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16.01.2018
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Medizinische ChemieSeminar 1
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Block 3Vom Molekül zur ZelleBiochemie Seminar & PraktikaAo. Univ. Prof. Mag. Dr. Georg Weitzer
Zentrum für Medizinische Biochemie
georg.weitzer@univie.ac.at
Informationen zur Lehrveranstaltung:
https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n202-2013/?state=0-53836-3031/organisatorische-informationen
Praktikumsskriptum:
Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle (Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.)
Literatur dazu:Zellbiologie, Bruce Alberts, Wiley - Verlag Chemieergänzend z.B.
Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“), Facultas -UniversitätsTaschenbuch Verlag, Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner
Sie finden die Folien für diese Lehrveranstaltung unter http://homepage.univie.ac.at/georg.weitzer/
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017
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Biochemisches Praktikum / Seminar
• Das BIOCHEMIE PRAKTIKUM / SEMINAR besteht aus einem Seminaranteil und dem eigentlichen Praktikum. Lerngrundlage ist das Praktikumsskriptum.
• 2 Praktika zu je 4 akadedmischen Stunden, 3 Seminare zu je 2 akademischen Stunden
• Benötigte Materialien:
1. Arbeitsheft für Seminare und Praktikums-Protokolle, Anwesenheitsblatt eingelebt. Der Besuch der Veranstaltungen wird darin durch den jeweiligen Gruppenleiter bestätigt.
2. Arbeitsmantel
Biochemisches Praktikum / Seminar
• SEMINAR 1: Notwendige Voraussetzungen, Allgemeines Verhalten im Labor. Verfassen des Protokolls.
• Hinwies auf Fehlerquellen, zufällige und systematische Fehler und Streuung;
• Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags.
• Vergabe der Referat Themen.
• PRAKTIKUM 1:
• Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren;
• Pipettierübung;
• Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen;
• Gelfiltration: Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe.
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Organisational unitPresentation title / topic OR Presenter's name
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Biochemisches Praktikum / Seminar
SEMINAR 2: Besprechung der Ergebnisse und Fehlerquellen des 1. Praktikums; Inhalt des zweiten Praktikumstags + Wiederholung theoretischer Grundlagen aus der Vorlesung.
Gr. 30 Fr. 19.1. 14:30 pünktlich!
SEMINAR 3: Auswertung des 2. Praktikums; Präsentation der Kurzreferate über das Seminar/ Praktikum durch die Studierenden.
Gr. 30 Do. 25.1. 14:30 pünktlich!
PRAKTIKUM 2:
Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante (KM-Wert) der Lactatdehydrogenase (LDH) für Pyruvat, Ermittlung der Sättigungskonzentration und der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (= Enzymmenge),
Statistische Auswertung der Ergebnisse der Gruppe
Biochemisches Praktikum / Seminar• Ort der Lehrveranstaltungen:
• PRAKTIKUM 1: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 3, Eingang auf Seite Türkenstraße, Parterre.
• PRAKTIKUM 2: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 1, Haupteingang, 1. Stock.
Pünktlichstes Erscheinen!
Art der Leistungsüberprüfung: LV mit “permanenten Prüfungscharakter” =
= Anwesenheitspflicht + Mitarbeit + Kurzreferat
Anwesenheitsblatt: https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n202-2011/?state=0-10538-293_2/block-3-vom-molekuel-zur-zelle
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SEMINAR 1:
Mediziinische ChemieSeminar 1
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Wozu Experimente und Labordiagnostik?
Neben Blickdiagnose und Anamnese sind chemische du biochemische Parameter von entscheidender Bedeutung für Diagnose und Therapie „Molecular precision medicine“
• Voraussetzungen: Allgemeines Verhalten im Labor
Führung von Protokollen
Erkennen von Fehlerquellenzufällige und systematische Fehler,
Streuung der analytischen Daten
• Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags
Arbeiten im Labor - Forschungslabor
Mediziinische ChemieSeminar 1
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GSP (good scientific practice)
Garantie der Reproduzierbarkeit
Strikte Vermeidung von Plagiarismus
Strikte Vermeidung von Fabrification
Protokollbuch
Nachvollziehbarkeit garantieren
IPR (intellectual property right) – Patente beachten
10 Jahre aufbewahren
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Arbeiten im Labor - Sicherheit
Mediziinische ChemieSeminar 1
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Hausverstand !!! Sauberkeit am Arbeitsplatz, Zusammenräumen nach Experiment Allgemeine Chemikalien (nach Gebrauch schließen, nichts zurückgießen) geeignete Schutzkleidung
Handschuhe
Arbeitsmäntel
Schutzbrillen ……
nicht Essen, Trinken, Rauchen….. Entsorgung von Gefahrenstoffen
Protokollführung (obligatorisch, Protokollheft A5)
Mediziinische ChemieSeminar 1
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Versuch, Datum (nicht Versuch 2 sondern Aminosäuretrennung mittels DC) Versuchsbedingungen (Reagenzien, Konzentration, Volumen,..........)… Ergebnisse (abgelesenen Werte, auch negative) Berechnung Endresultat: (Einheiten, signifikante Stellen) Interpretation (Diagnose positiv, Verdacht auf....)
Das Versuchsprotokoll beginnt mit einer Aufgaben- oder Fragestellung, erwähnt die verwendeten Reagentien und Geräte, beschreibt die Durchführung eines Experiments und dokumentiert Beobachtungen, Fehler, Erklärungen sowie die Auswertung der Ergebnisse.
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FEHLER - Minimieren
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Die Ergebnisse aller Analysenverfahren sind nichtfrei von Fehlern!
• grobe Fehler
• zufällige Fehler
• systematische Fehler
Kenngrößen
Medizinische ChemieSeminar 1
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• zufällige Fehler beinflussen die Reproduzierbarkeit der Experimente und Analysen
• Präzision = Reproduzierbarkeit
• systematische Fehler verursachen falsche Ergebnisse
• Richtigkeit = Abweichung des Mittelwertes von Mehrfachbestimmungen vom tatsächlichenWert
Präzision: gut schlecht gutRichtigkeit: gut gut schlecht
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Messgrößen
Medizinische ChemieSeminar 1
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• Für Präzision (zufälligen Fehler): • können mit der Gaußschen Verteilung beschreiben werden
– Standardabweichung, Variationskoeffizient
• Für Richtigkeit (systematischen Fehler):– Abweichung des Mittelwerts
vom wahren Wert
Standardabweichung
Meßgrößen für zufällige Fehler
Mediziinische ChemieSeminar 1
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Mittelwert
Varianz
Standardabweichung
Variationskoeffizient
(x)x =
n
n = Anzahl der Einzelmessungen
x = Einzelmessung
(x-x)2s2 =
n-1
s = (x-x)2
n-1
sVK =
x.100
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Zusammenhang zwischen Sensitivität und Spezifität von Methoden
Medizinische ChemieSeminar 1
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• Sensitivität beschreibt die Fähigkeit, tatsächlich Kranke als krank zu identifizieren.
richtig positiverichtig positive + falsch negative
• Spezifitätbezeichnet die Fähigkeit, tatsächlich Gesunde als gesund zu identifizieren.
richtig negativerichtig negative + falsch positive
• Screening (Suchtest)i. hohe Sensitivitätii. niedrige Spezifität
Die "Sensitivität" (richtig positive Rate eines Tests) bezeichnet den Anteil der test-positiven Personen unter allen Erkrankten einer Stichprobe, d. h. die Wahrscheinlichkeit, mit einem diagnostischen Test die Kranken auch als krank zu identifizieren. Eine hohe Sensitivität wird angestrebt, wenn eine Erkrankung mit hoher Sicherheit ausgeschlossen werden soll.Die "Spezifität" (richtig-negative Rate eines Tests) beschreibt den Anteil der Test-negativen Personen unter allen Nicht-Erkrankten einer Stichprobe, d. h. die Wahrscheinlichkeit, mit einem diagnostischen Test Nicht-Erkrankte korrekt zu identifizieren. Eine hohe Spezifität wird angestrebt, wenn eine Erkrankung mit großer Sicherheit bestätigt werden soll.
Zusammenhang zwischen Sensitivität und Spezifität von Methoden
Medizinische ChemieSeminar 1
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• Sensitivität beschreibt die Fähigkeit, tatsächlich Kranke als krank zu identifizieren.
richtig positiverichtig positive + falsch negative
• Spezifitätbezeichnet die Fähigkeit, tatsächlich Gesunde als gesund zu identifizieren.
richtig negativerichtig negative + falsch positive
• Screening (Suchtest)i. hohe Sensitivitätii. niedrige Spezifität
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Verteilung der Messdaten
> 95% der Daten
Hohe Spezifität aber geringe Sensitivität
Hohe Sensitivität aber geringe Spezifität
Quellen:http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/zaspel-uta-2003-09-26/HTML/chapter2.htmlhttps://de.wikipedia.org/wiki/Standardabweichung_%28Wahrscheinlichkeitstheorie%29Georg Weitzer,MUW 01/2017
Konvention:Alle Daten die kleiner oder größer als der Mittelwert +/- 2 x Standardabweichung sind, werden ausgeschieden.
Sig
nals
tärk
e
IdealzustandGesunde Kranke
Qualitätskontrolle – Qualitätsmanagement in medizinisch-analytischen Labors
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• Extern: Versenden von gemessenen Proben
• Intern: mit Standards
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Bewertung von Messergebnissen bei Patienten
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• Longitudinal– Verlaufskontrolle über lange Zeit
• Transversal– Vergleich mit Referenzbereich (Gesunde + andere Patienten
• Referenzbereich• z.B. Mittelwert + 2 s
SEMINAR 1:
Mediziinische ChemieSeminar 1
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Wozu Experimente und Labordiagnostik ?
Voraussetzungen
Allgemeines Verhalten im Labor
Führung von Protokollen
Fehlerquellenzufällige und systematische Fehler, Streuung
Inhalt des ersten Praktikumstags
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Für das Praktikum
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mitbringen:
• Arbeitsmantel• Skriptum• Rechner, Bleistift, Lineal...• Protokollheft• Anwesenheitsblatt
Trennmethoden
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• Dünnschichtchromatographie• Ionenaustauschchromatographie• Reversed Phase Chromatography
(apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)• Gaschromatographie• Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie)• Affinitätschromatographie
• Elektrophorese
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Allen Methoden ist gemeinsam, dass die Moleküle durch den unterschiedlich langen Aufenthalt in zwei nicht mischbaren Phasen getrennt werden.
Phasen sind z.B. Lösungsmittel, Oberflächen, Antikörper, …
Georg Weitzer, MUW 01/2017
Nernstscher VerteilungssatzBeschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig).
Verteilungskoeffizient c =[Br2] Chloroform[Br2] Wasser
Chemie erleben Wawra et al.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017
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Inhalt
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1. DC von Aminosäuren
2. Pipettierübung (Präzisionskontrolle)
3. Gelfiltration
4. Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen
1. Trennung von Aminosäuren mittels der Dünnschichtchromatographie
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• Stationäre Phase
• Cellulose auf Aluminiumträger, (mitWasser gefülltes Gel)
= hydrophil
• Mobile Phase
• Organisches Lösungsmittel
= hydrophob
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Auftragen der Proben
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Glasröhrchen
Cellulose auf Alu-folie
Standard, Referenzwert
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Laufmittel= mobile Phase
Glastrog nach ca. 90 min
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Markieren der Front & Rf-Wert berechnen
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Front
Start
Wanderstreckeder mobilenPhase
Rf-Wert berechnen
Wanderstreckeder Aminosäure
Auswertung
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Nernstscher Verteilungssatz
Verteilungskoeffizient c =
W(as) = Rf(as)
W(m)
• Rf = Retentionsfaktor
[Aminosäure] stationäre Phase
[Aminosäure] mobile Phase
Chemie erleben, Wawra et al. Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zweimiteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig/flüssig oder flüssig/fest oder flüssig/flüssig).
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2. Pipettierübung (Präzisionskontrolle)
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1. In eine Mikrotiterplatte werden in eine Spalte achtmal 125 µl Wasser pipettiert und
2. 75 µl gelbe Farbstofflösung zugesetzt.
3. Nach Pipettieren der Farbstofflösung wird durch mehrfaches Aufziehen mit der Pipette gemischt!
4. Die 1. Spalte dient als Leerwert (LW), in die nur destiliertes Wasser (200 µl) pipettiert wird.
5. Die Konzentration des Farbstoffs in diesen Mischungen wird durch Messung der Extinktion bei 415 nm mit einem Photometer bestimmt.
6. Berücksichtigen Sie bei Ihrer Auswertung den LW, indem sie den Mittelwert des LWs bilden und diesen von Ihren Messwerten abziehen! Aus den so erhaltenen 8 Werten/Spalte errechnen Sie nun jeweils den Mittelwert, die Standardabweichungund den Variationskoeffizienten. Das Resultat kann bei einem VK
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Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemischesmittels Gelfiltration
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• Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer equilibriert.
• 0.5 ml der Probe direkt auf die
trockengelaufene Glasfritte auftragen.
(Dextranblau und Methylrot)
• Wenn vollkommen ins Säulenmaterial
eingedrungen, ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen.
• Austretender Elutionspuffer in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) sammeln.
• Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit 1 Tropfen HCl ansäuern.
Glasfritte
3. Gelfiltration
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Chemie erleben, Wawra et al.
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Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration
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Dextranblau: großes Molekül, eluiert zuerstMethylrot: kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus
Ionenaustausch- bzw. Affinitätschromatographie
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4. Elektrophorese
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Die Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld
Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine
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Voraussetzungen:
• Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein.
• richtige Wahl des Puffers !
• Trägermaterial (analog zur stationären Phase)
• Gleichstromquelle
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Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn die Proteine zur Anode wandern sollen?
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• pI (Serumproteine) ~ 5
• Anode = + Pol
• Kathode = - Pol
• Puffer soll pH > 5 sein, also in der Praxis bei 9 liegen
isoelektr. Punkt
Elektrophorese -Durchführung
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Vorbereitung – Pipettieren kleiner Volumina – Proben auftragen
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Nach der Elektrophorese
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• Färben der Proteine
• Trägermaterial durchsichtig machen
• Densitometrische Auswertung
• Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials
Elektropherogramm
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Chemie erleben Wawra et al.
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Diagnostische Aussagemöglichkeiten
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Organisational unitPresentation title / topic OR Presenter's name
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Wie Grundlagenforschung zu technologischen und oder medizinischen Anwendungen führen kann:
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Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen mit derSDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
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Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen mit derSDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Mediziinische ChemieSeminar 1
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Immunoblot: Nachweis eines bestimmten Proteins mittels Antikörpers
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Isoelektrische Fokussierung
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• Auftrennung über pH Gradienten
2D-Gelelektrophorese - Proteomanalyse
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1. Isoelektrische Fokussierung
2. Dann SDS-PAGE
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2D-Gelelektrophorese – Proteomanalyse - Beispiele
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Quelle: Wikipedia
Maximal . 20 000 Punkte
Veränderte neue Kernproteine in Tumorproben identifziert mit 2D-Gelelektrophorese und Massenspektroskopie (MALDI-TOF)
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Holzmann K et al. Eur J Biochem. 1997;244(2):479-86.
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Liver tumor
Burkitts lymphoma
Rat lung tissue
Rat testis tissue
Diagnosemöglichkeit:
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Organisational unitPresentation title / topic OR Presenter's name
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Organisational unitPresentation title / topic OR Presenter's name
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1. Praktikum: Gruppe 26 Do. 12:30 pünktlichstGruppe 30 Do. 16:00 pünktlichst
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