View
36
Download
8
Category
Preview:
DESCRIPTION
Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) MHC tipizálás Hiperszenzitivitási reakciók. (a diasorhoz tartoznak a FIG4(T-APC).MPG (998KB) és a pro5.exe (4414KB) animációkat tartalmazó fájlok). - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.)
Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló
immunológiai módszerek (ELISA)
MHC tipizálás
Hiperszenzitivitási reakciók
(a diasorhoz tartoznak a FIG4(T-APC).MPG (998KB) és a pro5.exe (4414KB) animációkat tartalmazó fájlok)
Az immunoesszék érzékenysége
A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése
1. A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával
lektinek által indukált aktivációα-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció(korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata)2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése
aktivációs markerekproliferatív válasz 3H-timidin beépülés
CFSE fluoreszcencia feleződéssejtciklus vizsgálata
Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA)
3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után
ELISPOTIntracelluláris citokin festésPentamer (vagy tetramer) technikaPentamer (vagy tetramer) technika
Témák:
A humorális immunválasz szakaszai
felismerés aktiváció, proliferáció, differenciáció
Nyugvó IgM+, IgD+ érett B-sejt
AntigénAktivált
B-sejt
Segítő T-sejt,más stimulus
Klonálisexpanzió
B-sejt
Nagy affinitásúIg-t expresszáló
B-sejt
Nagy affinitásúIgG
MemóriaB-sejt
Affinitásérés
Izotípusváltás
Antitesttermelés
IgG-t expresszáló
A T-sejt válasz szakaszai
Antigénfelismerés
Klonális expanzió
Differenciáció Effektorfunkciók
NaívCD8+
T-sejt
NaívCD4+
T-sejt
Citokinek(pl. IL-2)
Citokinek(pl. IL-2)
Nyirokszervek Perifériás szövetek
CD4+ EffektorT-sejt
CD8+ EffektorT-sejt (CTL)
CD4+ MemóriaT-sejt
Aktiváció
CD8+ MemóriaT-sejt
Makrofágok, B-sejtek,
más sejtek aktivációja
Fertőzötttarget sejtek
ölése,makrofágaktiváció
B-sejt receptor komplex általi jelátvitelMembrán Ig
keresztkötéseantigénnel
Tirozinfoszforiláció
Biokémiaiintermedierek
Aktív enzimek
Transzkripciósfaktorok
PLCaktiváció
Emelkedettic Ca2+
Ca2+ dependens enzimek
Diacilglicerol
GTP/GDP cserea Ras-on, Rac-on
T-sejt receptor komplex általi jelátvitel
Az áttekintett folyamatok többsége lépéseiben vizsgálható
TCR mediáltjelek
indítása
Biokémiaiintermedierek
Késői jelátvitelenzimei
Transzkripciósfaktorok
kalcineurin MAP kinázok
Diacilglicerol
GTP/GDP cserea Ras-on
PLC1aktiváció
Adapterfehérjék
T sejt
Emelkedett ic Ca2+
Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.
Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki.
Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek
gyakorisága kicsi.
A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA+Ionomycin jelenlétében
B-sejt (egér) T-sejt T-sejt
BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák
LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket
A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék.
A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével
aktiválják a sejteket.
Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja
a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő
PMA-val
TLR4
Poliklonális B-sejt aktivátorok és hatásaikAktivátor T-sejt függés Ig szekréció
Humán B-sejt
PWM (pokeweed mitogen) nincs van
SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) nincs van
EBV (transzformáló hatású is) van van
Anti-Ig van citokinek jelenlétében
Egér B-sejt
LPS nincs van
PWM van van
PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) nincs van
Anti-Ig nincs citokinek jelenlétében
Poliklonális T-sejt aktivátorokPhytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis
Concanavalin A (ConA) lektin Phaseolus vulgaris
anti-CD3 monoklonális ellenanyag
Receptorok ligand általi aktivációja(„keresztkötés”)
(pillanatszerű)
foszforilációs lépések(másodpercek-percek)
- Western blot- Bead array
ic Ca2+ szint emelkedés
- FACS, mikroszkópia
Génaktiváció - RT-PCR
Citokin szintézis
Citokin szekréció
- IC citometria
- ELISA, ELISPOT- Bioassay
Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok)
Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom- IN antigének
Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTTA limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata
Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson
alapul
- FRET
A jelenlevő vagy termelt „antigének” (fehérjék, citokinek, ellenanyagok, ….)
vizsgálata
ELISA
ELISA plate (lemez)
Enzyme Linked Immune Sorbent Assay
lyuk avagy kút
Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre
enzyme linked immune sorbent
ellenanyaghoz konjugált enzim
enzim
felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok
Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás
Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk
Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusaihasznált módszerek alaptípusai
(szempontok: hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár)
Direkt módszer Indirekt módszer
Felület
Antigén
Primer ellenanyag
Jelzés
Jelzés
Szekunder ellenanyagok
egyszerűség több jel nagyobb érzékenység
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusaisorán használt módszerek alaptípusai
Enzim-antienzim rendszer(leginkább mikroszkópos immunhisztokémiában lehet találkozni vele)
PAP – peroxidáz / anti-peroxidázAPAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz
Antigén
Primer ellenanyag
Szekunder ellenanyagok
A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus
ellenanyagok
Enzimek
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai
Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerekAz avidin nagy affinitással képes a biotint kötni
Egyszerű ABC
Antigén
Biotinált ellenanyag
Avidin
Avidin-enzim komplexek
Biotin-enzim komplex
Avidin Biotin enzimComplexek
(arányok!!! mint a precipitációnál)
Jel felerősítése
A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják.rendszereket összekombinálva is használják.
Lásd a következő példákat. Lásd a következő példákat.
Az ELISA rendszerek nem csak a vizsgált anyag jelenlétének a kimutatására, hanem ismert
koncentrációjú sztenderdek segítségével a pontos mennyiség meghatározására is alkalmasak
Bioaktív anyagok kimutatása
hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek
doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása
szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel
Tumor antigének kimutatásaCitokinek, hormonok kimutatása
kombinált „szendvics” ELISA
Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. szérum, liquor, szennyvíz).
A nem kötődő anyagok kimosása
telítés: a szabad plasztikfelület beborítása
aspecifikus fehérjével
felesleges fehérjék kimosása
eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált
ellenanyagok hozzáadása
felesleges ellenanyagok kimosása
avidinnel konjugált enzim hozzáadása
színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása
citokin specifikus ”capture” ellenanyagok
kitapasztása
citokintartalmú minta hozzáadása
felesleges konjugátum kimosása
Tumordiagnosztika
A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában
Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak
Tumor antigén (pl. a beteg szérumából)
Tumor Ag specifikusdetektor/reporter
ellenanyag (a kit része)
Tumor Ag specifikuscsapda ellenanyaggal
fedett felület (a kit része)
Prosztata daganatok• prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával.• Hasonlóan használható fel a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból
Hólyagrák:Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker
Pajzsmirigy daganatok:A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker
Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet.
Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára.
Her-2/neu protein:185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.
egyszerű indirekt ELISA lépéseiAntigén specifikus ellenanyag kimutatásához
az antigén kitapasztása(coating avagy fedés)
felesleges antigén kimosásatelítés: a szabad plasztikfelület
beborítása aspecifikus fehérjével
felesleges fehérjék kimosása
specifikus ellenanyagok hozzáadása
Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok
hozzáadása
felesleges ellenanyagok kimosása
színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása
Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid
segítségével
HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid
Fertőzések diagnosztikája
Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor.
vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak
a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez
emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét
ilyen elven működik:• Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t• HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból• Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatásA toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.
AutoimmunitásA különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják
Pl.SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben
számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható).
I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével:
• glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% -ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene
• IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75% -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető.
• inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)
Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása
A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál).Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia).Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető.
Antigén
IgM IgG
anti-IgM anti-IgG
Memória válasz
Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében
Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma)
ellenanyag capture-ellenanyag
a szérum ellenanyaga
izotípus specifikus ellenanyag
kompetitív ELISAÉrzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez.
- A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás
- Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása
-Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés
- Mosás
- Kromogén anyagok hozzáadása
Gyakran használják kis méretű antigének, vagy haptének esetében. Ha kevés az antigénen a hozzáférhető epitop, a szendvics ELIZÁban lefoglalja ezeket az első „capture” ellenanyag.
A színreakció itt fordított: több oldott antigén = halványabb szín
ELISA alaptípusok (összefoglalás)
egyszerű capture/szendvics
antigén
Ag specifikusellenanyag
detektor/reporterellenanyag
kompetitív
pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához
antigén
Ag specifikuscapture ellenanyag
Ag specifikusdetektor/reporter
ellenanyag
antigének kimutatásához
az oldatban jelen van a kimutatandó Ag
Ag specifikusellenanyag
kis mennyiségű, kis méretű antigén kimutatásához (elég ha ha csak egyféle specifikus ellenanyaggal rendelkezünk)
antigén
nincs jelen oldott Ag
Aspecifikus kitapadásból eredő hiba
A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető:
•telítéssel/blokkolással•detergens alkalmazásával
ELISA hibák
Az antigén mellett a plasztik felületrekitapadhatnak maguk az ellenanyagok is
- akár közvetlenül
- akár indirekten
a színreakció ugyan az
hook effect! – nagy koncentráció vagy kevés mosás miatt
Elkészült ELISA lemezekElkészült ELISA lemezek
pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből
(terhességi teszt)
Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását
kihasználó technikán alapulnak!
Diagnosztikai gyorstesztek:
hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal
nitrocellulóz membrán
jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter(A jelzés szabad szemmel is látható!)
elölnézet oldalnézet
hCG csapda ellenanyag sáv
kontroll ellenanyag sáv
abszorbciós rész (cellulóz, papír)
abszorbciós lap, mintafelviteli rész
vizeletminta
hCG csapda ellenanyag sáv
kontroll ellenanyag sáv
jelölt ellenanyagok
hCG
kontroll sáv
teszt sáv
van hCG nincs hCG
a jelölt ellenanyagra specifikus
ellenanyagok
Elvben a szendvics ELISÁra hasonlít
hCG sáv( kikötött hCG)
kontroll ellenanyag sáv
a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok
kontroll sáv
teszt sáv
van hCG nincs hCG
Ugyanez kompetitív rendszerben
A kompetitív ELISA elve hasonló
Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre:•kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek)
•festékkel töltött latex gyöngyök
Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására
Az eljárás szemikvantitatívá tehető
Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei:
élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása
ELISPOTEnzyme Linked Immuno-Spot
• Elve hasonlít az ELISA-hoz• Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának
meghatározására szolgált.• Ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek,
kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is.
• Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására.
• Érzékenység: kb. 1 per 300 000 sejt• Az első lépéseit sejtkultúrában aszeptikus körülmények között
végzik.
ELISPOT- a capture ellenanyagok kitapasztása
- blokkolás
- a sejtek hozzáadása
- biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például)
- avidin-enzim konjugátum
- oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol)
(aktiválás, inkubáció)
- mosás
A citokin termlő sejt helyét mutató folt
Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal
A mérés menete
Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)
A spotok száma az ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja
A spotok mérete arányos az ellenanyag vagy citokin termelő képességgel
A spotok által elfoglalt összterület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi
Western blotWestern blot
Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő
specifikus kimutatására alkalmas.Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is
vizsgálható vele.
• Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményeivizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei
sok, legalább 106 sejt szükséges a vizsgálathoz
A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás)A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk.
Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy anti-foszfotirozin elleanyaggal a foszforilált fehérjék sávja)
A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat membránra viszik át(PVDF, nirocellulóz)
Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik:
• enzimmel konjugált ellenanyag• indirekt módszer (primer és szekunder ellenanyagok)
StandardProtein minta
SDS-PAGE Membrán Western blot
Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján
Western Blot
pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotjapl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja
aktiválatlan ConA PHA
A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben
Y P-Y P-Y
P-Y blot
A pozitív HIV tesztet megerősítő WB vizsgálati módszerek:
Western-blot:HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja.Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják.A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak.
Fab
Fc
Epitóp a protein felszínén
Primer ellenanyag
Szekunder ellenanyag
Torma- peroxidáz
Immobilizált proteinek
Membrán
H2O2
H2O
luminol
enhancer
h
Detektálás
Megnövelt kemilumineszcencia/Enhanced chemiluminescence (ECL)/
• H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol)• Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba• A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható• A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer)
luminol
„Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok
(1. )
(proteomika?)
Cytokine arrayCytokine array
A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít
( - )
IFN
( + ) IL-2 IL-4 …
…
MIP3β …
különféle kikötött specifikus ellenanyagok
Vizsgálandó citokin tartalmú oldat
Jelzett ellenanyagok keveréke
Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas
Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség
CD40L ésCD40L+SLAM kombinációvalaktivált moDC citokin termelése
Réthi és mtsi. 2006
Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia• Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.)• Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak paraformaldehid, glutáraldehid – kémiai keresztkötésekalkoholok – vízelvonó szer (szövettípustól és az antigéntől függően)• Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban
• Immunfluoreszcencia• fluoreszcensen jelzett ellenanyag – fluoreszcens mikroszkóp
FITC – fluoreszcein izotiocianátPE – fikoeritrin, stb.
• Immunoenzim módszer• enzimmel konjugált ellenanyag
P – peroxidázPA – alkalikus foszfatáz(a szubsztátból oldhatatlan, színes
csapadékot képeznek)
Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC)Aktin mikrofilamentek kimutatása
Szövetminta
FIXÁLÁS
Festés előtti metszetFAGYASZTÁS
METSZÉS
IMMUNHISZTOKÉMIA
„FESTÉS” - rácseppentett reagensekkel
ImmunhisztokémiaABC Technika (lásd a korábbi diát is)
Secunder antitest
Avidin
Szövetmetszet
Sejtek (sejttenyészetek)
Tárgylemez
Primer antitest
Biotin
Enzim
X
normál hisztokémia (nem immun)
Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)
Immunhisztokémia(CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)
Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC)Aktin mikrofilamentek kimutatása
Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugáltphalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.
A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek:
Western-blot (lásd a korábbi dián)HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja.Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják.A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak.
Immunfluoreszcens vizsgálat:A teszt immortalizált, HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget.
Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában, immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)
Autoimmunitás immunfluoreszcens diagnosztikája
A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is ki lehet mutatni
A termelődött citokinek intracelluláris kimutatásaimmunfluorimetriával
jelzéssel ellátott citokin-specifikus ellenanyag
- a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni
- de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció)
citokinek
- előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént
felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők
(„sejttípus marker” pl. CD4)
Eredmény:
Megtudható az is belőle, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket!
Érzékenysége elérheti a Western blot-ét(pl. hűtött CCD kamerás mikroszkóppal– akár egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz)
Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a
jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók.
BioassayBioassay
pl. Wehi 164 sejtek
pl. CTLL2 sejtek
van IL-2 nincs IL-2
van TNF nincs TNF
Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL2.
A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (pl. MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg.
citokinkoncentráció
IL-2
TNF
CTLL2CTLL2
Wehi 164Wehi 164
MTT assay:
„Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok
(2.) (áramlási citométerrel)
(proteomika?)
Az eljárás kis térfogatokkal (5-20l) is működik, de műszerigényes.
CytometricCytometric/multiplex/multiplex bead array (CBA) bead array (CBA)A cyitokine array-hez hasonló alapelvű áramlási citometriás módszer.A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású
gyöngyök azonosítják
CBA cytokine array
IL-2
IL-4
IL-8
…
…
IL-12 IL-23 IL-17 … …
A CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAvalA CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAval
Szendvics ELISA CBA
Cytometric/multiplex bead array (CBA)Cytometric/multiplex bead array (CBA)
IL-2capture ellenanyagok
IL-2
IL-4 IFN
IL-2 „reporter” ellenanyag
IL-8IL-1β
IL-6IL-12 IL-10
TNFα
Citokin mennyiség
Citokin standard hígítási sorozat
500pg/ml 250pg/ml 125pg/ml 62pg/ml 31pg/ml 16pg/ml 8pg/ml 0
A citokinek mennyiségére az eltérő színnel jelölt „reporter” ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk
Az intracelluláris (citoplazmatikus) Ca2+ szint meghatározása
A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció növekedése pl.
fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható.
/Fluo-3 vagy az Indo-1/
példa – intracelluláris Ca2+ jel egy sejtben kimutatva:
antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál(klikk a képre)
B sejt
T sejt
(klikk a képre)
módszer: RT-PCR, QRT-PCR
A génaktiváció vizsgálataA génaktiváció vizsgálata
A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható
pl. citokin gének aktivációja
sejtek RNS izolálás
RNS (reverz transzkriptáz) cDNS
cDNS (PCR) hossz és mennyiség meghatározás
RT-PCR: agaróz gél (pl. denzitometria)QRT-PCR: fluoreszcens módszer(TaqMan probe (FRET) v. interkaláló fluorokróm SYBR green)
Sejtciklus
DNS mennyiség meghatározása(fluoreszcens DNS interkalátorok, 3H-timidin)
- transzkripció kimutatása (RT-PCR)
- fehérjék kimutatása (Immunoassay)
sejtszám változás meghatározása(CFSE)
a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció
GG22
MMGG00
GG11
ss
0 200 400 600 800 1000
GG00GG11
ss GG22 MM
DNDNS analízis S analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához)(pl.aneuploidia diagnosztikájához)
DNS mennyiség
sejtszám
2N2N 4N4N
A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl.
a DNS-be sztöhiometrikus módoninterkalálódó fluoreszcens festékekkel(propidium jodid, PI)
Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra)
A B-/T-sejt proliferáció mérésére alkalmas módszerek
3H-jelölt timidin-beépülés a totál DNS-beépülést méri.Nem méri, hogy hány sejt hányszor osztódott(β-bomlás mérése).
A timidin-analóg bromodeoxyuridin (BrdU) alkalmazható kísérleti állatokban és sejtkultúrákban is. Az osztódó sejtek BrdU-specifikus ellenanyag felhasználásával kimutathatók(mikroszkópia, FACS).
Újabban a karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter, CFSE használata terjedt el.
A sejtosztódás meghatározásaA sejtosztódás meghatározásaA „Cell tracer” festékek bediffundálnak a sejtbe, és sokáig megőrződnek. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez. Amikor az intracelluláris festéka két utódsejtbe szétosztódik, a fluoreszcencia intenzitás felére csökken.
sejtosztódások:7 6 5 4 3 2 1 0
T-sejtek funkcionális vizsgálataT-sejtek funkcionális vizsgálataAntigén specifikus T-sejtek azonosítása
immunizálás
Hasznos lehet pl. immunizálás eredményességének vizsgálatakor
antigén antigén specifikusspecifikus
T-sejtT-sejt
Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak.felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak.
T-sejt klónok ugyanolyan T-sejt receptorral
De az MHC kötődése a T-sejt receptorhoz kis affinitású
egy MHC molekula és egy MHC molekula és T-sejt receptor T-sejt receptor
kölcsönhatása nem kölcsönhatása nem elég erőselég erős
Megjelölt MHC-peptid komplex felhasználható a rá specifikus T-sejt receptor kimutatására
MHC
T-sejt receptorok
T-sejtT-sejt
Pentamer (vagy tetramer) technikaPentamer (vagy tetramer) technika
a létrejövő a létrejövő pentamerpentamer
self assembling coiled-coil-domain
MHC
peptid
fluoreszcens jelzés
a pentamer egyik alegysége
Multimerizált MHC-peptid komplex aviditása már kellően erős lehet.
peptid-specifikus
T-sejt
MHC pentamer
Az MHC pentamer kötődése a T-sejthez
Az MHC-peptid oligomer reakciója a specifikus T-sejt receptorokkal
nagy aviditású.
T-sejt receptorok
Ide kattints az animációhoz
MHC multimerek segítségével meghatározható az antigén-specifikus
T-sejtek száma, értékelhető pl. a vakcinák, vagy egy adott terápiás
eljárás hatékonysága.
MHC DextramerekMHC Dextramerek
CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban
EBV BZLF-1 (RAKFKQLL/ HLA-B*0801)-specifikus T-sejtek
(a normál populáció 90-95%-a hordozó)
Influenza epitóp (GILGFVFTL/HLA-A0201)-specifikus T-sejtek
egészséges donorban
MHC multimer jelöléses példák
A perzisztáló (pl. herpeszvírusok) vagy visszatérő fertőzések miatt a specifikus T-sejtek száma viszonylag magas lehet
allél szekvencia Tumor (asszociált) epitop peptid eredeteA*0201 GVLVGVALI Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 694-702
A*0201 LLGRNSFEV p53 261-269
A*0201 LLLLTVLTV MUC-1 12-20
A*0201 RLLQETELV HER-2/neu 689-697
A*0201 RMFPNAPYL Wilm's Tumour (WT1) 126-134
A*0201 SLLMWITQV NY-ESO-1 157-165
A*0201 STAPPVHNV MUC-1 950-958
A*0201 VISNDVCAQV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) 154-163
A*0201 VLQELNVTV Leukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) 169-177
A*0201 VLYRYGSFSV gp100 (pmel17) 476-485
A*0201 YLEPGPVTA gp100 (pmel17) 280-288
A*0201 YLSGANLNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 571-579
A*0201 KVLEYVIKV MAGEA1 278-286
A*0201 KVAELVHFL MAGEA3 112-120
A*0201 KTWGQYWQV gp100 (pmel17) 154-162
A*0201 HLSTAFARV G250 (renal cell carcinoma) 217-225
A*0201 ILAKFLHWL Telomerase 540-548
A*0201 ILHNGAYSL HER-2/neu 435-443
A*0201 IMDQVPFSV gp100 (pmel17) 209-217
A*0201 KIFGSLAFL HER-2/neu 348-356
A*0201 LMLGEFLKL Survivin 96-104
A*0201 ALQPGTALL Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) 14-22
A*0201 CMTWNQMNL Wilm's Tumour (WT1) 235-243
A*0201 ELAGIGILTV MelanA / MART 26-35
A*0201 FLTPKKLQCV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) 141-150
A*0201 GLYDGMEHL MAGEA-10 254-262
A*0301 KQSSKALQR bcr-abl 210 kD fusion protein 21-29
A*0301 ATGFKQSSK bcr-abl 210 kD fusion protein 259-269
A*0301 ALLAVGATK gp100 (pmel17) 17-25
A*2402 VYGFVRACL Telomerase reverse transcriptase (hTRT) 461-469
A*2402 TYLPTNASL HER-2/neu 63-71
A*2402 TYACFVSNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 652-660
A*2402 TFPDLESEF MAGEA3 97-105
A*2402 EYLQLVFGI MAGEA2 156-164
A*2402 CMTWNQMNL Wilm's Tumour (WT1) 235-243
A*2402 AFLPWHRLF Tyrosinase 188-196
B*0801 GFKQSSKAL bcr-abl 210 kD fusion protein 19-27
allél szekvencia EBV epitopA*0201 CLGGLLTMV EBV LMP-2 426-434
A*0201 GLCTLVAML EBV BMLF-1 259-267
A*1101 IVTDFSVIK EBV EBNA-4 416-424
A*2402 TYGPVFMCL EBV LMP-2 419-427
B*0702 RPPIFIRRL EBV EBNA-3A 247-255
B*0801 FLRGRAYGL EBV EBNA-3A 193-201
B*0801 RAKFKQLL EBV BZLF-1 190-197
B*3501 HPVGEADYFEY EBV EBNA-1 407-417
allél szekvencia Influenza A epitopA*0101 CTELKLSDY Influenza A (PR8) NP 44-52
A*0201 GILGFVFTL Influenza A MP 58-66
A*0301 ILRGSVAHK Influenza A (PR8) NP 265-274
allél szekvencia HIV epitopA*0201 ILKEPVHGV HIV-1 RT 476-484
A*0201 KLTPLCVTL HIV-1 env gp120 90-98
A*0201 SLYNTVATL HIV-1 gag p17 76-84
A*0201 TLNAWVKVV HIV-1 gag p24 19-27
A*0301 QVPLRPMTYK HIV-1 nef 73-82
A*0301 RLRPGGKKK HIV-1 gag p17 19-27
A*2402 RYLKDQQLL HIV-1 gag gp41 67-75
B*0702 IPRRIRQGL HIV-1 env gp120 848-856
B*0702 TPGPGVRYPL HIV-1 nef 128-137
B*0801 FLKEKGGL HIV-1 nef 90-97
B*0801 GEIYKRWII HIV-1 gag p24 261-269
B*2705 KRWIILGLNK HIV-1 gag p24 265-274
H-2Kd AMQMLKETI HIV-1 gag p24 199-207
Antigén specifikus T sejtek Antigén specifikus T sejtek kimutatására alkalmas MHC-peptid kimutatására alkalmas MHC-peptid
pentamer példákpentamer példákA vizsgált személy szövettípusának A vizsgált személy szövettípusának
megfelelő MHC multimer szükséges hozzámegfelelő MHC multimer szükséges hozzá
A TRANSZPLANTÁCIÓS IMMUNOLÓGIA GYAKORLATI VONATKOZÁSAI
MHC TIPIZÁLÁS
ember – HLA tipizálás
laboratóriumi egér – H2 tipizálás (miért nincs szükség rá?)
HLA tipizálásHLA tipizálás
- szövet/szerv transzplantációkhoz általában a HLA-B és a HLA-DR a legfontosabb a HLA-C kevéssé immunogén, gyakran alig befolyásolja a transzplantáció eredményét
- diagnosztikai értéke van HLA és a különféle betegségek között összefüggés lehet (HIV-rezisztenciás esetek egy része is adott spec HLA-B allélhez köthető)
MHC I: HLA-A, HLA-B, HLA-CMHC II: HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR
Fogalmak:autológ - saját eredetű (MHC azonos)allogén - idegen eredetű (MHC különbségek)xenogén - idegen faból származó (MHC és akár „vércsoport” antigén különbségek is)
• Hiperakut rejekció
Okok: alloantigénekkel szembeni előzetes immunizácó, preformált anti-HLA ellenanyagok, ABO-vércsoport inkompatibilitás, xenotranszplantáció
antitestek kötődnek a szerv endotél sejtjeihez
komplementrendszer aktiválódásatrombózis
vascularis necrosis
terápia rezisztens
Transzplantációs reakciók(allorektivitás)
• HLA-A, B, C, DR, DQ, DP, és minor hisztokompatibilitási antigének jelentősége
• idegen MHC-antigének T sejtek általi felismerése
Direkt: saját T sejtek - donor APC-k (CD8+ T sejt válasz)
Indirekt: saját APC bemutatja a donor MHC-molekula katabolizmusából származó fragmenteket (CD4+ T sejtek)
citokin felszabadulás
GYULLADÁS
forrás: Klinikai immunológia (II. klinikum) (OHVI 1990 szerk.: Szegedi, Gergely, Sipka, Szemere) Stenszky Valéria: Autoimmun betegségek genetikai vonatkozásai
Betegségek(autoimmun)
HLA
gyakoriság
beteg kontroll
SLEDR3 55 20
B8 50 20
Hidralazin(?) indukált lupus erythematosus
DR4 73 32
Basedow-kórDR3 56 25
B8 43 20
Krónikus aktív hepatitis DR3 55 21
Sclerosis multiplexDR2 60 30
B7 37 24
Myasthenia gravis B8 44 20
Autoimmun IgA glomerulonephritis
DR4 53 19
I. típ. diabetes
DR3 72 24
DR3 49 22
B8 40 21
Addison-kór (idiotópiás, autoimmun)
DR3 70 20
B8 46 23
Sjörgen-szindrómaDR3 70 20
B8 50 22
Coeliaka
DR3 79 22
DR7 60 15
B8 68 22
Goodpasture-szindróma DR2 88 29
IgA hiány DR3 81 20
Dermatitis herpetiformisDR3 82 20
B8 75 22
De Qervain-thyreoiditis B35 70 15
Reiter-szindróma B27 79 9
Felty-szindróma DR4 95 20
Betegségek HLA
gyakoriság
betegkontrol
lNarcolepsia DR2 100 22
Bechterew-kór B27 89 9
Adrenogenitális szindróma
Sóvesztő forma
Késői forma
Virilizáló forma
Bw47 36 1
B14 57 4
B5 48 10
Psoriasis vulgaris
Cw6 56 15
B13 24 8
B17 27 8
DR7 48 23
Idiopátiás haemochromatosis A3 76 28
Bechet-kór B51 50 11
Arany indukált thrombocytopenia DR3 50 13
Arany indukált leukopénia DR3 47 13
HLA allotípusok és betegségek közötti kapcsolatok
A régi klasszikus módszer:
Szerotipizálás A tipizálandó vérsejtek és a tipizáló szérum közötti szerológiai reakción alapul.Az MHC I és/vagy MHC II molekula változatokat felismerő ellenanyagokat tartalmazó szérumok segítségével véghez vitt komplement mediált lízis/sejtkárosítás.
Ha a tipizáló szérum nem reagál a sejtekkel, nincs lízis(az elpusztult/károsodott sejteket festék hozzáadásával teszik láthatóvá)
A tipizáló szérumokat régen immunizálódott személyektől gyűjtötték (pl. többször szült nők, vérátömlesztést kapott személyek - többféle MHC allél ellen immunizálódtak), ezt később monoklonális ellenanyagokkal váltották ki.
HLA tipizálási módszerek:
A szérumok/ellenanyagok specifitásának jellemzése és az új HLA allélek azonosítása nemzetközi workshopok keretében történik.
A rendelkezésre álló, jól karakterizált szérumok mennyisége mindig limitált – ezért mikrotiter tálcákon végzik a vizsgálatokat (mikrocitotoxicitási vizsgálat, Terasaki plate)
Az MHC II (HLA-DP, DQ, DR) allotípusokat B sejteken vizsgáljákperifériás vér, Ficoll gradiens PBMCPBMC, olcsó nylonvatta szlop dúsított B sejtek
Szerotipizálás
Az MHC antigének kompatibilitását kevert limfocita reakcióval (MLR) is vizsgálhatják.- Kétirányú MLR – mindkét donor T limfocitái válaszolnak- Egyirányú MLR – az egyik személy limfocitáinak osztódását gátolják (γ besugárzás,
sejtosztódás gátló Mitomycin C kezelés)
AZ ALLOREAKTÍV AKTIVÁLÓDÓ LIMFOCITÁK ARÁNYA EGY ADOTT EGYEDBEN NAGYON MAGAS LEHET (1-10%)
(alloreaktivitás és MHC restrikció látszólagos paradoxonának szemléletes feloldása:az allogén MHC a saját T sejt számára úgy „látszik”, mintha saját MHC lenne idegen peptiddel)
A szerotipizálásnak vannak korlátai: – gyakori keresztreakciók (HLA-B27 – HLA-B7, nem csak a poliklonális szérumok miatt)– HLA-C ellen (alacsony immunogenitású), kevés specifikus szérum– egyes variációkat, kis eltéréseket nem képes detektálni
Szerológiai módszerekkel a változatok töredékét lehet csak kimutatni!
Genetikai vizsgálatokGenetikai vizsgálatok- PCR-SSP (Sequence Specific Primer) ha ismert a szekvenciaKülönféle egyedi HLA szekvenciákra specifikus primerekkel elvégzett sokmintás PCR vizsgálat. Az allél specifikus primerpárok segítségével, a PCR reakcióban megsokszorozott génszakaszok kimutathatók az agaróz gélben
HLA-A 0201 0202 0203 …
-PCR-SSOP (Szekvencia Specifikus Oligonokleotid Próba)
Jelzéssel ellátott, allél specifikus oligonukleotidok hibridizációja a vizsgált személy DNS-éhez.
A vizsgálandó személy HLA génszakaszait PCR–rel sokszorosítják (nem allél specifikus primerekkel). A terméket nitrocellulóz membránon vagy mikrotiter tálcákon immobilizálják és különféle allél specifikus jelölt oligonukleotidokkal hibridizálják.A jelölés lehet radioaktív, enzim vagy fluoreszcens. – példát lásd a következő diákon (ELPHA )
-SBT (Sequence Based Typing)
DNS szekvenálással állapítják meg az allotípust(egészen kis eltérések, és új változatok is kimutathatóak vele)
Genetikai vizsgálatok
- Vérből szeparált PBMC-ből genom DNS izolálás- Az MHC II gének 2. exonjának és az MHC I gének 2. és 3. exonjának amplifikálása PCR-reakcióval. A primerek nem allél specifikusak, de biotinnal jelöltek.
ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)(1. lépés)
DP DQ DR B C A
Egy gyakorlati példa PCR-SSOP-re:
A PCR amplifikátumot mikroteszt („ELISA”) lemez lukjaiba osztják szét.A lukak alja sztreptavidinnel fedett, és az egyes lukak liofilizált formában tartalmazzák a különféle allélszakaszokkal komplementer szekvencia specifikus oligonukleotidokat (SSOP).
Sztreptavidin
A biotinált amplifikátum kikötődik a sztreptavidinre, és egyidejűleg visszaoldja az oligonukleotidokat.
biotinált PCR amplifikátum
A komplementer szekvenciák hibridizálnak, és a mosás után csak az adott allélekre specifikus oligonukleotidok maradnak a lemezen.
Az oligonukleotidokon levő jelzést pl. enzim konjugált ellenanyag ismeri fel. Az enzim megfelelő szubsztráttal színreakciót katalizál.
ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)(2. lépés)
(Jelen esetben az oligonukleotidon levő jelzés nem lehet biotin, mert az „foglalt”. Lehet pl. digoxigenin, vagy FITC. A FITC ebben az esetben nem fluoreszcens jel, hanem ún. „tag”)
pl. HLA-A tipizáló lemez (3.lépés)
HLA-A0276
HLA-A2434
HLA-A A*01010101A*0214 A*0263 A*0309 A*2301 A*2428 A*2603 A*300102 A*3306 A*6824A*01010102NA*0215N A*0264 A*0310 A*2302 A*2429 A*2604 A*300201 A*3307 A*6825A*010102 A*0216 A*0265 A*0311N A*2303 A*2430 A*2605 A*300202 A*3308 A*6826A*010103 A*021701 A*0266 A*0312 A*2304 A*2431 A*2606 A*300203 A*3401 A*6827A*010104 A*021702 A*0267 A*0313 A*2305 A*2432 A*260701 A*3003 A*3402 A*6828A*0102 A*0218 A*0268 A*0314 A*2306 A*2433 A*260702 A*3004 A*3403 A*6829A*0103 A*0219 A*0269 A*0315 A*2307N A*2434 A*2608 A*3006 A*3404 A*6830A*0104N A*022001 A*0270 A*0316 A*2308N A*2435 A*2609 A*3007 A*3405 A*6831A*0106 A*022002 A*0271 A*0317 A*2309 A*2436N A*2610 A*3008 A*3406 A*6832A*0107 A*0221 A*0272 A*0318 A*2310 A*2437 A*2611N A*3009 A*3407 A*6833A*0108 A*0222 A*0273 A*0319 A*2311N A*2438 A*2612 A*3010 A*3408 A*6834A*0109 A*0224 A*027401 A*0320 A*2312 A*2439 A*2613 A*3011 A*3601 A*6835A*0110 A*0225 A*027402 A*0321N A*2313 A*2440N A*2614 A*3012 A*3602 A*6901A*0111N A*0226 A*0275 A*0322 A*2314 A*2441 A*2615 A*3013 A*3603 A*7401A*0112 A*0227 A*0276 A*0323 A*24020101A*2442 A*2616 A*3014L A*3604 A*7402A*0113 A*0228 A*0277 A*0324 A*24020102LA*2443 A*2617 A*3015 A*4301 A*7403A*0114 A*0229 A*0278 A*0325 A*240202 A*2444 A*2618 A*3016 A*6601 A*7404A*0115N A*0230 A*0279 A*110101 A*240203 A*2445N A*2619 A*3017 A*6602 A*7405A*0116N A*0231 A*0280 A*110102 A*240204 A*2446 A*2620 A*3018 A*6603 A*7406A*0117 A*0232N A*0281 A*110103 A*240205 A*2447 A*2621 A*310102 A*6604 A*7407A*0118N A*0233 A*0282N A*110104 A*240206 A*2448N A*2622 A*3102 A*6605 A*7408A*0119 A*0234 A*0283N A*110105 A*240207 A*2449 A*2623 A*3103 A*6606 A*7409A*0120 A*023501 A*0284 A*110201 A*240208 A*2450 A*2624 A*3104 A*680101 A*7410A*02010101A*023502 A*0285 A*110202 A*240209 A*2451 A*2625N A*3105 A*680102 A*7411A*02010102LA*0236 A*0286 A*1103 A*240210 A*2452 A*2626 A*3106 A*680103 A*7412NA*020102 A*0237 A*0287 A*1104 A*240211 A*2453 A*2627 A*3107 A*680104 A*8001A*020103 A*0238 A*0288N A*1105 A*240212 A*2454 A*2628 A*3108 A*680105 A*9201A*020104 A*0239 A*0289 A*1106 A*240301 A*2455 A*2629 A*3109 A*68020101A*9202A*020105 A*0240 A*0290 A*1107 A*240302 A*2456 A*2630 A*3110 A*68020102A*9203A*020106 A*0241 A*0291 A*1108 A*2404 A*2457 A*2631 A*3111 A*680301 A*9204A*020107 A*0242 A*0292 A*1109 A*2405 A*2458 A*2632 A*3112 A*680302A*020108 A*0243N A*0293 A*1110 A*2406 A*2459 A*2633 A*3113 A*6804A*020109 A*0244 A*0294N A*1111 A*2407 A*2460N A*29010101A*3114N A*6805A*020110 A*0245 A*0295 A*1112 A*2408 A*2461 A*29010102NA*3201 A*6806A*020111 A*0246 A*0296 A*1113 A*2409N A*2462 A*290201 A*3202 A*6807A*020112 A*0247 A*0297 A*1114 A*2410 A*2463 A*290202 A*3203 A*6808A*0202 A*0248 A*0299 A*1115 A*2411N A*2464 A*290203 A*3204 A*6809A*020301 A*0249 A*03010101A*1116 A*2413 A*2465 A*2903 A*3205 A*6810A*020302 A*0250 A*03010102NA*1117 A*2414 A*2466 A*2904 A*3206 A*6811NA*0204 A*0251 A*03010103A*1118 A*2415 A*250101 A*2905 A*3207 A*6812A*0205 A*0252 A*030102 A*1119 A*2417 A*250102 A*2906 A*3208 A*6813A*020601 A*0253N A*030103 A*1120 A*2418 A*2502 A*2907 A*3209 A*6814A*020602 A*0254 A*030104 A*1121N A*2419 A*2503 A*2908N A*3210 A*6815A*020603 A*0255 A*030105 A*1122 A*2420 A*2504 A*2909 A*3211Q A*6816A*0207 A*0256 A*0302 A*1123 A*2421 A*2505 A*2910 A*3212 A*6817A*0208 A*0257 A*0303N A*1124 A*2422 A*2506 A*2911 A*3213 A*6818NA*0209 A*0258 A*0304 A*1125 A*2423 A*260101 A*2912 A*3301 A*6819A*0210 A*0259 A*0305 A*1126 A*2424 A*260102 A*2913 A*330301 A*6820A*0211 A*0260 A*0306 A*1127 A*2425 A*260103 A*2914 A*330302 A*6821A*0212 A*0261 A*0307 A*1128 A*2426 A*260104 A*2915 A*3304 A*6822
szekvencia alapon 2006 októberéig leírt
HLA-A allélek (480)egy régebbi nomenklatúra
szerint(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/allele.html)
és a szerológiai alapon jellemzett
HLA-A allélek (28):
A1 A2 A203 A210 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9) A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36 A43 A66(10) A68(28) A69(28) A74(19) A80
2012:1757 HLA-A allél1290 HLA-A fehérje87 null allél
2012-es HLA nomenklatúra
A szekvenálás térhódításával rengeteg új allélt/változatot mutatnak ki, ezért a nomenklatura rendszeres frissítésre szorul
http://hla.alleles.org/
2012 januárjáig 7196 különböző HLA allélt (A,B,C, DP, DQ, DR,…) írtak le
Nomenclature IndicatesHLA the HLA region and prefix for an HLA geneHLA-DRB1 a particular HLA locus i.e. DRB1HLA-DRB1*13 a group of alleles which encode the DR13 antigen or sequence homology to other DRB1*13 allelesHLA-DRB1*13:01 a specific HLA alleleHLA-DRB1*13:01:02 an allele that differs by a synonymous mutation from DRB1*13:01:01HLA-DRB1*13:01:01:02 an allele which contains a mutation outside the coding region from DRB1*13:01:01:01HLA-A*24:09N a 'Null' allele, an allele which is not expressedHLA-A*30:14L an allele encoding a protein with significantly reduced or 'Low' cell surface expressionHLA-A*24:02:01:02L an allele encoding a protein with significantly reduced or 'Low' cell surface expression, where the mutation
is found outside the coding regionHLA-B*44:02:01:02S an allele encoding a protein which is expressed as a 'Secreted' molecule onlyHLA-A*32:11Q an allele which has a mutation that has previously been shown to have a significant effect on cell surface
expression, but where this has not been confirmed and its expression remains 'Questionable'
MHC-I
MHC-II
HLA nomenklatúra részletei
TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK
Ártalmatlan anyagok bejutása egyes emberekben túlérzékenységi reakciókat
válthat ki
Nemkívánatos gyulladáshoz, sejtek és szövetek károsodásához vezet
Az immunrendszer az idegen anyagra nem megfelelően reagál
Többnyire ártalmatlan anyagok hatására alakul ki, másodszori (esetleg többszöri) találkozás eredményeként
TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK ÁTTEKINTÉSE
I. típusú„azonnali”
II. típusú III. típusú IV. típusú„késői”
Ellenanyag mediált T sejt mediált
- az elején szenzitizációval indulnak- gyakran autoimmun megbetegedésekkel kapcsolatban- a típusok effektor mechanizmusai átfedhetnek – tünetek egy része hasonló lehet- sok olyan eset lehetséges amikor nem tisztán az egyik vagy a másik típus jelenik meg (pl. I – IV)
AZ ELLENANYAG MEDIÁLT TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK TÍPUSAI
Ellenanyagizotípus
Antigén
Effektor mechanizmus
Példa
Szolubilis antigén
Hízósejt aktiváció
Allergiás rhinitis, asthma bronchiale,
anaphylaxia
Szolubilis antigén
Komplement, fagociták
Sejtfelszíni receptor
Sejtfelszíni vagy mátrix-
kötött antigén
Az ellenanyag megváltoztatja
a jelátvitelt
Komplement, FcR+ sejtek (fagociták, NK-sejtek)
Egyes gyógyszer-allergiák
(pl. penicillin)
Krónikus urtikária
(ellenanyag az FcRIα ellen)
Szérumbetegség, Arthus-reakció
II. típus III. típusI. típus
• I. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ
• „azonnali” hiperszenzitivitási reakció
• „klasszikus” ALLERGIA
A szenzitizáció folyamata
Első találkozás a pollennel
Az antigén bejutása, felvétele
Antigén-specifikus
T-sejtek aktivációja
IgE termelés és azok kötődése a
hízósejtek felszínéhez
(Az antigénprezentáció a naív T sejtek számára és a naív B sejtek aktivációja természetesen a nyirokcsomóban történik)
IgE
Fc RIea
bg
foszfatidil-kolin
PGD2
PGD2
PAF
LTC4
PIP2
IP3
DAG
Ca2+Ca2+
Ca2+foszfolipid
PKC
LTC4
LTD4LTE4
LYSO-PC arachidonsav
szekretorosgranulum
mediátorokcitokinekIL-3, IL-4,IL-5, IL-6
TNFa
endoplazmásretikulum
PI-PLCg
Ca2+
Ca2+
szekréció
MAP-kináz
proteinek(miozin-
könnyűlánc)foszforilációja
PLA2
ciklooxigenáz
5-lipoxigenáz
ITAM
ITAM
ITAM
ITA
M
ITA
M
ITA
M
citokin génektranszkripciója
SykLyn
NFATAP-1 NF- Bk
AZ ALLERGÉN HATÁSÁRA A HÍZÓSEJTBEN KIVÁLTOTT
REAKCIÓK
KORAI MEDIÁTOROK(raktározott)
Biogén aminok – hisztamin
Enzimek – triptáz, kináz, karboxipeptidáz
KÉSŐI MEDIÁTOROK
citokin
kemokin
lipid-mediátor
enzim
toxikus mediátor
Termék típusa Termék Biológiai hatások
kötőszöveti ‘remodelling’
toxikus a parazitákranöveli az erek permeabilitásátsimaizom összehúzódáshoz vezet
gyulladáskeltő, különböző sejttípusok citokintermelését serkenti, aktiválja az endotéliumot
TNFα (egy része granulumokban raktározva)
simaizom összehúzódáshoz vezet növeli az erek permeabilitását serkenti a nyáktermelést
serkentik és erősítik a Th2-választ
granulocita termelés és aktiválás
monocita, makrofág és granulocita toborzás
leukociták toborzása, lipidmediátorok felszabadulásának serkentése, neutrofilok, eozinofilok és trombociták aktiválása
A TNF tároltan is megtalálható, és késői mediátor is
korai (tárolt) mediátorok
A hízósejt degranuláció hatása függ a szöveti környezettől
Hányás, hasmenés,
hasi görcsök
Köhögés, mellkasi
szorítóérzés, sípoló légzés
Ödéma, gyulladás és megnövekedett antigénszállítás a nyirokcsomókba
Hízósejt aktiváció és degranuláció
Emésztőrendszer Légutak Vérerek
Megnövekedett emésztőnedv szekréció és
perisztaltika
Csökkent átmérő és megnövekedett nyáktermelés
Megnövekedett vérátáramlás és
permeabilitás
AZ IgE ÁLTAL KÖZVETÍTETT HIPERSZENZITIVITÁS TÍPUSAI
SZINDRÓMA GYAKORI ALLERGÉNEK
A BELÉPÉS HELYE VÁLASZ
szisztémásanafilaxis
gyógyszerekállati mérgekföldi mogyoró
intravénás(közvetlen vagy
szájon át történő felszívódás
ödémaér áteresztő képesség
növekedésetracheális okkluzió
keringés összomlásahalál
akut urtikária rovar csípésallergia teszt
szubkután a véráram lokális fokozódásaéráteresztő képesség növekedése
Allergiás rinitisz
szénanátha
pollenházi atka ürülék
belégzés orr nyálkahártya ödéma orr nyálkahártya irritáció
asztma állatszőrpollen
házi atka ürülék
belégzés légutak szűkületefokozott nyálka képződés
légutak gyulladása
étel allergia csonthéjasokföldimogyoróhalak, kagyló
tej, tojás
szájon át hányáshasmenés
pruritusz (viszketés)urtikária (csalánkiütés)
anafilaxis (ritka)
Hízósejtek működésének vagy antigén specifikus IgE jelenlétének vizsgálatakísérleti állatmodellben:
Passzív kután anafilaxis
A bőrbe szenzitizált élőlény szérumát, vagy antigén specifikus IgE ellenanyagokat juttatnak lokálisan („lokális passzív immunizálás”).
Egy két nap elteltével intravénásan juttatnak az állatba antigént, és jelzőfestéket (Evans-blue – albuminhoz kötődik a keringésben)
A kisméretű antigén a korábbi oltás helyén kiváltja az IgE hordozó hízósejtek aktivációját.
A hisztamin hatására megnő a helyi kapillárisok permeabilitása, a kék festék kijut a szövetbe – kék elszíneződés az oltás helyén
Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia)
Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia) Fekete üröm (Artemisia vulgaris)
levélfonák zöld levélfonák fehéresen molyhos
Fekete üröm (Artemisia vulgaris) – ?
Fehér üröm (Artemisia absinthium) – Abszint
Recommended