sciascia 2014, avaliação de aPT e aPS/ aPT com risco trombótico:

(1) 38 artigos foram avaliados para aPT(2) 10 artigos avaliados para aPS/aPT

aPT

Estudos com aPT ( 5,705 pacientes e 1,262 controles ), 22% apresentou associação

significativa com trombose arterial e venosa.

O isotipo das Ig foi avalido em poucos estudos, a IgG foi associada com trombose venosa e não

arterial.

A IgM apresentou menor associação quando comparada a IgG. O titulo destes anticorpos não

foi avaliado devido a falta de material de referência.

aPS/aPT

Estudos com aPS/aPT ( 1,775 pacientes e 628 controles), 83% apresentou associação

significativa trombose venosa.

O isotipo das Ig foi avalido em poucos estudos, a IgG foi associada com trombose venosa e não

arterial (perde-se analise multivariada).

A IgM apresentou menor associação quando comparada a IgG.

Sciasacia S, Thrombosis and Haemostasis, 2014.

A avaliação dos anticorpos antifosfolípides não deve ser realizado em práticaautomatizada de análise

A prática laboratorial deve seguir orientações de guidelines internacionalmentereconhecidos pela comunidade cientifica;

Anticorpos contra o domínio I da β2GPI: O teste mostra ser promissor, no entanto aindanão sabemos se a principal utilidade esta relacionada ao diagnóstico ou risco deestratificação

Anticorpos contra aPT e (aPS/aPT): E um teste que contribui para avaliação de risco datrombose, analise multivariada confirma aPS/PT como fator de risco independente paratrombose, associação entre aPS/aPT e LA necessitam de avaliação. Ainda há nível deevidencia III (baixo/moderado grau de evidência);

Considerações finais

Agradecimentos