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ANÁLISIS DE
AZÚCARES EN
ALIMENTOS
1. INTRODUCCIÓN:
Los CH, constituyen la mayor parte de los componentes vegetales.
CH son los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosa, pectinas y gomas.
G-F y S; se acumulan especialmente en el jugo celular.
Almidones: son CH de reserva y se encuentran en forma de plastidios.
La Hemic. Y Pectinas; son polisacáridos (material estructural)
Gomas; productos de deshechos.
ANÁLISIS DE AZÚCARES EN ALIMENTOSANÁLISIS DE AZÚCARES EN ALIMENTOS
2. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
2.1. Métodos Químicos basados en la reducción del Cu
2.2. Métodos Físicos
-Polarimetría
-Refractometría
2.3. Métodos Enzimáticos
2.4. Métodos Cromatográficos
-Cromatrografía de Gases (CG)
-Cromatografía Líquida (HPLC)
CARBOHIDRATOS
Pertenecen al grupo de nutrientes
básicos
Cx(H2O)y
Polihidroxicetonas o polihidroxialdehídos y derivados.
Interés de su análisis: - Control de etiquetado
(diabéticos...)- Determinación contenido en Energía- Calidad y adulteraciones en jugos de frutas- Controlar el azúcar de
remolacha- Perfiles de fermentación- Hidrólisis del almidón...
-Monosacáridos-Oligosacáridos-Polisacáridos
Funciones:- Edulcorantes (glu, fru,sac...)- Modificadores de viscosidad- Estimulantes de insulina- Fte de E en dieta- Influencia en textura- Sabor y olor (Maillard)
Azúcares más importantes: - Monosacáridos:
- glucosa- fructosa
- Disacáridos:- sacarosa- lactosa - maltosa
Mezcla= Azúcar invertido
1.- INTRODUCCIÓN
OH
OHOH
CH2OH
OH
O
-D-glucosa
OH
OOH
CH2OH
OH
OOHOH2C
CH2OHOH
OHSacarosa
OHOH2C CH2OH
OH
OH
-D-fructosa
1.- INTRODUCCIÓN
OH
1.- INTRODUCCIÓN
Disacárido o Trisacárido Monosacáridos formados por hidrólisis
Sacarosa Glucosa y fructosa
Lactosa Glucosa y galactosa
Maltosa Glucosa (dos moléculas)
Rafinosa Galactosa, glucosa y fructosa
Melizitosa Glucosa (dos moléculas) y levulosa
Azúcar Poder Edulcorante Relativo Rotación específica (º circulares)
Lactosa 16 +52.5
Rafinosa 22 +104.0
Galactosa 32 +80.2
Ramnosa 32 +8.3
Maltosa 32 +137.0
Xilosa 40 +18.8
Glucosa 74 +52.5
Sacarosa 100 +66.5
Azúcar invertido 130 -20.1
Fructosa 173 -92.3
Reac DISOLUCIÓN DE AZÚCARES
DISOLUCIONES DE FEHLING (CuSO4 + tartrato Na/K, NaOH)
MonosacáridosAlgunos disacáridos
-C=O; -C=O = Agentes reductores
H
R-C=O [ox] R-C=O + 2H+
OH
Cu+2 + 1e- [red] Cu+ Q/OH- Cu2O (rojo ladrillo)
2.-MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
2.1.- Métodos químicos basados en la reducción del Cu
No reductores: hidrólisis = monosacáridos.
Cu2O (rojo ladrillo
Determinación del precipitado de óxido cuproso
2.1.-Métodos químicos basados en la reducción del Cu
A) Secar y pesar directamente (si no hay precipitados, ej: Ca...)
C.2) Valoración con KI: Cu+2 + 1e- Cu+ I- + 2e- I2 (yodometría con tiosulfato)
C.1) Electrolisis del cobre: Cu+2 + 2e- Cuº (metálico)
(diferencia de lo que pesa el cátodo antes y después)
- reacción de reducción: NO-3 + 4H+ + 3e- NO + 2H2O
- reacción de oxidación: Cu+ Cu+2 + 1e-
C) Disolución de Cu2O en HNO3 (oxidante):
B) Disolución de Cu2O en Fe2(SO4)3 y valoración con KMnO4 (Mét. de Bertrand)
-Felhing A:
34,64 g CuSO4 500 mL H2O
-Felhing B:
173 g tartrato sódico potásico + 50 g NaOH 500 mL H2O
5 mL A + 5 mL B + 40 mL H2O son reducidos por 0.05 g de glucosa
a. Método de Felhing:
2.1.- Métodos químicos basados en la reducción del Cu
Procedimiento más clásico
Imprescindible operar siempre en las mismas condiciones
Concentraciones entre 0.5 y 1 %
-Felhing A:
69,278 g CuSO4 1 L H2O
-Felhing B:
346 g tartrato sódico potásico + 100 g NaOH 1 L H2O
2.1.- Métodos químicos basados en la reducción del Cu
b. Método de Lane y Eynon:
Uso de azul de metileno 1%
Se trabaja con 10 mL o con 25 mL de solución de Felhing
Tablas para 10 mL y tablas para 25 mL
Azúcar (mg / 100 mL disolución) = (Factor x 100) / Título
Título(mL de disol.
gastados)
Factor
Glucosa
Factor
Fructosa
Factor
Sacarosa
10 50 65 90
12 55 80 92
14 60 88 93
b. Método de Lane y Eynon:
2.-MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
2.2.- Métodos físicos
a. POLARIMETRÍA
Azúcar actúa sobre la luz polarizada desviación =
f([az])
Poder rotatorio = desviación en º del plano de luz polarizada debido a la presencia de una sustancia determinada
[20D=.V/l.p
Determinación cuantitativa de sacarosa, azúcar invertido, glucosa y
fructosa
Azúcar Rotación específica (grados
circulares) Lactosa Rafinosa Galactosa Rammnosa Maltosa Xilosa Glucosa Sacarosa Azúcar invertido Fructosa
+ 52.5º + 104.0º +80.2º +8.3º
+137.0º +18.8º +52.5º +66.5º -20.0º -92.3º
2.2.- Métodos físicos
a. POLARIMETRÍA
Muy usado para el control rápido de
fábrica
Con un refractómetro se mide el índice de refracción
Los azúcares en disolución se expresan en % de sólidos solubles (Brix)
2.2.- Métodos físicos
B. REFRACTOMETRÍA
2.-MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
2.3.- Métodos cromatográficos
Bala de gas
portador
Inyect. Horno Columna Detect
Cromatografía de Gases
CG
Cromatografía Líquida de Alta Resolución
HPLC
Ventajas:
Rápida y muy sensible
Aplicación:
Identificación y cuantificación de monosacáridos y oligosacáridos
Inconvenientes:
Transformación preliminar de los glúcidos en compuestos volátiles
Cada monosacárido suele dar numerosos picos (anómeros y , etc)
CROMATOGRAMAS COMPLEJOS
A. CROMATOGRAFÍA DE GASES
Trimetilsililación
Azúcar (no volátil) Eter trimetilsililo (volátil)
Analizable por CG con detector FID
Agentes sililantes:
- Hexametildisilazano (HMDS)- Clorotrimetilsilano (TMCS)- Piridina
2:1:10 vol/vol
R-OH + CH3 -Si-NH-Si- CH3 R-O- Si- CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Azúcar HMDS Eter trimetilsililo
La elección del procedimiento a emplear dependerá de:- matriz de muestras- analitos de interés- resolución requerida- presencia de sustancias interferentes- requerimientos de velocidad de análisis
Ventajas:
No requiere derivatización previa
No existe un procedimiento universal para la determinación de todos los carbohidratos por HPLC
Inconvenientes:
El detector de IR que es el más comúnmente utilizado no es específico, es sensible a cambios en la temperatura, le afecta la composición de los disolventes y por tanto no se puede trabajar con él en gradiente.
B. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Desalado de la muestra:
Esquema general de la preparación de la muestra
Extracción de la grasa con disolventes orgánicos:- Eter de petróleo- Tetracloruro de carbono- Hexano
Desproteinización por extracción de la muestra:
- Mezcla de alcohol (EtOH) y agua- Etanol, HClO4 dil., seguido por acetonitrilo, 2-propanol- Agua caliente (¡ojo! con la temperatura r. de hidrólisis)
- Resinas anión / catión
- Columnas resina-base especiales- Solución TEPA en CH3CN/H2O (remedio temporal)
- Precolumnas “on-line” de intercambio iónico
PROCESO CROMATOGRÁFICOPROCESO CROMATOGRÁFICO
•INYECCIÓN: Se inyecta la muestra en la corriente de la f.m., que es un disolvente o una mezcla de disolventes
•SEPARACIÓN: Pasan a una columna que contiene la fe (líquido o sólido) adecuada para que efectúe la separación, retardando el flujo de los componentes de la muestra.
•DETECCIÓN: Los compuestos separados salen a diferentes intervalos, pasan a través de un detector, y se registran en papel, obteniéndose así el cromatograma.
TR
Area
Análisis Cualitativo
Análisis Cuantitativo
BA
S
ttrB trA
CROMATOGRAMA
ANÁLISIS CUALITATIVO
tR o t’R f(Tª, f.e., f.m., flujo,etc) pequeñas fluctuaciones en cualquiera de las condiciones experimentales da lugar a resultados erróneos
1º
BA
S
tRB tRA
P1P2
Cromatograma de los patrones
Cromatograma de la muestra
Tiempo de Retención Relativo
2ºANÁLISIS CUALITATIVO
Se reducen los errores anteriores tRA – t0 = tRS – t0
BA
S
tRB tRA
P1P2
tRS
S
SCromatograma de la muestra con la sustancia de referencia
Cromatograma de los patrones con la sustancia de referencia
ANÁLISIS CUALITATIVO
Adición del patrón a la muestra
3º
A
S
A + P
P
Cromatograma de la muestra
Cromatograma de la muestra con el patrón
tRA
A
Indice de Retención de Kovats
4ºANÁLISIS CUALITATIVO
*Muy reproducible incluso en muestras cromatografiadas en distintos cromatógrafos
tRZ+1 tRA tRZ
S
ZA
Z+1
IA = 100 z + 100
log tRA - log tRZ
log tRZ+1 - log tRZ
PROBLEMA * Analitos con el mismo tR
SOLUCIÓN * Cambiar condiciones
experimentales Cambio en los tR
ANÁLISIS CUANTITATIVO
* Altura del pico* Altura del pico * Area del pico* Area del pico
Forma de medir Áreas
* Triangulación
* Cuadratura
* Planímetro
* Recorte y pesada
* Integración Electrónica
PARÁMETROS DE MEDIDA
MÉTODOS CUANTITATIVOS
* Método del Estándar Externo
* Método del Estándar Externo
* Método del Estándar Interno
* Método del Estándar Interno
ANÁLISIS CUANTITATIVO
1ºMÉTODO DEL ESTÁNDAR EXTERNO
P4P3P2P1 M
A
Concentración de analito
P1 P2 P3 P4M
A4
A3
AMA2
A1
2º MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO
E EE E E
P4P3P2P1M
M’ P’1 P’2 P’3 P’4
P1 /E
A1 /AE
P3 /E P4 /E
Concentración de analitoConcentración de estándar
A2 /AE
A3 /AE
A4 /AE
AanalitoAestándar
M/E
P2 /E
AM /AE
*
*
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