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UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
PREVALENCIA DE POLIMORFISMOS EN GENES QUE CODIFICAN PARA ENZIMAS METABOLIZADORAS DE FARMACOS UTILIZADOS EN EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA
Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica, área de Especialización en Bioquímica Clínica
CAROLINA SALAS PALMA
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. Mauricio Farfán
Santiago, Chile Septiembre, 2010
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
INFORME DE APROBACION
TESIS DE MAGÍSTER EN BIOQUÍMICA
Se informa a la Comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis presentada por la candidata:
CAROLINA SALAS PALMA
ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para optar al Grado de Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica Clínica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día ………………………………………………………………… Director de Tesis: Dr. Mauricio Farfán ____________________________ Comisión Informante de Tesis: QF. Betzabé Rubio ____________________________
Dra. Daniela Seelenfreund ____________________________
Dra. Rosemarie Mellado ____________________________
iii
AGRADECIMIENTOS
Al Servicio de Oncología, Farmacia Clínica, Infectología y Laboratorios del Hospital Dr.
Luis Calvo Mackenna, por su colaboración en la realización de este trabajo.
Al Servicio de Oncología del Hospital Dr. Gustavo Fricke por su cooperación.
Al St. Jude Children Research Hospital por su apoyo con muestras controles y realización de
parte de los objetivos planteados en el presente trabajo.
iv
FINANCIAMIENTO
Este trabajo contó con el financiamiento de la Fundación Nuestros Hijos y recursos propios
del Centro de Estudios Moleculares Facultad de Medicina-Universidad de Chile Hospital Dr.
Luis Calvo Mackenna.
v
ABREVIATURAS
6-MP : Mercaptopurina
ADN : Acido desoxirribonucleico
BFM : Berlin Frankfurt Münster
CN : Control negativo
CP : Control positivo
dNTPs : Desoxirribonucleótidos
DS : Desviación estándar
EET : Error estándar total.
GMPS : Guanosina monofosfato sintetasa
GR : Glóbulos rojos
HLCM : Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna
HPRT : Hipoxantin fosforribosil transferasa
IMDPH : Inosina monofosfato deshidrogenasa
ITPA : Inosina trifosfato pirofosfohidrolasa
LLA : Leucemia linfoblástica aguda
mL : Mililitros
uL : Microlitro
mM : Milimolar
uM : Micromolar
MTHFR : Metil tetrahidro folato reductasa
MTX : Metotrexato
pb : Pares de bases
PINDA : Programa Infantil de Drogas Antineoplásicas
r.p.m : Revoluciones por minuto
RPC : Reacción de la polimerasa en cadena
SJCRH : St. Jude Children Research Hospital
TGN : Nucleótidos de tioguanina
TPMT : Tiopurina s-metiltransferasa
vi
INDICE
Página
AGRADECIMIENTOS iii
FINANCIAMIENTO iv
ABREVIATURAS v
I. RESUMEN x
II. ABSTRACT xi
III. INTRODUCCIÓN 1
IV. HIPÓTESIS 8
V. OBJETIVOS 8
V.1. Objetivos generales 8
V.2. Objetivos específicos 8
VI. MATERIALES Y MÉTODOS 9
VI.1. Reactivos 9
VI.2. Población estudiada 10
VI.3. Extracción de ADN 10
VI.4. Detección de polimorfismos 11
VI.4.1 TPMT 12
VI.4.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*2 12
VI.4.1.2 Detección del polimorfismo TMPT*3B 13
VI.4.1.3 Detección del polimorfismo TMPT*3C 13
VI.4.2 ITPA 13
VI.4.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A 13
VI.4.3 MTHFR 14
VI.4.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677C>T 14
VI.4.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298A>C 14
VI.5 Obtención del lisado de glóbulos rojos 15
VI.6 Cuantificación de la actividad de la enzima TPMT 15
VI.7 Correlación entre la actividad enzimática y la
presencia de polimorfismos en la enzima TPMT 16
VI.8 Evaluación de la toxicidad asociada a la terapia con 6-MP 16
vii
VII. RESULTADOS 17
VII.1. Implementación del proyecto 17
VII.2. Cálculo del tamaño muestral 17
VII.3. Detección de polimorfismos 18
VII.3.1 TPMT 18
VII.3.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*3B 20
VII.3.1.2 Detección del polimorfismo TPMT*3C 20
VII.3.1.3 Detección del polimorfismo TPMT*2 21
VII.3.2 ITPA 21
VII.3.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A 22
VII.3.3 MTHFR 23
VII.3.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T 25
VII.3.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C 25
VII.4. Cuantificación de la actividad TPMT 26
VII.5. Correlación entre la actividad enzimática y polimorfismo de TPMT 27
VII.6. Análisis de toxicidad asociada a polimorfismos en el gen TPMT*1 27
VIII. DISCUSIÓN 29
IX. CONCLUSIONES 36
X. BIBLIOGRAFIA 37
XI. ANEXOS 41
XI.1. Consentimiento informado 41
XI.2. Asentimiento informado 44
XI.3. Carta de aprobación comité de ética científico pediátrico
Servicio de Salud Metropolitano Oriente 47
XI.4. Carta de certificación de consentimientos y asentimientos informados 48
XI.5. Carta aprobación comité de ética científico
Hospital Dr. Gustavo Fricke 49
XI.6. Carta solicitud extensión del estudio 50
XI.7. Polimorfismos encontrados para los pacientes incluidos en el estudio 51
viii
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 Representación esquemática del metabolismo de 6-MP 2
Figura 2 Rol de la enzima MTHFR en el metabolismo del ácido fólico 3
Figura 3 Polimorfismos en el gen TPMT*1 6
Figura 4 Detección del polimorfismo TPMT*3B 20
Figura 5 Detección del polimorfismo TPMT*3C 20
Figura 6 Detección del polimorfismo TPMT*2 21
Figura 7 Detección del polimorfismo ITPA 94C>A 22
Figura 8 Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T 25
Figura 9 Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C 25
Figura 10 Asociación entre genotipo y actividad de
la enzima TPMT 27
ix
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1 Partidores utilizados para la detección de los polimorfismos
de los genes TPMT*1, ITPA y MTHFR 11
Tabla 2 Protocolos finales de reacciones de RPC para detección de los
diferentes polimorfismos 12
Tabla 3 Características demográficas de los pacientes estudiados 18
Tabla 4 Frecuencias genotípicas para las variantes del gen TPMT*1 19
Tabla 5 Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1 19
Tabla 6 Frecuencias genotípicas para las variantes del gen ITPA 21
Tabla 7 Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA 22
Tabla 8 Frecuencias genotípicas para las variantes del gen MTHFR 23
Tabla 9 Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR 24
Tabla 10 Combinaciones de frecuencias genotípicas para los
polimorfismos MTHFR 677C>T y 1298A>C 24
Tabla 11 Actividad de la enzima TPMT según genotipo 26
Tabla 12 Grados de toxicidad observado en pacientes con
polimorfismos en el gen TPMT*1 28
Tabla 13 Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1 en una
variedad de grupos étnicos 30
Tabla 14 Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA
en una variedad de grupos étnicos 33
Tabla 15 Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR
en una variedad de grupos étnicos 34
x
I. RESUMEN
Prevalencia de polimorfismos en genes que codifican para enzimas metabolizadoras
de fármacos utilizados en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda
La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es la neoplasia más común en niños. En el
tratamiento de la LLA, la 6-mercaptopurina (6-MP) y el metotrexato (MTX) tienen un rol
fundamental. Sin embargo, una serie de efectos adversos a estos fármacos se han asociado con la
presencia de polimorfismos presentes en genes que codifican para enzimas involucradas en su
metabolización. Algunos polimorfismos en los genes que codifican para las enzimas Tiopuril s-
metiltransferasa (gen TPMT*1) y la enzima Inosina trifosfato pirofosfohidrolasa (gen ITPA), se
han asociado a la presencia de concentraciones plasmáticas tóxicas de 6-MP, aumentando la
probabilidad de desarrollar efectos adversos durante el tratamiento, y por ende, abandono o
suspensión de la terapia. Por otra parte, la presencia de efectos adversos a MTX han sido
asociados a polimorfismos en el gen que codifica para la enzima Metil tetrahidro folato
reductasa (gen MTHFR).
El conocimiento de la prevalencia de estos polimorfismos y su rol en el tratamiento de la
LLA ha permitido el desarrollo de una farmacogenética efectiva mejorando significativamente el
tratamiento de esta neoplasia en países desarrollados. De acuerdo a esto, y tomando en
consideración que en Chile no existen estudios respecto a este tema, este trabajo plantea
establecer la prevalencia de los polimorfismos más comunes para los genes TPMT*1, ITPA y
MTHFR en niños chilenos con LLA.
El análisis de 103 pacientes con LLA atendidos en los Hospitales Dr. Luis Calvo Mackenna y
Dr. Gustavo Fricke, muestran que las frecuencias alélicas para los polimorfismos estudiados para
los genes TPMT*1, ITPA, MTHFR 677C>T y MTHFR 1298A>C son 4%, 1%, 48% y 29%,
respectivamente. Además, se encontró una correlación entre la presencia de polimorfismos en el
gen TPTM*1 y la actividad de la enzima TPMT. Los resultados obtenidos corresponden al
primer paso para el desarrollo de una farmacogenética efectiva para el tratamiento de la LLA en
nuestro país.
xi
II. ABSTRACT
Prevalence of polymorphism in genes encoding drugs metabolizing enzymes in
chilean children with acute limphoblastic leukemia
Acute limphoblastic leukemia (ALL) is to the most common cancer in children. 6-
mercaptopurine (6-MP) and Methotrexate (MTX) are key drugs for ALL treatment. During
treatment however, several adverse effects have been associated to toxic plasma concentration of
these drugs. These adverse reactions are related to single nucleotide polymorphisms in genes that
code for enzymes involved in 6-MP and MTX metabolism. Polymorphisms in genes coding for
metabolizing enzymes Thiopurine S-methyltransferase (TPMT*1 gene) and Inosine triphosphate
pyrophosphatase (ITPA gene) are associated with toxic plasma concentrations of 6-MP,
increasing the risk to develop adverse reactions during treatment, and leading to suspend
therapy. On the other hand, adverse reactions to MTX have been linked to the gene encoding
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR gene).
The knowledge of the prevalence of these polymorphisms and their involvement in ALL
treatment has allowed the development of effective farmacogenetics resulting in a better
treatment of this cancer in industrialized countries. Considering the above and the lack of this
type of study in Chile, we sought to determine the prevalence of the most common
polymorphisms in TPMT*1, ITPA and MTHFR genes in Chilean children with ALL.
The analysis of 103 patient with diagnosed ALL from the Dr. Luis Calvo Mackenna and
Dr. Gustavo Fricke hospitals showed that the allelic frequency for polymorphisms in TPMT*1,
ITPA and MTHFR 677C>T and MTHFR 1298A>C genes were 4%, 1%, 48% and 29%,
respectively. We also found a correlation between the presence of the polymorphism in the
TPMT*1 gene and TPMT enzyme activity. The results obtained in this study correspond to the
first step for the development of an effective pharmacogenetic protocol for ALL treatment in
Chile.
1
III. INTRODUCCION
Leucemia Linfoblástica Aguda y su tratamiento
La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es la neoplasia más común en niños en el mundo
(Wall y Rubnitz 2003). En nuestro país esta tendencia es similar, presentándose
aproximadamente 120 nuevos casos por año (Protocolo PINDA. 2005). La génesis de esta
enfermedad no es clara involucrándose tanto factores genéticos como ambientales. En los
pacientes con LLA se observa una inhibición de la hematopoyesis por las células leucémicas
provocando una infiltración de éstas en diversos tejidos, lo que se manifiesta en una disminución
de glóbulos rojos, plaquetas y granulocitos causando un cuadro de anemia, trombocitopenia y
granulocitopenia (Silva y cols. 2008). En Chile, el tratamiento de la LLA se encuentra
protocolarizado por el Programa Infantil de Drogas Antineoplásicas (PINDA) de manera
armonizada para todos los centros de salud pediátricos estatales (Protocolo PINDA. 2006). El
éxito del tratamiento antileucémico, que tiene una duración promedio de 2 a 3 años, se basa en
una terapia combinada de fármacos quimioterápicos (Schrappe y cols. 2000). Específicamente,
este tratamiento se divide en diferentes etapas: inducción a la remisión, consolidación o
intensificación y terapia de mantenimiento o continuación (Pui y Evans 2006). De los fármacos
quimioterápicos incluidos en la terapia contra LLA, la 6-Mercaptopurina (6-MP) cumple un rol
esencial durante todas las etapas de tratamiento (Campbell y cols. 1999) al igual que el
metotrexato (MTX). Hoy en día aproximadamente un 80 % de los niños con LLA se recuperan,
asociándose el fracaso de la terapia principalmente a los efectos tóxicos de 6-MP y MTX, lo que
lleva a interrumpir o descontinuar la terapia antileucémica (Stocco y cols. 2009a).
Toxicidad asociada al tratamiento con 6-MP
La 6-MP corresponde a un análogo de purina que en el citoplasma celular es convertida en
tioinosina monofosfato por la enzima Hipoxantin Fosforribosil Transferasa (HPRT).
Posteriormente, la tioinosina monofosfato se convierte en tioguanosina monofosfato a través de
dos reacciones que involucran la acción de las enzimas Inosina Monofosfato Deshidrogenada
(IMDPH) y Guanosina Monofosfato Sintetasa (GMPS). Este proceso es competitivo por la
acción de la TioPurina-s-MetilTransfersa (TPMT), que mediante un proceso de metilación de la
2
6-MP que genera el metabolito inactivo 6-metil-mercaptopurina. La enzima TPMT participa
también en la metabolización de los monofosfatos de Tioinosina a Metil-Tioinosina-
Monofosfatos, molécula que inhibe la síntesis de novo de purinas (Stocco y cols. 2009a). Otra de
las enzimas claves en el metabolismo de la 6-MP es la enzima ITPA (Inosina Trifosfato
Pirofosfohidrolasa), cuya función radica fundamentalmente en prevenir la acumulación de
inosina trifosfatos (6-tio-ITP). La figura 1 representa esquemáticamente el metabolismo de la 6-
MP y las enzimas involucradas.
Figura 1: Representación esquemática del metabolismo de 6-MP (Adaptado de Stocco y cols. 2009a).
A pesar de los buenos resultados obtenidos en el tratamiento de LLA con 6-MP, se han
descrito diversos efectos adversos asociados a este fármaco. Los más comunes son las toxicidad
hematológica y hepática que se expresa como trombocitopenia, granulocitopenia y anemia.
Además, se presentan efectos gastrointestinales como anorexia, náuseas, vómitos, estomatitis,
diarrea, ictericia, entre otros (Evans y cols. 2001). Estos efectos adversos se han asociado a la
presencia de niveles tóxicos de metabolitos de 6-MP circulantes, específicamente nucleótidos de
tioguanina (TGN), responsables del efecto citotóxico del fármaco (Relling y cols. 1999a). Estos
niveles tóxicos de TGN se relacionan directamente con la actividad de la enzima TPMT, su
principal vía metabólica de eliminación. Por otra parte, la actividad de la enzima TPMT presenta
Metilmercaptopurina Metil-tio-IMP Metil-tio-GMP
Metil-tio-ITP
Tio-ITP
Mercaptopurina
TPMT TPMT TPMT
Tio-GMP (TGN) GMPS IMPDH HPRT
ITPA Tio-IDP
TPMT
Tio-GDP (TGN)
Tio-GTP (TGN)
3
una gran variación interindividual, pudiéndose diferenciar individuos con actividad baja o
indetectable, intermedia o normal (Krynetski y cols. 1995), los cuales al ser tratados con dosis
estándares de 6-MP presentan una mayor concentración de TGN y por lo tanto, aparición de
efectos adversos asociados a concentraciones tóxicas de 6-MP (Relling y cols. 1999b). En los
últimos años se han asociado otros efectos adversos al tratamiento con 6-MP como rash cutáneo,
pancreatitis, neutropenia febril, entre otros (Marinaki y cols. 2004), los cuales han sido asociados
a una disminución de la actividad enzimática de la ITPA provocando una acumulación inusual
de 6-tio-ITP, que serían responsable de los efectos adversos descritos anteriormente.
Toxicidad asociada al tratamiento con MTX
Se han descrito una serie de efectos adversos a la administración de MTX, especialmente en
la etapa de mantención tales como hepatotoxicidad y leucopenia. Estos efectos adversos, se han
asociado a una disminución en la actividad de las enzimas involucrados en su metabolización,
principalmente la enzima Metil TetraHidro Folato Reductasa (MTHFR), encargada de catalizar
la reducción de 5,10-metiltetrahidro folato a 5-metiltetrahidro folato (Figura 3), que es la
principal forma de folato circulante utilizada en la generación de los metabolitos necesarios para
la transformación de homocisteína a metionina (Ongaro y cols. 2009).
Figura 2: Rol de la enzima MTHFR en el metabolismo del ácido fólico (Adaptado de Skibola y cols.
1999).
Metilación DNA S-adenosilmetionina
S-adenosil homocisteina
Homocisteina
Metionina
5 metil THF
THF 5, 10 metilen THF
MTHFR
B12
DHF Acido fólico
Purinas
10 formil THF
Síntesis DNA dTMP dUMP Timidilato sintetasa
4
Farmacogenética como herramienta en el tratamiento de la LLA
La alteración en la funcionalidad de enzimas metabolizadoras o transportadoras de fármacos
influye directamente en la eficacia y toxicidad de un fármaco en particular. Estas enzimas
metabolizadoras al presentar variaciones genéticas o polimorfismos pueden cambian su
funcionalidad, lo que puede llevar a una disminución en la actividad enzimática, o una
disminución en la eficacia de medicamentos que requieren ser metabolizados para ser activos
(Tello 2006). El estudio de estas variantes genéticas ha permitido modificar y optimizar terapias
farmacológicas de acuerdo a polimorfismos presentes en cada individuo (Columbres 2008). En
este sentido, la farmacogenética ha abierto un nuevo horizonte en el tratamiento del cáncer, ya
que busca identificar la respuesta farmacológica individualizada (farmacocinética y
farmacodinamia) según su genotipo previo a la administración de un fármaco, reduciendo los
efectos tóxicos y optimizando la eficacia de la terapia, lo que finalmente se traduce en un
incremento en el índice de sobrevida total con un mayor número de pacientes que logran la
remisión completa de la enfermedad (Cheok y Evans 2006).
Polimorfismos en la enzima TPMT
Uno de los factores más importantes que influyen en la concentración plasmática de 6-MP es
la actividad de la enzima TPMT, encontrándose que pacientes con baja o nula actividad en esta
enzima se asocian a un aumento en la concentración de TGN, y por ende, efectos adversos
asociados a 6-MP. Estudios posteriores, permitieron relacionar la baja actividad TPMT a
polimorfismos en el gen que codifica para esta enzima, el gen TPMT*1 (Relling y cols. 1999a).
Actualmente, la actividad de la enzima TPMT es considerada como altamente variable y
polimórfica en todos los estudios realizados hasta la fecha, observándose que cerca del 90 % de
los individuos tienen una actividad normal, el 10% actividad intermedia y el 0,3% baja o
indetectable, lo cuál está directamente relacionado con la presencia de polimorfismos en el gen
TPMT*1 (Relling y cols. 1999a). Estudios previos indican que pacientes homocigóticos para
variantes alélicas mutadas toleran la dosis completa del fármaco sólo hasta el 7% de las semanas
previstas en el tratamiento, debiéndose disminuir la dosis de 6-MP en un 76% de los casos para
evitar toxicidad. Por otra parte, los pacientes heterocigotos toleran la dosis en un 65% de las
semanas previstas y la dosis de 6-MP se debe disminuir en un 16% de ellos para evitar toxicidad
5
(McLeod y cols. 2000; Relling y cols. 1999). Estos antecedentes apoyan fuertemente el cambio
en la dosificación de 6-MP de acuerdo a la presencia de variantes del gen TPMT*1. Tomando en
consideración polimorfismos en el gen TPMT*1, los cambios en las dosis de 6-MP permiten
disminuir tres veces la toxicidad causada por TGN, igualando los resultados obtenidos en
pacientes con una actividad normal de la enzima TPMT tratados con dosis convencionales de 6-
MP (Stocco y cols. 2009a).
El gen TPMT*1 se encuentra en un fragmento de 25 Kb ubicado en el cromosoma 6p22.3 y
está constituido por 10 exones y 9 intrones. Hasta la fecha, de los 25 polimorfismos asociados al
gen TPMT*1, cuatro variantes (TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B y TPMT*3C) se han descrito
como las más frecuentes, abarcando alrededor de un 95% de las mutaciones encontradas en el
gen TPMT*1 en poblaciones caucásicas, asiáticas y afroamericanas (Evans y cols. 2001; Yates y
cols. 1997).
El polimorfismo TPMT*2 contiene una sola mutación en el codón 80 del exón 5 (G238C)
que lleva a una sustitución de alanina por prolina causando una reducción de 100 veces de la
actividad enzimática respecto al alelo silvestre (Krynetski y cols. 1995). La variante TPMT*3B
contiene una mutación en el codón 154 del exón 7 (G460A), a diferencia de la variante
TPMT*3C que contiene una mutación en el codón 240 del exón 10 (A719G). El polimorfismo
TPMT*3A, por su parte, contiene las mutaciones del exón 7 (G460A) y del exón 10 (A719G)
(Yates y cols. 1997).
La presencia de estos 4 alelos es predictiva del fenotipo, ya que el modo de herencia es co-
dominante, es decir, los pacientes heterocigóticos que tengan un alelo silvestre y una de estas
variantes alélicas, presentan una actividad intermedia de la enzima TPMT; mientras que los
homocigóticos que heredan dos de los alelos mutados presentan una actividad nula en esta
enzima (Rajapakse y cols. 2000). La figura 2 representa esquemáticamente los polimorfismos
más comunes en el gen TPMT*1 y su efecto en la actividad de la enzima que codifica.
6
Figura 3: Polimorfismos en el gen TPMT*1. A. Esquema del gen TPMT*1 y los principales
polimorfismos descritos para este gen (TPMT*2, TPMT*3A, TPMT 3C) B. Distribución poblacional de los
genotipos silvestre y mutados para el gen TPMT*1 y su relación con la actividad enzimática (Adaptado de
Cheok y Evans 2006).
Polimorfismos en la enzima ITPA
El gen que codifica para la enzima ITPA se encuentra localizado en el cromosoma 20p.
Hasta la fecha cinco polimorfismos han sido descritos para este gen. De ellos, el polimorfismo
94 C>A que se traduce en un cambio de prolina a treonina, es el que tiene mayor relevancia
clínica, ya que afecta directamente la actividad enzimática presentando una disminución de
actividad de 30 % en heterocigotos y una anulación total de la actividad para la variante
homocigoto (Sahasranaman y cols. 2008; Kurzawski y cols. 2009).
Polimorfismos en la enzima MTHFR
El gen de la enzima MTHFR está localizado en el cromosoma 1p36.3 y está formado por 11
exones y 10 intrones (Goyette y cols. 1994). De los polimorfismos descritos para esta enzima,
dos de ellos han sido descritos como los más frecuentes, el polimorfismo MTHFR 677C>T y el
MTHFR 1298A>C. El polimorfismo MTHFR 677C>T contiene una mutación que provoca una
sustitución de alanina por valina, en tanto el polimorfismo MTHFR 1298A>C resulta en un
A B
Silvestre (wt)
Variante (v)
Variante (v)
Variante (v)
G238C Ala>Prol
G460A Ala>Tir
A719C Tir>Cis
A719C
Tir>Cis
Actividad TPMT/mL GR
Pobla
ció
n (
%)
7
cambio de glutamato por alanina. Ambos polimorfismos producen una disminución de su
actividad y por ende, un aumento de las concentraciones plasmáticas de MTX en pacientes que
lo presentan, asociándose a concentraciones tóxicas de MTX en pacientes con LLA (Ongaro y
cols. 2009).
Relación de los polimorfismos en las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR con el
tratamiento de la LLA
Tomando en cuenta los antecedentes descritos que indican la importancia de los
polimorfismos en el gen TPMT*1, ITPA y MTHFR en relación al desarrollo de efectos adversos
en pacientes con LLA bajo tratamiento con 6-MP y MTX, y considerando que en Chile no
existen estudios respecto al tema, en este trabajo se propone determinar la prevalencia de los
polimorfismos más frecuentes en los genes TPMT*1, ITPA y MTHFR en pacientes pediátricos
con LLA que se encuentran en tratamiento con 6-MP y MTX. Para el caso de los polimorfismos
en el gen TPMT*1 se propone establecer una relación entre los polimorfismos identificados con
la actividad de la enzima TPMT en los pacientes que los presenten, de modo de asociar ambas
variables.
Los resultados obtenidos en este estudio constituyen el primer paso para desarrollar y aplicar
en el futuro una farmacogenética efectiva para el tratamiento de pacientes con LLA, generando
una plataforma de manejo terapéutico con un enfoque más individualizado para los pacientes
con LLA.
8
IV. HIPOTESIS
Los pacientes con LLA chilenos presentan polimorfismos en los genes que codifican
para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR. Para el caso del polimorfismo en el gen
TPMT*1, este polimorfismo se asocia a una disminución de la actividad enzimática y a
un aumento de los efectos adversos relacionados con concentraciones tóxicas de 6-MP.
V. OBJETIVOS
V.1. Objetivos Generales
1. Determinar la prevalencia de los polimorfismos más comunes en los genes que codifican
para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR en pacientes con LLA chilenos.
2. Correlacionar la actividad de la enzima TPMT con polimorfismos en el gen TPMT*1.
V.2. Objetivos Específicos
1. Identificar los polimorfismos más prevalentes en los genes que codifican para las enzimas
TPMT, ITPA y MTHFR.
2. Cuantificar la actividad de la enzima TPMT en niños con LLA.
3. Correlacionar la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1 con la actividad de la
enzima TPMT y la presencia de efectos adversos presentes durante la terapia con 6-MP.
9
VI. MATERIALES Y METODOS
VI.1 Reactivos
De Roche Applied Science, Mannheim, Alemania, se obtuvo: kit de extracción de ácidos
nucleicos High pure viral nucleid acid kit.
De New England Bio Labs, Ipswich, E.E.U.U., se obtuvieron: enzimas de restricción NspI,
HindI, MboII, NspI, MwoI y AccI.
De Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, E.E.U.U se obtuvieron: los partidores de
RPC: P2C, P2W, P2M, P460F, P460R, P719F, P719R, P32T F, P32T R, M677 F, M677 R,
M1298 F y M1298 R.
De Promega corporation, Madison, E.E.U.U, se obtuvieron: la enzima Taq polimerasa, solución
de MgCl2 y solución buffer.
De Invitrogen by life technologies, Carlsbad, E.E.U.U, se obtuvieron: la agarosa y set dNTPs
100mM.
De Merck KGaA, Darmstadt, Alemania se obtuvieron: el buffer TAE 50X y etanol absoluto.
De Fermentas life sciences, Burlington, Canadá, se obtuvo: el marcador de peso molecular de
100 bp.
10
Objetivo específico 1: Identificar los polimorfismos más prevalentes en los genes que
codifican para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR.
Para el cumplimiento de este objetivo se reclutaron niños con LLA en tratamiento bajo
protocolo PINDA. Para la detección de los polimorfismos genéticos se utilizó la técnica de
reacción de la polimerasa en cadena (RPC) y posterior digestión enzimática de los fragmentos
amplificados. Como templado, se utilizó ADN obtenido de las muestras sanguíneas.
VI.2. Población estudiada
Durante los meses de junio del año 2009 hasta febrero del año 2010 se reclutó a la población
en estudio, la cual incluyó a pacientes pediátricos con LLA diagnosticada que se encontraban en
cualquiera de las fases de tratamiento quimioterapéutico bajo protocolo PINDA, tratados en los
Hospitales Dr. Luis Calvo Mackenna (HLCM) y Dr. Gustavo Fricke. Para el ingreso al estudio el
padre o tutor del paciente firmó un consentimiento y asentimiento informado (Anexos 1 y 2), el
cual fue aprobado por el comité de ética científico pediátrico del Servicio de Salud
Metropolitano Oriente (Anexo 3) y el comité de ética científico del Hospital Dr. Gustavo Fricke
(Anexo 5). Para la inclusión de los otros polimorfismos estudiados no considerados en el
proyecto original se solicitó la autorización al comité de ética científico pediátrico del Servicio
de Salud Metropolitano Oriente (Anexo 6).
VI.3. Extracción de ADN
A cada paciente se le extrajo una muestra de 3 mL de sangre periférica, recolectada en tubos
heparinizados y almacenadas a 4ºC. La extracción de ADN se realizó utilizando 0,2 mL de
sangre con el sistema comercial High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche), de acuerdo a
instrucciones entregadas por el proveedor. El ADN extraído se resuspendió en 100 L de agua
grado biología molecular y se almacenó a -20ºC para su posterior análisis. No se observaron
diferencias en el rendimiento de la extracción utilizando sangre recolectada en tubos
heparinizados con respecto a la obtenida en tubos con EDTA.
11
VI.4. Detección de polimorfismos
La presencia de los polimorfismos estudiados se determinaron mediante técnicas basadas en
la RPC, utilizando los partidores detallados en la tabla 1. Los protocolos de amplificación por
RPC se estandarizaron de acuerdo a las condiciones físicas del laboratorio. Las condiciones
finales de reacción de la RPC se detallan en la tabla 2.
Tabla 1: Partidores utilizados para la detección de los polimorfismos de los genes TPMT*1, ITPA y
MTHFR.
PARTIDOR SECUENCIA REFERENCIA
P2C (5’- TAAATAGGAACCATCGGACAC -3’) Yates y cols. 1997
P2W (5’- GTATGATTTTAT GCAGGTTTG-3’). Yates y cols. 1997
P2M (5’- GTATGATTTTATGCAGGTTTC-3’) Yates y cols. 1997
P460F (5’-ATAACAGAGTGGGGAGGCTGC-3’) Yates y cols. 1997
P460R (5’-CTAGAACCCAGAAAAAGTATAG-3’) Yates y cols. 1997
P719F (5’- CAGGCTTTAGCATAATTTTCAATTCCTC-3’) Yates y cols. 1997
P719R (5’- TGTTGGGATTACAGGTGTGAGCCAC -3’) Yates y cols. 1997
P32T F (5’- CGTGCTCACATGGAGAATCA-3’) Cao y Hegele 2002
P32T R (5’- CCTGGAAGCTACCTGGACAA -3’), Cao y Hegele 2002
M677 F (5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’) Skibola y cols. 1999
M677 R (5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’) Skibola y cols. 1999
M1298 F (5’-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3’) Skibola y cols. 1999
M1298 R (5’-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3’) Skibola y cols. 1999
12
Tabla 2: Protocolos finales de RPC para la detección de todos los polimorfismos ensayados en este
trabajo.
TPMT*2 TPMT*3A TPMT*3B TPMT*3C ITPA 94C>A MTHFR
677C>T
MTHFR
1298 A>C
Extracto
ADN 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L 5 L 5 L
MgCl2 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM
dNTP 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM
Partidor 1 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM
Partidor 2 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM 1 uM
Taq
polimerasa
(Promega®)
1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U
Volumen
final 30 L 30 L 30 L 30 L 30 L 30 L 30 L
VI.4.1 TPMT
Para determinar la presencia de los polimorfismos más prevalentes en el gen TPMT*1, se
utilizó la técnica descrita por Yates y cols. (1997). Las condiciones finales de amplificación por
RPC, posteriores a la estandarización se encuentran descritos en la tabla 2. Como controles
positivos, se utilizó extracto de ADN de líneas celulares que presentan estas mutaciones,
gentilmente donadas por la Dra. Kristine Crews, co-director of the Phamacokinetics Shared
Resource, Pharmaceutical Sciences, St. Jude Children Research Hospital (SJCRH), Memphis,
TN, E.E.U.U. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador ABI 2720 (Applied
Biosystems) utilizando un programa de desnaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de 40
ciclos a 94°C durante 40 segundos, 55°C durante 40 segundos y 72°C durante 60 segundos, con
una extensión final de 10 minutos a 72°C. Los productos amplificados por RPC y posteriores
digestiones enzimáticas, se resolvieron en geles de agarosa al 2 %, teñidos con bromuro de etidio
y visualizados a luz ultravioleta.
VI.4.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*2 (rs 1800462): Para la reacción de RPC se
utilizaron los partidores específicos para la detección del alelo silvestre y el mutado. El partidor
P2C se incluyó en la reacción de RPC con el partidor P2W (Tabla 1). La amplificación de un
13
fragmento de 256 pb con estos partidores indicó la presencia de alelo silvestre. Por otra parte, la
amplificación con los partidores P2C y P2M (Tabla 1) indicó la presencia del alelo mutado. La
obtención de ambos productos indicó la presencia de genotipo heterocigoto.
VI.4.1.2 Detección del polimorfismo TMPT*3B (rs 1800460): Utilizando los partidores P460F
y P460R (Tabla 1) se amplificó un fragmento de 365 pb. Se utilizaron 15 L de reacción de RPC
como templado para la digestión enzimática con 1,25 U de la enzima de restricción MwoI. La
reacción se incubó durante 2 horas a 60° C. La obtención de bandas de 267 pb y 98 pb indicó la
ausencia de este polimorfismo. La presencia de las bandas de 365 pb, 267 pb y 98 pb indicó la
presencia de un alelo silvestre y otra mutado. La detección de una banda de 365 pb indicó que
ambos alelos presentan esta mutación.
VI.4.1.3 Detección del polimorfismo TMPT*3C (rs 1142345): Utilizando los partidores P719F
y P719R (Tabla 1) se obtuvo un producto de 293 pb. Se utilizaron 15 L de reacción de RPC
como templado para la digestión enzimática con 2,5 U de la enzima de restricción AccI. La
reacción se incubó durante 2 horas a 37° C. La obtención de una banda de 293 pb indicó la
ausencia de este polimorfismo. La obtención de las bandas de 293 pb, 207 pb y 86 pb indicó la
presencia de un alelo silvestre y otro mutado. La obtención de bandas de 207 pb y 86 pb indicó
que ambos alelos presentan esta mutación.
VI.4.2. ITPA
La reacción de amplificación se realizó en un termociclador ABI 2720 (Applied Biosystems)
utilizando un programa de desnaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de una
desnaturación de 40 ciclos a 94°C 40 segundos, 55°C 40 segundos y 72°C 60 segundos, con una
extensión final de 10 minutos a 72°C. Los productos amplificados por RPC y digestiones
enzimáticas, se resolvieron en geles de agarosa al 2 %, teñidos con bromuro de etidio y
visualizados con luz ultravioleta.
VI.4.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A (rs 41320251): Se determinó mediante
RPC y digestión enzimática de los fragmentos amplificados, adaptando los protocolos
descritos previamente (Cao y Hegele 2002). Utilizando los partidores P32T R y P32T F (Tabla
14
1) se obtuvo un amplicón de 256 pb. Para la detección de la variante genética presente, el
amplicón obtenido se digirió con 1 U de la enzima de restricción NspI. La reacción se incubó 2
horas a 37° C. La presencia de dos bandas de 228 pb y 28 pb es indicativa de presencia de
mutación, en el caso de ausencia de mutación se observa una banda de 256 pb.
VI.4.3 MTHFR
Para determinar la presencia de los polimorfismos en el gen que codifica para la enzima
MTHFR, se utilizó la técnica descrita por Skibola y cols. (1999). Este protocolo se estandarizó
llegando al descrito en la tabla 2.
La reacción de amplificación se realizó en un termociclador ABI 2720 (Applied Biosystems)
utilizando un programa de desnaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de 40 ciclos con
una desnaturación a 94°C 40 segundos, 59°C 40 segundos y 72°C 60 segundos, con una
extensión final de 10 minutos a 72°C. Los productos amplificados por RPC y posteriores
digestiones enzimáticas, se resolvieron en geles de agarosa al 2 % teñidos con bromuro de etidio
y visualizados con luz ultravioleta.
VI.4.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677C>T (rs 1801133): Utilizando los partidores
M677 R y M677 F (Tabla 1) se obtuvo un amplicón de 198 bp, el cual se digirió con 10 U de la
enzima de restricción HinfI. La mezcla reacción se incubó 2 horas a 37° C. En el caso existir
mutación se observaron dos bandas a 175 pb y 23 pb; en el caso de ausencia de mutación no se
observó digestión del amplicón.
VI.4.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298A>C (rs 1801131): Utilizando los
partidores M1298 R y M1298 F (Tabla 1) se obtuvo un amplicón de 163 bp. Para la detección de
la variante genética, el amplicón obtenido se digirió con 2,5 U de enzima de restricción MboII.
La reacción se incubó 2 horas a 37° C. Para el genotipo silvestre (1298 AA) se observaron cinco
fragmentos de 56 bp, 31 bp, 30 bp, 28 bp y 18 bp, para el heterocigoto (1298 AC) se observaron
seis fragmentos de 84 bp, 56 bp, 31 bp, 30 bp, 28 bp y 18 bp, y para el genotipo homocigoto
mutante (1298 CC) se observaron cuatro bandas de 84 bp, 31 bp, 30 bp y 18 bp. La presencia o
ausencia de los fragmentos de 84 bp y 56 pb son los determinantes para la definición de la
existencia de este polimorfismo.
15
Objetivo 2: Cuantificar la actividad de la enzima TPMT en niños con LLA.
Para el cumplimiento de este objetivo se determinó la actividad de la enzima TPMT en un
subgrupo de pacientes que presentaban o no polimorfismos en el gen TPMT*1. Este objetivo
se realizó en dos etapas: la obtención de los lisados de glóbulos rojos en el HLCM y la
cuantificación de la actividad en el SJCRH.
VI.5 Obtención del lisado de glóbulos rojos.
Para determinar la actividad de la enzima TPMT, se prepararon lisados de glóbulos rojos de
acuerdo a protocolos previamente descritos (McLeod y cols. 1995). Brevemente, la muestra de
sangre recolectada en tubos heparinizados se centrifugó y el precipitado de glóbulos rojos se
lavó dos veces con solución de NaCl 0,9%. Posteriormente se realizó el conteo de glóbulos rojos
y determinación del hematocrito utilizando un contador hematológico automatizado Coulter
Maxm (Beckman Coulter), para luego resuspender los glóbulos rojos en agua destilada y
producir su lisis. Finalmente, la muestra se centrifugó a 13.000 r.p.m. (Sorvall legend RT) y el
sobrenadante obtenido se almacenó a -80°C para determinar la actividad de la enzima TPMT.
VI.6 Cuantificación de la actividad de la enzima TPMT.
La cuantificación de actividad de TPMT se realizó siguiendo la técnica descrita previamente
(McLeod y cols. 1995) utilizando un ensayo radioquímico. El ensayo se basa en la conversión de
6 MP a Me-MP marcado radiactivamente con S-Me-14
C-adenosil-L-metionina como dador del
grupo metilo. Una unidad de actividad enzimática representa la formación de 1 nmol de Me-MP
por hora de incubación. La actividad de TPMT se normalizó por mL de eritrocitos.
La determinación de la actividad TPMT se realizó a través de una colaboración establecida
con la Dra. Mary Relling, Pharmaceutical Sciences, SJCRH, Memphis, TN, E.E.U.U.
Objetivo específico 3: Correlacionar la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1
con la actividad de la enzima TPMT y la presencia de efectos adversos presentes durante la
terapia con 6-MP.
16
Para el cumplimiento de este objetivo se correlacionó la actividad de la enzima TPMT de
los pacientes con el polimorfismo en el gen TPMT*1 y se comparó con el grupo control que
no presentaban los polimorfismos estudiados. Además, se evaluó la toxicidad hematológica y
hepática asociada a la terapia con 6-MP en un subgrupo de pacientes que presentaba
polimorfismos en el gen TPMT*1.
VI.7 Correlación entre la actividad enzimática y la presencia de polimorfismos en
la enzima TPMT
Por tratarse de un grupo de estudio pequeño que no sigue una distribución normal, se
debió analizar los datos con una prueba no paramétrica. Para ello, se utilizó el test de
Wilcoxon para dos grupos de comparación. Como control, se utilizó la actividad de la enzima
TPMT encontrada en pacientes que no presentaban polimorfismos en el gen TPMT*1. Se
consideró como estadísticamente significativo un valor p≤0.05 con un intervalo de confianza
del 95 %. Para el análisis estadístico se utilizó el programa computacional Graph Prism
versión 3.0.
VI.8 Evaluación de la toxicidad asociada a la terapia con 6-MP
Se identificaron los efectos adversos presentes durante la terapia asociados a toxicidad
mediada por 6-MP, específicamente en el período de inducción, en dos subgrupos de pacientes
que presentaban o no polimorfismos en el gen TPMT*1. Mediante la revisión de las fichas
clínicas, se evaluó la presencia de toxicidad hematológica y toxicidad hepática. De acuerdo a
guías de la “National Cancer Institute common terminology criteria for adverse events v3.0”, se
estratificó la toxicidad en grados de 0 a 4 (http://ctep.cancer.gov). Como indicadores de
toxicidad hematológica se utilizaron los recuentos de leucocitos, absoluto de neutrófilos (RAN)
y de plaquetas. Para la evaluación de la toxicidad hepática se utilizaron los niveles sanguíneos de
alanina amino transferasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST). Para el análisis, se utilizó el
mayor grado de toxicidad observado en el periodo de inducción, tomando en cuenta estudios
previos (Ongaro y cols. 2009).
17
VII. RESULTADOS
VII.1. Implementación del proyecto
Para lograr implementar este trabajo se estableció una coordinación entre los diferentes
servicios del HLCM, principalmente los servicios Farmacia Clínica, Laboratorio, Oncología e
Infectología. Para su ejecución, se realizó un trabajo coordinado con las enfermeras de los
servicios para el reclutamiento de pacientes y la obtención de las muestras. Esto llevó a la
formación de un equipo de trabajo efectivo para el cumplimiento de los objetivos planteados.
Este proyecto se presentó a la Fundación Nuestros Hijos, obteniendo el financiamiento para la
compra de reactivos, equipos y personal técnico involucrado en el desarrollo de este proyecto. A
nivel internacional también se entablaron lazos de colaboración, específicamente con el SJCRH,
centro de referencia mundial en el tratamiento de cáncer en niños. Con el fin de poder tener una
muestra de lo que ocurre a nivel país se estableció una alianza colaborativa con el Servicio de
Oncología del Hospital Dr. Gustavo Fricke, centro de derivación pediátrica oncológica de niños
(PINDA) que atiende a un gran porcentaje de niños con LLA de la V región.
VII.2. Cálculo del tamaño muestral
Con el objetivo de determinar el número de pacientes a enrolar en este estudio, se realizó el
cálculo del tamaño muestral, de modo de que los resultados obtenidos (polimorfismos del gen
TPMT*1) tuvieran una significancia estadística para la población en estudio. Considerando como
referencia una población total en tratamiento para LLA (en cualquiera de sus fases) de 300
pacientes, con una prevalencia estimada de 10 % para la variante heterocigota y error de 5%, el
tamaño muestral requerido es de 95 pacientes.
Durante el tiempo de duración del presente trabajo se analizaron los resultados de 103
pacientes diagnosticados con LLA que se encuentran en cualquiera de las etapas de tratamiento
quimioterapéutico (inducción, consolidación o mantención). De cada paciente se obtuvo una
muestra de sangre (ver materiales y métodos), previa firma del consentimiento y asentimiento
18
informado (ver anexo). En la tabla 3 se describen las características demográficas de los
pacientes incluidos en este estudio.
Tabla 3: Características demográficas de los pacientes estudiados.
CARACTERISTICA VALOR
Edad (años) 8,7 ± 4,8 (6 meses-23 años)
Sexo
Femenino 42 (41%)
Masculino 61 (59 %)
Valores representados como media ± DS y los números en %
VII.3. Detección de polimorfismos
VII.3.1 TPMT
El ADN extraído de las muestras de sangre según la metodología descrita, se utilizó para la
identificación de los polimorfismos del gen TPMT*1: TPMT*2, TMPT*3A, TPMT*3B,
TPMT*3C. Se encontró que la frecuencia para los polimorfismos en el gen TPMT*1
correspondió al 8 % (8/103). Específicamente, la frecuencia de los genotipos en condición
heterocigota para TPMT*3A correspondió a un 7% (7/103) y TPMT*3C un 1% (1/103). No se
encontró la variante TPMT*2 y TPMT*3B como tampoco variantes polimórficas en condición
homocigoto. La frecuencia genotípica y alélicas de los diferentes polimorfismos encontrados se
describe en las tablas 4 y 5, respectivamente. Las figuras 4 y 5 muestran los análisis de RPC y
digestión enzimática utilizados para determinar los polimorfismos descritos.
19
Tabla 4: Frecuencias genotípicas para las variantes del gen TPMT*1
GENOTIPO NÚMERO PACIENTES
(n=103) FRECUENCIA (%)
TPMT*1 / TPMT*1 95 92 %
TPMT*1 / TPMT*2 0 0 %
TPMT*1 / TPMT*3A 7 7 %
TPMT*1 / TPMT*3B 0 0 %
TPMT*1 / TPMT*3C 1 1 %
Tabla 5: Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1
ALELO NÚMERO DE ALELOS
(n=206) FRECUENCIA (%)
TPMT*1 198 96 %
TPMT*2 0 0 %
TPMT*3A 7 3 %
TPMT*3B 0 0 %
TPMT*3C 1 1 %
20
VII.3.1.1 Detección del polimorfismo TPMT*3B
Figura 4: Detección del polimorfismo TPMT*3B. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P460F y P460R.
Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los
carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CP, control positivo. CN, control negativo. B. Producto de la digestión enzimática del producto de RPC utilizando la enzima MwoI para el reconocimiento del polimorfismo
TPMT*3B. La presencia de la variante heterocigoto (w/m) para el polimorfismo es identificada por la presencia de dos bandas (365
pb y 265 pb). Los productos de digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes que presentan (paciente 1, 2 y 3) y no presentan
(paciente 4 y 5) el polimorfismo TPMT*3B. CP, control positivo.
VII.3.1.2 Detección del polimorfismo TPMT*3C
Figura 5: Detección del polimorfismo TPMT*3C. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P719F y P719R. Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los
carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CP, control positivo. CN, control negativo. B. Producto de la
digestión enzimática del producto de RPC utilizando la enzima AccI para el reconocimiento del polimorfismo TPMT*3C. La presencia de la variante heterocigoto (w/m) para el polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (293 pb, 207 pb y 86
pb).Los productos de digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. M, marcador de peso
molecular 100 pb. Los carriles 1 al 5 corresponden a muestras de pacientes que presentan (paciente 1, 2 y 3) y no presentan (paciente 4 y 5) el polimorfismo TPMT*3B. CP, control positivo.
293 pb
207 pb 100 pb
300 pb
86 pb
293 pb
M 1 2 3 4 5 CP CN M 1 2 3 4 5 CP
Genotipo w/m w/w
Genotipo w/m w/w
A B
365 pb
M 1 2 3 4 5 CP CN
365 pb 267 pb
M 1 2 3 4 5 CP
Genotipo w/m w/w
Genotipo w/m w/w
A B
100 pb
300 pb
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
21
VII.3.1.3 Detección del polimorfismo TPMT*2
Figura 6: Detección del polimorfismo TPMT*2. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P2C y P2W en la reacción a y los partidores P2C y P2M en la reacción b . La presencia de la variante silvestre (w/w) se identificada por una banda de
256 pb con el partidor a y ausencia de banda con el partidos b. Se identifica el genotipo heterocigoto (w/m) por la obtención de
bandas con el par de partidores a y b. Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los carriles 1 al 4 corresponden a muestras de pacientes (1 y 2). CP, control positivo. CN,
control negativo.
VII.3.2 ITPA
Para el caso de la ITPA, se encontró una frecuencia de un 3 % (3/103) para la variante
heterocigota del polimorfismo ITPA 94 C>A (Tabla 6). La frecuencia alélica para el
polimorfismo se detalla en la tabla 7. La figura 7 muestra el análisis de RPC y digestión
enzimática utilizada para determinar el polimorfismo descrito.
Tabla 6: Frecuencias genotípicas para las variantes del gen ITPA
GENOTIPO NÚMERO PACIENTES
(n=103) FRECUENCIA (%)
ITPA / ITPA 100 97 %
ITPA / ITPA 94 C>A 3 3 %
M 1a 1b 2a 2b CPa CPb CNa CNb
256 pb
Genotipo w/w w/m
300 pb
100 pb
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita,
Portugués (Brasil)
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita,
Portugués (Brasil)
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita,
Portugués (Brasil)
22
Tabla 7: Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA
ALELO NÚMERO ALELOS
(n=206) FRECUENCIA (%)
ITPA 203 99 %
ITPA 94 C>A 3 1 %
VII.3.2.1 Detección del polimorfismo ITPA 94 C>A
Figura 7: Detección del polimorfismo ITPA 94C>A. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores P32T F y P32T R. Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb.
Los carriles 1 al 6 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CN, control negativo. B. Producto de la digestión enzimática del
producto de RPC utilizando la enzima NspI para el reconocimiento del polimorfismo ITPA (94 CA). La presencia de la variante heterocigoto (w/m) para el polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (256 pb, 228 pb y 28 pb).Los productos de
digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los
carriles 1 al 6 corresponde a muestras de pacientes que presentan (paciente 1, 2 y 3) y no presentan (paciente 4, 5 y 6) el
polimorfismo ITPA (94 CA).
100 pb
300 pb 256 pb 256 pb 228 pb
M 1 2 3 4 5 6 CN M 1 2 3 4 5 6
Genotipo w/m w/w
Genotipo w/m w/w
A B
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
23
VII.3.3 MTHFR
Para el caso de MTHFR, se encontró que la frecuencia de los polimorfismos MTHFR
677C>T y 1298A>C correspondió a un 70 % (25% homocigoto y 45 % heterocigoto) y a un 53
% (5 % homocigoto y 48 % heterocigoto), respectivamente (Tabla 8). Las frecuencias alélicas
para los polimorfismos el gen MTHFR estudiados se detallan en la tabla 9. Las figuras 8 y 9
muestran los análisis de RPC y digestión enzimática utilizados para determinar los
polimorfismos descritos.
Tabla 8: Frecuencias genotípicas para las variantes del gen MTHFR
GENOTIPO NÚMERO PACIENTES
(n=103) FRECUENCIA (%)
MTHFR 677
MTHFR 677 CC 31 30 %
MTHFR 677 CT 46 45 %
MTHFR 677 TT 26 25 %
MTHFR 1298
MTHFR 1298 AA 48 47 %
MTHFR 1298 AC 50 48 %
MTHFR 1298 CC 5 5 %
24
Tabla 9: Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR
ALELO NÚMERO ALELOS
(n=206) FRECUENCIA (%)
MTHFR 677
C 108 52 %
T 98 48 %
MTHFR 1298
A 146 71 %
C 60 29 %
Tabla 10: Combinaciones de frecuencias genotípicas para los polimorfismos MTHFR 677C>T y
1298A>C.
GENOTIPO NÚMERO PACIENTES
(n=103) FRECUENCIA (%)
MTHFR 677 CC+MTHFR 1298 AA 8 8 %
MTHFR 677 CT+MTHFR 1298 AA 24 23 %
MTHFR 677 TT+MTHFR 1298 AA 16 16 %
MTHFR 677 CC+MTHFR 1298 AC 22 21 %
MTHFR 677 CT+MTHFR 1298 AC 19 18 %
MTHFR 677 TT+MTHFR 1298 AC 9 9 %
MTHFR 677 CC+MTHFR 1298 CC 1 1 %
MTHFR 677 CT+MTHFR 1298 CC 3 3 %
MTHFR 677 TT+MTHFR 1298 CC 1 1 %
25
VII.3.3.1 Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T
Figura 8: Detección del polimorfismo MTHFR 677 C>T. A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores M677 F y
M677 R. Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular
100 pb. Los carriles 1 al 6 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CN, control negativo. B. Producto de la digestión enzimática del producto de RPC utilizando la enzima HinfI. La presencia del genotipo heterocigoto (w/m) y homocigoto (m/m) para
el polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (198 pb, 175 pb y 23 pb) Los productos de digestión enzimática se
resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. Los carriles 1 y 2 corresponde a muestras de pacientes que presentan (paciente 1 y 2) la mutación en condición homocigoto (m/m), los carriles 3 y 4 la presentan en condición heterocigota (w/m)
(paciente 3 y 4) y los carriles 5 y 6 presentan el genotipo silvestre (paciente 5 y 6).
VII.3.3.2 Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C
Figura 9: Detección del polimorfismo MTHFR 1298 A>C .A. Producto de amplificación por RPC utilizando los partidores M1298 F
y M1298 R. Los productos de RPC se resolvieron en geles de agarosa al 2 % mediante electroforesis. M, marcador de peso molecular 100 pb. Los carriles 1 al 6 corresponden a muestras de pacientes estudiados. CN, control negativo. B. Producto de la digestión
enzimática del producto de RPC utilizando la enzima MboII. La presencia genotipo heterocigoto (w/m) y homocigoto (m/m) para el
polimorfismo es identificada por la presencia de tres bandas (84 pb, 56 pb y 31 pb). Los productos de digestión enzimática se resolvieron en geles de agarosa al 2% mediante electroforesis. Los carriles 1 y 2 corresponde a muestras de pacientes que presentan
(paciente 1 y 2) la mutación en condición homocigoto (m/m), los carriles 3 y 4 la presentan en condición heterocigota (w/m)
(paciente 3 y 4) y los carriles 5 y 6 presentan el genotipo silvestre (paciente 5 y 6).
198 pb
M 1 2 3 4 5 6 CN M 1 2 3 4 5 6
Genotipo m/m w/m w/w
Genotipo m/m w/m w/w
A B
198 pb 175 pb
100 pb
300 pb
84 pb 56 pb
31 pb 163 pb
M 1 2 3 4 5 6 CN M 1 2 3 4 5 6
B
Genotipo m/m w/m w/w
Genotipo m/m w/m w/w
100 pb
300 pb
A
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
Con formato: Fuente: 8 pto, Negrita
26
VII.4. Cuantificación de la actividad TPMT
Con el fin de correlacionar los polimorfismos encontrados con la actividad enzimática, se
estableció una colaboración con la Dra. Mary Relling del Pharmaceutical Science Department
del SJCRH para la determinación de la actividad de la enzima TPMT. De los 103 muestras
analizadas, se determinó la actividad TPMT a 13 muestras, de las cuales 6 presentaban
polimorfismos en el gen TPMT*1 y 7 muestras no presentaban ninguno de los polimorfismos
estudiados. Estas últimas fueron escogidas al azar y se utilizaron como control de actividad
TPMT. Los resultados encontrados se detallan en la tabla 11.
Tabla 11: Actividad de la enzima TPMT según genotipo. (n=13)
PACIENTE GENOTIPO ACTIVIDAD
(U/mL glóbulos rojos)
T01 TPMT*1 / TPMT*1 21,4
T95 TPMT*1 / TPMT*1 13,9
T98 TPMT*1 / TPMT*1 32,1
T99 TPMT*1 / TPMT*1 11
T100 TPMT*1 / TPMT*1 30,8
T101 TPMT*1 / TPMT*1 9
T102 TPMT*1 / TPMT*1 18,6
T7 TPMT*1 / TPMT*3A 9,2
T15 TPMT*1 / TPMT*3A 11,5
T25 TPMT*1 / TPMT*3A 11
T78 TPMT*1 / TPMT*3A 10,3
T83 TPMT*1 / TPMT*3A 12,2
T103 TPMT*1 / TPMT*3C 8,5
Una unidad de actividad enzimática (U) representa la formación de 1 nmol de Me-MP por hora de
incubación.
27
VII.5. Correlación entre la actividad enzimática y polimorfismo de la enzima
TPMT
El análisis estadístico de la actividad TPMT en las 13 muestras evaluadas mostró que la
mediana de actividad para el genotipo silvestre correspondió a un 19,5±3,5 (U/mL GR), mientras
que para el genotipo polimórfico fue de 10,45±0,6. El análisis de los datos obtenidos se realizó
utilizando el test de Wilcoxon que mostró una diferencia estadísticamente significativa (p=
0,0313) entre la actividad enzimática de los pacientes con genotipo polimórfico comparada con
la actividad encontrada en los pacientes con genotipo silvestre para el gen TPMT*1 (Figura 10).
WT/WT WT/Mut0
10
20
30
40
p=0.0313
Genotipo
Activi
dad T
PM
T
(U/m
L G
R)
Figura 10: Asociación entre genotipo y actividad de la enzima TPMT. Los valores corresponden a la
mediana ± error estándar medio (EEM).
VII.6. Análisis de toxicidad asociada a polimorfismos en el gen TPMT*1
Tomando en cuenta la correlación observada entre la presencia de polimorfismos en el gen
TPMT*1 y la actividad de la enzima TPMT (figura 10), se evaluó la presencia de efectos
adversos asociados al tratamiento con 6-MP en los pacientes que presentaban o no
polimorfismos en el gen TPMT*1. De los 8 pacientes que presentaron alguno de los
polimorfismos en el gen TPMT*1, en 4 de ellos se obtuvo acceso a sus fichas clínicas. Para
comparar, se escogió al azar un subgrupo de 4 pacientes que no presentaban ninguno de los
polimorfismos estudiados para el gen TPMT*1. En ambos subgrupos, se evaluó la presencia de
28
toxicidad hematológica y hepática estratificada en grados de 0 a 4 en el período de inducción del
tratamiento de LLA. Se eligió el período de inducción para el análisis, ya que es la unica etapa
que todos los pacientes analizados habían completado en su totalidad. El análisis de los 4
pacientes con polimorfismos mostró que todos ellos presentaron grados de toxicidad
hematológica y hepática en el rango 3-4 y 1-3, respectivamente. En el caso del subgrupo que no
presentaban los polimorfismos en el gen TPMT*1 estudiados los grados de toxicidad
hematológica y hepática se encontraban en el rango 2-3 y 0-1. La tabla 12 resume los resultados
de toxicidad hematológica y hepática, presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1 y los
valores de actividad de la enzima TPMT del subgrupo de pacientes estudiados.
Tabla 12: Grados de toxicidad observado en pacientes con polimorfismos en el gen TPMT*1
TOXICIDAD HEMATOLOGICA
TOXICIDAD
HEPATICA
Paciente Genotipo Actividad
TPMT
Leucopenia
grado
toxicidad
RAN
grado
toxicidad
Trombocitop
enia grado
toxicidad
ALT
grado
toxicidad
AST
grado
toxicidad
1 TPMT*1 / TPMT*3A 9,2 3 4 4 3 3
2 TPMT*1 / TPMT*3A 11,5 3 3 3 1 1
3 TPMT*1 / TPMT*3A 11 4 4 3 2 2
4 TPMT*1 / TPMT*3A 12,2 3 4 4 2 1
5 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 3 2 1 0
6 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 1 0 0 1
7 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 2 3 0 0
8 TPMT*1/ TPMT*1 - 2 1 3 1 0
29
VIII. DISCUSION
El estudio de los polimorfismos en el gen TPMT*1 involucrados en la farmacoterapia del
tratamiento de la LLA con 6-MP, es uno de los más claros ejemplos de aplicación clínica de una
farmacogenética efectiva. La importancia de estos estudios radica en la asociación de los efectos
adversos presentes durante la terapia con la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1. Esta
situación ha permitido el ajuste de la dosificación de 6-MP tomando en cuenta la presencia de
estos polimorfismos, lo que se ha traducido en terapias más seguras y efectivas (Cheok y Evans
2006). De las variantes genéticas descritas para el gen TPMT*1, las más frecuentemente
estudiadas son los polimorfismos TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B y TPMT*3C, las cuales
abarcan alrededor del 95% de las mutaciones descritas con una influencia directa en la actividad
de la enzima. A nivel mundial existe una serie de estudios de frecuencias genotípicas del gen
TPMT*1 realizados en una gran variedad de grupos étnicos (Tabla 13). Al analizar estos
resultados se observa una gran heterogeneidad existente entre las diferentes poblaciones, siendo
los polimorfismos predominantes el TPMT*3C y TPMT*3A, especialmente en poblaciones
caucásicas. En general, las poblaciones estudiadas presentan más de una variante alélica para
algunos de los polimorfismos a excepción de la noruega saami, china, japonesa y tailandesa en
donde sólo se encuentra un polimorfismo. En poblaciones sudamericanas se describe un
predominio del polimorfismo TPMT*3A, a excepción de la brasileña donde el polimorfismo
TPMT*2 es el mas común. En el presente estudio las frecuencias encontradas en sus condiciones
silvestre y heterocigoto para los polimorfismos más comunes en el gen TPMT*1 correspondieron
a un 96 y 4 %, respectivamente (Tabla 5). De estos polimorfismos sólo se encontraron las
variantes alélicas TPMT*3A y TPMT*3C en un 3% y 1 %, respectivamente (Tabla 5). No se
encontraron los polimorfismos TPMT*2 y TPMT*3B, como tampoco polimorfismos en
condición homocigota. Al comparar nuestros resultados con los descritos en diferentes grupos
étnicos, las frecuencias encontradas concuerdan con aquellas presentes en poblaciones
caucásicas donde la variante genética TPMT*3A es la más frecuente (3,2 a 5,7 %) (Tabla 13).
Con respecto a la frecuencia de estos polimorfismos en países latinoamericanos (Argentina,
Brasil, Colombia, Bolivia), se observa un predominio del alelo TPMT*3A y una ausencia del
alelo TPMT*2 y TPMT*3B, de forma similar a los resultados obtenidos en el presente estudio.
30
Tabla 13: Frecuencias alélicas para las variantes del gen TPMT*1 en una variedad de grupos étnicos.
(Adaptado de Sahasranaman y cols. 2008).
Grupo étnico Número
alelos TPMT*2 TPMT*3A TPMT*3B TPMT*3C
Caucásica americana 282 0,2 3,2 ND 0,2
Caucásica británica 398 0,5 0,45 ND 0,3
Caucásica francesa 382 0,5 5,7 ND 0,8
Caucásica francesa 938 0,7 3 0 0,4
Caucásica alemana 2428 0,2 4,4 0 0,4
Caucásica polaca 716 0,4 2,7 0 0,1
Caucásica sueca 1600 0,06 3,75 0,13 0,44
Caucásica noruega 132 0 3,4 0 0,3
Noruega saami 388 0 0 0 3,3
Caucásica Bulgaria 626 0,16 2.24 0 0,16
Afro americana 248 0,4 0 ND 2,4
Egipcia 400 0 0,003 0 0,013
Ghana 434 0 0 ND 7,6
Keniana 202 0 0 ND 5,4
China 384 0 0 ND 2,3
China 206 0 0 0 1
China (niños) 426 0 0 0 0,2
Japonés 1044 0 0 0 1,6
Tailandés 400 0 0 0 4,75
Suroeste asiática 198 0 1 ND 0
Suroeste asiática 1098 0 0 ND 1
Brasileña 408 2,2 1,5 0,2 1
Española 276 ND 3,26 1,45 1,45
Argentina 294 0,7 2,1 0 0
Colombiana 280 0,4 3,6 0 0
Chilena adultos 420 0,24 2,86 0 0,71
Chilena niños
PINDA 206 0 3 0 1
31
Un estudio previo realizado en población chilena describe frecuencias alélicas de
TPMT*2 0,24 %, TPMT*3A 2,86% y TPMT*3C 0,71 % (Alvarez y cols. 2009), las cuales no se
relacionan del todo con nuestros resultados. Posiblemente, la población incluida en este estudio,
(dadores de sangre sin patología de base asociada) podrían explicar estas diferencias. Sin
embargo, un aumento en el número del tamaño muestral podría igualar o equiparar las
frecuencias obtenidas en ambos estudios.
La medición de la actividad de la enzima TPMT permite establecer una relación entre la
presencia de un polimorfismo y su efecto en la actividad en la enzima codificada (relación
genotipo/fenotipo). Para el genotipo silvestre la actividad encontrada en este estudio fue
significativamente mayor (mediana=19,5 U/mL GR) que para el genotipo polimórfico
(mediana=10,45 U/mL GR) (Tabla 11). Los valores de actividad de TPMT obtenidos
concuerdan con los algoritmos utilizados en el SJCRH para clasificar la actividad TPMT de
acuerdo al polimorfismo en el gen TPMT*1, asignándoles actividades ≤5 U/mL GR, entre 5 y
13,5 U/mL GR y ≥13,5 U/mL GR para los genotipos homocigoto mutante, heterocigoto y
silvestre, respectivamente (Relling y cols. 1999a). Es importante destacar que en dos de los
pacientes analizados que no presentan los polimorfismos estudiados se encontró un valor de
actividad TPMT baja, valores que según la clasificación expuesta anteriormente correspondería a
un genotipo heterocigoto. Hasta la fecha, se han descrito más de 25 polimorfismos para el gen
TPMT*1 que afectan la actividad de la enzima, de los cuales para este estudio se escogieron sólo
los más frecuentes. Posiblemente estos dos pacientes presentan algún otro polimorfismo no
estudiado o un polimorfismo nuevo y/o específico de poblaciones latinoamericanas. Para
resolver esta interrogante sería interesante secuenciar el gen TPMT*1, de modo de encontrar el
polimorfismo responsable de este hallazgo.
El interés por estudiar el genotipo de la enzima TPMT se basa fundamentalmente en la
relación directa existente entre la toxicidad y la actividad de la enzima, la cual está directamente
relacionada con su genotipo. Los pacientes tratados con dosis convencionales de 6-MP y con una
actividad deficiente de esta enzima presentan un riesgo mayor de presentar una acumulación
excesiva de TGN (Relling y cols. 1999b). Estos niveles tóxicos de TGN se relacionan con la
presencia de efectos adversos en la terapia con 6-MP como neutropenia, leucopenia,
trombocitopenia o hepatotoxicidad. Actualmente los principales protocolos utilizados para el
32
tratamiento de la LLA infantil son los del grupo del SJCRH y del Berlin-Frankfurt-Münster
(BFM), siendo este último utilizado como base del programa PINDA aplicado a nivel nacional.
La diferencia fundamental entre ambos protocolos es la utilización de la genotipificación de
polimorfismos en el gen TPMT*1 en el protocolo del SJCRH como herramienta en el
tratamiento de la LLA, lo cual les permite realizar una individualización de dosis de 6-MP,
evitando o disminuyendo la toxicidad causada por este fármaco (Relling y cols. 2006). Sin
embargo, pacientes con actividad TPMT intermedia tratados con el protocolo BFM, es decir,
tratados con dosis convencionales de 6-MP (60 mg/m2/día) presentan una respuesta más
temprana al tratamiento antileucémico, lo cual se explica debido a la alta concentración
sistémica de 6-MP, debido al metabolismo bajo del fármaco (Cheok y cols. 2009 ). Si bien se
observa que al aplicar el protocolo BFM existe una recuperación más rápida de la enfermedad, la
toxicidad a 6-MP no se evalúa directamente, aplicándose sólo una reducción de dosis tomando
en cuenta el recuento RAN. En la práctica, esto se traduce en un abandono o suspensión de la
terapia a causa de la toxicidad a 6-MP (Relling y cols. 1999b), una situación que puede ser
evitada tomando en cuenta la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1.
Al analizar la relación entre la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1 y la presencia
de efectos adversos atribuibles a la terapia con 6-MP, se puede ver que existe una tendencia al
desarrollo de toxicidad hematológica y hepática (tabla 12) en los pacientes que presentan alguno
de los polimorfismos en el gen TPMT*1 en comparación con los pacientes con genotipo
silvestre. Sin embargo, es importante mencionar que este análisis se realizó en un pequeño
número de pacientes en forma retrospectiva. Un estudio prospectivo con un mayor número de
pacientes que incluya la documentación de efectos adversos asociados al tratamiento con 6-MP,
los cambios de dosificación en las diferentes etapas de tratamiento de LLA, permitirá establecer
si existe una relación entre la presencia de polimorfismos y presencia de efectos adversos
durante la terapia en los pacientes con LLA.
Tomando en cuenta la importancia que han adquirido otros polimorfismos en enzimas
involucradas en la metabolización de fármacos utilizados en el tratamiento de la LLA, se
determinó la prevalencia de los polimorfismos más importantes para los genes que codifican
para las enzimas ITPA y MTHFR, con el objetivo de tener un conocimiento global de los
polimorfismos involucrados en la farmacogenómica de la LLA. Hasta la fecha, no existen
antecedentes en población chilena sobre la frecuencia de los polimorfismos en estas enzimas, lo
cual ratifica la relevancia de este estudio. Para el caso del gen ITPA, la frecuencia alélica del
33
polimorfismo más frecuentemente descrito, la variante 94 C>A, correspondió a un 1 %. Esta
frecuencia es equivalente a la obtenida en poblaciones latinoamericanas, las cuales describen
frecuencias de 1 a 2 % (Marsh y cols. 2004) y más baja en relación a la existente en otros grupos
étnicos estudiados (Tabla 14). Se debe hacer notar que ninguno de los pacientes que presentó
alguno de los polimorfismos en el gen TPMT*1 presentaron polimorfismos en el gen ITPA. Si
bien la presencia de polimorfismos en el gen ITPA se ha asociado a una serie de efectos
adversos, no se ha podido demostrar una correlación entre la presencia de polimorfismos y
toxicidad (Van Dieren y cols. 2007). Sin embargo, al realizar una individualización de dosis de
acuerdo a la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1, se ha encontrado un aumento
significativo de la toxicidad mediada por ITPA asociado a la presencia de episodios con
neutropenia febril, el cual corresponde al efecto adverso más comúnmente asociado a una
actividad deficiente de la enzima ITPA (Stocco y cols. 2009b). Estos antecedentes apoyan la
importancia del estudio de estos polimorfismos en caso de considerar una individualización de
dosis tomando en cuenta sólo el genotipo de la enzima TPMT.
Tabla 14: Frecuencias alélicas para las variantes del gen ITPA en una variedad de grupos étnicos.
(Adaptado de Marsh y cols. 2004).
Grupo étnico Número de alelos ITPA 94 A
Peruano 158 1,3
Mexicano 188 1,6
Caucásico americano 190 6,3
Caucásico británico 250 7
Afro-americano 110 6,4
Africano 120 5
Ghana 162 5,6
Indu (este) 120 11
China 120 15
China 188 18,6
Filipina 110 13,6
Chilena niños PINDA 206 1
34
Tabla 15: Frecuencias alélicas para las variantes del gen MTHFR en una variedad de grupos étnicos.
(Adaptado de De Mattia y Toffoli 2009).
Grupo étnico MTHFR 677 C MTHFR 677 T MTHFR 1298 A MTHFR 1298 C
Europea/Caucásica 63,0-76,3 23,7-37,0 62,9-70,8 29,2-37,1
Hispánica 52,5-69,5 30,5-47,5 76,1-85,0 15,0-23,9
Afro-americana 85,4-91,7 8,3-14,6 81,2-88,1 11,9-18,8
Africana 89,0-89,2 10,8-11,0 89,2-89,8 10,2-10,8
India 90,5 9,5 73,0 27,0
China 48,9-66,7 33,3-51,1 79,8-85,4 14,6-20,2
Japonesa 59,7-64,4 35,6-40,3 81,4-82,2 17,8-18,6
Coreana 59,8 41,2 45,0 25,0
Chilena niños
PINDA 52 48 71 29
Para el caso de los polimorfismos en el gen que codifica para la enzima MTHFR, existen
antecedentes que indican las frecuencias alélicas para el caso del MTHFR 677 en la población
latina se encuentran entre un 53% a 70 % para el alelo C y 31% a 48 % para el alelo T,
respectivamente (Tabla 15) (De Mattia y Toffoli 2009). En este estudio se encontró que la
frecuencia para el alelo C y T fue de 52 % y 48 %, lo que concuerda con las frecuencias
encontradas en nuestra población de estudio. Una situación similar se observa para el caso del
polimorfismo MTHFR 1298. En este estudio, las frecuencias para el alelo A y C correspondieron
a un 71 % y 29 %, respectivamente. Estos valores concuerdan con los observados en la
población latina, en donde las frecuencias van desde un 76% a 85 % y 15% a 24 % para el alelo
A y C, respectivamente (Tabla 15) (De Mattia y Toffoli 2009).
Los resultados obtenidos en este estudio nos entregan una valiosa información sobre las
frecuencias de los polimorfismos implicados en el tratamiento de LLA, la cual será útil para
establecer el rol de estos polimorfismos en la toxicidad asociada a 6-MP y MTX durante el
tratamiento de esta neoplasia. Para ello, la revisión de las fichas clínicas y/o estudios
prospectivos serán determinantes para evaluar la importancia de la aplicación clínica de las
frecuencias genotípicas encontradas.
35
Finalmente, estos antecedentes constituyen el primer paso para desarrollar y aplicar en el
futuro una farmacogenética efectiva para el tratamiento de pacientes con LLA, generando una
plataforma de manejo terapéutico con un enfoque más individualizado para estos pacientes.
36
IX. CONCLUSIONES
Los polimorfismos más prevalentes para el gen TPMT*1 en niños chilenos con LLA
son TPMT*3A y TPMT*3C, ambos en condición heterocigoto con frecuencias alélicas
de 3% y 1%, respectivamente. Para el gen ITPA la frecuencia alélica del polimorfismo
P32T correspondió a un 1%. Para el gen MTHFR la frecuencia alélica para el
polimorfismos MTHFR 677C>T correspondió a un 48% y 29% para el polimorfismo
MTHFR 1298A>C.
La mediana de la actividad TPMT para el genotipo silvestre y polimórfico correspondió
a 19,5±3,5 y 10,45±0,6 U/mL GR, respectivamente.
Se encontró una correlación estadísticamente significativa entre la actividad de la
enzima TPMT y la presencia de polimorfismos en el gen TPMT*1. El análisis de los
efectos adversos observados en un subgrupo de pacientes con o sin polimorfismos
muestra una tendencia al desarrollo de toxicidad hematológica y hepática en los
pacientes con polimorfismos en el gen TPMT*1.
En conclusión, los resultados obtenidos en este estudio confirman la hipótesis propuesta,
comprobándose que los pacientes con LLA chilenos presentan polimorfismos en los genes que
codifican para las enzimas TPMT, ITPA y MTHFR. Además, se demostró que la presencia de
polimorfismos en el gen TPMT*1 se asocia a una disminución en la actividad de la enzima
TPMT, observándose una tendencia al desarrollo de efectos adversos relacionados con
concentraciones tóxicas de 6-MP en pacientes que presentan polimorfismos en el gen TPMT*1.
37
X. BIBLIOGRAFIA
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41
XI. ANEXOS
XI.1. Consentimiento informado
42
43
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XI.2. Asentimiento informado
45
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XI.3. Carta aprobación comité de ética científico pediátrico Servicio de Salud
Metropolitano Oriente.
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XI.4. Carta de certificación de consentimientos y asentimientos informados.
49
XI.5. Carta aprobación comité de ética científico Hospital Dr. Gustavo Fricke.
50
XI.6. Carta solicitud extensión del estudio.
51
XI.7. Polimorfismos encontrados para los pacientes incluidos en el estudio.
TPMT*3A TPMT*2 ITPA94C>A MTHFR 677 C>T MTHFR 1298 A>C
Código TPMT*3B TPMT*3C A (P2W-P2C) B (P2M-P2C)
T1 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/w
T2 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/w
T3 w/w w/w (+) (-) w/w w/w w/w
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T99 w/w w/w (+) (-) w/w w/m w/m
T100 w/w w/w (+) (-) w/w w/m m/m
T101 w/w w/w (+) (-) w/w w/m w/m
T102 w/w w/w (+) (-) w/w m/m w/m
T103 w/w w/m (+) (-) w/w w/m w/w
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