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TECNICAS DE ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS
HIBRIDACIONDE ACIDOS NUCLEICOSDOCENTE: Mara Soledad Depix UST
Desnaturalizacin y Renaturalizacin por efecto de la Temperatura
DESNATURALIZACIN DEL DNA
1. Fuerza inica50%
2. Longitud DNA doble 3. Composicin de bases
Tm oC = 2 x no(A + T) + 4 x n(G + C)
Curva de Desnaturalizacin y Composicin de Bases
CAMBIOS EN LA VISCOSIDAD Y ABSORBANCIA A 260 nm
Qu
es la Tm?
Tm = temperatura de melting o de separacin de las hebras. La Tm es una medida de la estabilidad de los hbridos definida como la temperatura a la cual 50% de los hbridos se encuentran formados y 50% permanecen disociados.
50% 5 - - - - - - - - - - -3 3 - - - - - - - - - - 5
50%
HIBRIDACION
2 elementos bsicos: Secuencia diana y sonda
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
Nmero de pares GC v/s pares AT Grado de complementariedad Largo de las hebras Concentracin de sal en la solucin Temperatura Concentracin de formamida
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
Nmero de pares GC v/s pares AT
Mayor nmero de enlaces de H entre la hebras mayor estabilidad
de los hbridos. 3 enlaces de H entre G y C 2 enlaces de H entre A y T
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
Temperatura
Mayor T aumenta la energa cintica de las hebras
y desestabiliza la estructura de los cidos nucleicos. las hebras se separan.
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
Grado de complementariedad
Menor complementariedad de bases, menos enlaces de H formados
menor estabilidad
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Largo de las hebras
Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb
ms enlaces de H mayor estabilidad del hbrido. Menor largo de las hebras (oligos)
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