分子病理診断の基礎技術と原理 ー分子病理診断講習...

分子病理診断の基礎技術と原理ー分子病理診断講習会ー

大阪大学大学院医学系研究科

病態病理学・病理診断科

森井 英一

第１０４回日本病理学会総会COI 開示

筆頭発表者名：森井 英一

演題発表に関連し、開示すべきCIO関係にある企業などはありません。

基本中の基本

染色体（山のような遺伝子の集まり）

DNA

RNA

蛋白質

基本中の基本

染色体（山のような遺伝子の集まり）

DNA

RNA

蛋白質

PCR

基本中の基本

染色体（山のような遺伝子の集まり）

DNA

RNA

蛋白質

PCR

Western Blotting

PCR

欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる

遺伝子 A

遺伝子 B

遺伝子 C

遺伝子 Z

PCR

欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる

遺伝子 A

遺伝子 B

遺伝子 C

遺伝子 Z

PCR

欲しい遺伝子の欲しい場所のみ増幅して手に入れる

遺伝子 A

遺伝子 B

遺伝子 C

遺伝子 Z

HybridizationとDNA polymeraseの活用

Hybridization

ある一本鎖DNAと相補的な配列をもつ一本鎖DNAの結合

DNA

Hybridization

ある一本鎖DNAと相補的な配列をもつ一本鎖DNAの結合

DNA

5’-GTAGAAGGCCT-3’

3’-CATCTTCCGGA-5’

DNA polymerase

一本鎖DNAの一部が二本鎖になると、そこからDNAを伸ばして全体を二本鎖にする酵素

DNA

DNA polymerase

一本鎖DNAの一部が二本鎖になると、そこからDNAを伸ばして全体を二本鎖にする酵素

DNA

primer

PCR

HybridizationとDNA polymeraseの活用

遺伝子 A

準備するもの増幅したい部分の両端を認識する短いDNA （primer)Taq polymeraseサーマルサイクラー（温度を時間を決めて上げ下げする装置）

PCR

HybridizationとDNA polymeraseの活用

遺伝子 A

準備するもの増幅したい部分の両端を認識する短いDNA （primer)Taq polymeraseサーマルサイクラー（温度を時間を決めて上げ下げする装置）

PCR

室温

94度

50度（一例）

PCR

50度

72度

94度

PCR

94度

50度

PCR

72度

50度

PCR

94度、50度、72度を繰り返すことで、DNAの一部が増幅できる

PCR

増幅したいDNAの量が、もともと多ければ、、、、、

早くDNAが増幅される。

これを利用すれば、RNAの量を定量することができる。(RT-PCR)

RT-PCR

mRNA

cDNA

逆転写(Reverse Transcription, RT)

cDNAの量をPCRで見積もることで、元のmRNAの量を定量する。

RT-PCR

mRNA

cDNA

逆転写(Reverse Transcription, RT)

PCR

RT-PCR

mRNA

cDNA

逆転写(Reverse Transcription, RT)

PCR

均等に増幅されることが大前提

PCRにおけるサイクル数とDNA量

DNA量

サイクル数

PCRにおけるサイクル数とDNA量

DNA量

サイクル数

PCRにおけるサイクル数とDNA量

DNA量

サイクル数

１サイクル毎に増幅されたDNA量を定量

DNA量

サイクル数

定量的PCR

基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく

定量的PCR

基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく

定量的PCR

基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく

蛍光量をサイクル毎に測定する

定量的PCR

基質として、蛍光ラベルしたヌクレオチドを加えておく

蛍光量をサイクル毎に測定する

欠点は、非特異的に増幅されたDNAも一緒に測定されてしまうこと

定量的PCR

TaqMan法

プライマー相補的なプローブ

消光物質発光物質

定量的PCR

TaqMan法

プライマー

定量的PCR

TaqMan法

プライマー

定量的PCR

TaqMan法

プライマー

定量的PCR

Western Blotting

あるタンパク質の量を見積もる方法

タンパク質 Aタンパク質 Bタンパク質 C

・・・

タンパク質 Z

膜の上に移す

膜の上での物探し

タンパク質を電気泳動

膜の上に移す

膜の上での物探し

タンパク質を電気泳動

目的のものは、どこにあるのか？

目的の蛋白質

抗原ー抗体反応を利用

目的の蛋白質に特異的な抗体

Western blotting法

Western Blottingの例

ふたたび

染色体（山のような遺伝子の集まり）

DNA

RNA

蛋白質

PCR

Western Blotting