Block 3 Vom Molekül zur Zelle Biochemie Seminar & Praktika · 2018. 1. 16. · 16.01.2018 3 Organisational unit Presentation title / topic OR Presenter's name 5 Biochemisches Praktikum

16.01.2018

1

Medizinische ChemieSeminar 1

1

Block 3Vom Molekül zur ZelleBiochemie Seminar & PraktikaAo. Univ. Prof. Mag. Dr. Georg Weitzer

Zentrum für Medizinische Biochemie

[email protected]

Informationen zur Lehrveranstaltung:

https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n202-2013/?state=0-53836-3031/organisatorische-informationen

Praktikumsskriptum:

Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle (Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.)

Literatur dazu:Zellbiologie, Bruce Alberts, Wiley - Verlag Chemieergänzend z.B.

Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“), Facultas -UniversitätsTaschenbuch Verlag, Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner

Sie finden die Folien für diese Lehrveranstaltung unter http://homepage.univie.ac.at/georg.weitzer/

Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017

16.01.2018

2

Biochemisches Praktikum / Seminar

• Das BIOCHEMIE PRAKTIKUM / SEMINAR besteht aus einem Seminaranteil und dem eigentlichen Praktikum. Lerngrundlage ist das Praktikumsskriptum.

• 2 Praktika zu je 4 akadedmischen Stunden, 3 Seminare zu je 2 akademischen Stunden

• Benötigte Materialien:

1. Arbeitsheft für Seminare und Praktikums-Protokolle, Anwesenheitsblatt eingelebt. Der Besuch der Veranstaltungen wird darin durch den jeweiligen Gruppenleiter bestätigt.

2. Arbeitsmantel


• SEMINAR 1:  Notwendige Voraussetzungen, Allgemeines Verhalten im Labor. Verfassen des Protokolls.

• Hinwies auf Fehlerquellen, zufällige und systematische Fehler und Streuung;

• Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags.

• Vergabe der Referat Themen.

• PRAKTIKUM 1:  

• Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren;

• Pipettierübung;

• Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen;

• Gelfiltration: Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe.

16.01.2018

3

Organisational unitPresentation title / topic OR Presenter's name

5


SEMINAR 2: Besprechung der Ergebnisse und Fehlerquellen des 1. Praktikums; Inhalt des zweiten Praktikumstags + Wiederholung theoretischer Grundlagen aus der Vorlesung.

Gr. 30 Fr. 19.1. 14:30 pünktlich!

SEMINAR 3: Auswertung des 2. Praktikums; Präsentation der Kurzreferate über das Seminar/ Praktikum durch die Studierenden.

Gr. 30 Do. 25.1. 14:30 pünktlich!

PRAKTIKUM 2: 

Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante (KM-Wert) der Lactatdehydrogenase (LDH) für Pyruvat, Ermittlung der Sättigungskonzentration und der maximalen Umsatzgeschwindigkeit (= Enzymmenge),

Statistische Auswertung der Ergebnisse der Gruppe

Biochemisches Praktikum / Seminar• Ort der Lehrveranstaltungen:

• PRAKTIKUM 1: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 3, Eingang auf Seite Türkenstraße, Parterre.

• PRAKTIKUM 2:  Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 1, Haupteingang, 1. Stock.

Pünktlichstes Erscheinen!

Art der Leistungsüberprüfung: LV mit “permanenten Prüfungscharakter” =

= Anwesenheitspflicht + Mitarbeit + Kurzreferat

Anwesenheitsblatt: https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n202-2011/?state=0-10538-293_2/block-3-vom-molekuel-zur-zelle

16.01.2018

4

SEMINAR 1:

Mediziinische ChemieSeminar 1

7

Wozu Experimente und Labordiagnostik?

Neben Blickdiagnose und Anamnese sind chemische du biochemische Parameter von entscheidender Bedeutung für Diagnose und Therapie „Molecular precision medicine“

• Voraussetzungen: Allgemeines Verhalten im Labor

Führung von Protokollen

Erkennen von Fehlerquellenzufällige und systematische Fehler,

Streuung der analytischen Daten

• Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags

Arbeiten im Labor - Forschungslabor


8

GSP (good scientific practice)

Garantie der Reproduzierbarkeit

Strikte Vermeidung von Plagiarismus

Strikte Vermeidung von Fabrification

Protokollbuch

Nachvollziehbarkeit garantieren

IPR (intellectual property right) – Patente beachten

10 Jahre aufbewahren

16.01.2018

5

Arbeiten im Labor - Sicherheit


9

Hausverstand !!! Sauberkeit am Arbeitsplatz, Zusammenräumen nach Experiment Allgemeine Chemikalien (nach Gebrauch schließen, nichts zurückgießen) geeignete Schutzkleidung

Handschuhe

Arbeitsmäntel

Schutzbrillen ……

nicht Essen, Trinken, Rauchen….. Entsorgung von Gefahrenstoffen

Protokollführung (obligatorisch, Protokollheft A5)


10

Versuch, Datum (nicht Versuch 2 sondern Aminosäuretrennung mittels DC) Versuchsbedingungen (Reagenzien, Konzentration, Volumen,..........)… Ergebnisse (abgelesenen Werte, auch negative) Berechnung Endresultat: (Einheiten, signifikante Stellen) Interpretation (Diagnose positiv, Verdacht auf....)

Das Versuchsprotokoll beginnt mit einer Aufgaben- oder Fragestellung, erwähnt die verwendeten Reagentien und Geräte, beschreibt die Durchführung eines Experiments und dokumentiert Beobachtungen, Fehler, Erklärungen sowie die Auswertung der Ergebnisse.

16.01.2018

6

FEHLER - Minimieren


11

Die Ergebnisse aller Analysenverfahren sind nichtfrei von Fehlern!

• grobe Fehler

• zufällige Fehler

• systematische Fehler

Kenngrößen


12

• zufällige Fehler beinflussen die Reproduzierbarkeit der Experimente und Analysen

• Präzision = Reproduzierbarkeit

• systematische Fehler verursachen falsche Ergebnisse

• Richtigkeit = Abweichung des Mittelwertes von Mehrfachbestimmungen vom tatsächlichenWert

Präzision: gut schlecht gutRichtigkeit: gut gut schlecht

16.01.2018

7

Messgrößen


13

• Für Präzision (zufälligen Fehler): • können mit der Gaußschen Verteilung beschreiben werden

– Standardabweichung, Variationskoeffizient

• Für Richtigkeit (systematischen Fehler):– Abweichung des Mittelwerts

vom wahren Wert

Standardabweichung

Meßgrößen für zufällige Fehler


14

Mittelwert

Varianz

Standardabweichung

Variationskoeffizient

(x)x =

n

n = Anzahl der Einzelmessungen

x = Einzelmessung

(x-x)2s2 =

n-1

s = (x-x)2

n-1

sVK =

x.100

16.01.2018

8

Zusammenhang zwischen Sensitivität und Spezifität von Methoden


15

• Sensitivität beschreibt die Fähigkeit, tatsächlich Kranke als krank zu identifizieren.

richtig positiverichtig positive + falsch negative

• Spezifitätbezeichnet die Fähigkeit, tatsächlich Gesunde als gesund zu identifizieren.

richtig negativerichtig negative + falsch positive

• Screening (Suchtest)i. hohe Sensitivitätii. niedrige Spezifität

Die "Sensitivität" (richtig positive Rate eines Tests) bezeichnet den Anteil der test-positiven Personen unter allen Erkrankten einer Stichprobe, d. h. die Wahrscheinlichkeit, mit einem diagnostischen Test die Kranken auch als krank zu identifizieren. Eine hohe Sensitivität wird angestrebt, wenn eine Erkrankung mit hoher Sicherheit ausgeschlossen werden soll.Die "Spezifität" (richtig-negative Rate eines Tests) beschreibt den Anteil der Test-negativen Personen unter allen Nicht-Erkrankten einer Stichprobe, d. h. die Wahrscheinlichkeit, mit einem diagnostischen Test Nicht-Erkrankte korrekt zu identifizieren. Eine hohe Spezifität wird angestrebt, wenn eine Erkrankung mit großer Sicherheit bestätigt werden soll.

Zusammenhang zwischen Sensitivität und Spezifität von Methoden


16

• Sensitivität beschreibt die Fähigkeit, tatsächlich Kranke als krank zu identifizieren.

richtig positiverichtig positive + falsch negative

• Spezifitätbezeichnet die Fähigkeit, tatsächlich Gesunde als gesund zu identifizieren.

richtig negativerichtig negative + falsch positive

• Screening (Suchtest)i. hohe Sensitivitätii. niedrige Spezifität

16.01.2018

9

Verteilung der Messdaten

> 95% der Daten

Hohe Spezifität aber geringe Sensitivität

Hohe Sensitivität aber geringe Spezifität

Quellen:http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/zaspel-uta-2003-09-26/HTML/chapter2.htmlhttps://de.wikipedia.org/wiki/Standardabweichung_%28Wahrscheinlichkeitstheorie%29Georg Weitzer,MUW 01/2017

Konvention:Alle Daten die kleiner oder größer als der Mittelwert +/- 2 x Standardabweichung sind, werden ausgeschieden.

Sig

nals

tärk

e

IdealzustandGesunde Kranke

Qualitätskontrolle – Qualitätsmanagement in medizinisch-analytischen Labors


18

• Extern: Versenden von gemessenen Proben

• Intern: mit Standards

16.01.2018

10

Bewertung von Messergebnissen bei Patienten


19

• Longitudinal– Verlaufskontrolle über lange Zeit

• Transversal– Vergleich mit Referenzbereich (Gesunde + andere Patienten

• Referenzbereich• z.B. Mittelwert + 2 s

SEMINAR 1:


20

Wozu Experimente und Labordiagnostik ?

Voraussetzungen

Allgemeines Verhalten im Labor

Führung von Protokollen

Fehlerquellenzufällige und systematische Fehler, Streuung

Inhalt des ersten Praktikumstags

16.01.2018

11

Für das Praktikum


21

mitbringen:

• Arbeitsmantel• Skriptum• Rechner, Bleistift, Lineal...• Protokollheft• Anwesenheitsblatt

Trennmethoden


22

• Dünnschichtchromatographie• Ionenaustauschchromatographie• Reversed Phase Chromatography

(apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)• Gaschromatographie• Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie)• Affinitätschromatographie

• Elektrophorese

16.01.2018

12

Allen Methoden ist gemeinsam, dass die Moleküle durch den unterschiedlich langen Aufenthalt in zwei nicht mischbaren Phasen getrennt werden.

Phasen sind z.B. Lösungsmittel, Oberflächen, Antikörper, …

Georg Weitzer, MUW 01/2017

Nernstscher VerteilungssatzBeschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig).

Verteilungskoeffizient c =[Br2] Chloroform[Br2] Wasser

Chemie erleben Wawra et al.

Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017

16.01.2018

13

Inhalt


25

1. DC von Aminosäuren

2. Pipettierübung (Präzisionskontrolle)

3. Gelfiltration

4. Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen

1. Trennung von Aminosäuren mittels der Dünnschichtchromatographie


26

• Stationäre Phase

• Cellulose auf Aluminiumträger, (mitWasser gefülltes Gel)

= hydrophil

• Mobile Phase

• Organisches Lösungsmittel

= hydrophob

16.01.2018

14

Auftragen der Proben


27

Glasröhrchen

Cellulose auf Alu-folie

Standard, Referenzwert


28

Laufmittel= mobile Phase

Glastrog nach ca. 90 min

16.01.2018

15

Markieren der Front & Rf-Wert berechnen


29

Front

Start

Wanderstreckeder mobilenPhase

Rf-Wert berechnen

Wanderstreckeder Aminosäure

Auswertung


30

Nernstscher Verteilungssatz

Verteilungskoeffizient c =

W(as) = Rf(as)

W(m)

• Rf = Retentionsfaktor

[Aminosäure] stationäre Phase

[Aminosäure] mobile Phase

Chemie erleben, Wawra et al. Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zweimiteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig/flüssig oder flüssig/fest oder flüssig/flüssig).

16.01.2018

16

2. Pipettierübung (Präzisionskontrolle)


31

1. In eine Mikrotiterplatte werden in eine Spalte achtmal 125 µl Wasser pipettiert und

2. 75 µl gelbe Farbstofflösung zugesetzt.

3. Nach Pipettieren der Farbstofflösung wird durch mehrfaches Aufziehen mit der Pipette gemischt!

4. Die 1. Spalte dient als Leerwert (LW), in die nur destiliertes Wasser (200 µl) pipettiert wird.

5. Die Konzentration des Farbstoffs in diesen Mischungen wird durch Messung der Extinktion bei 415 nm mit einem Photometer bestimmt.

6. Berücksichtigen Sie bei Ihrer Auswertung den LW, indem sie den Mittelwert des LWs bilden und diesen von Ihren Messwerten abziehen! Aus den so erhaltenen 8 Werten/Spalte errechnen Sie nun jeweils den Mittelwert, die Standardabweichungund den Variationskoeffizienten. Das Resultat kann bei einem VK

16.01.2018

17

Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemischesmittels Gelfiltration


33

• Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer equilibriert.

• 0.5 ml der Probe direkt auf die

trockengelaufene Glasfritte auftragen.

(Dextranblau und Methylrot)

• Wenn vollkommen ins Säulenmaterial

eingedrungen, ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen.

• Austretender Elutionspuffer in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) sammeln.

• Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit 1 Tropfen HCl ansäuern.

Glasfritte

3. Gelfiltration


34

Chemie erleben, Wawra et al.

16.01.2018

18

Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration


35

Dextranblau: großes Molekül, eluiert zuerstMethylrot: kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus

Ionenaustausch- bzw. Affinitätschromatographie


36

16.01.2018

19

4. Elektrophorese


37

Die Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld

Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine


38

Voraussetzungen:

• Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein.

• richtige Wahl des Puffers !

• Trägermaterial (analog zur stationären Phase)

• Gleichstromquelle

16.01.2018

20

Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn die Proteine zur Anode wandern sollen?


39

• pI (Serumproteine) ~ 5

• Anode = + Pol

• Kathode = - Pol

• Puffer soll pH > 5 sein, also in der Praxis bei 9 liegen

isoelektr. Punkt

Elektrophorese -Durchführung


40

Vorbereitung – Pipettieren kleiner Volumina – Proben auftragen

16.01.2018

21

Nach der Elektrophorese


41

• Färben der Proteine

• Trägermaterial durchsichtig machen

• Densitometrische Auswertung

• Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials

Elektropherogramm


42

Chemie erleben Wawra et al.

16.01.2018

22

Diagnostische Aussagemöglichkeiten


43


44

Wie Grundlagenforschung zu technologischen und oder medizinischen Anwendungen führen kann:

16.01.2018

23

Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen mit derSDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)


45

Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen mit derSDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)


46

Immunoblot: Nachweis eines bestimmten Proteins mittels Antikörpers

16.01.2018

24

Isoelektrische Fokussierung


47

• Auftrennung über pH Gradienten

2D-Gelelektrophorese - Proteomanalyse


48

1. Isoelektrische Fokussierung

2. Dann SDS-PAGE

16.01.2018

25

2D-Gelelektrophorese – Proteomanalyse - Beispiele


49

Quelle: Wikipedia

Maximal . 20 000 Punkte

Veränderte neue Kernproteine in Tumorproben identifziert mit 2D-Gelelektrophorese und Massenspektroskopie (MALDI-TOF)

50

Holzmann K et al. Eur J Biochem. 1997;244(2):479-86.


Liver tumor

Burkitts lymphoma

Rat lung tissue

Rat testis tissue

Diagnosemöglichkeit:

16.01.2018

26


51


52

1. Praktikum: Gruppe 26 Do. 12:30 pünktlichstGruppe 30 Do. 16:00 pünktlichst

Documents

Block 3 Vom Molekül zur Zelle Biochemie Seminar & Praktika · 2018. 1. 16. · 16.01.2018 3 Organisational unit Presentation title / topic OR Presenter's name 5 Biochemisches Praktikum